CN112481245B

CN112481245B - 一种重组d-塔格糖3差向异构酶dte-cm及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN112481245B
Application number: CN202011289022.6A
Authority: CN
Inventors: 齐向辉; 王洋; 张国艳; 员君华; 张宇飞; 袁娇
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Zhenjiang Baitai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112481245A

Abstract

本发明提供了一种重组D‑塔格糖3差向异构酶DTE‑CM及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，利用基因工程手段，构建重组了D‑塔格糖3差向异构酶，并将其核苷酸序列经过密码子优化，所述重组D‑塔格糖3差向异构酶具有优良的酶学特性，是制备高附加值稀有糖D‑阿洛酮糖的良好来源酶，更有利于D‑阿洛酮糖的工业化生产。

Description

一种重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM及其构建方法和应用。

背景技术

D-阿洛酮糖，也称为D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖的C-3差向异构体，其不仅仅具有低热值的特点，在降血糖、抗高脂血症、消炎和神经保护领域中也有着很好的应用。除此之外，D-阿洛酮糖还能够抗活性氧活性。因此，可将D-阿洛酮糖作为治疗剂应用于医疗保健行业。

但是，D-阿洛酮糖在自然界中含量很少，目前主要通过化学法和生物法来合成。化学法中通过加氢、加成反应、Ferrier重排等来合成D-阿洛酮糖，但是在合成过程中需要加入催化剂。成本较高，工艺复杂且副反应多、对环境不友好，不利于大规模生产。生物法通过使用酶法，如D-塔格糖3差向异构酶（DTEase）家族，来转化生产D-阿洛酮糖。采用酶法合成D-阿洛酮糖能够有效克服化学法的上述缺陷，但是由于在生产D-阿洛酮糖时需要酸性环境来抑制糖类的褐变效应并降低副产物的形成，而现有技术中存在的DTEase家族酶大多在碱性、较低温度下酶活较高，这极大的限制了其在生物法生产D-阿洛酮糖中的应用。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组D-塔格糖3差向异构酶及其构建方法和应用。在本发明中，利用基因工程手段，构建重组了D-塔格糖3差向异构酶，并将其核苷酸序列经过密码子优化，所述重组D-塔格糖3差向异构酶具有优良的酶学特性，是制备高附加值稀有糖D-阿洛酮糖的良好来源酶，更有利于D-阿洛酮糖的工业化生产。

本发明首先提供了一种重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM，编码重组D-塔格糖3差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

进一步的，将编码重组D-塔格糖3差向异构酶的基因进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

本发明中还提供了上述重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM的构建方法，具体包括如下步骤：

（1）重组D-塔格糖3差向异构酶转化子的构建：

PCR扩增合成优化序列后的目的基因dte-Cm，然后利用无缝克隆技术将目的基因整合到表达载体pANY1的多克隆位点上，利用化学转化法转入感受态E.coliRosetta细胞、筛选阳性克隆以及测序成功获得重组D-塔格糖3差向异构酶转化子E.coliRosetta /pANY1-cm-dte。

（2）重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM的表达和纯化：

将得到的E.coli Rosetta / pANY1-Cm-dte在LB培养基里培养，然后加入诱导剂IPTG，在低温低速下培养过夜，接着收集细胞经超声破碎释放重组蛋白，利用Ni²⁺-NTI柱纯化，获得纯化后的重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM。

进一步的，步骤（1）中，所述PCR的反应参数为：预变性98℃ 3 min；变性98℃ 30s；退火58℃ 30 s；延伸72℃ 45s；终延伸72℃ 5 min；34个循环。

进一步的，步骤（2）中，所述E.coliRosetta / pANY1-cm-dte在LB培养基里培养的条件为37 ℃、200 rpm振荡培养至OD为0.6-0.8。

进一步的，步骤（2）中，所述IPTG在培养基中的终浓度为1mM。

进一步的，步骤（2）中，所述低温低速下培养过夜为在25 ℃、150 rpm下培养过夜。

进一步的，步骤（2）中，所述Ni²⁺-NTI柱为1.0x10.0 mm。

本发明中还提供了上述重组D-塔格糖3差向异构酶在以D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖中的应用。

