CN110144340B

CN110144340B - 一种壳聚糖酶CsnQ及其应用

Info

Publication number: CN110144340B
Application number: CN201910454263.2A
Authority: CN
Inventors: 杨文钰
Original assignee: Zaozhuang Quanding Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zaozhuang Quanding Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN110144340A

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖酶CsnQ及其应用。所述壳聚糖酶CsnQ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种壳聚糖酶CsnQ的制备方法，产量高达1058.2U/mL。本发明所述壳聚糖酶CsnQ性质稳定，最适反应温度为60℃，在pH 4.0‑6.0之间保持稳定，40℃孵育1h仍然保持61.2％的活性。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。本发明所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

Description

一种壳聚糖酶CsnQ及其应用

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖酶CsnQ及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳寡糖具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等重要生物活性，被誉为“生命的第六元素”。壳寡糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通过β-l,4-糖苷键连接而成，分子量小于3900，聚合度小于20，极易溶于水，在医药、保健品、食品、养殖等领域比大分子壳聚糖有更大的应用价值。

壳寡糖是由大分子的壳聚糖降解而成。通常降解方法分为物理法、化学法和生物酶法降解三种类型。其中生物酶学降解具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势。利用壳聚糖酶生物酶法降解大分子壳聚糖逐渐成为壳寡糖制备过程中的主流方法。但是，目前市场上销售的壳聚糖酶价格昂贵、活力较低，且稳定性较差，严重限制了壳聚糖酶的应用前景。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种壳聚糖酶CsnQ及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶CsnQ产量高达1058.2U/mL，最适反应温度为60℃，在pH4.0-6.0之间保持稳定，40℃孵育1h仍然保持61.2％的活性，多种金属离子对壳聚糖酶CsnQ的酶活具有促进作用。降解方式为内切，降解主产物为壳二糖和壳三糖。本发明所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

一方面，本发明提供一种壳聚糖酶CsnQ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMGVGGTGATHAGAAGSGVNLTDPHKKEIAMELVSSAENSSLDWKAQYKYIEDIGDGRGYTGGIIGFCSGTGDMLELVQHYTDLEPGNILAKYLPALKKVNGSASHSGLGTPFTKDWATAAKDTVFQQAQNDERDRVYFDPAVSQAKADGLRALGQFAYYDAIVMHGPGNDPTSFGGIRKTAMKKARTPAQGGDETTYLNAFLDARKAAMLTEAAHDDTSRVDTEQRVFLKAGNLDLNPPLHWKTYGDSYSINSLEHTTTPLRSGC

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnQ对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGAAATACTTATTACCAACAGCAGCAGCAGGTTTATTATTATTAGCAGCACAACCAGCAATGGCAATGGGTGTAGGTGGTACAGGTGCAACACATGCAGGTGCAGCAGGTTCTGGTGTAAACTTAACAGATCCACATAAAAAAGAAATTGCAATGGAATTAGTATCTTCTGCAGAAAACTCTTCTTTAGATTGGAAAGCACAATACAAATACATTGAAGATATTGGTGATGGTCGTGGTTACACAGGTGGTATTATTGGTTTCTGTTCTGGTACAGGTGATATGTTAGAATTAGTACAACATTACACAGATTTAGAACCAGGTAACATTTTAGCAAAATACTTACCAGCATTAAAAAAAGTAAACGGTTCTGCATCTCATTCTGGTTTAGGTACACCATTCACAAAAGATTGGGCAACAGCAGCAAAAGATACAGTATTCCAACAAGCACAAAACGATGAACGTGATCGTGTATACTTCGATCCAGCAGTATCTCAAGCAAAAGCAGATGGTTTACGTGCATTAGGTCAATTCGCATACTACGATGCAATTGTAATGCATGGTCCAGGTAACGATCCAACATCTTTCGGTGGTATTCGTAAAACAGCAATGAAAAAAGCACGTACACCAGCACAAGGTGGTGATGAAACAACATACTTAAACGCATTCTTAGATGCACGTAAAGCAGCAATGTTAACAGAAGCAGCACATGATGATACATCTCGTGTAGATACAGAACAACGTGTATTCTTAAAAGCAGGTAACTTAGATTTAAACCCACCATTACATTGGAAAACATACGGTGATTCTTACTCTATTAACTCTTTAGAACATACAACAACACCATTACGTTCTGGTTGT

