CN102021156A - 蔗糖水解酶的突变体及其应用 - Google Patents

蔗糖水解酶的突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蔗糖水解酶的突变体Sinv2，其特征在于含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。这个突变体酶相对于突变前的酶具有中性的最适pH值和更高的水解蔗糖的功能。本发明含涉及该蔗糖水解酶突变体(SEQ ID NO：1)在降解蔗糖中的应用。

Description

蔗糖水解酶的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种蔗糖水解酶突变体，以及该突变体酶在蔗糖降解中的应用。
背景技术
蔗糖是植物中光合作用产生的可再生的碳水化合物，每年全球产量超过了5亿吨(马尔克斯·萨瓦亚·亚克，蔗糖乙醇的中巴合作，商务周刊，2009，1：72)。
蔗糖水解酶(β-D-fructofuranoside fructohydrolase，EC 3.2.1.26)是一类把蔗糖水解成葡萄糖和果糖的水解酶。目前鉴定的蔗糖水解酶主要是来自植物和真菌如酵母和曲霉(Lammens W.，et al，2008，Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose.J.Mol.Biol.，377：378-385.)。蔗糖水解酶在生物体中具有不同的形式，根据最适pH值的范围不同被分为三类，酸性、中性、碱性(
Figure BSA00000303056600011
L.H.S.，et  al.，Production and characterization of a thermostable extracellular [beta]-d-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with agroindustrial residues as carbon sources.Enzyme and Microbial Technology，2007.42(1)：52-57.)。按照进化起源上，蔗糖水解酶可以分为两类，酸性蔗糖水解酶是一类；中性和碱性又是一类(Bocock P.N.，et al.，2008，Evolution and diversity of invertase genes in Populus trichocarpa.Planta，227：565-576.)。酸性蔗糖水解酶是目前研究得最多的蔗糖水解酶，其中来自酿酒酵母的酸性蔗糖水解酶又是最受关注的(Goosen C.，et al.，2007，Molecular and biochemical characterization of a novel intracellular invertase  from Aspergillus niger with transfructosylating activity.Eukaryot.Cell，6：674-681.De Los Angeles Calixto-Romo M.，etal.，2008)，Expression，purification and immobilization of the intracellular invertase INVA，from Zymomonas mobilis on crystalline cellulose and Nylon-6.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，35：1455-1463.)；而中、碱性蔗糖水解酶由于纯化的难度以及酶蛋白不稳定，目前被研究的比较少(Roitsch T.，et al.，2004，Function and regulation of plant invertases：sweet sensations.Trends Plant Sci.，9：606-613.)。
在食品工业许多产品的生产中，用于水解蔗糖的蔗糖水解酶的最适宜pH值通常是在中性的范围内的(Serna-Saldivar S.R.，et al.，2008，Production of invert syru p from sugarcane juice using immobilized invertase.US patent 7435564.)。目前，一些研究小组正在寻找各种方法以提高蔗糖水解酶的最适pH值。Sanjar等人通过方式将蔗糖酶固定，成功地将酵母蔗糖水解酶的最适pH值从5.0提高到6.0(Sanjar G.，et al.，2006，Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10.Food Chem.，94：573-579.)。寻找适合于食品工业生产的新的中性蔗糖水解酶，提高水解蔗糖的速度，从而缩短发酵生产时间，对于降低利用蔗糖生产各种食品的生产成本具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是通过对蔗糖水解酶的改造，使之获得新的蔗糖水解酶突变体，这个突变体酶可用于蔗糖水解。
本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体Sinv2(SEQ ID NO：1)，其是通过分子改造蔗糖水解酶基因inv2(GenBank序列号HQ267532)而得到的，具体是通过缺失inv2分子上的前360个碱基，改造得到一个新的蔗糖水解酶突变体。这个蔗糖水解酶突变体和原酶相比，水解蔗糖的活性获得了1倍的提高，同时酶反应的最适pH值由酸性4.5变为中性6.0。
SEQ ID NO：1的蛋白质是蔗糖水解酶突变体Sinv2，由466个氨基酸组成。氨基酸序列如下：
序列特征：
长度：466氨基酸
类型：多肽
链型：单链
几何结构：立体
分子类型：蛋白质
序列描述：
Phe Arg Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp Met Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly Glu Tyr His Leu Phe
16              20                  25                  30
Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met His Trp
31              35                  40                  45
Gly His Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Pro
46              50                  55                  60
Thr Ala Ile Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp Ile Phe Ser Gly Ser
61              65                  70                  75
Ala Val Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys Asn Ala
76              80                  85                  90
Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gln Gln Gln Cys
91              95                  100                 105
Ile Ala Tyr Ser Ile Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Glu
106             110                 115                 120
Lys Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Lys Asp Phe Arg Asp
