CN102018964A - 一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程领域，提供了一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，含有三种独立的基因编码质粒，第一种是特异性靶抗原编码质粒，第二种是具有可局部富集DC的趋化因子编码质粒，第三种是可促进DC增殖成熟的细胞因子编码质粒，第一种、第二种和第三种编码质粒的质量比为100∶2-8∶2-8。本发明还提供了上述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，本发明的疫苗针对乙肝耐受和结核耐受个体，克服常规疫苗无法在耐受机体内诱导免疫的缺点，试验证实可通过增强DC富集和DC增殖成熟，增强诱导的特异性抗体和T细胞应答水平，打破了免疫耐受，显著降低HBV的转录复制水平，具有治疗慢性乙肝或结核的效果。

Description

一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***及制备方法 

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学领域，涉及三种质粒疫苗的设计、制备和混合共免疫的特殊方法，特别是，一种可有效打破特异性免疫耐受的三质粒基因共免疫疫苗***及制备方法。 

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染导致的急、慢性乙型肝炎(Hepatitis B)是世界性的卫生难题。HBV感染导致的机型乙型肝炎，容易发展成为慢性乙肝，并进行性地诱导肝硬化和肝癌，是导致我国成年人死亡的重要原因之一，迄今尚未发现有效的慢性乙肝治疗措施。全世界HBV慢性感染者超过3.5亿，每年约100万人死于HBV感染相关疾病，其中32万死于肝癌。我国是HBV感染的高发区，约60％的人群感染过HBV，超过10％的人群为乙肝表面抗原HBsAg携带者。乙型肝炎持续成为我国首位感染性疾病，每月新发病例高达12万，目前共有9300万的HBV感染患者和3000万的慢性乙肝患者，其治疗成为沉重的医疗负担，严重制约我国社会、经济、卫生事业的均衡发展。 

常规重组乙肝预防性疫苗以天然结构的乙肝病毒表面蛋白(HBV surface Antigen，HBsAg)为靶抗原，仅能在健康人体内诱导抗病毒免疫、发挥预防效果。而对已经感染HBV的慢性持续性乙肝感染者却基本无效，原因是慢性患者诱生了对HBV的特异性免疫耐受，即对HBV特异性的免疫无应答或低应答。特别是在生命早期感染了HBV的患者，诱导了终身的HBV特异性免疫耐受，对常规乙肝疫苗没有应答，几乎终身无法清除病毒。鉴于目前对慢性乙肝缺乏针对性的治疗方法，现有预防疫苗又无法施效，研制治疗性疫苗或基因治疗手段显得更为紧迫和重要。以免疫学手段激发、增强、调控机体抗HBV特异性免疫应答，可从根本上清除病毒，是防治HBV持续感染的关键。根据机体对乙肝病毒的特异性耐受机制，经过分子设计，重新设计和构建含有天然乙肝病毒蛋白有效抗原成分、并辅助以多种具有打破免疫耐受功能的免疫分子作为佐剂，显著增强机体对乙肝病毒抗原的提呈以及T细胞的激活和效应，是打破机体对乙肝病毒的免疫耐受，有效***病毒慢性感染的关键。 

在当前疫苗研制中，基因疫苗作为第三代疫苗的新兴代表，受到广大学者的重视。1990年，美国学者Wolff等首次发现：裸露的质粒DNA直接肌肉注射后，可高水平、持续表达外源蛋白质，并可诱生特异性免疫反应。此后，以此为基础建立及发展的基因免疫技术(Gene Immunization)已被广泛应用于抗病毒、细菌、寄生虫、肿瘤等的免疫应答研究。研究证实，编码靶抗原基因的基因疫苗(DNA疫苗)由于可较好地模拟天然病原体的感染过程，因此可在注射局部天然地表达具有天然空间构像的靶抗原，从而更有利于诱导抗原特异性免疫应答，尤其有利于诱导对清除病毒感染起决定性作用的Th1应答和细胞毒性T细胞(CTL)应答。单纯靶抗原基因疫苗的免疫效果通常有限，因此改造真核表达***、偶联免疫增强分子、联合应用佐剂、共免疫***以及多种载体***的创新和改进均成为近年基因免疫领域发展的新方向。 

病原体特异性免疫耐受的机制尚未完全阐明，目前认为乙肝耐受机制主要集中在两个层面：1)抗原提呈细胞(APC)层面：HBV通过抑制专职APC的分化、发育、增殖及APC功能(表面MHC分子、共刺激分子表达程度)，显著抑制APC对HBV抗原的提呈，从而无法有效激活HBV特异性T细胞应答；2)T细胞层面：HBV通过直接影响T细胞的分化、增殖、效应和凋亡，降低T细胞的数量、寿命、效应功能，从而使HBV特异性T细胞无法被激活、发挥效应或对HBV实施有效清除。由于T细胞对乙肝病毒抗原的识别必须经由APC的抗原提呈，因此APC的免疫功能低下可能是乙肝耐受更为深层次的机制。 