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnQ的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶CsnQ在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnQ。

优选：所述降解条件中反应温度为0～80℃。最适反应温度为60℃。

优选：所述降解条件中反应pH为4.0～9.6。最适反应pH为5.0。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶CsnQ为新颖的壳聚糖酶，其保守区与已有结构报道的壳聚糖酶(PDB：1CHK)氨基酸序列相似度为96.63％，基本一致，使得其保持了良好的催化活性(比活力达到690.5U/mg)；本发明所述壳聚糖酶CsnQ与已有结构报道的壳聚糖酶(PDB：1CHK)序列差异主要表现为：壳聚糖酶CsnQ包含有287个氨基酸序列，而壳聚糖酶(PDB：1CHK)只包含有238个氨基酸序列。本发明所述壳聚糖酶CsnQ的N端包含一段39个氨基酸(Met¹-Gly³⁹)组成的N-trunk结构，其C段包含9个氨基酸的C-tail结构(His²⁷⁸-Cys²⁸⁷)。两者包含有多种刚性氨基酸，增加了壳聚糖酶的三维结构的刚性，是其具有较好稳定性的结构基础。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶CsnQ的方法，即利用基因工程的技术方法，将壳聚糖酶CsnQ的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达1058.2U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达79.6％，蛋白质纯度高达95％。

3.本发明的壳聚糖酶CsnQ具有优良的理化性质，最适pH为5.0，在pH 4.0-6.0范围内保持稳定，40℃孵育1h仍然保持61.2％的活性，多种金属离子对壳聚糖酶CsnQ的酶活具有促进作用。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。本发明所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶CsnQ与已知壳聚糖酶序列之间的进化关系结果；

图2为本发明壳聚糖酶CsnQ的蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化前样品，2，纯化所得壳聚糖酶CsnQ)；

图3为本发明壳聚糖酶CsnQ的温度和pH适应性分析(A，壳聚糖酶CsnQ的最适反应温度；B，壳聚糖酶CsnQ的温度稳定性；C，壳聚糖酶CsnQ的最适反应pH；D，壳聚糖酶CsnQ的pH稳定性)；

图4为薄层层析(TLC)法检测本发明壳聚糖酶CsnQ的降解方式和酶解产物(M，壳寡糖DP1-4，壳寡糖1-4糖标准品)；

图5为阴离子一级质谱法检测本发明壳聚糖酶CsnQ的降解产物。

具体实施方式

实施例1壳聚糖酶CsnQ的序列分析

本发明所述壳聚糖酶CsnQ的产酶基因csnQ为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Vibrio sp.Q108具有较高的壳聚糖酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的壳聚糖酶序列。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主(大肠杆菌的)的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。序列合成在华大基因公司进行。本发明所述壳聚糖酶CsnQ包含有861个碱基序列，编码287个氨基酸序列。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，该序列包含有一个多糖水解酶第46家族(GH-46)的保守区。本发明的壳聚糖酶CsnQ保守区氨基酸序列与已有晶体结构报道的壳聚糖酶(PDB：1CHK)序列相似度为96.63％，基本保持一致，使得其保持了良好的催化活性(比活力达到690.5U/mg)；与本发明所述壳聚糖酶CsnQ与已有晶体结构报道的壳聚糖酶(PDB：1CHK)序列差异主要表现为：壳聚糖酶CsnQ包含有287个氨基酸序列，而壳聚糖酶(PDB：1CHK)只包含有238个氨基酸序列。壳聚糖酶CsnQ的N端包含一段39个氨基酸(Met¹-Gly³⁹)组成的N-trunk结构，其C段包含9个氨基酸的一段C-tail结构(His²⁷⁸-Cys²⁸⁷)，两者包含有多种刚性氨基酸，增加了壳聚糖酶的三维结构的刚性，是本发明所述壳聚糖酶CsnQ具有较好稳定性的结构基础。