121             125                 130                 135
Pro Lys Val His Trp Asn Glu Gln Ala Lys Gln Trp Val Met Ala
136             140                 145                 150
Leu Ala Thr Gln Gln Thr Ile Thr Phe Phe Gly Ser Pro Asp Leu
151             155                 160                 165
Lys Asn Trp Thr Arg Leu Ser Glu Phe Gly Lys Asn Tyr Gly Ala
166             170                 175                 180
His Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Pro Leu Glu Phe
181             185                 190                 195
Glu Gly Lys Thr Lys Trp Val Leu Leu Val Ser Ile Asn Pro Gly
196             200                 205                 210
Gly Pro Asn Gly Gly Ser Ala Thr Gln Tyr Phe Ile Gly Asp Phe
211             215                 220                 225
Asp Gly Lys Thr Phe Ser Ala Asp Pro Leu Pro Tyr Pro Leu Trp
226             230                 235                 240
Val Asp Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Ala Gly Val Thr Phe Ser Asn
241             245                 250                 255
Ile Gly Lys Asn Asp Gly Arg Arg Ile Phe Met Gly Trp Met Ser
256             260                 265                 270
Asn Trp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Pro Thr Lys Ser Phe Arg Asn
271             275                 280                 285
Ala Met Thr Leu Pro Arg Glu Leu Lys Leu Ala Ser Asn Gly Gln
286             290                 295                 300
His Leu Ile Leu Thr Ser Ala Pro Val Ser Glu Val Thr Lys Leu
301             305                 310                 315
Arg Gly Lys Ser Gly Glu Thr Ile Asn Ile Leu Val Asn Ser Glu
316             320                 325                 330
Lys Ser Ile Thr Asn Val Leu Gln Asp Phe Asn Gly Lys Phe Glu
331             335                 340                 345
Leu Asn Met Thr Ile Gln Arg Lys Asp Ala Lys Val Trp Gly Phe
346             350                 355                 360
Gly Leu Lys Asn Glu Leu Gly Asp Tyr Leu Asn Phe Thr Phe Asp
361             365                 370                 375
Trp Glu Gln Lys Ile Leu Lys Val Asp Arg Arg Asn Thr Gly Ile
376             380                 385                 390
Lys Glu Phe Ser Gln Lys Phe Ala Thr Glu Pro Phe Ala Pro Leu
391             395                 400                 405
Ala Lys His Asp Ser Tyr Thr Ile Arg Leu Phe Met Asp Lys Ala
406             410                 415                 420
Ser Ser Glu Ile Phe Ile Asn Asp Gly Glu Thr Val Leu Thr Asn
421             425                 430                 435
Leu Val Phe Pro Ser Gln Thr Tyr Lys Ser Leu Thr Phe Phe Thr
436             440                 445                 450
Ala Asn Lys Pro Trp Asn Val Glu Asn Leu Lys Ile Phe Glu Ile
451             455                 460                 465
Lys。
466
本发明还涉及含有本发明蔗糖水解酶突变体的宿主。
本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体，该突变体酶在蔗糖的降解中具有广泛的用途。
其特殊在于它的最适pH变为中性同时水解蔗糖的能力提高1倍，该突变体蛋白质可用于蔗糖的降解。
本发明所述的新的蔗糖水解酶突变体的制备方法包括蔗糖水解酶基因的克隆、蔗糖水解酶突变体基因的获得、蔗糖水解酶突变体基因的表达和纯化以及蔗糖水解酶突变体水解蔗糖酶活的测定等步骤，具体如下：
1)蔗糖水解酶基因inv2的克隆
使用上游引物inv-1：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAATAGACAGATGAATCCAGGTC-3’(包含一个PagI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物inv-2：5’-CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3’(包含一个PstI酶切位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖水解酶基因inv2，用限制性内切酶PagI和Pst I酶切蔗糖水解酶基因inv2后，***到经NcoI和Pst I酶切的表达载体pSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-inv2。
2)蔗糖水解酶突变体基因Sinv2的获得