DC是最强大的专职APC，通过感受危险信号、处理、提呈抗原，激活特异性T细胞应答，并通过激活Th2细胞进而激活B细胞应答，因此在特异性免疫应答中发挥初始的关键作用，可决定免疫应答的耐受或激活。抗原作用于机体不诱生免疫应答而导致免疫耐受的产生，关键机制在于抗原未能进行有效摄取和提呈、进而影响T、B细胞活化和效应。因此打破免疫耐受的首要步骤和关键是有效活化DC细胞。已知特异性免疫应答的诱导过程中，首先由感染局部的APC捕获病原体抗原，而后处理提呈抗原，在自身得到有效活化的同时移动到引流***，遭遇和活化特异性T细胞克隆。而局部的APC特别是DC数量较少。在该过程中，有效募集DC到感染或免疫局部、以及充分活化DC对于有效激活T细胞应答极为关键。 

本发明针对APC数量和功能低下在乙肝耐受中发挥的关键作用，设计了一种有助于打破乙肝病毒等病原体免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***。其发明理论基础和目的是：为了有效增强基因免疫局部(肌肉注射局部或鼻腔等免疫部位)APC的数目和抗原提呈功能，非常有必要在给予靶抗原基因疫苗的同时，给予可有效增强APC富集、 增殖分化及功能的免疫活性分子。已知免疫细胞的移动由趋化因子-趋化因子受体网络来调控，特定的趋化因子或其受体的上调有助于DC的定向迁移；趋化因子同时具有增强免疫细胞激活功能。而DC的发育和活化则受细胞因子和生长因子调节。 

根据上述理论基础，我们选择了CCL20这一趋化因子来促进免疫局部DC富集，而采用另一种细胞因子Flt3L作为促进DC成熟和功能活化的细胞因子。肝脏激活调控的趋化因子(Liver and Activation-Regulated Chemokine，LARC)，(标准命名：CC趋化因子配体20，CCL20)是1997年日本学者Hieshima等发现并鉴定的CC趋化蛋白，由上皮细胞表达，对未成熟DC、T细胞有很强的趋化作用。以往研究表明CCL20基因免疫可招募大量未成熟DC发挥抗肿瘤作用。fms样酪氨酸激酶3配体(fms-like tyrosinekinase 3 ligand，Flt3L)是促进骨髓造血干细胞生长的细胞因子，可强烈刺激DC增殖分化。以往的研究提示其胞外段1-134aa即具有其全部功能。人和小鼠FltL胞外段的同源性高达75％，且种属特异性很低，即人或小鼠FltL对于人或小鼠的DC细胞均有良好的刺激增殖作用。因此我们选择人Flt3L胞外段(1-402bp)作为DC活化分子。 

本发明以最强的APC-树突状细胞(DC)为对象，选择两种免疫活性分子：CCL20和Fflt3L来促进DC的局部富集和分化成熟及抗原提呈功能，将两种分子分别构建为基因疫苗，以特殊质量比例与编码HBsAg的乙肝基因疫苗混合，共免疫小鼠，来有效增强HBV特异性T细胞应答。特别是在乙肝转基因免疫耐受小鼠中，应用该三基因共免疫***进行免疫治疗，发现可有效重新唤起转基因小鼠低下的HBV特异性抗体和T细胞应答，显著降低HBV的转录复制水平，实现了良好的打破乙肝耐受的治疗效果。 

目前国外尚无与本发明一致或类似的乙肝治疗性基因疫苗的应用性开发研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***及制备方法，所述的这种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗及制备方法要解决现有技术中的常规乙肝疫苗和结核疫苗在乙肝和结核耐受患者体内无效的技术问题。 

本发明提供了一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，含有三种独立的基因编码质粒，第一种是特异性靶抗原编码质粒，第二种是具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒，第三种是可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒，所述的第一种特异性靶抗原编码质粒是以真核表达质粒为载体，克隆有人类乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原S蛋白(HBsAg)编码基因，所述的人类乙型肝炎病毒表面抗原 S蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述的第二种具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒是以真核表达质粒为载体，克隆有小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子(CCL20)编码基因，所述的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子CCL20的基因序列如SEQ ID NO：3所示，所述的第三种可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒以真核表达质粒为载体，克隆有人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段(1-402bp)编码基因，所述的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段(1-402bp)编码基因的基因序列如SEQ ID NO：5所示，第一种特异性靶抗原编码质粒、第二种具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒和第三种可促进DC增殖成熟的细胞因子编码质粒的质量比为100∶2-8∶2-8。 

进一步的，第一种特异性靶抗原编码质粒、第二种具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒和第三种可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒的质量比为：100∶4∶4。 

进一步的，所述的真核表达质粒选自pcDNA3系列、或者pVAX1系列质粒中的任一种。 

进一步的，所述的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

进一步的，所述的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子CCL20的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。 

进一步的，所述的人来源fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段(1-402bp)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。 

