CN104640565B - 乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原蛋白以及包含其的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本文提供编码乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白、表面抗原蛋白、其片段和组合的核酸序列以及表达所述蛋白质序列的遗传构建体/载体和疫苗。这些疫苗能够通过募集细胞试剂与体液试剂两者来在周边以及在肝脏中诱导免疫反应。也提供用于预防性和/或治疗性针对HBV使个体免疫的方法。所述组合疫苗也可用于特定设计疫苗以达成对HBV激发的特定免疫反应程度。
Description
发明领域
本发明涉及编码乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白、表面抗原蛋白及其片段和组合的核酸序列;涉及乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白、表面抗原蛋白及其片段和组合;涉及改进的HBV疫苗;涉及用于诱导针对HBV的免疫反应的改进方法;以及涉及用于预防性地和/或治疗性地使个体针对HBV免疫的改进方法。
背景
乙型肝炎是全球范围内流行的常见感染,其导致了肝硬化、肝功能衰竭以及肝细胞癌的发展。显著数量的肝炎病例未被报道出来是因为所述疾病的无症状特性。虽然如此,每年仍报道了约3.5亿慢性乙型肝炎病例。大部分肝炎感染的人群是在不发达国家或者发展中国家。
所述病毒基于其包膜蛋白上存在的抗原表位而被分为四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)。根据基因组序列的变化,HBV存在至少八种基因型(A-H)。HBV的替代基因型具有流行的地理分布。
表1示出HBV基因型的地理分布。
表1HBV的地理分布
HBV基因组是环形DNA分子,所述分子主要是双链但该双链具有由比另一链更长的一链产生的单链区域。所述双链区域由约3020个核苷酸的较短链与约3320个核苷酸的较长链杂交而产生。在所述较长链的非杂交核苷酸上的单链区域与HBV DNA聚合酶相缔合。HBV基因组DNA和HBV DNA聚合酶两者都包含在由多个HBV核心蛋白(HBcAg)分子形成的核蛋白壳内。HBV核心蛋白由HBV表面蛋白质或抗原(HBsAg)和脂质分子包膜。
所述HBV基因组含有编码七种不同蛋白质的四个开放阅读框(ORF):1)编码HBVDNA聚合酶的ORF,2)具有两个起始密码子的ORF,其中连接到第二个起始密码子的序列编码核心蛋白并且包括另一个上游起始密码子的序列编码被称为前C的序列;3)具有三个起始密码子的ORF,其中一个编码表面蛋白质(S蛋白;gp27)、一个包括编码被称为前S2(gp36)的序列的上游起始密码子,并且另一个包括编码被称为前S1(gp42)的序列的更上游的起始密码子;以及4)编码HBxAg的ORF,所述HBxAg是功能较少被了解的蛋白质(图1)。这些HBsAg包括3种表面蛋白或抗原(HBsAg):前S1、前S2和大S。
HBsAg的特征说明于图2中。亚型特异性表达中涉及的HBsAg的表位位于包括HBV表面抗原分子的两个外部环的区域(即,S蛋白的氨基酸110-180)中,并且使得HBV病毒株在抗原性方面不同。相同区域含有数目未知表位,所述表位限定HBsAg的为所有已知HBV野生型病毒株所共有的“a”决定簇。
用于HBV感染的预防疫苗和治疗涉及注射从慢性携带者的血浆中纯化的亚病毒颗粒或在稳定转染的真核细胞系中作为重组蛋白质而被产生的亚病毒颗粒。所述亚病毒颗粒是病毒蛋白质,并且这些疫苗通常被称为亚单位疫苗。HBV蛋白被施用给个体并变为个体的免疫***的靶标。在未感染的个体中,针对亚单位疫苗的免疫反应保护所述未感染个体免受HBV感染。在感染个体中,由疫苗诱导的免疫反应可以具有治疗效果。
Chisari F.V.,Am J Pathol.,2000.156:1117-1132和Pumpeus P.等Intervirology 2001.44:98-114公开了HBV基因组结构。Deny P.和F.Zoulim,PathologieBiologie 2010年8月,58(4):245 53讨论了乙型肝炎病毒的诊断和治疗。Michel M.L.和P.Tiollais,Pathologie Biologie2010年8月,58(4):288 95讨论了乙型肝炎疫苗以及它们的保护功效和治疗潜能。PCT公布W02004026899公开了含有具有HBV氨基酸序列的多肽序列的免疫原的用途。PCT公布的申请W02008093976公开了包括包含重组全长HBV表面抗原和HBV核心抗原的疫苗的HBV编码序列、蛋白质和疫苗。整个HBV表面抗原由三种类型的表面蛋白质(L蛋白、M蛋白和S蛋白)组成。PCT公布的申请W02009130588公开了包括编码乙型肝炎病毒核心抗原的核酸的HBV编码序列、蛋白质和疫苗,所述核酸经密码子优化来用于在人中表达。PCT公布W02010127115公开了使用重组载体递送HBV序列。
可用的HBV疫苗已经表现出了一些功效,但生产昂贵。此外,来源于血浆的亚单位疫苗还具有关于安全性方面的担忧。已经研究了若干疫苗方法,所述方法包括基于重组活载体、合成肽以及包含HBV蛋白质的密码子优化编码序列的DNA疫苗的那些方法。这些其它的方法迄今已具有改变的有限功效。此外,由于基因组的差异,一些HBV疫苗已经在一些地理区域内表现积极的功效并在其它区域内表现有限的功效。
当前可用的由用编码S蛋白的DNA转染的酵母产生的HBsAg基疫苗(例如,可自位于比利时的SmithKline Biologicals获得的ENG ERIX-B和可自位于美国的Merck&Co.获得的RECOMBIVAX/HB-VAX II)在约5%至10%的个体中不引发反应(C.Belloni,Immunogenicity of hepatitis B vaccine in term and preterm infants.Acta Paedia trica,1998.87:第336-338页)。另外,在年长个体中,无反应率增加至30%,并且针对HBV的免疫性可在疫苗接种之后若干年降低。多次剂量也用于获得完全保护。应关注有关HBsAg基疫苗ENGERI X-B的安全性,因为ENGERIX-B使中枢神经***(CNS)炎症性脱髓鞘的风险增加三倍。
除S蛋白之外,由哺乳动物细胞产生的其它HBsAg基疫苗也利用前S1和前S2。前S1和前S2抗原表达高度免疫原性T细胞和B细胞表位,并且一种所述疫苗在约80%的非反应性或低反应性个体中引发免疫反应(Rendi-Wagner,P.等,Comparative immunogenicity ofPreS/S hepatitis B vaccine in non-and low responders to conventionalvaccine.Vaccine,2006.24:第2781-9页.)。
已经研究直接施用核酸序列来针对动物和人疾病进行疫苗接种,并且很多努力集中在核酸递送的有效且高效的手段上,以便产生所需抗原的必要表达,从而引起免疫原性反应和最终这个技术的成功。
DNA疫苗允许内源性抗原合成,这诱导CD8+组织相容性的复杂的I类受限的细胞毒性T淋巴细胞,所述淋巴细胞用亚单位疫苗很少获得。此外,一段持续的时期内发生的抗原合成可以有助于克服低响应性并除去或减少强化注射的需要。另外,DNA疫苗似乎非常稳定且生产简单。
DNA疫苗安全、稳定、易于生产,并且在人中耐受良好,其中临床前实验指示几乎没有质粒整合迹象[Martin,T.等,Plasmid DNA malaria vaccine:the potential forgenomic integration after intramus cular injection.Hum Gene Ther,1999.10(5):第759-68页;Nichols,W.W.等,Potential DNA vaccine integration into host cellgenome.A nn N Y Acad Sci,1995.772:第30-9页]。此外,DNA疫苗非常适合用于重复施用,这是因为这样的事实,即疫苗的功效不受预先存在的对载体的抗体滴度的影响[Chattergoon,M.,J.Boyer和D.B.Weine r,Genetic immunization:a new era invaccines and immune therap eutics.FASEB J,1997.11(10):第753-63页]。然而,对于临床上采用DNA疫苗的一个主要障碍是当移动到较大动物身上时平台的免疫原性减小[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,Human clinical trials of plasmid DNA vaccines.Adv Genet,2005.55:第25-40页]。
在DNA疫苗免疫原的工程方面的最近的技术进步已经改善了DNA疫苗的表达和免疫原性,这些技术如密码子优化、RNA优化和免疫球蛋白前导序列的添加[Andre,S.等,Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120sequence with optimized codon usage.J Virol,1998.72(2):第1497-503页;Deml,L.等,Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiencyvirus type 1Gag protein.J Virol,2001.75(22):第10991-1001页;Laddy,D.J.等,Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avianinfluenza.Vaccine,2007.25(16):第2984-9页;Frelin,L.等,Codon optimization andmRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis Cvirus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther,2004.11(6):第522-33页],以及在质粒递送***方面的最近开发的技术,如电穿孔[Hirao,L.A.等,Intradermal/subcutaneousimmunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potencyin pigs and rhesus macaques.Vaccine,2008.26(3):第440-8页;Luckay,A.等,Effectof plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resultingvaccine-specific immune responses in rhesus macaques.J Virol,2007.81(10):第5257-69页;Ahlen,G.等,In vivo electroporation enhances the immunogenicity ofhepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake,protein expression,inflammation,and infiltration of CD3+T cells.J Immunol,2007.179(7):第4741-53页]。体内电穿孔技术在人临床试验中已被用来递送抗癌药物如博来霉素并且在很多临床前研究中被用于大量的动物物种上。此外,研究已表明使用共有免疫原与单独的天然抗原相比能够增加细胞免疫反应的幅度[Yan,J.等,Enhanced cellularimmune responses elicited by an engineered HIV-1subtype B consensus-basedenvelope DNA vaccine.Mol Ther,2007.15(2):第411-21页;Rolland,M.等,Reconstruction and function of ancestral center-of-tree humanimmunodeficiency virus type 1 proteins.J Virol,2007.81(16):第8507-14页]。
针对不同HBV抗原的抗体和细胞毒性T细胞(CTL)可涉及于降低病毒载量以及自肝脏清除HBV感染的细胞中。当前疫苗候选物的主要挑战已为诱导针对多种HBV抗原靶标以及针对HBV的主要基因型的体液免疫性与细胞免疫性两者。依然存在对编码HBV蛋白的核酸构建体和适用于诱导针对HBV的免疫反应的组合物的需要。依然存在对经济而有效的针对HBV的有效疫苗的需要。依然存在对增加中和抗体的水平并引发T细胞组分的有效疫苗的需要。依然存在对针对HBV的有效疫苗,包括针对具有广泛基因型范围的HBV病毒株有效的那些疫苗,并且优选地为全球范围内有效的通用疫苗的需要。
发明概述
本发明涉及一种疫苗,其包含:(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6;(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、在SEQ ID NO:10的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质和在SEQ ID NO:14的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质;以及(c)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、在SEQ ID NO:12的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质和在SEQID NO:16的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质。所述核酸分子可包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。
本发明还可涉及一种疫苗,其包含(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6;(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、在SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的蛋白质和在SEQ ID NO:14的全长氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的蛋白质;以及(c)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、在SEQ ID NO:12的全长氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的蛋白质和在SEQ ID NO:16的全长氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的蛋白质。
疫苗可为包含上述核酸的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合;并且在一些实施方案中,可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
本发明也涉及一种诱导针对HBV抗原的免疫反应的方法,所述方法包括向受试者施用本发明的疫苗。
本发明也涉及一种保护受试者免受HBV感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的疫苗。
本发明进一步涉及一种保护已诊断有HBV感染的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的疫苗。
本发明还包括适用于诱导针对HBV的免疫反应的疫苗。具有针对多种基因型的广泛效力的HBV免疫治疗疫苗的开发可以基于靶向普遍保存的HBV核心特异性抗原,使用针对HBV感染的治疗性DNA疫苗来提供。利用共有HBV免疫原诱导了更广泛的细胞免疫反应,并且可以适用于使在不同病毒株间的序列相异程度减至最低。
本文提供选自由以下组成的组的蛋白质:包含SEQ ID NO:2的蛋白质;在SEQ IDNO:2的氨基酸序列的整个长度上95%相同的蛋白质;SEQ ID NO:2的片段;与SEQ ID NO:2的片段95%相同的蛋白质;SEQ ID NO:4;在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的整个长度上95%相同的蛋白质;SEQ ID NO:4的片段;与SEQ ID NO:4的片段95%相同的蛋白质;SEQ ID NO:6;在SEQ ID NO:6的氨基酸序列的整个长度上95%相同的蛋白质;SEQ ID NO:6的片段;以及与SEQ ID NO:6的片段95%相同的蛋白质。
本文还提供一种选自由以下组成的组的蛋白质:(a)SEQ ID NO:2;(b)在如SEQ IDNO:2所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的蛋白质;(c)SEQ ID NO:2的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段;以及(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上95%相同的蛋白质的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。
还提供包含编码上文所述的一种或多种蛋白质分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中,所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:1;在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的整个长度上95%相同的核酸序列;SEQ ID NO:1的片段;与SEQ ID NO:1的片段95%相同的核酸序列;SEQ ID NO:3;在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的整个长度上95%相同的核酸序列;SEQ ID NO:3的片段;与SEQ ID NO:3的片段95%相同的核酸序列;SEQ IDNO:5;在SEQ ID NO:5的氨基酸序列的整个长度上95%相同的核酸序列;SEQ ID NO:5的片段;以及与SEQ ID NO:5的片段95%相同的核酸序列。