本发明所述的壳聚糖酶CsnQ与同属于同一家族(GH46)的氨基酸序列进行Blast分析，利用ClustalX软件进行多重序列比对，并利用Mega 7.1软件进行进化树分析。如图1所示，壳聚糖酶CsnQ与其他已经报道的壳聚糖酶具有较远的亲缘关系，为一个新颖的壳聚糖酶。

将壳聚糖酶CsnQ的碱基序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：PcsnQ-F：

5’-CATGCCATGG ATGAAATACTTATTACCAAC-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PcsnQ-R：

5’-CCGCTCGAGACAACCAGAACGTAATGGT-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-csnQ。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-csnQ，保存在-80℃备用。

实施例2壳聚糖酶CsnQ的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-csnQ在100mL的LB液体培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导20h。壳聚糖酶CsnQ活性的标准测定方法为：100μL酶液加入900μL 0.3％壳聚糖底物(20mM醋酸-醋酸钠，pH＝5.9)，在60℃下反应10min，加入750μL的DNS试剂，沸水中反应10min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达1058.2U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5mL/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到79.6％。

纯化所得壳聚糖酶CsnQ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图2所示，壳聚糖酶CsnQ的分子量为27kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶CsnQ的蛋白纯度达到95％以上。

实施例3温度和pH对壳聚糖酶CsnQ的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-80℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下壳聚糖酶CsnQ的相对酶活力。如图3A所示，壳聚糖酶CsnQ的最适反应温度为60℃。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ在不同温度(0-80℃)下孵育1h，取出后，在其最适反应温度(60℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3B所示，壳聚糖酶CsnQ温度稳定性较好，在40℃下孵育1h，酶活性可达到孵育前的61.2％。

在不同pH的三种不同缓冲液(50mM，Sodium acetate buffer，Phosphate buffer，Gly-NaOH buffer)下检测实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ的活性，酶活性最高值为100％。如图3C所示，壳聚糖酶CsnQ的最适反应pH为5.0。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ在不同pH条件下孵育24h，取出后，立即在其最适反应pH(5.0)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3D所示，壳聚糖酶CsnQ在pH 4.0-6.0的范围内活力可保持80％以上。

实施例4不同金属离子对壳聚糖酶CsnQ的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ在酶活力测定过程中添加5mM的不同金属离子，孵育24h，在壳聚糖酶CsnQ的标准测活条件下，检测不同金属离子对壳聚糖酶CsnQ酶活力的影响，以不添加金属离子的酶液作为对照，由表1所示，多种金属离子对壳聚糖酶CsnQ酶活力具有一定的促进作用。

表1不同金属离子对本发明壳聚糖酶CsnQ酶活力的影响

离子	浓度(mM)	相对酶活力(％)
			None	--	100
铝离子	5	48±10.1
			三价铁离子	5	88±2.6
钾离子	5	101±4.3
			钠离子	5	104±3.9
镁离子	5	106±0.7
			锂离子	5	106±3.3
铵离子	5	107±3.1
			二价铁离子	5	108±2.6
铜离子	5	108±3.3
			钡离子	5	109±4.2
钴离子	5	110±2.4
			钙离子	5	112±3.4
锌离子	5	114±3.8
			锰离子	5	121±3.1

实施例5壳聚糖酶CsnQ酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ与0.3％壳聚糖在60℃下分别孵育不同时间，然后在高效薄层层析板(HPTLC)检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰醋酸:水＝2:2:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶CsnQ酶解主产物为壳二糖(DP2)和壳三糖(DP3)。

如图4所示，酶解反应初期(0-10min)，大量大片段的寡糖产生，随着酶解反应的进行，大片段的寡糖逐渐转化为小片段的寡糖，说明该酶的作用方式是以内切的方式，从壳聚糖分子内部进行切割。

实施例6壳聚糖酶Csn Q酶解产物质谱法测定

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnQ与0.3％的壳聚糖底物孵育24小时，降解产物12,000g离心10分钟，弃沉淀。所得样品并与乙腈进行等体积混合，

进行阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明(图5)，降解主产物为壳二糖和壳三糖，与实施例5中TLC检测结果一致。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种新型壳聚糖酶CsnQ及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Val Gly Gly Thr Gly Ala Thr His