进一步的，还含有药学上可接受的佐剂、或者载体、或者赋形剂。 

本发明还提供了上述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 

a)以一确定为adr亚型HBV感染的慢性乙型肝炎患者血清DNA为模板，以SEQ ID NO：7所示的HBV S蛋白上游引物和SEQ ID NO：8所示的HBVS蛋白下游引物为引物，通过PCR扩增获得人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白抗原的编码基因，将通过PCR扩增的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白抗原编码基因经Bam HI和Not I双酶切； 

b)提取BALB/c小鼠胸腺细胞总RNA，然后逆转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID NO：9所示的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子上游引物和SEQ ID NO：10所示的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子下游 引物为引物，通过PCR扩增获得小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的编码基因；将通过PCR扩增的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的编码基因产物经KpnI和BamHI双酶切； 

c)提取人外周血细胞总RNA，然后逆转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID NO：11所示的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段编码基因上游引物和SEQ ID NO：12所示的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段编码基因下游引物为引物，通过PCR扩增获得人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段的编码基因，将通过PCR扩增的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)胞外段的编码基因产物经Bam HI和XbaI双酶切； 

d)将a)、b)、c)得到的三种经双酶切的PCR基因片段，分别与经同样双酶切的真核表达质粒相连接，获得分别编码HBsAg、CCL20和Flt3L胞外段的三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L； 

e)将三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L DNA分别转化宿主细菌，经大量培养后，分别大规模抽提三种纯化质粒DNA； 

f)将抽提得到的纯化的三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3LDNA分别溶解于无菌PBS，浓度分别为1-2μg/μl，将三种质粒以100∶2-8∶2-8的质量比例混合，组成上述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗。 

进一步的，三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L质量比为：100∶4∶4。 

进一步的，所述的真核表达质粒选自pcDNA3系列、或者pVAX1系列质粒中的任一种。 

进一步的，所述的宿主细菌为大肠杆菌DH5。 

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗。 

进一步的，还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。 

本发明还提供了述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***在制备治疗慢性乙肝药物中的应用。 

本发明还提供了述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***在制备治疗慢性结核药物中的应用。 

本发明的SEQ ID NO：1所示的序列为HBV adr亚型DNA序列(Pubmeddatabase：GI：22651877)的155-835位置，即编码S基因的1-681bp序列，atg(1-3)为起始码密码子，taa(679-681)为终止密码子)。 

本发明的SEQ ID NO：3所示的序列来自小鼠CC趋化因子配体20(CCL20)(又名Liver and Activation-Regulated Chemokine，LARC，小鼠来源：Pubmed database：GI：8394247)，其中atg(1-3)为起始码密码子，taa(292-294)为终止密码子。 

本发明的SEQ ID NO：5所示的序列来自人fms样酪氨酸激酶3配体(fms-liketyrosine kinase 3 ligand，Flt3L)胞外段1-402bp，人来源：Pubmed database：GI：38455415)，atg(1-3)为起始码密码子。 

本发明选择乙肝病毒表面抗原S(HBsAg)蛋白作为特异性基因疫苗靶抗原。S抗原蛋白是已被广泛证明的具有很强免疫原性的HBV来源蛋白抗原，重组制备的HBsAg，已作为预防性疫苗在全世界范围健康人群应用，可诱导高水平抗HBsAg抗体，对健康人群具有有效的乙肝预防效果。但由于乙肝携带者和慢性乙肝患者体内已持续存在一定水平的S抗原，导致机体对该抗原无免疫反应性，即耐受，因此重组乙肝S抗原疫苗在乙肝携带者和慢性乙肝患者体内无效。在本发明中，选择经典的HBsAg作为基因疫苗靶抗原，用于证实如何通过辅助佐剂质粒共免疫的方法，打破乙肝耐受个体对S抗原的耐受，实现治疗效果。 

本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3系列、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。 

本发明中，HBsAg蛋白、CCL20和flt3L胞外段蛋白编码基因的获得，可以通过多种方式获得，包括但不限于：1)化学合成DNA；2)通过适当引物以PCR技术扩增得到DNA。 

本发明中，三基因共免疫疫苗免疫小鼠采用肌肉注射方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以注射器吸取＜＝100μl质粒液体直接注射小鼠胫骨前肌肉，分别取50μl质粒注射于小鼠两条腿。除注射器外，也可选用其他有效的借助于市售仪器的基因免疫的方式，包括但不限于：基因枪技术、电穿孔辅助技术等。 

本发明中，“药学上可接受的”成份是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、***反应)、有合理效益/风险比的物质。 

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或 动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠或其组合。 