本发明一些方面提供诱导针对HBV的免疫反应的方法,所述方法包括以下步骤:向个体施用HBV核心抗原和/或HBV表面抗原分子和/或组合物。
本发明另外的方面提供保护个体免受HBV感染的方法。所述方法包括以下步骤:向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物;其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达,并且针对由所述核酸序列编码的蛋白质诱导保护性免疫反应。
在本发明的一些方面,提供用于治疗已经被HBV感染的个体的方法。所述方法包括以下步骤:向所述个体施用治疗有效量的此类核酸分子和/或组合物。
在另一方面,本发明提供一种包含编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的编码序列的核酸分子:(a)包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的蛋白质;(b)在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质;(c)包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:16的蛋白质的为至少20个氨基酸的免疫原性片段;以及(d)在SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质的为至少20个氨基酸的免疫原性片段。
核酸分子可包含一个或多个选自由以下组成的组的序列:(a)包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的核酸序列;(b)在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的整个长度上98%相同的核酸序列;(c)其片段,所述片段包含编码免疫原性片段的核酸序列,所述免疫原性片段包含由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15编码的至少20个氨基酸;以及(d)其片段,所述片段包含编码免疫原性片段的核酸序列,所述免疫原性片段包含在由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15编码的蛋白质的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质的至少20个氨基酸。核酸分子可为质粒。核酸分子可为表达载体,并且编码所述一种或多种蛋白质的序列可操作地连接至调控元件。核酸分子可被并入病毒颗粒中。
本发明的一些方面提供一种诱导针对HBV抗原的免疫反应的方法,所述方法包括向受试者施用本发明的核酸分子。
本发明的一些方面提供一种保护受试者免受HBV感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的核酸分子。
本发明的一些方面提供一种保护已诊断有HBV感染的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的核酸分子。
在另一方面,本发明提供一种选自由以下组成的组的蛋白质:(a)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16;(b)在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质;(c)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段;以及(d)在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的整个长度上98%相同的蛋白质的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。
本发明的一些方面提供一种适用于在受试者中产生针对HBV的免疫反应的疫苗,所述疫苗包含:本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合;并且在一些实施方案中,可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
附图简述
图1是示出由四个重叠的ORF组成的HBV基因组的结构的示意图。
图2说明HBV表面抗原的组构和特征。
图3说明共有HBV表面抗原中的IgELS和内切蛋白水解裂解位点。
图4说明长共有HBV表面抗原(LHBs)和小共有HBV表面抗原(SHBs)。
图5是载体pGX1801HepB-Mcore(SEQ ID NO:17)的图。
图6是载体pGX1802HepB pLHBs-A(SEQ ID NO:18)的图。
图7是载体pGX1803HepB pLHBs-C(SEQ ID NO:19)的图。
图8是载体pGX1804HepB pSHBs-A(SEQ ID NO:20)的图。
图9是载体pGX1805HepB SHBs-C(SEQ ID NO:21)的图。
图10说明HBcAg共有序列相较于个别基因型A、B、C、D和E的***发生分析。
图11A和图11B示出了来自pM Core表达实验的结果。图11A示出了来自体外翻译方案的结果。图11B示出了蛋白质印迹的结果。
图12是说明pMCore的质粒图谱和序列的图。
图13显示使用pMCore质粒的转录/翻译反应,其中所得M核心蛋白用抗HA单克隆抗体免疫沉淀,并且在SDS-PAGE凝胶上跑电泳。
图14显示使用单克隆HA标签一抗检测短暂转染的细胞中的M核心蛋白,继之以用DyLight 594标记的抗兔二抗检测。Hoechst染色也用于荧光标记细胞核。M核心的表达主要定位于细胞质,如通过核外部的染色所示。
图15说明免疫流程。4只小鼠用30μg pMCore肌肉内免疫。
图16显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ分泌量值增强。
图17显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ分泌量值增强。
图18显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的TNF-α分泌量值增强。
图19显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的TNF-α分泌量值增强。
图20显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的CD 107a分泌量值增强。
图21显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的CD 107a分泌量值增强。
图22显示来自用对照pVAX或共有核心抗原pMCore免疫的Ba lb/c小鼠的HBcAg特异性CD4或CD8IFN-γ+、TNF-α+分泌细胞的平均百分比。
图23显示来自用对照pVAX或共有核心抗原pMCore免疫的Balb/c小鼠的HBcAg特异性CD4或CD8双重阳性产生性细胞的平均百分比。
图24显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的肝脏中的干扰素-γT细胞反应。
图25显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的肝脏中的干扰素-γT细胞反应。
图26显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的肝脏中的肿瘤坏死因子-αT细胞反应。
图27显示来自用pM-Core疫苗接种的Balb/C小鼠的肝脏中的肿瘤坏死因子-αT细胞反应。
图28显示用对照pVAX或共有核心抗原pMCore免疫的Balb/c小鼠的肝脏中的HBcAg特异性CD4和CD8IFN-γ+、TNF-α+产生性细胞的百分比。
图29显示用对照pVAX或共有核心抗原pMCore免疫的Balb/c小鼠的肝脏中的HBcAg特异性CD4或CD8双重阳性产生性细胞的平均百分比。
图30显示抗原特异性抗体产生性脾脏细胞。值是平均值±平均值的标准误差。通过学生t检验来确定显著性。
图31示出了来自ELISPOT测定的数据。
图32显示在刺激来自免疫的小鼠的脾细胞之后,每百万个脾细胞的HBcAg特异性IFN-γ斑点形成单位(SFU)的频率。
图33示出了来自实验的数据,所述实验使用CSFE标记的细胞来比较进行疫苗接种和未进行疫苗接种的动物中由CD8 T细胞体内除去体内肽处理的靶细胞。
图34显示体内特异性杀伤。两组用pVax(对照)或pMCore免疫的小鼠通过尾部静脉接受CFSE标记的靶细胞(CFSElo用不相关肽脉冲处理,或CFSEhi用表位特异性肽脉冲处理)。回收CFSE标记的细胞,并且通过FACS进行的分析用于定量杀伤百分比。
图35示出了用pVax载体(对照)或者用表达HBV M-核心的质粒pMCore处理的CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+的增殖百分比的比较。
图36显示CD4和CD8 T细胞的增殖百分比。
图37A和图37B示出了来自用pVax载体(对照)或者用表达HBV M-核心的质粒pMCore处理的动物的系列稀释的血清中的抗-HBV核心IgG和IgA的比较。
图38显示血清和脾细胞中由pMCore诱导的HBcAg特异性体液免疫反应。值是平均值±平均值标准误差。通过学生t检验来确定显著性。
图39显示血清和脾细胞中由pMCore诱导的HBcAg特异性体液免疫反应。值是平均值±平均值的标准误差。通过学生t检验来确定显著性。
图40显示来自CD4+和CD8+脾和肝细胞的TNF-α和IFN-γ的百分比。
图41显示来自通过测量血清中的ALT水平来确定由免疫小鼠所诱导的清除是否影响肝脏的实验中的数据。
图42显示在流体动力学注射PBS、pMCore(HBcAg)或pNS3/4A(HCV NS3-4A)之后三天自初始实验小鼠或用pMcore免疫的小鼠获取的肝脏切片的免疫染色。相较于NS3/4a转染的对照肝脏,对于pMCore免疫的肝脏而言,清除率高得多。用抗HA抗体检测PMcore或NS3/4A表达(白色/浅灰色细胞)。
图43显示转染后3天,其中在用HBcAg肽刺激之后,分析细胞的脱粒标记表达(CD107a)和IFN-γ+表达。
图44显示测量转染后第3、6和12天的血清ALT水平,并且显示没有相关接种疫苗的动物中的血清ALT水平升高的证据。
图45显示用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHb C)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴中的总细胞免疫反应。
图46显示用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHb C)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴中的核心特异性细胞免疫反应。
图47显示用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHb C)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴中的表面抗原A特异性细胞免疫反应。
图48显示来自用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHbC)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴中的ELISPOT测定表面抗原C特异性细胞免疫反应的数据。
图49显示用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHb C)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴中的总细胞免疫反应。
图50显示来自用小(即,pMCore、pSHb A和pSHb C)、长(即,pMCore、pLHb A和pLHbC)和长+IL-12(即,pMCore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的猴的系列血清稀释液中的抗HBV抗体的比较。
图51显示来自用长+IL-12(即,pMcore、pLHb A、pLHb C和prlIL-12)疫苗免疫的动物的系列稀释液中的抗HBV抗体的比较。
图52显示HBV表面抗原DNA构建体和它们的表达。(A)基因型A和C的HBs共有序列相较于天然HBs的***发生分析。共有序列用星号指示。(B)DNA质粒中的HBs基因***物的示意图。pLHBs和pSHBs表示大和小HBs蛋白抗原。前S1、前S2和大S蛋白用内切蛋白水解裂解位点连接。(C)通过用单克隆抗体和多克隆小鼠血清对转染的RD细胞进行细胞内染色来检测pLHBs和pSHBs。
图53显示pLHBs与SHBs两者均在Balb/c中引发强力抗体和T细胞反应。将每组五只Balb/c小鼠在三个不同实验中进行免疫,并且分析它们对体液反应与细胞反应两者的的诱导。(A)在各次免疫之后一周测量的HBs特异性IgG反应。箭头指示免疫时间点。(B)由各构建体诱导的针对合成前S1/S2和大S肽的总IFN-γ反应。(C)通过使用个别HBs肽表征LHBs和SHBs的分别16和12种基质集合中的HBs特异性免疫显性表位。这显示细胞介导的免疫反应的幅度增强。
图54显示体内特异性杀伤。不同组的用pVax(对照)或四种HBs构建体中的任一种免疫的小鼠通过尾部静脉接受CFSE标记的靶标细胞(CFSElo用不相关肽脉冲处理,或CFSEhi用表位特异性肽脉冲处理)。回收CFSE标记的细胞,并且通过FACS(荧光活化的细胞分选)进行的分析用于定量杀伤百分比。
图55显示HBc/HBs疫苗混合物诱导强力免疫反应。(A)来自用HBs/HBc疫苗混合物在不同免疫时间点(箭头)免疫的小鼠的血清的HBs特异性抗体反应。(B)在离体刺激来自HBs/HBc混合物免疫的小鼠的脾细胞之后的IFN-γ反应。免疫的小鼠对核心抗原肽与表面抗原肽两者起反应。
图56显示抗原特异性CD8 T细胞诱导抗病毒细胞因子。在离体刺激来自不同免疫组的balb/c小鼠的脾细胞(表3)之后对抗病毒细胞因子的细胞内染色。淋巴细胞用针对CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a的抗体染色。这个数据代表3个不同实验中的每组4只小鼠。
图57显示在非人灵长类动物中的免疫原性。五只恒河猴用pSHBs/pMCore、pLHBs/pMCore或pLHBs/pMCore+pIL-12肌肉内免疫(表4),继之以电穿孔。所述猴接受三次免疫。(A)在仅2次免疫之后就观察到针对HBs的高抗体效价。(B)在首次免疫之前立刻以及在各次免疫之后2周测量IFN-γ反应。(C)在来自不同组的大多数猴中观察到许多阳性HBs基质肽集合,从而确认在免疫的猕猴中具有广泛T细胞反应。(D)在末次免疫之后对PBMC的细胞内染色(IFN-γ、TNF-α、IL-2)显示在CD4与CD8两者中均存在HBs和HBc特异性抗病毒细胞因子产生。
图58A-58D显示治疗性HBV疫苗在恒河猴中的安全性。在疫苗接种之前(前)、在第三次疫苗接种之后(第3次)、在第四次疫苗接种之前(第4次前)、在第四次疫苗接种之后(第4次)分析样本。在第三次疫苗接种之后,碱性磷酸酶存在测定误差。所有测量值的正常范围都由虚线来描绘。(A)血清碱性磷酸酶。(B)血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。(C)血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平。(D)血清总胆红素水平。(E)血清肌酸酐水平。(F)血清血液尿素氮水平。
图59A-59D显示四个HBs质粒的序列注释。将IgE前导物、内切蛋白水解裂解位点和C末端HA标签的序列加下划线。四个HBs质粒是:基因型A大表面蛋白(pLHBs-A)(A)和小表面蛋白(pSHBs-A)(B)以及基因型C大表面蛋白(pLHBs-C)(C)和小表面蛋白(pSHBs-C)(D)。
详述
本发明涉及引发针对HBV表面(HBs)和HBV核心(HBc)抗原的抗体介导的免疫性与细胞介导的免疫性两者的高度优化的多价合成乙型肝炎病毒(HBV)免疫原。编码病毒的最流行基因型的这些质粒诱导针对HBs抗原的结合抗体,并且驱动针对HBc抗原与HBs抗原两者的强力细胞介导的免疫性(CMI)。质粒独立地引发广泛交叉反应性T细胞反应和高效价抗体反应以及疫苗诱导的细胞毒性活性。含有两种表面抗原的质粒混合物诱导跨越多种抗原表位的强烈并且广泛的细胞免疫反应,具体来说,诱导病毒的A基因型与C基因型之间的交叉反应性。编码HBs和HBc抗原的优化质粒混合物诱导靶向S抗原的强烈体液和细胞反应,并且驱动涉及清除受感染肝细胞的不同多表位反应。
具体来说,本发明涉及针对乙型肝炎病毒(HBV)的可用于保护个体免受HBV感染,并且向诊断有HBV感染的个体提供治疗益处的疫苗。所述疫苗也可用于诱导针对HBV抗原的免疫反应。本发明的HBV疫苗包括一种或多种核酸分子。具体来说,核酸分子编码一种或多种共有HBV核心蛋白。共有HBV核心蛋白源于来自基因型A、B、C、D和E的核心蛋白的序列,并且因此共有HBV核心蛋白是独特的。核酸分子也可编码共有HBV核心蛋白的一个或多个免疫原性片段。
另外,核酸分子可编码一种或多种共有HBV表面抗原。共有HBV表面抗原源于来自HBV基因型A的分离株的表面抗原的序列,并且因此共有HBV表面抗原是独特的。共有HBV表面抗原也可源于来自HBV基因型C的分离株的表面抗原的序列,从而产生独特的HBV表面抗原。核酸分子也可编码共有HBV表面抗原的一个或多个免疫原性片段。
本发明的疫苗可包括编码共有HBV核心蛋白的核酸分子和/或编码共有HBV表面抗原的核酸分子的任何组合。疫苗也可包括编码共有HBV核心蛋白的免疫原性片段的核酸分子和/或编码共有HBV表面抗原的免疫原性片段的核酸分子的任何组合。
HBV核心蛋白和HBV表面抗原的这些组合惊人地并且出乎意料地诱导对HBV核心蛋白和HBV表面抗原的差异性免疫反应。换句话说,取决于向受试者施用的特定组合,对HBV核心蛋白和HBV表面抗原的免疫反应的强度不同。因此,本发明的疫苗的任何使用者都可设计包含特定组合以在施用所述设计的疫苗的受试者中诱导所需免疫反应的疫苗。因此,任何使用者都可定制本发明的疫苗以控制受试者中的免疫反应的程度。
由于HBV核心蛋白和HBV表面抗原的独特共有序列,本发明的疫苗可广泛适用于多种类型的HBV。
本发明的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白质。
1.定义.