进一步的，所述应用包括如下步骤：向D-果糖溶液中加入纯化的重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM和Ni²⁺，在50-60℃范围内反应，然后升温至100℃，离心获取上清，得到含有产物D-阿洛酮糖的混合液。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明中，构建了E.coliRosetta / pANY1-cm-dte 重组子，实现了D-塔格糖3差向异构DTE-CM在大肠杆菌里高效表达，获得了大量纯净的D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM。

（2）本发明构建的重组酶D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM，来源于Christensenella minuta一种和人体肥胖相关的肠道菌，不仅来源安全，而且此酶具有优良的酶学特性，能够在pH为酸性的环境下显示出较高的催化活性。并且，该酶在以D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖时能够有效解决现有技术制备过程中存在的褐变效应、副产物多等缺陷，为生物法生产D-阿洛酮糖的工业化提供了不错的酶源。

（3）本发明所述重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM，在pH 6.0、50℃且含有1mM Ni2+的环境下能够高效的将D-果糖用来转化生产D-阿洛酮糖，转化率为30%。是目前为止报道了相同功能酶里面在酸性条件下转化率最高的。

附图说明

图1为D-塔格糖家族酶催化D-果糖和D-塔格糖的可逆反应。

图2为目的基因dte-Cm pCR扩增结果。

图3为DTE-CM的表达及纯化结果。

图4为DTE-CM的进化树分析结果。

图5为DTE-CM的氨基酸对比分析结果。

图6为DTE-CM反应物经HPLC检测结果。

图7为离子种类（A）和Ni²⁺ （B）离子浓度对酶学性质研究结果。

图8为温度、pH 对DTE-CM的酶活和稳定性的影响；其中，A为DTE-CM在不同温度下的相对酶活性，B为DTE-CM在不同温度下的稳定性试验结果，C为DTE-CM在不同pH值下的相对酶活性，D为DTE-CM在不同pH下的稳定性试验结果。

图9为DTE-CM以不同浓度底物D-果糖进行转化的结果。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

在本发明中，实施例中所涉及的重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM酶活性单位被定义为：在pH6.0和50℃下催化每分钟生成1µmol D-阿洛酮糖的酶量。测定方法如下：在1mL的反应体系里含有1 mM Ni²⁺、50 g/L D-果糖、50 mM pH 6.0的磷酸钠缓冲液和终浓度为0.5µM DTE-CM，在50℃下持续反应10 min。然后沸水浴10分钟以终止反应。将反应样品在13000 rmp下离心4 min，收集上清液过0.22μm的滤膜并使用HPLC进行检测D-阿洛酮糖的生成量。

HPLC条件：岛京光示差检测器RID-250、色谱柱为安捷伦HPLX-Ca（300 X 7.7 mm）、纯水做流动相，检测温度84℃，流速为0.6ml/min.

实施例中纯化部分所涉及的缓冲溶液的配方如下：

裂解缓冲液：50 mM 磷酸盐缓冲液, 150 mM NaCl, 1 mM DTT（二硫苏糖醇）, pH7.0；

平衡缓冲液：50mM 磷酸盐缓冲液, 500 mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0；

洗涤缓冲液：50mM磷酸盐缓冲液, 500 mM NaCl, 50 mM 咪唑, 1mM DTT, pH7.0；

洗脱缓冲液：50mM 磷酸盐缓冲液, 150 mM NaCl, 300 mM 咪唑, 1mM DTT, pH7.0。

实施例1：重组子E.coliRosetta / pANY1-cm-dte的构建

（1）以Genbank数据库公开的Christensenella minuta假定的编码D-塔格糖3差向异构酶的dte基因序列（NCBI 登录号：NZ_CP029256.1）SEQ NO：1所示，结合大肠杆菌密码子的偏好性，为使dte-cm能更好地表达，对原始序列进行优化，优化的基因序列SEQ NO：3所示。将优化后的序列提交给苏州金唯智科技有限公司进行基因合成。