本发明的药物组合物，还含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6-8。 

本发明和与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明以公认的具有强免疫原性的乙肝病毒表面S抗原构建pHBsAg，作为特异性靶抗原基因疫苗；同时将两种促进DC局部富集和发育成熟的免疫活性分子CCL20和Flt3L分别构建为基因疫苗佐剂，将三种质粒基因以特殊质量比例混合，构成本发明所述的可打破特异性免疫耐受的三基因共免疫疫苗***。本发明的疫苗针对乙肝耐受和结核耐受个体，克服常规乙肝疫苗无法在耐受机体内诱导免疫的缺点，根据耐受个体内APC功能被乙肝病毒显著抑制、从而无法对持续存在的乙肝表面抗原S进行有效抗原提呈进而激活特异性T细胞的关键机制，通过在给予S抗原基因疫苗的同时，给予可显著富集DC的趋化因子CCL0基因佐剂和可显著激活DC生长和成熟的细胞因子Flt3L基因佐剂，使注射肌肉局部在表达疫苗靶抗原S的同时，也表达高水平的CCL20和Flt3L，则CCL20和Flt3L可有效趋引淋巴循环中的DC到达肌肉局部，大量增殖，并发生功能成熟(上调表达表面MHC和共刺激分子CD80/86，CD40等)，显著增多和功能增强的DC可在肌肉局部高效摄取提呈提呈乙肝S抗原，从而显著增强对T细胞的激活，诱导耐受个体内原本功能低下的特异性T细胞应答和B细胞抗体应答，实现对乙肝免疫耐受的打破。在转基因小鼠的治疗试验中，该三质粒共免疫疫苗***证实可通过增强DC富集和抗原提呈功能，显著打破了乙肝特异性免疫耐受，诱导高水平的特异性抗体和T细胞应答，因此具有治疗慢性乙肝或结核的良好潜能，有较好的预期临床价值。 

附图说明

图1显示了本发明的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***中靶抗原质粒即pcDNA3-HBsAg的构建示意图，其中A为构建示意图、B为PCR后的电泳图、C为酶切重组质粒后的电泳图。 

图2显示了本发明的三质粒共免疫疫苗中趋化因子佐剂质粒即pcDNA3-CCL20的构建示意图，其中A为构建示意图、B为PCR后的电泳图、C为酶切重组质粒后的电泳图。 

图3显示了本发明的三质粒共免疫疫苗中细胞因子佐剂质粒即 pcDNA3-FltL(1-402bp)的构建示意图，其中A为构建示意图、B为PCR后的电泳图、C为酶切重组质粒后的电泳图。 

图4显示了本发明的三质粒的体外表达的高效性和表达的特异性情况。 

图5显示了本发明的三质粒共免疫疫苗***中pCCL20的体内外趋化DC特性，A显示了pCCL20表达上清对脾脏细胞的趋化活性，B显示了被趋化细胞的CCR6表达，C显示了pCCL20肌注小鼠的体内趋化功能。 

图6显示了本发明的三质粒共免疫疫苗***中pFlt3L体外表达产物活化DC的特性，其中A为DC与pflt3L表达上清共孵育后的表型；B为DC与pflt3L表达上清共孵育后的IL-12分泌情况。 

图7显示了本发明有关三种质粒最佳剂量比例、免疫次数与免疫间隔的摸索，采用100μg靶抗原质粒(pHBsAg)与递增剂量的pCCL20/pflt3L质粒混合共免疫，A显示了不同质粒比例对肌肉注射局部淋巴细胞浸润的影响，B显示了不同质粒比例对HBsAg特异性抗体产生的影响。 

图8显示了本发明的三质粒共免疫疫苗在正常小鼠诱导的HBV特异性血清IgG。 

图9显示了本发明的三质粒共免疫疫苗在正常小鼠诱导的HBV特异性T细胞增殖与杀伤，其中A为T细胞增殖的示意图，B为对SP2/0-HBsAg靶细胞的特异性杀伤活性的示意图。 

图10显示了本发明的HBV转基因小鼠体内HBsAg、HBV DNA持续高水平存在而抗HBsAg抗体缺如的情况，其中A和B显示了在HBV转基因小鼠体内的血清HBVDNA、HBsAg的表达及anti-HBsAg的抗体水平。 

图11显示了本发明的三质粒共免疫在乙肝转基因耐受小鼠中诱导的特异性免疫应答，其中A显示了在转基因乙肝耐受小鼠中anti-HBsAg抗体，B显示了在转基因乙肝耐受小鼠中HBsAg特异性T细胞增殖活性；C显示了特异性杀伤活性。 

图12显示了本发明的三质粒共免疫在乙肝转基因小鼠中显著降低HBV蛋白及DNA水平，其中A和B显示了在乙肝转基因小鼠中血清HBsAg水平和HBV DNA的拷贝数；C显示了在乙肝转基因小鼠中肝脏免疫组化检测HBsAg的表达。 

图13显示了本发明的三质粒共免疫疫苗打破HBV特异性免疫耐受的可能机制与高效富集与活化DC功能相关，其中A显示了肌注局部淋巴细胞浸润指数，B显示了浸润淋巴细胞中DC比例，C显示了引流***中细胞总数和DC数量的变化，D显示了局部引流***DC成熟度的变化。 