本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用,除上下文另外明确规定之外,单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
对于本文所列举的数值范围,明确涵盖了在有相同精密度之间的每个***的数字。例如,对于6-9的范围,除了6和9外还涵盖数字7和8,并且对于6.0-7.0的范围,明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的DNA质粒疫苗中来增强由下文所述的DNA质粒和编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体,或片段、其片段或衍生物,包括Fab、F(ab′)2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物,所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号,所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。
如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如,A-T/U和C-G)或者胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。
如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定HBV抗原(如HBV核心或表面抗原)的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白质的疫苗可以被用来诱导针对特定HBV抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫,所述疫苗包含编码这些蛋白质的共有序列和/或核酸分子。
如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙);它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。
如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株HBV抗原交叉反应的哺乳动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。
就多肽序列来说,“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株HBV抗原交叉反应的哺乳动物中引发免疫反应的多肽。共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些实施方案中,共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。
如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号,所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“表达形式”是指基因构建体,所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必须的调控元件,以使得当存在于所述个体的细胞中时,编码序列将表达。
如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即,同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时,如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时,如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即,是单链核酸模板序列的互补序列)。
在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下,如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比:最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量,并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下,单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时,胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。
如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如HBV共有抗原的引入,宿主的免疫***(例如哺乳动物的免疫***)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此,核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此,核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此,核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体,其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合,以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。
如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下,启动子可以被定位在基因的5′(上游)或者3′(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知,这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子,所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件,它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的HBV蛋白质的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部***解,所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端。
如本文所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件,即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如,探针)将与第二核酸序列(例如,靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下),在所述温度下与靶标互补的50%的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在,在Tm下,50%的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件,即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子,如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐),并且温度对于短的探针(例如,约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如,大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交,阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下:50%甲酰胺、5x SSC以及1%SDS、在42℃下孵育,或者5x SSC、1%SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1%SDS洗涤。
如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同,或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。
如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同的,或者就核酸而言,如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补,则第一序列和第二序列也这样相同。
“亚型”或“血清型”:如本文交换使用的并且关于HBV,意指HBV的基因变体,以使得一个亚型被免疫***识别而从不同的亚型中分离。
本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段;(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体;(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸;或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的***、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同,但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质,所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代,即以相似特性(例如,亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸,在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的,这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面,亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性,这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。美国专利号4,554,101以引用方式全部并入本文。如本领域所了解的,具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是,与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性,并且特别是那些氨基酸的侧链,如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。
如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体,并优选地是DNA质粒。
2.疫苗
本发明涉及一种乙型肝炎疫苗。乙型肝炎疫苗(HBV)可包含编码HBV核心抗原、HBV表面抗原或其组合的核酸;HBV核心抗原、HBV表面抗原或其组合、或(1)编码HBV核心抗原和/或HBV表面抗原的核酸,和(2)HBV核心抗原和/或HBV表面抗原,或(3)其组合的组合。HBV核心抗原可包含源于来自多种HBV基因型的核心蛋白的氨基酸序列的共有蛋白质。类似地,HBV表面抗原可包含源于来自多种HBV基因型的表面抗原的氨基酸序列的共有蛋白质。所述共有HBV核心蛋白和共有HBV表面抗原是独特的,并且分别与跨越多种HBV基因型的核心和表面抗原具有类似性。因此,本发明的疫苗可适用于多种类型的HBV,并且适用于广泛分布的人群。另外,本发明的疫苗可针对编码共有HBV核心蛋白、共有HBV表面蛋白或其组合的特定核酸加以定制。换句话说,本发明的疫苗可被设计来控制受试者中针对一种或多种HBV血清型的免疫反应的程度或强度。
疫苗可为DNA疫苗。DNA疫苗公开于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594中,所述专利以引用的方式完全并入本文。DNA疫苗可还包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。
疫苗可为HBV核心蛋白和/或HBV表面抗原蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。
a.HBV核心抗原
本发明的疫苗可包含HBV核心蛋白。HBV核心蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应,或优选所有以上提及的反应,以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。
表2示出了来自HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-D和HBV-E基因型的带有共有HBV核心蛋白的核心抗原的基因型之间的相似性,所述核心抗原在图表中被称为“HBV-M-核心”。对于一些实施方案,HBV M核心构建体被设计为具有对广泛的HBV核心靶标的增加的同源性。核心抗原与设计的M核心构建体的基因型类似性使与广泛HBV核心靶标的同源性增加。所有的基因型应该以HBV的通用免疫治疗疫苗来代表。
表2 HBV核心蛋白的同一性百分比
所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的核心蛋白表位,可针对所述免疫原诱导抗HBV免疫反应。HBV抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。
HBV核心抗原可包含共有蛋白质。HBV共有核心抗原以全身性与在肝脏中两种方式诱导抗原特异性T细胞和高效价抗体反应。因此,包含HBV共有核心抗原的疫苗向肝脏提供保护性免疫反应。因此,任何使用者都可设计本发明的疫苗以包括HBV共有核心抗原来向肝脏提供免疫基疗法和/或保护。
具体来说,在诱导的免疫反应中,HBV共有核心抗原刺激脾细胞(具体来说是CD4+细胞和CD8+细胞)分泌或产生类似量的干扰素-γ(INF-γ),但不同量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。引起关注的是,脾脏和肝脏中诱导的免疫反应不同。在脾脏中,多于CD4+细胞的CD8+细胞产生INF-γ与TNF-α两者,然而,在肝脏中,发生相反情况。换句话说,在肝脏中,多于CD8+细胞的CD4+细胞产生INF-γ与TNF-α两者。另外,在肝脏中,产生的抗原特异性IgA多于IgG,并且保护性免疫反应惊人地并出乎意料地包括不导致肝脏损伤的抗原特异性CTL反应。因此,包含HBV共有核心抗原的本发明的疫苗可在外周中递送以建立对肝脏的抗原特异性靶向作用来清除或消除HBV感染的细胞而不导致对肝脏的损害或肝脏的炎症。
编码共有HBV核心蛋白的核酸序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。SEQ ID NO:1编码HBV共有核心蛋白。SEQ ID NO:3编码连接于IgE前导物的HBV共有核心蛋白。SEQ ID NO:5编码连接于IgE前导物和HA标签的HBV共有核心蛋白。
一些实施方案涉及编码与HBV共有蛋白、HBV共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白质的免疫原性片段相同或同源的蛋白质的核酸序列。可提供编码在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达95%同一性、在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达97%同一性、在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达98%同一性以及在共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达99%同一性的免疫原性蛋白质的所述核酸分子。同样,也提供编码本文所述的免疫原性片段和与本文所述的蛋白质相同的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白质的与本文核酸编码序列具有95%同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白质的与本文核酸编码序列具有96%同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白质的与本文核酸编码序列具有97%同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白质的与本文核酸编码序列具有98%同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白质的与本文核酸编码序列具有99%同源性的核酸分子。在一些实施方案中,具有与本文所公开的共有蛋白的编码序列同源的本文所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白质序列的编码序列的5’末端的序列。
一些实施方案涉及编码在全长HBV核心共有蛋白、HBV核心共有蛋白的免疫原性片段和各种HBV核心共有蛋白的各种免疫原性片段的氨基酸序列的整个长度上具有特定同一性百分比的蛋白质的核酸序列。可提供编码在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达80%同一性、在全共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达85%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达90%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达91%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达92%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达93%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达94%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达95%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达97%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达98%同一性、在全长HBV核心共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达99%同一性的免疫原性蛋白质的所述核酸分子。同样,也提供编码本文所述的免疫原性片段和与本文所述的HBV核心蛋白具有如上指示的类似同一性百分比的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有80%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有83%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有85%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有90%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有91%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有92%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有93%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有94%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有95%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有96%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有97%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有98%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV核心蛋白编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有99%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。在一些实施方案中,具有与本文公开的共有HBV核心蛋白的编码序列同源的本文公开的编码序列的核酸分子包括编码IgE前导序列的序列,所述IgE前导序列连接于编码本文公开的同源蛋白质序列的编码序列的5’末端。