（2）根据载体pANY1上多克隆位点序列及同源臂的特征，利用生物信息学PrimerPremier 5软件设计上游引物F: 5’-ACATCAGCCGTAGGATCCATGAAATACGGTTTATTGTACCATTATT-3’ 和下游引物R: 5’- GGGGACGTCGACTCTAGACTAGTGATGATGATGGTGATGCG -3’（下划线部分是与pANY1质粒序列相同的部分），并交给苏州金唯智科技有限公司合成引物。

（3）以公司合成的dte-Cm基因为模板，利用NEB Q5高保真聚合酶PCR扩增目的基因。所述PCR反应条件为：预变性：98 ℃、3 min，变性：98 ℃、30 s，退火：58 ℃、30 s，延伸：72 ℃、45s，终延伸：72 ℃、5 min，34个循环。

（4）所得的PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为0.9 Kb的电泳条带，如图2所示，将PCR产物利用产物纯化试剂盒获得纯化的dte基因。

（5）pANY1质粒经 BamH1和Xba1双酶切线性化后利用切胶纯化获得线性化质粒，按照无缝克隆试剂盒的方法将步骤（3）中的dte基因与线性化质粒进行重组质粒构建；通过化学转化方法将重组质粒转化于感受态E.coli 中，通过PCR验证、提取质粒验证以及测序验证筛选转化成功的阳性克隆子，保存并命名为E.coli Rosetta / pANY1-cm-dte。

实施例2：重组D-塔格糖3差相异构酶DTE-CM的诱导表达及纯化

将重组子E.coliRosetta /pANY1-cm-dte接种于LB培养基（酵母粉10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、氯化钠20 g/L）中，37 ℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀至0.6-0.8之间，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导，25 ℃、150 rpm低速过夜诱导表达DTE-CM，利用SDS-PAGE检测DTE-CM的表达情况，以不加IPTG诱导的重组菌为空白对照，如图3所示。

为纯化DTE-CM，用0.85%NaCl溶液洗涤离心后的细胞两次，并在裂解缓冲液中重新悬浮，并使用超声波仪在400w，工作1.5s，间歇2.5s的条件下超声处理10 min，在4℃和8000g下离心30分钟以去除细胞碎片，并通过0.22μm过滤器过滤上清液。将滤液装载到Ni²⁺-NTI柱上，并用5个柱体积的平衡缓冲液平衡。用5个柱体积的洗涤缓冲液从柱上洗脱未结合蛋白质。然后，使用10个柱体积的洗脱缓冲液从柱上洗脱重组DTE-CM。使用Amicon Ultra 15超滤管和50 mM pH 7.0磷酸钠缓冲液对DTE-CM进行脱盐和浓缩处理。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白纯度。

图3为DTE-CM的表达及纯化结果，图中M为蛋白的Maker，1为未加IPTG诱导的重组子大肠杆菌细胞蛋白胶图，2为加入IPTG诱导重组子大肠杆菌细胞蛋白胶图；3为经过纯化后的DTE-CM纯酶蛋白胶图。从图中可以看出，得到了一条大小为33kDa的单一纯净的蛋白条带。以牛血清白蛋白为标准，用Bradford法测定蛋白质浓度。然后将纯化后的纯酶样品加入终浓度15%甘油-80℃低温保存。

将DTE-CM的氨基酸序列进行同源性分析与已经成功鉴别的D-塔格糖3差向异构酶家族进行对比，构建***发育树，如图5所示，DTE-CM与来源于R. cellulolyticum 和 C. bolteae 酶同源性最高为42.9 %；如图6所示，通过氨基酸序列对比，重组D-塔格糖3差向异构酶的活性位点具有严格的保守性，其中DTE-CM的金属结合位点Glu150, Asp183, His209和 Glu244 完全保守，说明D-塔格糖3差向异构酶家族局域相同的催化机理。