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。 

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下： 

质粒、菌种、细胞、动物：质粒pcDNA3、pET32a、宿主细菌DH5α(Invitrogen公司购买)。基因合成委托上海赛百盛公司。4-6周龄雌性BALB/c(H-2K^d)小鼠购自中国科学院动物中心。4-6周龄雌性C57BL/6(H-2K^b)转基因小鼠由第二军医大学免疫教研室惠赠。C2C12为C3H鼠源性肌细胞系。 

分子生物学试剂：Bam HI、Not I、KpnI和Xba I(TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(TaKaRa公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)，ECL发光检测试剂(BioRad公司)；Mega质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)。 

免疫学试剂和材料：纯化HBsAg蛋白(北京大学医学部肝病研究所北京肝炎试剂研制中心)；细胞因子GM-CSF和IL-4(Prospec公司)；抗小鼠CD3抗体、CD19抗体、抗-flt3L抗体(e-Bioscience公司)；抗-HBsAg抗体、抗-CCL20抗体和豚鼠补体(R&D公司)；荧光标记抗CD11c、抗小鼠I-A^d、抗小鼠CD40/CD80/CD86抗体、抗CCR6抗体(BD公司)、HRP标记羊抗小鼠IgG(Southern Biotech公司)；IL-12 ELISA试剂盒(eBioscience公司)；戊巴比妥钠(佛山市化学试剂厂)；无菌注射器(BD公司)。 

实施例1：pHBsAg、pCCL20、pflt3L三种质粒的构建 

1)pHBsAg质粒的构建 

如图1(A)所示，从一确定为adr亚型HBV感染的慢性乙型肝炎患者血清，抽提DNA，以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HBV S蛋白上游引物和下游引物为引物，通过PCR扩增获得人乙肝病毒HBV表面抗原S(HBsAg，226氨基酸)706bp大小的编码基因(图1B)，经BamH I和Not I双酶切，与经同样酶切处理的pcDNA3连接，获得重组真核表达质粒pHBsAg。以BamH I和Not I行双酶切鉴定，证实可切出698bp大小片段(图1C)，测序结果如SEQ ID NO：13所示(仅显示从Bam HI酶切位点到HBsAg编码基因再到Not I酶切位点部分序列，其中atg(16-18)和taa(694-696)分别是HBsAg编码基因的起始码和终止码)，证实构建正确。 

2)小鼠CCL20质粒的构建 

如图2(A)所示，取1×10⁶小鼠胸腺细胞，用Trizol抽提细胞总RNA，以逆转录获得的cDNA第一链为模板，以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的CCL20上游引物和下游引物为引物，经PCR法扩增获得312bp的CCL20编码基因片段(图2B)。用KpnI和BamHI双酶切，与经相同双酶切的pcDNA3质粒载体连接，获得充足真核表达质粒pcDNA3-CCL20。以Kpn I和Bam HI对pCCL20质粒进行双酶切鉴定，证实可切出300bp大小片段(图2C)，测序结果如SEQ ID NO：14所示(仅显示从Kpn I酶切位点到CCL20编码基因再到Bam HI酶切位点部分序列，其中atg(9-12)和taa(301-303)分别是CCL20编码基因的起始码和终止码)，证实构建正确。 

3)人pFlt3L胞外段(1-402bp)质粒的构建 

如图3(A)所示，取人外周血5ml，分离外周血白细胞后，用Trizol抽提细胞总RNA，以逆转录获得的cDNA第一链为模板，以SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的FltL上游引物和下游引物为引物，经PCR法扩增423bp的Flt3L胞外段(1-402bp)基因编码片段(图3B)。用BamHI和Xba I双酶切，与经相同双酶切的pcDNA3质粒载体连接，获得真核表达质粒pcDNA3-Flt3L。以BamHI和Xba I对pFlt3L质粒进行双酶切鉴定，证实可切出415bp大小片段(图3C)，测序结果如SEQ ID NO：15所示(仅显示从Bam HI酶切位点到Flt3L胞外段(1-402bp)编码基因再到Xba I酶切位点部分序列，其中atg(9-11)和taa(412-414)分别是Flt3L胞外段编码基因的起始码和终止码)，证实构建正确。 

将三种重组质粒分别转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，分别获得三种纯化质粒。 

实施例2  p-HBsAg、p-CCL20、p-flt3L质粒的体外表达 

将上述构建的pHBs、pCCL20、pflt3L质粒DNA以电转染法转染小鼠肌细胞C2C12，37℃、5％CO₂培养。48h后收集表达上清。表达上清10倍浓缩处理，以SDS-PAGE分离蛋白，转膜，与兔抗小鼠HBs、CCL20及flt3L抗体孵育过夜。与HRP标记的羊抗兔IgG抗体孵育后以化学发光试剂盒显色。Western检测检测相应抗原发现： 抗-HBs抗体可与pHBs转染上清结合；而抗-CCL20抗体则与pCCL20转染上清特异结合；抗Flt3L抗体可与pflt3L转染上清特异结合(图4)。结果提示：p-HBs、p-CCL20、p-flt3L重组质粒均能够在体外肌细胞中有效表达。 