在一些实施方案中,所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中,所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的片段。片段可以是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少99%的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQID NO:5。片段可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的片段至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。片段可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的片段至少80%、至少85%、至少90%至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在一些实施方案中,片段包含编码前导序列的序列,例如免疫球蛋白前导物,如IgE前导物。在一些实施方案中,片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中,片段不含编码前导序列,例如像IgE前导物的编码序列。
此外,共有HBV核心蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。连接于IgE前导物的共有HBV核心蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:4。具体来说,在SEQ ID NO:4中,IgE前导物连接于共有HBV核心蛋白的氨基末端。连接于IgE前导物和HA标签的共有HBV核心蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:6。在SEQ ID NO:6中,IgE前导物和HA标签分别连接于共有HBV核心蛋白的氨基末端和羧基末端。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6同源的蛋白质。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的共有蛋白质序列具有95%同源性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的共有蛋白质序列具有96%同源性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的共有蛋白质序列具有97%同源性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的共有蛋白质序列具有98%同源性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及与如SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的共有蛋白质序列具有99%同源性的免疫原性蛋白质。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。
在一些实施方案中,蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中,蛋白质不含IgE前导物。共有蛋白质的片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的共有蛋白质。可提供SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6。在一些实施方案中,片段包括前导序列,例如像免疫球蛋白前导物,如IgE前导物。在一些实施方案中,片段不含前导序列。在一些实施方案中,片段不含前导序列,例如像IgE前导物。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的免疫原性片段同源的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6 95%同源的蛋白质。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96%同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97%同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98%同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99%同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中,片段包括前导序列,例如像免疫球蛋白前导序列,如IgE前导物。在一些实施方案中,片段不含前导序列。在一些实施方案中,片段不含前导序列,例如像IgE前导物。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的免疫原性片段相同的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列的整个长度上80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的蛋白质。在一些实施方案中,片段包括前导序列,例如像免疫球蛋白前导物,如IgE前导物。在一些实施方案中,片段不含前导序列。在一些实施方案中,片段不含前导序列,例如像IgE前导物。
如本文关于使信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所提及,所述信号肽/前导序列替换蛋白质的N末端甲硫氨酸,所述N末端甲硫氨酸由编码所述蛋白质的无信号肽编码序列的核酸序列的起始密码子编码。因此,举例来说,SEQ ID NO:4是具有连接在SEQ IDNO:2的N末端的信号肽/前导序列的SEQ ID NO:2,即SEQ ID NO:4是包含连接于SEQ ID NO:2的N末端的信号肽的蛋白质。当不存在信号肽时,SEQ ID NO:2中的第一残基“Xaa”通常是甲硫氨酸。然而,包含连接于SEQ ID NO:2的信号肽的蛋白质(如SEQ ID NO:4)用使信号肽连接于蛋白质的残基置换Xaa处的1个甲硫氨酸。因此,SEQ ID NO:2的N末端残基可为任何残基,但如果它是由起始序列编码,那么它是甲硫氨酸。在SEQ ID NO:2的N末端连接信号肽/前导序列通常会消除N末端甲硫氨酸。如本文所用,纵使消除SEQ ID NO:2的N末端Xaa残基,仍然意图SEQ ID NO:4包含具有连接在SEQ ID NO:2的N末端的信号肽/前导序列的SEQID NO:2。类似地,SEQ ID NO:4的编码序列包含SEQ ID NO:2的编码序列,其中信号肽/前导序列的编码序列连接于编码SEQ ID NO:2的编码序列的5’末端。在SEQ ID NO:2的编码序列中,起始密码子可为“nnn”,但它在信号肽/前导序列的编码序列连接于编码SEQ ID NO:2的编码序列的5’末端时被消除。如本文所用,意图SEQ ID NO:4的编码序列包含SEQ ID NO:2的编码序列,其中信号肽/前导序列的编码序列连接在SEQ ID NO:2的编码序列的存在nnn的5’末端。因此,举例来说,意图SEQ ID NO:3包含SEQ ID NO:1,其中信号肽/前导序列的编码序列替代nnn连接在SEQ ID NO:1的5’末端。在一些实施方案中,nnn是在SEQ ID NO:1的5’末端的起始密码子。
b.HBV表面抗原
疫苗可包含HBV表面抗原。本文提供能够在哺乳动物中引发针对一种或多种HBV血清型的免疫反应的HBV表面抗原。表面抗原可包含使得它们特别有效作为可诱导抗HBV免疫反应所针对的免疫原的表面蛋白表位。HBV表面抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。
HBV表面抗原可包含共有蛋白质。自来自HBV基因型A或C的初级分离株的表面抗原的序列产生共有HBV表面抗原。具体来说,共有HBV表面抗原包括S蛋白或S蛋白、前S2和前S1的组合(图3和4)。将内切蛋白水解裂解位点引入共有HBV表面抗原中以提供适当蛋白质折叠和较好CTL加工。改进共有HBV表面抗原中的密码子使用以反映人基因的密码子偏好。另外,避免具有极高(例如,大于80%)或极低(例如,小于30%)GC含量的区域,因为所述区域中存在顺式作用基序(如内部TATA框)、重复序列和结构化序列。将Kozak序列引入共有HBV表面抗原中以增加翻译起始,并且添加IgE前导序列以增加蛋白质表达。
编码共有HBV表面抗原的核酸序列是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。SEQ ID NO:9编码源于基因型A,并且包括S蛋白、前S2和前S1的长共有HBV表面抗原蛋白(LHBs-A)。SEQ ID NO:11编码源于基因型C,并且包括S蛋白、前S2和前S1的长共有HBV表面抗原蛋白(LHBs-C)。SEQ ID NO:13编码源于基因型A,并且包括S蛋白的短共有HBV表面抗原蛋白(SHBs-A)。SEQ ID NO:15编码源于基因型C,并且包括S蛋白的短共有HBV表面抗原蛋白(SHBs-C)。
一些实施方案涉及编码在共有HBV表面抗原、共有HBV表面抗原的免疫原性片段和相同蛋白质的免疫原性片段的氨基酸序列的整个长度上相同的蛋白质的核酸序列。因此,可提供编码在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达95%同一性、在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达97%同一性、在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达98%同一性、以及在共有HBV表面抗原序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达99%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。同样,也提供编码本文所述的免疫原性片段和在本文所述的HBV表面抗原蛋白的氨基酸序列的整个长度上相同的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及编码在本文核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有95%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有96%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有97%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度具上有98%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有99%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。在一些实施方案中,具有在本文公开的共有HBV表面抗原蛋白的编码序列的氨基酸序列的整个长度上相同的本文公开的编码序列的核酸分子包括编码IgE前导序列的序列,所述IgE前导序列连接于编码本文公开的相同蛋白质序列的编码序列的5’末端。
一些实施方案涉及编码在全长HBV表面抗原共有蛋白、HBV表面抗原共有蛋白的免疫原性片段和各种HBV表面抗原共有蛋白的各种免疫原性片段的氨基酸序列的整个长度上具有特定同一性百分比的蛋白质的核酸序列。可提供编码在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达80%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达85%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达90%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达91%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达92%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达93%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达94%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达95%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达96%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达97%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达98%同一性、在全长HBV表面抗原共有序列的氨基酸序列的整个长度上具有多达99%同一性的免疫原性蛋白质的所述核酸分子。同样,也提供编码本文所述的免疫原性片段和与本文所述的HBV表面抗原蛋白具有如上指示的类似同一性百分比的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有80%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有83%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有85%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有90%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有91%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有92%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有93%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有94%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有95%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有96%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有97%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有98%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。一些实施方案涉及编码在本文全长核酸HBV表面抗原编码序列的氨基酸序列的整个长度上具有99%同一性的免疫原性蛋白质的核酸分子。在一些实施方案中,具有在本文公开的共有HBV表面抗原蛋白的编码序列的氨基酸序列的整个长度上相同的本文公开的编码HBV表面抗原序列的核酸分子包括编码IgE前导序列的序列,所述IgE前导序列连接于编码本文公开的相同蛋白质序列的编码序列的5’末端。
在一些实施方案中,核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中,核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的片段。片段可为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15。片段可与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:15的片段至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。片段可与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的片段至少80%、至少85%、至少90%至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在一些实施方案中,片段包括编码前导序列,例如像免疫球蛋白前导序列,如IgE前导物的序列。在一些实施方案中,片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中,片段不含编码前导序列,如IgE前导物的编码序列。
此外,共有HBV表面抗原LHBs-A、LHBs-C、SHBs-A和SHBs-C的氨基酸序列分别是SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
蛋白质可与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16相同。一些实施方案涉及在本文共有蛋白质序列的整个氨基酸序列长度上具有95%同一性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及在本文共有蛋白质序列的整个氨基酸序列长度上具有96%同一性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及在本文共有蛋白质序列的整个氨基酸序列长度上具有97%同一性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及在本文共有蛋白质序列的整个氨基酸序列长度上具有98%同一性的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及在本文共有蛋白质序列的整个氨基酸序列长度上具有99%同一性的免疫原性蛋白质。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99%相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。