实施例3：

取200μL纯化的D-塔格糖3差相异构酶DTE-CM 加入到50g/L的D-果糖磷酸盐缓冲液中，pH 6.0,50℃反应30min。沸水浴10分钟终止反应。13000rmp离心4min，收集上清液过0.22μm的滤膜，利用HPLC检测是否有D-阿洛酮糖产生。

如图4所示，DTE-CM反应物在22.5min处有明显的峰，与D-阿洛酮糖标品出峰时间一致，表明有D-阿洛酮糖生成，这说明了重组的D-塔格糖3差相异构酶DTE-CM具有催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的能力。

实施例4：

为了探讨D-塔格糖3差向异构酶酶学性质，本实施例中分别研究了D-塔格糖3差向异构酶在不同金属离子及浓度、不同温度、pH环境下的酶活情况。

（1）金属离子对DTE-CM酶活性的影响：

设置多组试验，将50 g/L D-果糖、50 mM pH 6.0磷酸钠缓冲液混合，然后分别加入终浓度为1mM的Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺，最后加入0.5µM DTE-CM混合反应，在4 ℃下孵育30分钟，然后50 ℃反应10 min分析DTE-CM对金属离子的相对活性。以Ni²⁺测得的活性为表示为100 %，来分析其他金属离子环境下DTE-CM的酶活性。

图7A是不同金属离子环境下DTE-CM的酶活性，从图中可以看出在没有金属离子存在的情况下DTE-CM没有任何活性，说明DTE-CM是一种严格金属离子依赖酶，只有二价金属离子存在的时候才具有活性，同时Cu²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺对酶的活力没有促进作用，金属离子Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺能提高酶活性，其中Ni2+促进能力最强，可见，DTE-CM的最适金属离子为Ni²⁺。

基于上述试验的基础上，本实施例在浓度0-5 mM的范围内探讨了Ni²⁺离子的浓度对DTE-CM的酶活性的影响。图7B为不同浓度Ni²⁺离子环境下DTE-CM的酶活性，从图中可以看出在0-1 Mm之间酶活性随着Ni²⁺ 浓度的增加而增加，浓度为1 Mm时活性最大，当Ni²⁺离子浓度在1-5 mM 时酶活性趋于稳定，可见，Ni²⁺的最适浓度为1mM。

（2）温度对DTE-CM酶活性的影响：

设置多组试验，将DTE-CM孵育在50 mm，pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别探讨了DTE-CM在30～80℃下的酶活性。如8A所示，DTE在50 ℃时具有最大的催化活力。图8B不同的温度和时间间隔下测得DTE的相对酶活，从图中可知DTE-CM在40℃下是比较稳定的，当温度大于50℃，DTE-CM很容易失去活性。同时考察了金属离子Ni²⁺对DTE-CM 热稳定性的影响，加入Ni²⁺ DTE-CM与未加入Ni²⁺在50℃下的半衰期进行对比发现Ni²⁺能很大程度上增加其热稳定性。

（3）pH对DTE-CM酶活性的影响：

使用的不同缓冲液是醋酸盐缓冲液pH 5.0-5.5、磷酸盐缓冲液pH 6.0-7.5和Tris–HCl缓冲液50 mM，pH 8.0-9.0。在不同pH值下进行了酶活性测定。在pH稳定性分析中，纯化酶在pH 5.0-8.0，4 ℃下孵育2h，在标准检测条件下测定其活性。结果如图8C示，DTE-CM在pH为6.0的时候活性最高。图8D显示DTE-CM分别在不同pH下4 ℃处理2 h，然后测的相对酶活，以未处理的酶活性100%,有图可知DTE-CM在不同pH下是相对稳定的。

实施例5：

在实施例4中得出的最佳条件下，分别将含有100 g/L、300 g/L、500 g/L D-果糖和5 mM DTE-CM进行酶促合成D-阿洛糖，每隔20分钟测定一次酶转化的过程曲线，直到反应达到平衡为止。