Sinv2基因是根据inv2基因序列信息从inv2基因的361位碱基开始设计引物来进行改造。以1)中构建的pSE-inv2为模板，使用上游引物Sinv：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3’(包含一个PagI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物inv-2进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，54℃15秒，72℃1.5分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物用限制性内切酶PagI和Pst I酶切后，***到经NcoI和Pst I酶切的表达载体pSE380，转化到XL1-Blue感受态细胞(CaCl2化学法转化)。然后进行DNA测序分析确定正确的转化子。
3)蔗糖水解酶突变体基因Sinv2的表达和表达产物的纯化
将含有质粒pSE-Sinv2的重组大肠杆菌菌株接种、培养基、超声波破胞、离心、纯化、层析、洗脱，收集洗脱的蛋白质溶液，验证，发现有一条目的大小的蛋白质条带。
4)蔗糖水解酶突变体Sinv2水解蔗糖酶活的测定
将蔗糖水解酶突变体Sinv2纯化物，加入DNS溶液溶解，加入试剂混合，放置沸水中反应，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD600。利用吸光度测定值来计算酶活。
将获得的突变前的Inv2和突变后的Sinv2的酶活和最适pH的实验数据作图。结果发现：蔗糖水解酶突变体Sinv2的最适pH值由4.5提高到6.0，同时水解蔗糖的酶活提高1倍。
具体实施方式
下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。
在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-Blue(购自TaKaRa公司)；载体为购自Intrivogen公司的表达载体pSE380；购自Intrivogen公司的Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质；购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶。
下面将通过实施例对本发明作详细描述：
1)蔗糖水解酶基因inv2的克隆
使用上游引物inv-1：5’-CACTCATGA TGCACCACCACCACCACCACAATAGACAGATGAATCCAGGTC-3’(包含一个PagI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物inv-2：5’-CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3’(包含一个PstI酶切位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖水解酶基因inv2，用限制性内切酶PagI和Pst I酶切蔗糖水解酶基因inv2后，***到经NcoI和Pst I酶切的表达载体pSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-inv2。
2)蔗糖水解酶突变体基因Sinv2的获得
Sinv2基因是根据inv2基因序列信息从inv2基因的361位碱基开始设计引物来进行改造。以1)中构建的pSE-inv2为模板，使用上游引物Sinv：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3’(包含一个PagI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物inv-2进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，54℃15秒，72℃1.5分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物用限制性内切酶PagI和Pst I酶切后，***到经NcoI和Pst I酶切的表达载体pSE380，转化到XL1-Blue感受态细胞(CaCl2化学法转化)。转化产物克隆送交上海生物工程有限公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。
3)蔗糖水解酶突变体基因Sinv2的表达和表达产物的纯化
将含有质粒pSE-Sinv2的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD600为0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)30℃诱导10小时。11000转离心3min，收集菌体，用4mL裂解缓冲液(50mmol/LNaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，超声波破胞9min。12000转离心10min，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4ml上清液加入1mL 50％的镍亲和层析胶体，在4℃用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加1ml冲洗缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有一条目的大小的蛋白质条带。
4)蔗糖水解酶突变体Sinv2水解蔗糖酶活的测定
取5μL蔗糖水解酶突变体Sinv2纯化物，加入500μL 1％(w/v)蔗糖(溶于pH 7.0、100mmol/L的磷酸缓冲液中)溶液混合，在45℃作用30分钟后，加入1mL DNS溶液[DNS试剂配制：称取1克氢氧化钠用约40mL双蒸水溶解，再称取1克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mL双蒸水中，两种溶液混合，定容到100mL。]，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD600。利用吸光度测定值来计算酶活。
将获得的突变前的Inv2和突变后的Sinv2的酶活和最适pH的实验数据作图。结果发现：蔗糖水解酶突变体Sinv2的最适pH值由4.5提高到6.0，同时水解蔗糖的酶活提高1倍。
附图说明：
图1是蔗糖水解酶突变体Sinv2纯化物的SDS-PAGE图。
图2是蔗糖水解酶突变前后(Inv2和Sinv2)酶活及最适pH的比较图。
从图1了解到，蔗糖水解酶突变体Sinv2纯化物的分子量为51kDa。
从图2了解到，蔗糖水解酶突变前后(Inv2和Sinv2)酶活发生了显著的变化：突变后Sinv2的酶活是突变前Inv2的2倍；突变前最适pH为酸性4.5，突变后最适pH为中性6。提高水解蔗糖的速度，从而缩短发酵生产时间，对于降低利用蔗糖生产各种食品的生产成本具有十分重要的意义。
序列表
<110>广西科学院
<120>蔗糖水解酶的突变体及其应用
<160>1
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>586
<212>PRT
<213>土壤未培养微生物
<400>1
Phe Arg Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp Met Asn
1               5                   10                  15
Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly Glu Tyr His Leu Phe
16              20                  25                  30
Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met His Trp
31              35                  40                  45
Gly His Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Pro
46              50                  55                  60