共有蛋白质的片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的共有蛋白质。可提供SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的免疫原性片段相同的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的在氨基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的整个长度上95%相同的蛋白质。
可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的免疫原性片段相同的蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的整个长度上95%相同的蛋白质。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96%同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97%同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98%同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99%同一性的免疫原性片段。
c.HBV核心抗原和表面抗原的组合
疫苗可包含如上所述的HBV核心抗原和表面抗原的组合。HBV抗原的这个组合能够在哺乳动物中引发针对一种或多种HBV血清型的免疫反应。疫苗可被设计或定制来具有HBV抗原的特定组合,此又提供控制哺乳动物中的免疫反应的程度或强度的能力。
组合可包含一种或多种编码以下的核酸:(1)HBV-M-核心、LHBs-A、SHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(2)HBV-M-核心、LHBs-A、SHBs-A和LHBs-C;(3)HBV-M-核心、LHBs-A和SHBs-A;(4)HBV-M-核心和LHBs-A;(5)HBV-M-核心、SHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(6)HBV-M-核心、LHBs-C和SHBs-C;(7)HBV-M-核心和SHBs-C;(8)HBV-M-核心、LHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(9)HBV-M-核心、LHBs-A和SHBs-C;(10)HBV-M-核心和SHBs-C;(11)HBV-M-核心、LHBs-A、SHBs-A和SHBs-C;(12)HBV-M-核心、LHBs-A和SHBs-C;(13)HBV-M-核心、SHBs-A和SHBs-C;(14)LHBs-A、SHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(15)LHBs-A、SHBs-A和LHBs-C;(16)LHBs-A和SHBs-A;(17)SHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(18)LHBs-C和SHBs-C;(19)LHBs-A、LHBs-C和SHBs-C;(20)LHBs-A和SHBs-C;(21)LHBs-A、SHBs-A和SHBs-C;(22)LHBs-A和SHBs-C;(23)SHBs-A和SHBs-C;(24)HBV-M-核心和SHBs-A;(25)HBV-M-核心、LHBs-A和LHBs-C;或(26)LHBs-A和LHBs-C。
一示例性实施方案涉及一种包括一种或多种编码HBV-M-核心、LHBs-A和LHBs-C的核酸的疫苗。另一示例性实施方案涉及包括一种或多种编码HBV-M-核心、SHBs-A和SHBs-C的核酸的疫苗。另一示例性实施方案涉及一种包括一种或多种编码HBV-M-核心、LHBs-A和LHBs-C的核酸以及如IL-12的佐剂的疫苗。
组合疫苗也包含一种或多种呈一种或多种蛋白质亚单位形式的共有HBV核心蛋白和/或HBV表面抗原蛋白、一种或多种包含一种或多种共有HBV核心蛋白和/或共有HBV表面抗原蛋白的灭活病毒颗粒、或一种或多种包含一种或多种共有HBV核心蛋白和/或HBV表面抗原蛋白的减毒病毒颗粒。减毒疫苗可为减毒活疫苗、灭活疫苗和使用重组载体来递送编码一种或多种共有HBV核心蛋白和/或HBV表面抗原蛋白的外来基因的疫苗、以及亚单位和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体来递送外来抗原的那些、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗的实例描述于以下美国专利号中:4,510,245;4,797,368;4,722,848;4,790,987;4,920,209;5,017,487;5,077,044;5,110,587;5,112,749;5,174,993;5,223,424;5,225,336;5,240,703;5,242,829;5,294,441;5,294,548;5,310,668;5,387,744;5,389,368;5,424,065;5,451,499;5,453,364;5,462,734;5,470,734;5,474,935;5,482,713;5,591,439;5,643,579;5,650,309;5,698,202;5,955,088;6,034,298;6,042,836;6,156,319和6,589,529,所述专利各自以引用的方式并入本文。
d.疫苗构建体和质粒
疫苗可包括编码HBV核心蛋白、HBV表面抗原以及HBV核心蛋白/表面抗原的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的HBV核心抗原的核酸序列的遗传构建体,所述核心抗原包括共有蛋白序列、与共有蛋白序列同源的序列、共有蛋白序列的片段以及与共有蛋白序列的片段同源的序列。另外,本文提供可包含编码本文公开的HBV表面抗原(包括共有蛋白质序列、与共有蛋白质序列同源的序列、共有蛋白质序列的片段以及与共有蛋白质序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。
所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分,所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。
核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在哺乳动物中有效引发免疫反应的量在哺乳动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞,所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。
编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下,选择密码子来减少RNA二级结构的形成,如由于分子内键而形成的二级结构。
所述载体可以包含编码抗原的异源核酸,并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子,所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子,如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。这些启动子的实例在美国专利申请公布号US20040175727中进行描述,所述申请公布的整体内容被并入本文中。
所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号,所述多聚腺苷酸化信号可以在HBV核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的多聚腺苷酸化信号。
载体也可包含在共有HBV核心蛋白编码序列或共有HBV表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子,如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。多聚核苷酸功能增强子被描述在美国专利号5,593,972、5,962,428以及WO94/016737中,每个专利的全部内容以引用方式并入本文。
载体还可以包含哺乳动物的复制起点,以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4,其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域,这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体,如本文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。
基于可从Invitrogen获得的pVAX1的序列,在被用作本文所述的质粒1-6的主链的pVAX1的序列中发现以下突变:
C>G241 在CMV启动子中
C>T1942 主链,在牛生长激素多聚腺苷酸化信号(bGHpolyA)的下游
A>-2876 主链,在卡那霉素基因的下游
C>T3277 在高拷贝数突变的pUC复制起点(Ori)中(参见Nucleic Acid Research1985)
G>C 3753在RNA酶H位点上游的pUC Ori的最末端中
在CMV启动子上游的主链上碱基对2、3和4从ACT变为CTG。
所述载体的主链可以是pAV0242。所述载体可以是复制缺陷5型腺病毒(Ad5)载体。
所述载体还可以包含调控序列,所述调控序列可以非常适合在施用所述载体的哺乳动物或人细胞中的基因表达。共有HBV编码序列可以包含密码子,所述密码子可以允许在宿主细胞中更有效地转录编码序列。
所述载体可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。所述载体可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白质。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达***(Invitrogen,San Diego,Calif.),其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen,SanDiego,Calif.),其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白质的表达载体或***,所述技术和物质包括Sambrook等,Molecular Cloning and Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor(1989),其以引用方式全部并入本文。
在一些实施方案中,载体可包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20或SEQ ID NO:21的核酸序列。SEQ ID NO:17编码共有HBV核心蛋白,而SEQ ID NO:18-21编码共有HBV表面抗原。SEQ ID NO:17-21的载体图谱分别显示于图5-9中。
e.疫苗的药物组合物
疫苗可呈药物组合物形式。药物组合物可包含疫苗。
药物组合物可包含约5纳克至约10mg的疫苗DNA。在一些实施方案中,根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5毫克的疫苗DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约50纳克至约1毫克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约1微克至约350微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约5微克至约250微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约10微克至约200微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约15微克至约150微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约20微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约25微克至约75微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约30微克至约50微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约35微克至约40微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物含有约100微克至约200微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物包含约10微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物包含约20微克至约80微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物包含约25微克至约60微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物包含约30内克至约50微克的DNA。在一些实施方案中,所述药物组合物包含约35纳克至约45微克的DNA。在一些优选的实施方案中,所述药物组合物含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中,所述药物组合物含有约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中,所述药物组合物含有约25微克至约250微克的DNA。在一些优选的实施方案中,所述药物组合物含有约100微克至约200微克的DNA。
在一些实施方案中,根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100内克疫苗DNA。在一些实施方案中,药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗DNA。在一些实施方案中,药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗DNA。
在其它实施方案中,药物组合物可包含多达并包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克疫苗DNA。在一些实施方案中,药物组合物可包含多达并包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗DNA。在一些实施方案中,药物组合物可包含多达并包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg疫苗DNA。
根据待使用的施用模式,药物组合物可出于配制目的还包含其它试剂。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况下,它们是无菌、无热原以及无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常,等渗的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下,优选等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中,将血管收缩剂添加到制剂中。
所述疫苗可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体(carrier)或稀释剂的功能分子。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂,其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知的转染促进剂。
所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。所述转染促进剂是聚-L-谷氨酸,并且更优选地,所述聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗。所述转染促进剂还可以包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烯,并且透明质酸还可以用来与所述遗传构建体一起施用。在一些实施方案中,所述DNA载体疫苗还可以包括转染促进剂如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体(如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知的转染促进剂。优选地,所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染剂在所述疫苗中的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在替代的质粒中表达或作为蛋白质与在疫苗中的以上质粒组合而被递送的其它基因。所述佐剂可以选自由以下组成的组:α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍化生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤的T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜有关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括缺失信号序列并任选包括来自IgE的信号肽的IL-15)。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍化生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合。在一示例性实施方案中,佐剂是IL-12。
可以是适用的佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因:MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。
f.疫苗递送的方法
本文提供一种用于递送药物制剂以提供包含表位的HBV核心蛋白和/或HBV表面抗原的遗传构建体和蛋白质的方法,所述表位使得它们成为可诱导对HBV病毒性感染的免疫反应所针对的特别有效的免疫原。递送所述疫苗或疫苗接种的方法可以被提供来诱导治疗性和/或预防性免疫反应。所述疫苗接种过程可以在哺乳动物中产生针对多种HBV基因型的免疫反应。所述疫苗可以被递送至个体以便调整哺乳动物的免疫***的活动并增强免疫反应。所述疫苗的递送可以是作为核酸分子的HA抗原的转染,所述核酸分子表达在细胞中并被递送到细胞的表面,在细胞表面上免疫***识别并诱导细胞免疫、体液免疫或细胞和体液免疫。疫苗的递送可用于通过对哺乳动物施用如本文所讨论的疫苗而在哺乳动物中诱导或引发针对多种HBV病毒的免疫反应。