图9为DTE-CM以不同浓度底物D-果糖进行转化的结果，从图中可以看出，三种浓度D-果糖分别在1.5、4和10 h后达到平衡，经HPLC 分析分别得到30.2、90.3和156 g/L的D-阿洛酮糖，计算该酶转化D-果糖生成D-阿洛酮糖的转化率，结果显示为30 %。由此可见，利用本发明的D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM能够以D-果糖为底物高效转化合成D-塔格糖的特点，且能够在酸性条件下完成这一转化，所以本发明所述重组D-塔格糖3差向异构酶可用于高附加值D-阿洛酮糖的工业化生产。

实施例6：

本实施例中在pH 6.0，50 ℃和1 mM Ni²⁺ 条件下研究了DTE-CM的动力学参数，分别以不同浓度（5–400 mM）的D-果糖、D-阿洛糖、D-塔格糖和D-山梨糖做底物来研究DTE-CM酶对不同底物的特异性和动力学参数，结果如表1所示。

表1. DTE-CM在不同底物下的动力系学参数和相对活力

底物	<i>K</i><sub><i>m</i></sub>(mM)	<i>K</i><sub><i>cat</i></sub>(min<sup>-1</sup>)	<i>K</i><sub><i>cat</i></sub><i>/K</i><sub><i>m</i></sub>(mM<sup>-1</sup>min<sup>-1</sup>)	Relative activity (%)
					D-果糖	94.7±1.2	4230±34	45±4.5	26±1.8
D-阿洛酮糖	53.8±3.4	6572±44	124±6.3	68±0.5
					D-塔格糖	34.9±1.6	9318±36	267±3.1	100±0.4
D-山梨糖	66.8±2.6	5874±29	89±2.9	40.2±1.2

从表1中可以看出，DTE-CM能够分别以D-果糖，D-阿洛酮糖，D-山梨糖和D-塔格糖为底物进行可逆化的c-3位异构化反应，但是DTE-CM对D-塔格糖的相对活力最高，对D-果糖的相对活力最低。通过双倒数曲线对DTE-CM的动力学参数进行分析， DTE-CM对果糖的K _m,K _cat, K _cat/K _m值分别是94.7 mM、4230 min^-1和45 mM^-1min^-1。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM及其构建方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> D-塔格糖3差相异构酶(Christensenella minuta)

<400> 1

atgaaatacg gtttattgta ccattattgg tcggacggct ggtcctgcga ttacccgaag 60

accgcggaaa agatcaaaaa ggccgggttc gatgtgatgg agatcggcgg agaccatctg 120

agcaggatga acgcggcgga gatggacgcg ctcaggcggg cggccgtgga ccttggcctc 180

gagctgtccg tcaatatcgg tccggcacgc gaccaggacc ttgcttccga agacaaagcc 240

acgcgggagc atgggatcgc ttacctcacg gacgtgctga agcggatgga cggcatcggc 300

tgcaggatga tgatcggcgc gctgtatacc ttctggccgg cggatttcag cgtcgaaaac 360

gacaaggaac gtgcgtggga ccgttccatc gattcccttc gggaactcgc ccgggccgcg 420

gaggatcttg gctccacctg ttccctcgag atcctgaacc gctatgaggg ttatatcctc 480

aacacctgcg aagaggggct tcggtacctc gagcgtatcg gcagcccaag catgaagctt 540

ttgcttgaca ccttccatat gagcatcgag gaggacagcc ttcccggagc aatccgcctt 600

gcaggcagcc ggctcgggca tatgcacctc ggggaaggca accgcaagct gcccggcctc 660

ggttccctgc cgtgggcgga gatcggccag gccctgcgcg acgcgcattt cgacggtttt 720

gcggtcatcg agcctttcat gcgctacggc gggcagatcg caaaggatat acacttgtgg 780

cacgatttct tccccggcgc tacggaagcg gagatggacc ggatgctggc cgattcactc 840

gccttcctga aacagcattt cgaggcgtag 870

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Tyr Gly Leu Leu Tyr His Tyr Trp Ser Asp Gly Trp Ser Cys