20 25 30

Ala Gly Ala Ala Gly Ser Gly Val Asn Leu Thr Asp Pro His Lys Lys

35 40 45

Glu Ile Ala Met Glu Leu Val Ser Ser Ala Glu Asn Ser Ser Leu Asp

50 55 60

Trp Lys Ala Gln Tyr Lys Tyr Ile Glu Asp Ile Gly Asp Gly Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Gly Gly Ile Ile Gly Phe Cys Ser Gly Thr Gly Asp Met Leu

85 90 95

Glu Leu Val Gln His Tyr Thr Asp Leu Glu Pro Gly Asn Ile Leu Ala

100 105 110

Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Lys Lys Val Asn Gly Ser Ala Ser His Ser

115 120 125

Gly Leu Gly Thr Pro Phe Thr Lys Asp Trp Ala Thr Ala Ala Lys Asp

130 135 140

Thr Val Phe Gln Gln Ala Gln Asn Asp Glu Arg Asp Arg Val Tyr Phe

145 150 155 160

Asp Pro Ala Val Ser Gln Ala Lys Ala Asp Gly Leu Arg Ala Leu Gly

165 170 175

Gln Phe Ala Tyr Tyr Asp Ala Ile Val Met His Gly Pro Gly Asn Asp

180 185 190

Pro Thr Ser Phe Gly Gly Ile Arg Lys Thr Ala Met Lys Lys Ala Arg

195 200 205

Thr Pro Ala Gln Gly Gly Asp Glu Thr Thr Tyr Leu Asn Ala Phe Leu

210 215 220

Asp Ala Arg Lys Ala Ala Met Leu Thr Glu Ala Ala His Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ser Arg Val Asp Thr Glu Gln Arg Val Phe Leu Lys Ala Gly Asn Leu

245 250 255

Asp Leu Asn Pro Pro Leu His Trp Lys Thr Tyr Gly Asp Ser Tyr Ser

260 265 270

Ile Asn Ser Leu Glu His Thr Thr Thr Pro Leu Arg Ser Gly Cys

275 280 285

<210> 2

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaatact tattaccaac agcagcagca ggtttattat tattagcagc acaaccagca 60

atggcaatgg gtgtaggtgg tacaggtgca acacatgcag gtgcagcagg ttctggtgta 120

aacttaacag atccacataa aaaagaaatt gcaatggaat tagtatcttc tgcagaaaac 180

tcttctttag attggaaagc acaatacaaa tacattgaag atattggtga tggtcgtggt 240

tacacaggtg gtattattgg tttctgttct ggtacaggtg atatgttaga attagtacaa 300

cattacacag atttagaacc aggtaacatt ttagcaaaat acttaccagc attaaaaaaa 360

gtaaacggtt ctgcatctca ttctggttta ggtacaccat tcacaaaaga ttgggcaaca 420

gcagcaaaag atacagtatt ccaacaagca caaaacgatg aacgtgatcg tgtatacttc 480

gatccagcag tatctcaagc aaaagcagat ggtttacgtg cattaggtca attcgcatac 540

tacgatgcaa ttgtaatgca tggtccaggt aacgatccaa catctttcgg tggtattcgt 600

aaaacagcaa tgaaaaaagc acgtacacca gcacaaggtg gtgatgaaac aacatactta 660

aacgcattct tagatgcacg taaagcagca atgttaacag aagcagcaca tgatgataca 720

tctcgtgtag atacagaaca acgtgtattc ttaaaagcag gtaacttaga tttaaaccca 780

ccattacatt ggaaaacata cggtgattct tactctatta actctttaga acatacaaca 840

acaccattac gttctggttg t 861

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg atgaaatact tattaccaac 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga caaccagaac gtaatggt 28

Claims

1.一种壳聚糖酶CsnQ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述壳聚糖酶CsnQ的核酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ在降解壳聚糖中的应用。

5.一种降解壳聚糖的方法，其特征是，选用权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0～80℃。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，最适反应温度为60℃。

8.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应pH为4.0～9.6。

9.如权利要求8所述的方法，其特征是，最适反应pH为5.0。