在将所述疫苗递送给所述哺乳动物并因此将所述载体递送到哺乳动物的细胞中后,转染的细胞将表达并分泌共有HBV核心蛋白和共有HBV表面抗原。这些分泌的蛋白质或合成抗原将作为外源物质而被免疫***识别,这将进行可以包括以下的免疫反应:生成针对所述抗原的抗体和特异性针对所述抗原的T细胞反应。在一些实施方案中,用本文所讨论的疫苗接种的哺乳动物将具有引发的免疫***,并且在被HBV病毒株激发时,引发的免疫***将允许通过体液免疫、细胞免疫或两者来快速清除随后的HBV病毒。所述疫苗可以被递送至个体以便调整个体的免疫***的活动,从而增强免疫反应。
递送疫苗DNA的方法描述于美国专利号4,945,050和5,036,006中,所述专利均以引用的方式整体并入本文。
所述疫苗可以施用至哺乳动物以在哺乳动物中引发免疫反应。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类、母牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡,并且优选为人、母牛、猪或鸡。
g.与佐剂一起递送疫苗
所述药物组合物、优选本文所述的疫苗可以与蛋白质或编码佐剂的基因组合来施用,所述佐剂可以包括:α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍化生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1或TAP2或其功能片段。在一示例性实施方案中,佐剂是IL-12。
h.用疫苗产生免疫反应的方法
疫苗可用于在哺乳动物中产生免疫反应,包括治疗性或预防性免疫反应。免疫反应可产生针对HBV核心抗原、HBV表面抗原或其组合的抗体和/或杀伤T细胞。可分离所述抗体和T细胞。
一些实施方案提供产生针对HBV核心蛋白、HBV表面抗原蛋白及其组合的免疫反应的方法,所述方法包括向个体施用疫苗。一些实施方案提供针对HBV感染对个体进行预防性疫苗接种的方法,所述方法包括施用疫苗。一些实施方案提供对已被HBV感染的个体进行治疗性疫苗接种的方法,所述方法包括施用疫苗。可在施用疫苗之前按常规进行HBV感染的诊断。
i.用疫苗治疗的方法
疫苗可用于在哺乳动物中产生保护肝脏的免疫反应。免疫反应可产生不导致对肝脏的损害或肝脏的炎症的抗原特异性CTL反应。在一些实施方案中,疫苗可被递送至外周中以建立靶向肝脏的抗原特异性免疫反应来清除或消除HBV感染的细胞而不损害肝脏或导致肝脏的炎症。在一些实施方案中,治疗可包括递送包含HBV共有核心抗原的疫苗至外周中以建立靶向肝脏的抗原特异性免疫反应来清除或消除HBV感染的细胞而不导致对肝脏的损害或肝脏的炎症。
3.施用途径
所述疫苗或药物组合物可以通过不同的途径来施用,所述途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、粘膜、局部地、经由吸入、经由颊施用、胸腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻囊内以及关节内或其组合。对于兽医使用,所述组合可以根据标准的兽医规范而作为适当可接受制剂来施用。兽医可以轻易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。所述疫苗可以通过传统的注射器、无针注射设备、“微粒轰击枪”或其它物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波来施用。
疫苗的载体可以通过若干熟知的技术来递送至哺乳动物,所述技术包括在有和没有体内电穿孔、脂质体介导的纳米颗粒促进的重组载体情况下的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种),所述重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。所述HBV抗原可以可以经由DNA注射并随同体内的电穿孔一起而被递送。
a.电穿孔
疫苗或药物组合物可通过电穿孔来施用。经由电穿孔而施用所述疫苗可以使用电穿孔设备来完成,所述电穿孔设备被配置来对所需的哺乳动物组织递送在细胞膜中有效形成可逆的细孔的脉冲能量,并且优选地所述脉冲能量是与使用者输入的预先设定的电流相似的恒定电流。所述电穿孔设备可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可以包括且并入电穿孔设备的各种元件中的一种或多种,其包括:控制器,电流波形发生器、阻抗测定仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储部件、电源以及电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔设备例如EP***(InovioPharmaceuticals,Inc.,Blue Bell,PA)或者Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)来促进质粒转染细胞而完成。
可以促进本发明的DNA疫苗的递送的电穿孔设备和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963、由Smith等提交的美国专利公开2005/0052630中描述的那些,它们的内容以引用方式整体并入本文。可以用于促进DNA疫苗的递送的其它电穿孔设备和电穿孔方法包括在2007年10月17日提交的共同待决的和共同拥有的美国专利公开序列号11/874072中所提供的那些,所述专利公开根据美国法典第35篇第119条第(e)款要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益,它们所有都整体并入本文。
Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963描述了模块化电极***以及它们用于促进将生物分子引入到身体或植物中所选定组织的细胞中的使用。所述模块化电极***可以包括多个针电极;皮下注射针;提供从可编程的恒定电流脉冲控制器到多个针电极的传导性连接的电连接器;以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地***到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下注射针将生物分子递送到所选定的组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器,并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容以引用方式并入本文中。
Smith等提交的美国专利公开2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中的电穿孔设备。所述电穿孔设备包括其操作由软件或固件来规定的电动力学设备(“EKD设备”)。所述EKD设备基于使用者控制和脉冲参数的输入而在一个阵列的电极之间产生一系列的可编程的恒定电流脉冲模式,并允许电流波形数据的存储和获得。所述电穿孔设备还包括具有一排针电极的可替换的电极圆盘、用于注射针的中央注射通道以及可移动的导向盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容以引用方式并入本文中。
在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可以被适配来用于不仅深入穿透到组织如肌肉中,而且深入穿透到其它组织或器官中。由于电极阵列的配置,注射针(以递送选择的生物分子)也被完全***到靶器官中,并且注射是在由这些电极预先描绘的区域内垂直地施用至的靶组织上。在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的这些电极优选是20mm长和21号规格。
此外,在一些实施方案中涵盖的是合并的电穿孔设备和其用途,有电穿孔设备描述在以下专利中:1993年12月28日公告的美国专利5,273,525、2000年8月29日公告的美国专利6,110,161、2001年7月17日公告的6,261,281以及2005年10月25日公告的6,958,060以及2005年9月6日公告的美国专利6,939,862。此外,本文涵盖了覆盖主题的专利,所述主题提供在涉及使用多种设备中的任一种来递送DNA的2004年2月24日公告的美国专利6,697,669和关于注射DNA的方法的2008年2月5日公告的美国专利7,328,064中。以上专利的全部内容以引用方式并入本文。
4.制备疫苗的方法
本文提供用于制备包含本文所讨论的DNA疫苗的DNA质粒的方法。所述DNA质粒在最终亚克隆步骤进入哺乳动物表达质粒之后,可用于在大型发酵罐中使用本领域已知的方法接种细胞培养物。
用于与本发明的EP设备一起使用的DNA质粒可以使用已知设备和技术的组合来配制或制造,但是优选地它们使用优化质粒制造技术来制造,所述技术描述在2007年5月23日提交的美国公开的申请号20090004716中。在一些实例中,在这些研究中使用的DNA质粒可以按大于或等于10mg/mL的浓度来配制。制造技术还包括或并入本领域普通技术人员普遍已知的各种设备和方案,除在美国序列号60/939792中所述的那些外,还包括2007年7月3日公告的许可专利、美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利、美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522的全部内容地分别并入本文。
实施例
本发明进一步在以下实施例中进行说明。应了解,这些实施例在表示本发明的优选实施方案时仅仅通过说明来给出。从上文的讨论和实施例中,本领域的技术人员可以确定本发明的必要特性,并且在不背离其精神和范围的情况下,可以做出本发明的各种变化和修改以便使其适应于各种用法和条件。因此,除本文所示和所述的那些之外,从以上描述本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这些修改也旨在属于所附权利要求的范围内。
实施例1
HBV核心蛋白
共有HBV核心蛋白也被称为HBV修饰的M核心或M-核心构建体,它是根据来自HBV基因型A、B、C、D以及E的表位序列中设计。选择来自这些基因型的HBV核心蛋白序列来包含在共有核心的构建中,所述共有核心会诱导针对广泛范围的基因型的免疫,从而提供HBV的通用疫苗。在一些实施方案中,M-核心构建体的修改包括添加IgE前导序列。在一些实施方案中,M-核心蛋白质是使用用于增强表达的密码子优化和RNA优化来编码的。
1.共有核心抗原的构建和表达
通过以下方式来构建HBV基因型A、B、C、D和E核心共有核苷酸序列:产生各基因型的核心基因的共有序列,接着产生全部五种基因型共有序列的共有序列,由此避免偏向大量测序的基因型。另外,自不同国家收集序列以避免取样偏向大量测序的基因型。使用clustal X软件比对序列以产生最终HBcAg共有序列。如图10中所示,观察到多基因型共有HBcAg序列与来自不同基因型的所有取样序列都存在相对接近性。
在产生共有序列之后,进行若干修饰以增加抗原自质粒的表达水平。具体来说,添加高效IgE前导序列和C末端HA标签,并且对构建体进行RNA和密码子优化。这产生具有IgE前导物和HA标签的编码M核心序列的核酸序列(SEQ ID NO:5),其用EcoRI和NotI消化,并且克隆至表达载体pVAX(Invitrogen)中,受控于巨细胞病毒立即-早期启动子。所得构建体接着命名为pMCore(SEQ ID NO:17)。
体外表达测试使用pMCore构建体和pVAX来完成,所述pVAX被用作对照。示出阳性表达的结果描绘在图11A和图11B中示出的凝胶图像中。
另外,通过转染含有乙型肝炎的核心基因的pMCore DNA质粒来表达HBcAg蛋白(图12)。使用含有35S-甲硫氨酸的快速偶联转录/翻译表达***(Promega,Madison,WI)检测pMCore的表达。使用靶向编码的HA表位的抗HA单克隆抗体克隆HA-7(Sigma-Aldrich)使合成的基因产物免疫沉淀。使免疫沉淀的蛋白质在12%SDS-PAGE凝胶上进行电泳,并且随后固定并干燥。通过放射自显影术来检测并有放射性35S的合成的蛋白质。对溶解产物的这个体外翻译测定显示在预期分子量28kDa处存在可检测HBcAg(图13)。
通过免疫荧光测定,使用抗HA标记的单克隆抗体来进一步确认表达。根据制造商指南,使用TURBOFECT(Thermo Scientific),用pMCore转染横纹肌肉瘤(RD)细胞系。首先用2%甲醛固定细胞,接着测定蛋白质表达。在室温下使固定的细胞与于‘基本标准溶液’(0.1%BSA、0.2%皂素、0.02%叠氮化钠)中稀释的兔单克隆HA标签(Invitrogen)一起孵育1小时。随后在室温下使细胞与DyLight 594标记的抗兔二抗(Thermo Scientific)一起孵育20分钟。共焦成像用于观察细胞质中以及转染的RD细胞的核周围的HBcAg,如图14中所示。表达样式确认携带共有核心基因的DNA质粒可在不同细胞中体外高度表达。具体来说,使用Zeiss Axiovert 100倒置共焦显微镜获得图像。使用Image J软件(NIH,Rockville,MD)对荧光强度进行分析和定量。
2.小鼠的免疫
C57BL/6转基因小鼠被分成每组4只小鼠的两组并使用电穿孔来以20μg的DNA按每两周一次的间隔免疫三次(组1-pVAX载体对照;组2pM-Core)。小鼠在第0天、第14天、第28天被免疫并在第35天被处死。从处死的动物中收获脾脏、肝脏以及血清。
另外,以及为评估T细胞和B细胞免疫反应的产生,使Balb/c小鼠免疫,并且测量各种外周组织中的两种反应。小鼠接受30μg pMCore或pVax的三次肌肉内免疫,随后进行电穿孔,如免疫流程(图15)中所描绘。具体来说,自Jackson Laboratories购买六至八周龄雌性Balb/c小鼠。根据国立卫生研究所和宾夕法尼亚大学机构照顾和使用委员会(IACUC)指南供养动物。对于DNA免疫研究,将八只动物分成两组。免疫组中的各动物相隔两周在胫骨前(TA)肌肉中接受30μg pMCore的总计三次免疫。各次免疫伴随有用CELLECTRA适应性恒定电流电穿孔装置(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)进行体内电穿孔。通过由完全***肌肉中的26规格的固体不锈钢电极组成的三角形3电极阵列递送两个0.2安培恒定电流方波脉冲。各脉冲的时长是52毫秒,其中在脉冲之间延迟1秒。
Balb/C小鼠品系的体内研究指示取自脾脏的CD8和CD4T细胞中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素γT细胞(IFN-γ)和CD107a的分泌的量值增强。图16和17说明用pM-Core对Balb/C小鼠进行疫苗接种使来自脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的IFN-γ分泌的量值增强。图18和19说明用pM-Core对Balb/C小鼠进行疫苗接种使来自脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的TNF-α分泌的量值增强。图20和21说明用pM-Core对Balb/C小鼠进行疫苗接种使来自脾脏的CD8+和CD4+T细胞中的CD 107a分泌的量值增强。
在其它实验中,考查T细胞中的IFN-γ和TNF-α分泌。为收集用于这些其它实验的脾细胞,在末次免疫之后一周处死小鼠,并且收集脾脏,且放置在R10培养基(补充有10%FBS和1x抗生素-抗霉菌素的RPMI培养基)中。将脾脏个别地压碎,用40μM细胞过滤器过滤,并且用1mLACK溶解缓冲液处理5分钟以溶解红细胞。将脾细胞再混悬于完全R10培养基中,并且用于进一步免疫测定。
将一小组脾细胞在每毫升107的浓度下再混悬于R10培养基中,并且将100μL接种在96孔圆底板上。100μL含有pMCore集合肽或10ng/ml PMA(Sigma,St.Louis,MO,USA)和500ng/ml离子霉素(Calbiochem,Novabiochem,La Jolla,CA,USA)混合物的培养基作为阳性对照,或0.1%二甲亚砜(Sigma,St.Louis,MO,USA)作为阴性对照。所有孔都含有5μL/mL两种蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素(brefeldin)A(GolgiPlug)和莫能菌素(monensin)(Golgistop)(都来自BD Bioscience)。在37℃下在5%CO2中孵育细胞5小时,并且在37℃下用LIVE/DEAD可固着死细胞染色剂(Invitrogen)染色10分钟。使用对小鼠CD3、CD4和CD8特异的抗体来进行细胞外染色。接着分别使用BD CYTOFIX/CYTOPERM和PERM/WASH(BDBioscience)使脾细胞可渗透并洗涤。
细胞内细胞因子染色。
接着用针对小鼠干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的抗体使细胞内细胞因子染色。将一小组淋巴细胞以每毫升107的浓度再混悬于R10培养基中,并且将100μL接种在96孔圆底板上。100μL含有pMCore集合肽或10ng/ml PMA(Sigma,St.Louis,MO,USA)和500ng/ml离子霉素(Calbiochem,Novabiochem,La Jolla,CA,USA)混合物的培养基作为阳性对照,或0.1%二甲亚砜(Sigma,St.Louis,MO,USA)作为阴性对照。所有孔都含有5μL/mL两种蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A(GolgiPlug)和莫能菌素(Golgistop)(都来自BD Bioscience)。在37℃下在5%CO2中孵育细胞5小时,并且在37℃下用LIVE/可固着死细胞染色剂(Invitrogen)染色10分钟。使用对小鼠CD3、CD4和CD8特异的抗体来进行细胞外染色。接着分别使用BD Cytofix/CytopermTM和Perm/WashTM(BD Bioscience)使脾细胞可渗透并洗涤。接着用针对干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α、白介素-2和溶酶体相关的膜蛋白质1的抗体对细胞进行细胞内染色。
在细胞外和细胞内染色期间使用缀合的抗小鼠抗体,包括:CD3-藻红素/Cy7(PE/Cy7)、CD4-多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)、CD8-别藻蓝蛋白(APC)、IFN-γ-Alexa Fluor700、TNF-a-异硫氰酸荧光素(FITC)和IL-2-藻红素青色素(PE)(都来自BD Biosciences,San Jose,CA)。
诱导的平均HBcAg特异性IFN-γT细胞反应是强力的,为每百万个脾细胞2000(±210)SFU。引起关注的是,对刺激的脾细胞的细胞内染色揭示CD4+细胞与CD8+细胞两者均产生几乎类似量的抗原特异性IFN-γ(分别是0.74和0.94),但CD4+细胞和CD8+细胞的TNF-α的水平不同,分别是约0.3%和1.5%(图22)。关于针对两种细胞因子是双重阳性的细胞,观察到类似趋势。在脾脏中,存在的双重阳性CD4+细胞(约0.2%)少于双重阳性CD8+细胞(平均0.7%)(图23)。
在施用pM-Core DNA疫苗的动物中还证明了HBV特异性T-细胞向肝脏的迁移。以高频率和对肝脏的效应功能来靶向HBV核心抗原特异性T细胞是开发HBV免疫治疗的目标。在免疫之后,处死动物并移除它们的肝脏,并确定HBV特异性效应子T细胞向肝脏的迁移。结果显示在体内pM-Core疫苗将效应子T细胞驱使到肝脏中。图24和图25示出干扰素-γT细胞肝脏反应,并且图26和图27证明肿瘤坏死因子-α肝脏免疫反应和由用pM-Core进行疫苗接种而引起的提高的反应。