1 5 10 15

Asp Tyr Pro Lys Thr Ala Glu Lys Ile Lys Lys Ala Gly Phe Asp Val

20 25 30

Met Glu Ile Gly Gly Asp His Leu Ser Arg Met Asn Ala Ala Glu Met

35 40 45

Asp Ala Leu Arg Arg Ala Ala Val Asp Leu Gly Leu Glu Leu Ser Val

50 55 60

Asn Ile Gly Pro Ala Arg Asp Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Lys Ala

65 70 75 80

Thr Arg Glu His Gly Ile Ala Tyr Leu Thr Asp Val Leu Lys Arg Met

85 90 95

Asp Gly Ile Gly Cys Arg Met Met Ile Gly Ala Leu Tyr Thr Phe Trp

100 105 110

Pro Ala Asp Phe Ser Val Glu Asn Asp Lys Glu Arg Ala Trp Asp Arg

115 120 125

Ser Ile Asp Ser Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ala Ala Glu Asp Leu Gly

130 135 140

Ser Thr Cys Ser Leu Glu Ile Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Asn Thr Cys Glu Glu Gly Leu Arg Tyr Leu Glu Arg Ile Gly Ser Pro

165 170 175

Ser Met Lys Leu Leu Leu Asp Thr Phe His Met Ser Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Leu Pro Gly Ala Ile Arg Leu Ala Gly Ser Arg Leu Gly His Met

195 200 205

His Leu Gly Glu Gly Asn Arg Lys Leu Pro Gly Leu Gly Ser Leu Pro

210 215 220

Trp Ala Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ala His Phe Asp Gly Phe

225 230 235 240

Ala Val Ile Glu Pro Phe Met Arg Tyr Gly Gly Gln Ile Ala Lys Asp

245 250 255

Ile His Leu Trp His Asp Phe Phe Pro Gly Ala Thr Glu Ala Glu Met

260 265 270

Asp Arg Met Leu Ala Asp Ser Leu Ala Phe Leu Lys Gln His Phe Glu

275 280 285

Ala

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatga aatacggttt attgtaccat tattggtcgg acggctggtc ctgcgattac 60

ccgaaaacgg cggagaagat caagaaggcc ggcttcgatg tgatggaaat cggcggcgat 120

catctgagcc gcatgaatgc ggcggaaatg gatgcgctgc gtcgtgcggc ggttgatctg 180

ggtctggaac tgagcgttaa catcggtccg gcccgtgatc aagatctggc gagtgaagac 240

aaagcgaccc gcgaacacgg catcgcctat ctgaccgatg tgctgaaacg catggatggc 300

atcggctgcc gcatgatgat cggcgcgctg tataccttct ggccggcgga cttcagcgtg 360

gaaaacgata aagagcgcgc gtgggatcgc agcattgaca gtctgcgtga actggcccgt 420

gcggcggaag atctgggtag tacgtgcagt ctggaaattc tgaaccgcta cgagggctac 480

attctgaata cgtgcgaaga aggtctgcgc tatctggaac gcatcggtag cccaagcatg 540

aaactgctgc tggacacctt ccacatgagc atcgaggagg atagtctgcc gggcgcgatt 600

cgtctggccg gtagccgtct gggtcatatg catctgggcg aaggcaaccg caaactgccg 660

ggtctcggta gtctcccatg ggcggaaatt ggccaagcgc tgcgtgatgc gcatttcgac 720

ggtttcgcgg tgatcgaacc gtttatgcgc tacggcggcc agattgcgaa ggatatccat 780

ctgtggcacg acttcttccc gggtgccacg gaagcggaga tggaccggat gctggccgat 840

tcactcgcct tcctgaaaca gcatttcgag gcgcatcacc atcatcatca ctagtctaga 900

Claims

1.重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM在以D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖中的应用，编码所述重组D-塔格糖3差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：向D-果糖溶液中加入纯化的重组D-塔格糖3差向异构酶DTE-CM和Ni²⁺，在50-60℃范围内反应，然后升温至100℃，离心获取上清，得到含有产物D-阿洛酮糖的混合液。