Thr Ala Ile Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp Ile Phe Ser Gly Ser
61              65                  70                  75
Ala Val Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys Asn Ala
76              80                  85                  90
Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gln Gln Gln Cys
91              95                  100                 105
Ile Ala Tyr Ser Ile Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Glu
106             110                 115                 120
Lys Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Lys Asp Phe Arg Asp
121             125                 130                 135
Pro Lys Val His Trp Asn Glu Gln Ala Lys Gln Trp Val Met Ala
136             140                 145                 150
Leu Ala Thr Gln Gln Thr Ile Thr Phe Phe Gly Ser Pro Asp Leu
151             155                 160                 165
Lys Asn Trp Thr Arg Leu Ser Glu Phe Gly Lys Asn Tyr Gly Ala
166             170                 175                 180
His Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Pro Leu Glu Phe
181             185                 190                 195
Glu Gly Lys Thr Lys Trp Val Leu Leu Val Ser Ile Asn Pro Gly
196             200                 205                 210
Gly Pro Asn Gly Gly Ser Ala Thr Gln Tyr Phe Ile Gly Asp Phe
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Asp Gly Lys Thr Phe Ser Ala Asp Pro Leu Pro Tyr Pro Leu Trp
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241             245                 250                 255
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256             260                 265                 270
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286             290                 295                 300
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331             335                 340                 345
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346             350                 355                 360
Gly Leu Lys Asn Glu Leu Gly Asp Tyr Leu Asn Phe Thr Phe Asp
361             365                 370                 375
Trp Glu Gln Lys Ile Leu Lys Val Asp Arg Arg Asn Thr Gly Ile
376             380                 385                 390
Lys Glu Phe Ser Gln Lys Phe Ala Thr Glu Pro Phe Ala Pro Leu
391             395                 400                 405
Ala Lys His Asp Ser Tyr Thr Ile Arg Leu Phe Met Asp Lys Ala
406             410                 415                 420
Ser Ser Glu Ile Phe Ile Asn Asp Gly Glu Thr Val Leu Thr Asn
421             425                 430                 435
Leu Val Phe Pro Ser Gln Thr Tyr Lys  Ser Leu Thr Phe Phe Thr
436             440                 445                 450
Ala Asn Lys Pro Trp Asn Val Glu Asn Leu Lys  Ile Phe Glu Ile
451             455                 460                 465
Lys
466

Claims (3)

1.一种蔗糖水解酶突变体，其特征在于：具有SEQ ID NO：1氨基酸序列：
(1)序列特征：
i.长度：466氨基酸
ii.类型：多肽
iii.链型：单链
iv.几何结构：立体
(2)分子类型：蛋白质
(3)序列描述：
Phe Arg Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp Met Asn
1                5                  10                  15
Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly Glu Tyr His Leu Phe
16              20                  25                  30
Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met His Trp
31              35                  40                  45
Gly His Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Pro
46              50                  55                  60
Thr Ala Ile Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp Ile Phe Ser Gly Ser