由pM-core DNA构建体编码的M-核心共有免疫原驱动强烈平衡的CD4+/CD8+T细胞免疫反应。在HBV感染后诱导的T细胞以高频率流通到肝脏中并且表现用于免疫清除的正确效应子表型,从而支持进一步开发这个免疫治疗性疫苗。
也考查在DNA免疫之后,肝脏内抗原特异性T细胞产生细胞因子的能力。通过将1mLPBS直接注射至各小鼠的肝静脉中来灌注各肝脏。具体来说,将肝脏收集,压碎,并且再混悬于5mL 44%等张珀可(Percoll)中。用3mL 66%等张珀可使混合物下伏,并且在2000rpm下离心20分钟以达成梯度分离。收集淋巴细胞,并且于10mL R10中洗涤,并且必要时用ACK溶解缓冲液处理。当用HBcAg肽体外刺激时,自肝脏分离的CD4 T细胞与CD8 T细胞两者均产生IFN-γ和TNF-α(图28和29)。尽管CD4 T细胞显示高百分比的双重产生者,但CD8显示少许乃至不显示IFN-γ+TNF-α+产生性细胞。作为替代,大多数CD8 T细胞仅产生IFN-γ或TNF-α。观察到肝脏中富含HBcAg特异性CD4 T细胞,此与脾脏的情况相反。静息肝脏中的HBcAg特异性CD4 T双重阳性细胞的百分比与在脾脏中观察到的百分比类似。此外,确认外周CD8 T细胞是优于肝脏驻留CD8 T细胞的双重产生者。也观察到来自免疫的小鼠的肝脏驻留B细胞产生抗体的能力。引起关注的是,作为粘膜器官的肝脏产生的抗原特异性IgA高于IgG(图30),这是先前尚未加以研究的观察结果。
图31示出了使用酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)测定通过pM-Core诱导的细胞免疫反应。用横跨整个pMCore长度和具有8个氨基酸重叠的15-mer肽的两个集合来刺激脾细胞。将R10培养基中的200,000个脾细胞接种在96孔的IFN-γ捕获抗体(R&D system)涂布的板中,并在37℃下5%CO2中在特异性肽集合存在下刺激过夜。将细胞冲洗掉并使板与生物素化的抗小鼠IFN-γ检测抗体(R&D***)孵育过夜。随后将链霉亲和素-碱性磷酸酶和5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸对甲苯胺盐以及氯化硝基四氮唑蓝用于使斑点显色。使用自动ELISPOT读取器(CTL Limited)计数斑点。如图31所示,用pMCore免疫可以诱导强烈的细胞免疫反应。平均HBcAg-特异性IFN-γT细胞反应是每百万脾细胞约2000(±210)SFU。
ELISPOT测定用于进一步考查IFN-γ。具体来说,用跨越HBcAg的整个长度并且重叠8个氨基酸的15聚体肽的两种集合物刺激脾细胞。总计存在33个个别肽,其被随机集合,其中前17个肽进入集合1,而后16个肽在集合2中。排除IgELs和HA标签以使得肽尽可能接近于天然抗原。将200,000个脾细胞于R10培养基中接种在96孔IFN-γ捕集抗体(R&D system)涂布的板中,并且在37℃下,在5%CO2中,在特定肽集合物存在下刺激过夜。洗掉细胞,并且使各板与生物素化抗小鼠IFN-γ检测抗体(R&D system)一起孵育过夜。抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶以及5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸对甲苯胺盐和氯化硝基四氮唑蓝随后用于使斑点显色。使用自动ELISPOT读取器(CTL Limited)对斑点计数。观察到在最终免疫之后一周,pMCore免疫的小鼠显示强烈HBcAg T细胞反应的迹象,如在离体刺激之后,通过IFN-γELISPOT测定所鉴定。图32显示显性表位偏向肽集合物2。
体内细胞毒性测定研究使用与流式细胞术结合的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记来进行。我们评估了细胞群的细胞中的细胞***。将脾细胞从初始实验的小鼠中分离并将其分为两个群。CFSE高度标记的一个群用有关肽(例如HBV核心肽)脉冲处理。CFSE低度标记的另一个群用不相关的肽(例如HCV NS3肽)脉冲处理。将标记的、肽处理的细胞组合并用于进行流分析的继承性转移实验中。将处理的、标记的靶细胞的组合群施用给两组小鼠,即对照组以及免疫组。从每组小鼠中分离脾细胞,并在流式细胞仪上运行样本。测量CFSE的数量。通常,在这样的实验中,形成两个峰,第一个是不相关肽;第二个是指示更大CFSE的峰中的免疫肽。
图33证明通过疫苗接种所诱导的CD8 T细胞可以特异性地除去体内靶细胞。这些结果证明来自初始实验的小鼠的脾脏和肝脏的样本含有在不相关肽和相关肽的峰中的几乎等量的细胞,同时这些结果显示在免疫组中,来源于用相关肽进行脉冲的那些的细胞的峰显著小于不相关的肽。这些数据证明用HBV肽处理的靶细胞在用HBV疫苗进行免疫的小鼠中被特异性地除去,但是在未免疫的小鼠中没有。用不相关肽处理的靶细胞的任何除去如果全部发生,则其在用HBV疫苗进行免疫的小鼠中和在未免疫的小鼠中是相同的,并且显著少于用HBV肽处理的靶细胞的除去。
进一步考查在DNA免疫之后诱导的HBV特异性CD8 T细胞特异性体内消除靶标细胞的能力。相对于慢性感染,靶向核心抗原的人CTL在急性清除HBV方面是重要的。在最终免疫之后一周,来自pVax或pMCore免疫的两个组各自的4只小鼠用已用HBcAg(相关)或HCV-NS3/4A(不相关)肽进行脉冲处理的靶标脾细胞进行过继性转移。简要来说,来自初始实验的小鼠的脾细胞用1μM或1nM CFDA SE(invitrogen)染色。标记的脾细胞接着用指示的肽(1μM)涂布,并且将各群体的107个细胞静脉内注射至初始实验的小鼠或免疫的小鼠中。在24或90小时之后,分离来自脾脏和肝脏的细胞,并且通过流式细胞术来分析。如下计算杀伤百分比:100-([(感染的细胞中脉冲的相关肽%/感染的细胞中脉冲的不相关肽%)/(未感染的细胞中脉冲的肽%/未感染的细胞中脉冲的不相关肽%)]x 100)。通过对CFSE标记的脾细胞进行门控以追踪杀伤,观察到pMCore疫苗接种的小鼠能够诱导对抗原脉冲处理的靶标细胞的强烈特异性杀伤,如图34中所示。观察到的脾脏中的平均杀伤百分比是约83%,而肝脏中的平均值是76%,显示疫苗诱导的迁移至肝脏中并且保留在肝脏中的CTL能够杀伤HBV肽脉冲处理的靶标细胞。这是显示通过任何方法,并且具体来说通过全身性免疫来在肝脏中诱导HBcAg特异性CTL反应的首个研究。这个数据提供外周免疫可诱导可迁移至肝脏中,并且溶解靶标细胞的效应细胞的证据。
图35示出从使用CFSE标记的T细胞增殖测定中收集的数据。比较用pVax载体(对照)或者用表达HBV M-核心的质粒pMCore处理的CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+的增殖百分比。简要来说,根据制造商的说明,将分离的脾细胞用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)细胞示踪剂试剂盒(Cell Tracer Kit)(Invitrogen)来染色。染色细胞用盐水冲洗三次并用pMCore-特异性重叠肽刺激。使细胞在37℃下孵育96小时。48小时后,除去50%的培养基并用新鲜的R10更换。在第4天,收获细胞并将其用CD3、CD4和CD8-特异性单克隆抗体(BDPharmingen)染色。用含有1%多聚甲醛(PFA)的PBS固定细胞并在FACScalibur(BectonDickinson)上获得所述细胞。使用FlowJo程序来分析数据。CFSE低的和CFSE中等的群被认为是增殖的细胞。如图35所示,分离自脾脏的CD3+CD8+T细胞与CD3+CD4+T细胞相比增殖更多。
用T细胞增殖测定进行的其它实验也使用CFSE标记。具体来说,根据制造商说明书,利用羧基荧光素二乙酸丁二酰亚胺酯(CFDA-SE)细胞追踪试剂盒(Invitrogen)将分离的脾细胞染色。染色的细胞用盐水洗涤三次,并且于总体积200μL的含有1μg/mL浓度的HBcAg集合肽的培养基中接种在96孔U形底板中。在37℃下孵育细胞96小时。在48小时之后,移除50%的培养基,并且用新鲜R10替换。如上讨论的CD4 T细胞与CD8 T细胞两者之间的细胞因子产生的差异与它们的最终增殖能力类似。在用抗原特异性肽刺激4天之后,CD8+ T细胞增殖比CD4+细胞高2倍以上(图36)说明在反应方面的明确CD8T细胞偏倚。
图37A和图37B是示出来自用pVax载体(对照)或者用表达HBV M-核心的质粒pMCore处理的动物的系列稀释血清中抗-HBV核心抗体的比较的ELISA数据。简要来说,将高结合ELISA板(Costar,Corning,NY)用PBS中的1μg/ml HBcAg蛋白质涂布,在4℃下放置24h,并且然后用PBS-吐温冲洗,并用含有1%BSA的PBS在室温下封闭2h。将连续稀释的血清样本添加到孔中,并在室温下孵育1h。冲洗之后,通过HRP-标记的山羊抗小鼠IgG(图37A)或者IgA(图37B)来显示结合的血清抗体。使用四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)作为底物来检测过氧化物酶缀合的Ab,并且用MultiscanELISA板读取器来测量450nm处的OD。观察在从免疫小鼠收集的血清中的抗原特异性体液反应。
为进一步探究在pMCore免疫的小鼠中诱导的免疫反应,通过B细胞ELISpot以及在分别使用在疫苗接种之后收集的脾细胞和血清的ELISA中来分析抗原特异性IgG和IgA反应。如上所述分离并纯化脾细胞。对于ELISA,在4℃下,高结合ELISA板(Costar,Corning,NY)用含1μg/ml HBcAg蛋白的PBS涂布24小时,接着用0.1%PBS-吐温洗涤,并且在室温下用含有1%BSA的PBS阻断2小时。添加连续稀释的血清样本至各孔中,并且在室温下孵育1小时。在洗涤之后,通过HRP标记的山羊抗小鼠IgA或IgG来揭示结合的血清抗体。使用四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)作为底物来检测过氧化物酶缀合的抗体,并且用Multiscan ELISA板读取器测量450nm下的OD值。当相较于对照动物时,观察到免疫的小鼠的血清中的IgG和IgA效价较高(图38)。免疫的小鼠的B细胞ELISpot(图39)证明HBcAg特异性IgG和IgA分别在每百万个细胞约200SFU和100SFU下。这说明通过用pMCore免疫,B细胞区室被活化。在3次免疫之后,合成HBcAg质粒有效诱导抗原特异性细胞反应和体液反应。
图40证明了来自CD4+和CD8+脾和肝细胞中的TNF-α和IFN-γ百分比。
在不存在HBV的小动物模型的情况下,通过流体动力学注射将HBcAg用于瞬时转染小鼠肝脏。用pMCore或者HCV NS3/4A转染免疫的小鼠肝脏。转染后三天免疫组织化学染色显示与NS3/4A-转染的肝细胞相比HBcAg-转染的肝细胞的清除。测量血清中的ALT水平以便确保通过免疫小鼠诱导的清除不引起任何肝脏损伤。图41中的结果显示由免疫小鼠诱导的清除没有引起任何肝脏损伤。
直接流体动力学注射也用于短暂转染小鼠肝脏。此处,免疫的小鼠肝脏或初始实验的小鼠肝脏用pMCore或编码丙型肝炎抗原(HCV NS3/4A)的不相关质粒转染。简要来说,在7秒时期内用含100μg质粒的2mL(小鼠重量的约10%体积)林格氏溶液静脉内注射免疫的小鼠以短暂转染肝脏。通过用抗HA单克隆抗体使肝脏染色来确定质粒的表达或清除。转染后三天的免疫组织化学染色(图42)显示相较于NS3/4A转染的动物肝脏,HBcAg转染的肝细胞被清除。在图43中,自pMCore流体动力学注射的小鼠分离的CD8 T细胞显示相较于用不相关质粒转染的免疫的动物肝脏,IFN-γ+CD107a+(脱粒标记)的频率较高。
因为pMCore转染的肝细胞的清除似乎涉及脱粒,所以认为杀伤可导致肝脏损伤。为考查免疫的小鼠是否能够清除转染的肝细胞而不诱导显著肝脏损伤,测量酶丙氨酸转氨酶(ALT)的活性的测定用于指示当血清中的酶水平升高时,肝脏损伤的存在(图44)。具体来说,使用基于吸光度的测定(Stanbio Laboratory),在BioTek Synergy 2微板读取器上测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性。结果报道为每升的单位数(U/L),并且表示每分钟氧化1μmol/L NADH的酶的量。这些研究显示特异性清除HBcAg转染的肝细胞不使转染的免疫的动物中的ALT水平增加超出5-30U/L的正常范围(图44)。
实施例2
HBV表面蛋白
1.HBsAg DNA疫苗设计
相较于用单一天然免疫原免疫,在具有高度可变抗原性序列的可变病原体的情形下使用共有免疫原可有效诱导更直接免疫反应来抗击天然病毒多样性。自GenBank收集8-2个肝炎基因型A大表面抗原序列和70个肝炎基因型C大表面抗原序列,并且在进行多重比对之后获得基因型特异性大表面抗原和小表面抗原共有序列。Clustal X(1.8版)软件用于创建用于产生共有序列的多重比对。
使用编码是在世界上两种最常见基因型的基因型A或C的共有序列,产生编码HBV表面包膜蛋白的单独大S或前S1/S2加大S的DNA构建体(图52A、图59A-59D)。考查由编码全长HBs或单独大S的构建体引发的免疫反应的差异,因为前S1的氨基末端结构域可帮助病毒连接和进入,而前S2的羧基末端可涉及感染性。仅大S构建体命名为小HBs(SHBs),而含有前S1/S2的质粒命名为大HBs(LHBs)。
根据来自HBV基因型A的初级分离株的表位序列来设计共有HBV表面蛋白,以使所得共有蛋白质与HBV基因型A初级分离株的表面蛋白具有94.2%至99.8%的序列同一性。具体来说,设计两种形式的所述共有蛋白质(图4和图52B)。一种包括S蛋白,并且也称为SHBs-A,其中SEQ ID NO:13是核酸序列,而SEQ ID NO:14是氨基酸序列。第二种包括S蛋白、前S2和前S1,并且也称为LHBs-A,其中SEQ ID NO:9是核酸序列,而SEQ ID NO:10是氨基酸序列。
也根据来自HBV基因型C的初级分离株的表位序列来设计共有HBV表面蛋白,以使所得共有蛋白质与HBV基因型C初级分离株的表面蛋白具有96.5%至99.8%的序列同一性。具体来说,设计两种形式的所述共有蛋白质(图4)。一种包括S蛋白,并且也称为SHBs-C,其中SEQ ID NO:15是核酸序列,而SEQ ID NO:16是氨基酸序列。第二种包括S蛋白、前S2和前S1,并且也称为LHBs-C,其中SEQ ID NO:11是核酸序列,而SEQ ID NO:12是氨基酸序列。
在产生共有基因型A或C大和小表面抗原共有序列之后,进行密码子优化和RNA优化。对于以上共有HBV表面抗原,将内切蛋白水解裂解位点引入共有HBV表面抗原中以提供适当蛋白质折叠和较好抗原加工(图3)。改进共有HBV表面抗原中的密码子使用以反映人基因的密码子偏好。另外,避免具有极高(例如,大于80%)或极低(例如,小于30%)GC含量的区域,因为所述区域中存在顺式作用基序(如内部TATA框)、重复序列和结构化序列。将Kozak序列引入共有HBV表面抗原中以增加翻译起始作用。在起始密码子的上游添加高效IgE前导序列以增强和增加蛋白质表达,如先前所述(Yan等,Vaccine(2008)26:5210-5215)(参见图3和52B)。合成优化的基因,并且验证序列。
将共有HBV表面抗原SHBs-A、LHBs-A、SHBs-C和LHBs-C克隆至表达载体中以分别产生构建体pSHb A(也称为pSHb-A)、pLHb A(也称为pLHb-A)、pSHb C(也称为pSHb-C)和pLHbC(也称为pLHb-C)(图4)。将合成的基因型A大和小表面抗原基因在BamHI和XhoI位点处亚克隆至表达载体pGX0001中,而将合成的基因型C大和小表面抗原基因在EcoRI和NotI位点处亚克隆至pGX0001中。HBcAg质粒(pMCore)的产生描述于实施例1中。
2.多种HBsAg DNA疫苗的体外表达
根据制造商指南,使用TurboFectTM(Thermo Scientific),用pLHBs-A、pLHBs-C、pSHBs-A和pSHBs-C转染横纹肌肉瘤(RD)和人肝癌(Hep G2)细胞系。对于细胞内测定,洗涤细胞,并且使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD PharMingen,San Diego,CA),根据它们的说明书进行固定。在固定之后,细胞用来自免疫的小鼠的血清或针对乙型肝炎病毒表面的小鼠单克隆抗体(Abcam,Cambridge,MA)染色。细胞接着用异硫氰酸荧光素缀合的抗小鼠二抗(BD Biosciences,San Jose,CA)染色。洗涤细胞,并且用2%多聚甲醛固定。在使用CellQuest软件的LSR仪器(BD Biosciences)上获取染色并固定的细胞,并且用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)进行分析。
在构建和优化四个构建体之后,通过细胞内染色来确认各质粒的蛋白质表达。RD或Hep G2细胞用个别构建体或用作为对照的空pGX0001载体短暂转染。48小时后,使用抗HBsAg多克隆小鼠血清或商购获得的小鼠单克隆抗体对细胞进行细胞内染色。使用流式细胞术确认表达(图52C)。观察到用各构建体转染的细胞中的HBs蛋白表达水平增加超过用空载体(pGX0001)转染的细胞。
实施例3
个别合成HBsAg DNA质粒在小动物模型中的免疫原性
在表达研究之后,在体内评估个别质粒诱导抗原特异性体液和细胞反应的能力。自Jackson Laboratories购买六至八周龄雌性Balb/c小鼠。根据国立卫生研究所和宾夕法尼亚大学机构照顾和使用委员会(IACUC)指南供养动物。用15μg表达小或大S抗原的质粒或pGX0001对照,相隔2周在第0、2和4周给予Balb/c小鼠三次肌肉内(IM)免疫。各次疫苗接种立即继之以向感染部位电穿孔,如先前所述(Hirao等,Vaccine(2008)26:440-448)。
对于免疫,所有DNA都使用无核酸酶水(Qiagen,Valencia,CA91355)稀释。免疫组中的各动物接受15μg适当质粒的总计三次肌肉内免疫。对于组合的研究,各动物在两处胫骨前(TA)肌肉中接受总计45μg DNA。免疫继之以用适应性恒定电流电穿孔装置(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)进行体内电穿孔。通过由完全***肌肉中的26规格的固体不锈钢电极组成的三角形3电极阵列递送两个0.2安培恒定电流方波脉冲。各脉冲的时长是52毫秒,其中在脉冲之间延迟1秒。首先考查疫苗诱导的体液反应,因为老的DNA疫苗在产生显著抗体反应方面尚未一致。
1.抗体ELISA测定
进行ELISA以分析在使用重组全长HBsAg蛋白作为靶标抗原进行各次免疫之后7天,自小鼠收集的血清中的抗原特异性IgG反应。在4℃下,高结合ELISA板(Costar,Corning,NY)用含1μg/ml重组蛋白的PBS涂布24小时,接着用0.1%PBS-吐温洗涤,并且在室温下用含有1%BSA的PBS阻断2小时。添加连续稀释的血清样本至各孔中,并且在室温下孵育1小时。在洗涤之后,通过HRP标记的山羊抗小鼠IgG来检测结合的IgG。使用四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)作为底物来检测过氧化物酶缀合的抗体,并且用Multiscan ELISA板读取器测量450nm下的OD值。
来自任一基因型的pLHBs与pSHBs两者均具有高度免疫原性。进一步免疫使这些反应加强,其中在第三次免疫之后两周,抗体反应显示最大增强(图53A)。相反,用pGX0001对照免疫的小鼠仅展现背景水平的IgG反应。尽管在各组中观察到IgG反应的量值的一些差异,但在各次免疫之后的渐进性增强在各组内是一致的。
2.IFN-γELISPOT