实施例3  CCL20表达产物具有趋化DC的良好活性 

将pCCL20转染细胞上清加入趋化池下室，将脾细胞悬液加入上室中，37℃孵育4小时。收集下室中及膜上的细胞，计算趋化指数(chemotaxis index，CI)显示：pCCL20表达上清对脾脏细胞具有明显的趋化活性，趋化指数达9.18(图5A)，显著高于对照组0.84(P＝0.001)。且被趋化细胞有83.34％是CCR6⁺细胞(图5B)，提示特异性趋化。 

将pCCL20肌肉注射小鼠，分离肌注局部淋巴细胞显，发现CCL20能够显著趋化淋巴细胞细胞到达免疫局部，其浸润指数为1.667，显著高于对照组(0.333，P＝0.007)，提示了良好的体内趋化功能。提取局部肌肉免疫部位的总RNA，RT-PCR分析CCL20唯一受体CCR6表达，发现pCCL20质粒免疫部位有大量CCR6表达，而pcDNA3免疫组肌肉未见CCR6(图5C)。提示CCL20质粒在体内可趋化CCR6⁺细胞到达局部免疫部位。 

实施例4  flt3L表达产物可促进DC发育成熟活性 

取正常6-8周龄BALB/c小鼠股骨和胫骨，冲洗骨髓腔，破红细胞后，加抗CD3、CD19抗体、豚鼠补体于37℃反应1小时后离心，用10％FCS RPMI1640(GM-CSF10ng/ml和2ng/ml的IL-4)培养，第6天加入pflt3L质粒转染上清培养2天。发现：pflt3L表达上清共孵育，能使DC细胞表面的MHC II类分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达显著上调(图6A)，提示显著促进了DC的成熟。同时，培养上清中DC分泌的IL-12水平显著增加(P＝0.000)(图6B)，证实了Flt3L具有促进DC成熟的功能。 

实施例5  p-HBsAg、p-CCL20、p-flt3L三质粒共免疫疫苗的最佳剂量、途径、次数、间隔时间摸索 

常规共免疫方案(即三种质粒均等量混合)可能有以下缺点：局部肌肉组织摄取不同DNA的效率各异，不同基因在同一部位的表达也存在相互影响，因此确定最佳的三质粒混合比例及基因免疫方案对于诱导出高效价的抗体至关重要。探讨了不同量的趋化因 子pCCL20和细胞因子pflt3L质粒和常规100μg靶抗原质粒pHBsAg共同免疫对抗HBsAg抗体产生的影响。将真核表达质粒pHBsAg、pCCL20、pflt3L溶解于无菌、无热源的PBS中，浓度调为1μg/μl。采用肌肉注射法免疫：BALB/c小鼠采轻度麻醉后，在胫骨前肌肉正中注射100μg靶抗原质粒pHBsAg，每只小鼠两腿各50μg/μl。而pCCL20和细胞因子pflt3L质粒量由0.16至200μg变动，与pHBsAg质粒混合后肌肉注射。于0周、3周、6周肌注免疫小鼠三次。每两周经眼眶采血，血清-20℃冻存。 

检测一次肌肉注射后至14天内的肌肉注射局部淋巴细胞的浸润指数，发现：低于1μg以下的CCL20和flt3L质粒不能发挥共免疫增强效果；采用2-8μg pCCL20和2-8μg flt3L质粒与100μg的靶抗原质粒混合，可达到最佳的免疫增强效果(p＜0.05)，进一步加大两个辅助质粒的量不能增强免疫效果(图7A)，相比而言，4μg pCCL20和4μg flt3L质粒与100μg靶抗原质粒混合效果最佳且佐剂用量最小，且pCCL20和pflt3L质粒肌肉注射后，其局部淋巴细胞浸润在第3-5天达最大。 

检测免疫第6周血清HBsAg特异性抗体，发现2-8μg pCCL20和2-8μg pflt3L质粒与100μg靶抗原质粒共免疫诱导的抗体效价最高(图7B)(P＜0.05)。进一步加大两个辅助质粒的量诱导的抗体效价反而有所下降，相比而言，4μg pCCL20和4μg flt3L质粒与100μg靶抗原质粒混合效果最佳且佐剂用量最小，提示靶抗原质粒和pCCL20、pflt3L三质粒的最佳质量比为100∶4∶4。 