61              65                  70                  75
Ala Val Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys Asn Ala
76              80                  85                  90
Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gln Gln Gln Cys
91              95                  100                 105
Ile Ala Tyr Ser Ile Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Glu
106             110                 115                 120
Lys Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Lys Asp Phe Arg Asp
121             125                 130                 135
Pro Lys Val His Trp Asn Glu Gln Ala Lys Gln Trp Val Met Ala
136             140                 145                 150
Leu Ala Thr Gln Gln Thr Ile Thr Phe Phe Gly Ser Pro Asp Leu
151             155                 160                 165
Lys Asn Trp Thr Arg Leu Ser Glu Phe Gly Lys Asn Tyr Gly Ala
166             170                 175                 180
His Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Pro Leu Glu Phe
181             185                 190                 195
Glu Gly Lys Thr Lys Trp Val Leu Leu Val Ser Ile Asn Pro Gly
196             200                 205                 210
Gly Pro Asn Gly Gly Ser Ala Thr Gln Tyr Phe Ile Gly Asp Phe
211             215                 220                 225
Asp Gly Lys Thr Phe Ser Ala Asp Pro Leu Pro Tyr Pro Leu Trp
226             230                 235                 240
Val Asp Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Ala Gly Val Thr Phe Ser Asn
241             245                 250                 255
Ile Gly Lys Asn Asp Gly Arg Arg Ile Phe Met Gly Trp Met Ser
256             260                 265                 270
Asn Trp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Pro Thr Lys Ser Phe Arg Asn
271             275                 280                 285
Ala Met Thr Leu Pro Arg Glu Leu Lys Leu Ala Ser Asn Gly Gln
286             290                 295                 300
His Leu Ile Leu Thr Ser Ala Pro Val Ser Glu Val Thr Lys Leu
301             305                 310                 315
Arg Gly Lys Ser Gly Glu Thr Ile Asn Ile Leu Val Asn Ser Glu
316             320                 325                 330
Lys Ser Ile Thr Asn Val Leu Gln Asp Phe Asn Gly Lys Phe Glu
331             335                 340                 345
Leu Asn Met Thr Ile Gln Arg Lys Asp Ala Lys Val Trp Gly Phe
346             350                 355                 360
Gly Leu Lys Asn Glu Leu Gly Asp Tyr Leu Asn Phe Thr Phe Asp
361             365                 370                 375
Trp Glu Gln Lys Ile Leu Lys Val Asp Arg Arg Asn Thr Gly Ile
376             380                 385                 390
Lys Glu Phe Ser Gln Lys Phe Ala Thr Glu Pro Phe Ala Pro Leu
391             395                 400                 405
Ala Lys His Asp Ser Tyr Thr Ile Arg Leu Phe Met Asp Lys Ala
406             410                 415                 420
Ser Ser Glu Ile Phe Ile Asn Asp Gly Glu Thr Val Leu Thr Asn
421             425                 430                 435
Leu Val Phe Pro Ser Gln Thr Tyr Lys Ser Leu Thr Phe Phe Thr
436             440                 445                 450
Ala Asn Lys Pro Trp Asn Val Glu Asn Leu Lys Ile Phe Glu Ile
451             455                 460                 465
Lys。
466
2.一种宿主细胞，其是含有权利要求1所述蔗糖水解酶突变体的原核细胞或真核细胞。
3.权利要求1所述的突变体蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。
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CN109486793A (zh) * 2018-11-27 2019-03-19 江南大学 一种蔗糖水解酶突变体及其制备方法与应用
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