此外，3次免疫后抗体效价显著提高，提示免疫3次效果由于1次和2次免疫。 

实施例6  三质粒共免疫疫苗***诱导的HBsAg特异性抗体应答 

根据上述最佳共免疫方案，研究三质粒共免疫疫苗对于靶抗原质粒pHBsAg基因免疫效果的增强作用。将6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)健康小鼠30只，分为5组：(1)pcDNA3空质粒对照；(2)pHBsAg质粒组；(3)pHBsAg+pCCL20质粒组；(4)pHBsAg+pflt3L质粒组；(5)pHBsAg+pCCL20+pflt3L质粒组。以100μg pHBs、4μgpCCL20和4μg pflt3L质粒混合，于0、3、6周共同肌注免疫小鼠，采集小鼠血清。间接ELISA法检测血清特异抗HBsAg IgG。以纯化HBsAg蛋白(5μg/ml)包被聚苯乙烯微孔板4℃过夜，以(5％山羊血清、5％小牛血清、PBST)封闭，37℃1h。1∶100血清加板，37℃1h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃1h，洗板后以TMB显色30min，终止反应后测A₄₉₀值。 

结果显示，pHBsAg质粒本身肌注免疫可诱导较好的特异性血清IgG，pCCL20或者pFlt3L单独作为佐剂质粒共免疫，均可增强诱导的IgG水平。在此基础上，三质粒按照特殊质粒比例共免疫进一步显著增强了HBV特异性IgG的诱导(图8)。 

实施例7  三质粒共免疫疫苗***诱导的HbsAg特异性细胞免疫应答 

免疫第8周处死小鼠，取脾细胞，以5×10⁵细胞/孔加入96孔板，分别加入丝裂原con A(5μg/ml)或HBsAg蛋白(5μg/ml)，培养72小时，在收获细胞前18小时每孔加入0.5uCi ³H-TdR，以多头细胞收集仪收集细胞，液体闪烁计数器测量cpm值。刺激指数(SI)＝实验组CPM/(脾细胞+1640)CPM。淋巴细胞杀伤试验中，取转染HBsAg的sp2/0细胞以50mM的CFSE标记，与经过5mM CFSE染色的sp2/0细胞等体积混合，以2×10⁷/只的剂量经尾静脉注射各免疫组小鼠，18小时后，取小鼠脾细胞FACS检测两种靶细胞数量。 

T细胞增殖结果发现：如图9A所示，pHBsAg单质粒免疫后，T细胞增殖指数为2.95，混合pflt3L质粒共免疫几乎不能增加T细胞增殖，而与pCCL20质粒共免疫则显著增强了T细胞增殖(SI＝5.1)，而最高的T细胞增殖发生于三质粒共免疫组(SI＝5.6)。检测对SP2/0-HBsAg靶细胞的特异性杀伤活性，发现，pHBsAg单质粒免疫组的杀伤活性有限，双质粒免疫组不能增强杀伤，仅有三质粒共免疫可显著增强特异性杀伤活性幅度达15％～20％(p＜0.05，图9B)。 

实施例8  三质粒共免疫疫苗***打破乙肝慢性感染免疫耐受的效果和机制 

1)HBV转基因慢性乙肝小鼠模型存在HBsAg耐受： 

引进二军大HBV转基因小鼠，经血清HBsAg、HBeAg和anti-HBsAg抗体的检测，证实小鼠在5个月时间内持续高表达HBV的HBsAg蛋白、HBeAg；而anti-HBsAg抗体水平始终检测不到。其次，以组化检测小鼠肝组织中HBsAg的表达，发现与对照相比，转基因小鼠肝细胞内大量表达HBsAg蛋白，确证该小鼠属于乙肝慢性感染状态和免疫低下状态，即免疫耐受(图10)。 

2)在HBV转基因小鼠体内三质粒共免疫显著打破了对HBSAg的免疫耐受 

在呈免疫耐受状态的HBV转基因小鼠体内，经三质粒基因共免疫3次后，在原本不能产生特异性免疫应答的小鼠体内，唯一地诱导了较高水平的抗HBsAg IgG的分泌(图11A)、以及对HBsAg特异性的T细胞增殖及杀伤活性(图11B)，提示打破HBV特异性免疫耐受，诱导了良好的免疫应答。 

3)体内外证实三质粒共免疫HBV打破HBV特异性免疫耐受 

如图12所示，除诱导了良好的特异性免疫应答外，通过近3个月的跟踪监测，发现，自共免疫3周后，转基因小鼠血清中持续居高的HBsAg水平显著下降，在第6周已降至200GMT，第9周不能检测出，而对照小鼠HBsAg水平高达5000GMT；同时，检测血清游离HBV DNA水平，发现，已近乎同样的动力学过程，高达10⁵的DNA拷贝在第6周和第9周分别降至3000和0，提示三质粒共免疫对HBV感染的有效清除(图12A和图12B)。肝脏免疫组化显示，对照组肝细胞内表达大量HBsAg抗原，而三质粒共注射组实现了最佳的HBsAg清除效果(图12C)，提示三质粒共免疫清除乙肝病毒的良好治疗效果。 

4)pCCL20/pflt3L/pHBsAg基因共免疫打破免疫耐受机制 

为分析三质粒免疫打破免疫耐受的机制，首先检测了肌注局部浸润淋巴细胞的浸润指数，发现(如图13A)，三质粒免疫的浸润指数达到2.87，显著(p＜0.05)高于对照各组及pHBsAg+pCCL20双质粒免疫组(1.5)。分离肌肉局部浸润淋巴细胞，检测其中CD11c+DC比例，发现，三质粒共免疫后，浸润淋巴细胞中高达85.36％的细胞为CD11c⁺CD3^-CD19^-DC细胞(图13B)，而pcDNA3质粒免疫小鼠肌肉组织未能检测到足够量的DC细胞，提示三质粒共免疫显著地增强了注射局部DC的富集和增殖，而DC的数量和有效活化是基因免疫打破免疫耐受的关键。 

进一步分析引流***中浸润淋巴细胞中DC的数目表型发现：与脾脏淋巴细胞相比，三质粒共免疫小鼠腹股沟引流***中淋巴细胞的数目与DC的数目均显著增多(1.5％增至2.8％)(图13C)；同时，DC表面CD80/86、I-Ad、CD40的表达水平均显著上调(图13D)，而脾脏淋巴细胞与DC数量与比例均无显著变化。提示三质粒共免疫还显著促进了引流***中DC的富集与成熟活性，从而可能更好地激活T细胞，并辅助B细胞，增强特异性细胞免疫与体液免疫。这也是pCCL20/pflt3L/pHBsAg三质粒共免疫疫苗***打破免疫耐受的主要机制。 

Claims (15)

1.一种可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：含有三种独立的基因编码质粒，第一种编码质粒是特异性靶抗原编码质粒，第二种编码质粒是具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒，第三种编码质粒是可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒，所述的第一种特异性靶抗原编码质粒是以真核表达质粒为载体，克隆有人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白编码基因，所述的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述的第二种具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒是以真核表达质粒为载体，克隆有小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子编码基因，所述的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的基因序列如SEQ ID NO：3所示，所述的第三种可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒以真核表达质粒为载体，克隆有人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段编码基因，所述的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段编码基因的基因序列如SEQ ID NO：5所示，特异性靶抗原编码质粒、具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒和可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒的质量比为100∶2-8∶2-8。

2.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：特异性靶抗原编码质粒、具有可局部富集树突状细胞的趋化因子编码质粒和可促进树突状细胞增殖成熟的细胞因子编码质粒的质量比为：100∶4∶4。

3.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：所述的真核表达质粒选自pcDNA3系列、或者pVAX1系列质粒中的任一种。

4.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：所述的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：所述的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：所述的人来源fms样酪氨酸激酶3配体胞外段Flt3L的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

7.根据权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***，其特征在于：还含有药学上可接受的佐剂、或者载体、或者赋形剂。

8.权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a)以一确定为adr亚型HBV感染的慢性乙型肝炎患者血清DNA为模板，以SEQID NO：7所示的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白上游引物和SEQ ID NO：8所示的人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白下游引物为引物，通过PCR扩增获得编码人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白基因，将通过PCR扩增的编码人类乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白基因的产物经Bam HI和Not I双酶切；

b)提取BALB/c小鼠胸腺细胞总RNA，然后逆转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID NO：9所示的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子上游引物和SEQID NO：10所示的小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子下游引物为引物，通过PCR扩增获得编码小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的基因；将通过PCR扩增的编码小鼠来源的肝脏激活调控的趋化因子的基因产物经Kpn I和Bam HI双酶切；

c)提取人外周血细胞总RNA，然后逆转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ IDNO：11所示的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段编码基因上游引物和SEQ ID NO：12所示的人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段编码基因下游引物为引物，通过PCR扩增获得编码人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段的基因，将通过PCR扩增的编码人来源的fms样酪氨酸激酶3配体胞外段的基因产物经Bam HI和Xba I双酶切；

d)将a)、b)、c)得到的三种经双酶切的PCR基因片段，分别与经同样双酶切的真核表达质粒相连接，获得分别编码HBsAg、CCL20和Flt3L胞外段的三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L；

e)将三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L DNA分别转化宿主细菌，经培养，分别大规模抽提三种纯化质粒DNA；

f)将抽提得到的纯化的三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L DNA分别溶解于无菌PBS，浓度分别为1-2μg/μl，将三种质粒以100∶2-8∶2-8的质量比例混合，组成权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗。

9.根据权利要求8所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，其特征在于：三种真核表达质粒p-HBsAg、p-CCL20和p-Flt3L质量比为：100∶4∶4。

10.根据权利要求8所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述的真核表达质粒选自pcDNA3系列、或者pVAX1系列质粒中的任一种。

11.根据权利要求8所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述的宿主细菌为大肠杆菌DH5α。

12.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***。

13.如权利要求12所述的一种药物组合物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。

14.权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***在制备治疗慢性乙肝药物中的应用。

15.权利要求1所述的可打破免疫耐受的三质粒共免疫疫苗***在制备治疗慢性结核药物中的应用。

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