通过IFN-γELISPOT来考查pLHBs-A、pLHBs-C、pSHBs-A和pSHBs-C构建体诱导细胞免疫反应的能力。由Genescript(Piscataway,NJ)合成匹配HepB共有核心、表面抗原A和表面抗原C 15聚体肽,并且将所述肽再混悬于DMSO中,并在各肽的近似最终浓度1mg/mL下集合。遵循制造商说明书,使用IFN-γELISpot(MabTech,Sweden)测量细胞反应。用R10(具有10%热失活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640)和PMA/IM(0.1μg/mL PMA和0.5μg/mL离子霉素,Sigma Aldrich,St.Louis,MO)对照一式三份操作样本。
响应于由共有大HBV表面蛋白产生的合成肽的两种集合物来分析HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞。第一肽集合物含有跨越前S1和前S2蛋白的肽,而第二肽集合物由跨越大S蛋白的肽组成。全部四个共有构建体都能够诱导强烈T细胞反应,并且在两种基因型内观察到交叉免疫反应性图53B。尽管,合起来,前S蛋白在尺寸方面几乎类似于大S蛋白,但在细胞介导的免疫性(CMI)反应方面,存在朝向大S蛋白的表位偏倚。这些结果指示编码全长HBV表面抗原或HBV表面抗原的仅大S部分的合成DNA免疫原展现足够不同以靶向HBV的主要基因型的免疫原性。全长构建体在诱导针对HBV天然蛋白的IgG方面不显示超过较短构建体的显著差异。
3.HBV表面抗原(15聚体)肽定位
在确认CMI的量值之后,探究针对基因型特异性靶标的细胞反应的幅度。因此,相对于各种基质肽集合物进行多组干扰素-γELISpot测定。由GenScript(Piscataway,NJ)合成跨越LBHs-A或LHBs-C蛋白的两组肽,各自含有重叠8个氨基酸的15个氨基酸残基。为定位免疫显性表位,将两组肽集合成大或小HBsAg组的分别16或12种集合物。如上所述进行IFN-γELISpot测定。这些不同组的集合肽在基质测定中用于定位各构建体的表位。超过每百万个细胞50SFU的反应被视为阳性。
这些数据说明这些合成表面抗原质粒在BALB/c小鼠中诱导不同表位反应。观察到在pLHBs-A免疫的小鼠中,16种LHBs-A基质集合物中的12种是阳性的,而在pLHBs-C免疫的小鼠中,16种LHBs-C基质集合物中的8种是阳性的。就对12种SHBs-A基质肽集合物中的9种起反应的pSHBs-A免疫的小鼠而言,小HBS质粒显示较高反应倍数,而pSHBs-C免疫的小鼠展现对所有SHBs-C基质集合物起反应(图53C)。这些数据指示由这4个HBs构建体诱导高度广泛交叉反应性的细胞反应。因此,这些基因型特异性共有疫苗可能能够诱导针对在这些基因型之间分散度多达8%的各种初级表面抗原分离株的交叉反应性细胞反应。
实施例4
细胞毒性测定和接种疫苗的小鼠的肝脏和脾脏中观察到的抗原特异性CTL
抗病毒效应CD8 T细胞可诱导细胞毒性,其是一种用于消除HBV感染的肝细胞的细胞活性。使用体内细胞毒性测定评估构建体在周边中产生HBs特异性CTL的能力,所述CTL也可返回免疫的小鼠的肝脏。来自初始实验的小鼠的脾细胞用1μM(高)或1nM(低)CFDA SE(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)染色。标记的脾细胞接着用指示的肽(相关或不相关肽)(1μM)涂布,并且将各群体的107个细胞静脉内注射至初始实验的小鼠或免疫的小鼠中。在90小时之后,分离来自血液、脾脏或肝脏的细胞,并且通过流式细胞术来分析。如下计算杀伤百分比:100-([(感染的细胞中脉冲的相关肽%/感染的细胞中脉冲的不相关肽%)/(未感染的细胞中脉冲的肽%/未感染的细胞中脉冲的不相关肽%)]x 100)。
HBV特异性CTL迁移至肝脏中为肝脏内消除受感染细胞所必需。观察到用HBsAg合成肽脉冲处理的过继性转移的靶标脾细胞的抗原特异性消除。用SHBs构建体免疫的小鼠的脾脏中的靶标细胞的平均杀伤百分比对于基因型A和C而言分别是39%和48%。LHBs构建体的平均靶标细胞消除率是35%(对于基因型A)和51%(对于基因型C)。清除是强力的,但不如同如实施例1中所述,在用单独核心Ag质粒免疫的小鼠中观察到的反应一样强力,在实施例1中,指示脾脏和肝脏中的靶标清除率分别是83%和76%。对针对HBs产生的CTL可靶向肝脏中的抗原清除的证明是令人鼓舞的,因为它支持HBs和HBc组合以进一步扩大细胞效能以及限制逃逸。对于SHBs-A和SHBs-C,肝脏中的靶标细胞的消除百分比是45%和66%,而在LHBs-A和LHBs-C组中,是60%和74%(图54)。疫苗特异性CTL迁移至肝脏(已知会遏制T细胞反应并诱导耐受性的器官)中强调构建体在诱导功能性CMI方面的有效性。
实施例5
HBsAg-HBcAg DNA混合物的免疫原性
因为用各合成HBsAg质粒免疫引发广泛交叉反应性免疫反应,所以超出表面抗原来延伸反应以进一步增强针对病毒内的不同抗原的免疫原性。使HBs质粒与编码HBcAg的质粒(pMCore)组合以产生用于免疫的HBs-HBc DNA疫苗混合物来确定所述混合物是否将通过增加T细胞将识别以消除的免疫表位的数目来增强细胞反应,因为HBV的核心抗原涉及通过诱导HBcAg特异性CTL反应来进行病毒清除。
五组小鼠用仅HBs抗原或HBs和HBc组合抗原的疫苗混合物免疫。各小鼠接受两次注射,继之以在两处TA中进行电穿孔。小鼠用仅含有表面抗原(两种基因型)的混合物或用含有表面抗原与实施例1中所述的共有核心抗原质粒(pMCore)两者的混合物免疫(参见表3)。仅HBsAg免疫的小鼠在它们的血清中产生高IgG效价。引起关注的是,在SHBs-pMCore组中观察到类似效价,但在LHBs-pMCore混合物组中强力性较小(图55A)。抗原靶标的增加可能已导致一定抗体抑制。
表3HBs-HBc DNA混合物小鼠研究的免疫组。
小鼠组 | DNA混合物 |
组1 | 仅pGX0001 |
组2 | pLHBs-A/pLHBs-C |
组3 | pSHBs-A/pSHBs-C |
组4 | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore |
组5 | pSHBs-A/pSHBs-C/pMCore |
为进一步探究由HBs-HBc免疫的小鼠引发的免疫反应,评估各免疫组的IFN-γ的产生。对于基因型A和基因型C肽,无pMCore的各组的每百万个脾细胞的平均SFU分别是约689和666以及1160和1312。此外,针对基因型C,添加pMCore使每百万个脾细胞的总SFU平均增加400个斑点,并且当脾细胞用基因型A肽刺激时,反应加倍(图55B)。
已知CD8 T细胞是负责HBV清除的主要效应细胞。重要的是确定哪个T细胞类型导致所观察到的IFN-γ产生,并且考查这些T细胞是否可响应于抗原性再相遇,通过释放其它抗病毒细胞因子(如TNF-α和IL-2)和脱粒标记(如CD107a)来诱导多种抗病毒功能。在用适当肽离体刺激之后评估来自免疫的小鼠的CD8 T细胞诱导这些细胞因子和标记的能力。多色流动分析揭示在所有组内,来自各组的显著百分比的CD8 T细胞是多功能性(即,产生多种细胞因子)、活化的CD8 T细胞(图56A-F)。在这些CD8 T细胞中,也观察到抗原特异性诱导淋巴细胞脱粒标记CD107a。当用表面抗原肽刺激时,来自HBs-HBc混合物组的CD8 T细胞显示较高多功能活性,从而确认CD8T细胞抗病毒细胞因子(如IFN-γTNF-α和IL-2)和脱粒标记CD107a的协同作用。也观察到通过清除转移的抗原脉冲处理的细胞来诱导CTL。尽管对于包括LHBs构建体的混合物,对HBs的抗体反应存在降低,但SHBs-pMCore疫苗混合物维持体液反应在仅用SHBs免疫的动物中被检测到。
实施例6
用混合物免疫恒河猴诱导强烈细胞HBc和HBs特异性以及体液HBs特异性免疫反应
先前DNA构建体在较大动物和人中的DNA疫苗效能已证明一致地较微弱。由pLHBs或pSHBs和pMCore的组合在小鼠中激发的强烈抗体和T细胞反应导致对这些构建体在更接近地模拟人免疫反应的非人灵长类动物模型(NHP)中的免疫原性的评估。对于疫苗免疫原性而言,这是一个障碍,因为相较于小鼠模型,NHP的较大规模和远系繁殖的MHC群体通常导致免疫原性降低或不存在。对于这些研究,添加Th1驱动性细胞因子IL-12以进行分析。已显示当作为佐剂添加至免疫中以增强针对来自各种病原体的不同抗原的免疫反应时,IL-12通过帮助CD8 T细胞致敏和扩增来驱动CMI。这个佐剂增加DNA疫苗在小鼠中以及在猕猴和人中的T细胞反应。
1.疫苗接种
根据美国实验室动物照顾认证联合会(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care)的标准将15只印度恒河猴舍饲在Bioqual(Rockville,MD)。将恒河猴置于各组,其中各组有5只猴。参见表4。
表4非人灵长类动物免疫组
猴组 | DNA混合物 |
组A | pSHBs-A/pSHBs-C/pMCore |
组B | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore |
组C | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore+IL-12 |
一组通过肌肉内(IM)递送(也称为体内电穿孔)来施用包括1.0mg各构建体pMCore、pSHb A和pSHb C的疫苗;这个组称为“小”组。第二组通过IM递送来施用包括1.0mg各构建体pMCore、pLHb A和pLHb C的疫苗;这个组称为“长”组。第三组通过IM递送来施用包括1.0mg各构建体pMCore、pLHb A和pLHb C、以及0.4mg prhIL-12(表达优化恒河猴IL-12的质粒)的疫苗;这个组称为“长+IL-12”或“pLHBs+12”组。构建体prhIL-12编码恒河猴IL-12蛋白。将DNA递送至四头肌中的单一部位中,继之以用恒定电流装置(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)进行体内EP,其中以0.5A恒定电流、52ms脉冲长度以及脉冲之间停止1s下进行3次脉冲。在第0、4、12和30周对动物接种疫苗。
2.样本收集
在第0周免疫之前以及在各次免疫之后(即在第0、4和12周之后),自猴收获样本。在各次免疫之后2周,将动物放血。将血液(在各时间点20mL)收集在EDTA管中,并且使用标准菲科尔-希帕克(Ficoll-Hypaque)程序,用Accuspin管(Sigma-Aldrich)分离PBMC。将额外5mL血液收集至凝结管中,并且将血清等分以进行分析。
在用pSHBs/pMCore而非用pLHBs/pMCore免疫两次之后,观察到针对HBsAg的高效价抗体反应。这个反应与图55A的小鼠抗体数据类似。在第三次免疫之后,针对pLHBs/pMCore的反应得以加强。早在仅两次免疫之后,IL-12佐剂就使pLHBs/pMCore混合物免疫的抗体效价增强(图57A)。
在第一次免疫之后,来自PBMC的细胞免疫反应显示少许乃至无HBs或HBc特异性反应。然而,在第二次免疫之后,观察到反应,并且在各次随后免疫之后得以加强。在第三次免疫之后,在所有组中观察到每百万个PBMC超过2000SFU的强力反应,并且主要靶向核心抗原。相较于单独pLHBs/pMCore混合物,添加IL-12佐剂使T细胞反应的量值增强每百万个PBMC 1000SFU(图57B)。为进一步确定细胞反应的幅度,产生共有核心肽的基质集合物以测定可能的表位的数目。T细胞反应跨越多种肽集合物,其中平均对12个肽表位起反应(图57C)。这些反应与先前如在小动物模型中观察到的那些一致。这些结果表明这些混合物能够以强力量值与幅度两者诱导细胞反应,并且这些反应的量值可通过添加IL-12来进一步增强。
图45-48显示由向小、长和长+IL-12组施用的疫苗诱导的细胞免疫反应。酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)测定用于测定细胞免疫反应,如以上在实施例1中所详述。如图45-48中所描绘,各次疫苗接种使T细胞反应加强。然而,HBV核心抗原比HBV表面抗原A和HBV表面抗原C具有更大免疫原性。数据也证明较长共有HBV表面抗原(即,包括S蛋白、前S2和前S1)与较小共有HBV表面抗原(即,包括S蛋白)具有相同免疫原性。
类似于图45-48,图49显示如通过ELISPOT测定测量的由向小、长和长+IL-12组施用的疫苗诱导的细胞免疫反应,然而,考查涵盖核心抗原、表面抗原A和表面抗原C的肽的不同集合物。再次,各次疫苗接种使T细胞反应加强,添加IL-12使细胞免疫反应增强,并且长和短共有HBV表面抗原具有类似免疫原性。
图50显示比较小、长和长+IL-12组的抗HBV抗体反应的ELISA数据。如以上在实施例1中所详述来进行ELISA。观察到自免疫的猴收集的血清中的抗原特异性体液反应。具体来说,包括长共有表面抗原(即S蛋白、前S2和前S1)的疫苗具有较好抗体反应,此可归因于疫苗中存在额外表位。
图51显示比较长+IL-12组在免疫之前(疫苗接种前)以及在免疫之后第0周、第4周和第12周(即分别是第1次后、第2次后和第3次后)的抗HBV抗体反应的ELISA数据。如以上在实施例1中所述来进行ELISA。图51中的数据说明2次免疫或剂量为产生可测量的抗体所需。此外,在第三次免疫或剂量之后,观察到抗HBV抗体反应的显著加强。
实施例7
类似于实施例5中用小鼠进行的实验,自实施例6的免疫的恒河猴分离脾细胞(即CD8和CD4 T细胞)以考查响应于施用共有核心和共有表面抗原的组合的INF-γ和TNF-α分泌水平。通过多功能和表型流动分析来研究CD8和CD4 T细胞以考查肿瘤坏死因子、干扰素γ和CD107a自这些CD8和CD4 T细胞的分泌以确定来自实施例6的免疫的猴的CD8和CD4 T细胞是否与实施例1中研究的小鼠CD8和CD4 T细胞具有类似特征。
为进一步确定细胞免疫反应的功能,在用来自A和C基因型的核心和表面抗原刺激之后,对抗病毒细胞因子进行细胞内染色。用针对抗病毒细胞因子的抗体进行的细胞内染色揭示在来自免疫的猴的CD4与CD8 T细胞两者中,抗病毒细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)的抗原特异性产生被诱导。图57D显示在三次免疫之后,观察到HBV特异性CD4与CD8 T细胞反应两者。类似于用IFN-γELISpot观察到的结果,针对核心抗原的反应占优势。然而,添加IL-12使反应的总体量值增强,如所预期,这个作用对于CD8 T细胞而言更显著。平均诱导CD4与CD8反应两者1%表明诱导由Th1免疫性与Th2免疫性两者组成的广泛免疫反应,并且就这个策略在人试验中的进步而言是强烈令人鼓舞的。
针对HBs抗原与HBc抗原两者的抗体和T细胞反应类似于实施例5中用小鼠产生的结果。当作为Th1极化细胞因子佐剂的IL-12添加至pLHBs-pMCore混合物中时,这些反应是甚至更令人印象深刻的。似乎pLHBs-pMCore+IL-12制剂高度有效作为优选组合。值得注意的是疫苗制剂不导致与肝脏损伤相关的参数升高。
实施例8
使用肝脏血液化学状况分析在疫苗接种后分析非人灵长类动物中的肝脏功能
因为对用HBV活动性感染的患者的临床研究已表明T细胞反应可能与在疾病期间的肝病变相关联,所以对这些多价疫苗关于肝脏功能的总体安全性进行初步分析。为考查肝脏功能,在免疫之前、在第三次疫苗接种之后、以及恰好在第四次疫苗接种之前和在第四次疫苗接种之后分析接种疫苗的动物中的碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素的血清水平。血液化学状况分析由IDEXX Laboratories操作,并且包括碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素。这个分析的结果显示于图58中。在免疫时期完成之前、期间和之后,肝功能测试中不存在碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素升高表明诱导HBV特异性免疫反应并不诱导针对接种疫苗的动物的肝脏的显著损害。
总之,数据支持与特定电穿孔组合施用编码设计的HBV抗原的这个合成DNA疫苗混合物会在小鼠与NHP两者中驱动强力以及不同细胞和体液反应,同时避免总体毒性。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的,并且不应视为对本发明的范围的限制,所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。
对公开的实施方案的各种变化和修改将为本领域技术人员显而易知。可在不脱离本发明的精神和范围下进行所述变化和修改,包括但不限于关于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法的那些变化和修改。
Claims (22)
1.一种疫苗,其包含:
(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:10和SEQID NO:14;或
(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:12和SEQID NO:16。
2.如权利要求1所述的疫苗,其还包含:
(c)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6。
3.如权利要求1所述的疫苗,其包含:
(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:10和SEQID NO:14;
(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:12和SEQID NO:16;以及
(c)编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子:SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6。
4.如权利要求3所述的疫苗,其中所述核酸分子包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13和SEQ ID NO:15。
5.如权利要求1所述的疫苗,其中所述核酸分子是质粒。
6.如权利要求1所述的疫苗,其中所述核酸分子被并入病毒颗粒中。
7.如权利要求1所述的疫苗,其还包含佐剂分子。
8.如权利要求7所述的疫苗,其中所述佐剂分子是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
9.权利要求1所述的疫苗用于生产用于在受试者中诱导针对HBV抗原的免疫反应的药剂的用途。
10.权利要求1所述的疫苗用于生产用于保护受试者免受HBV感染的药剂的用途。
11.权利要求1所述的疫苗用于生产用于保护已诊断有HBV感染的受试者的药剂的用途。
12.一种核酸分子,其包含编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的编码序列:
包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的蛋白质。
13.如权利要求12所述的核酸分子,其包含一个或多个选自由以下组成的组的序列:
SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15。
14.如权利要求12所述的核酸分子,其中所述核酸分子是质粒。
15.如权利要求12所述的核酸分子,其中所述核酸分子是表达载体,并且编码一种或多种蛋白质的序列可操作地连接至调控元件。
16.如权利要求12所述的核酸分子,其中所述核酸分子被并入病毒颗粒中。
17.权利要求12所述的核酸分子用于生产用于在受试者中诱导针对HBV抗原的免疫反应的药剂的用途。
18.权利要求12所述的核酸分子用于生产用于保护受试者免受HBV感染的药剂的用途。
19.权利要求12所述的核酸分子用于生产用于保护已诊断有HBV感染的受试者的药剂的用途。
20.一种蛋白质,其选自由以下组成的组:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16。
21.一种适用于在受试者体内产生针对HBV的免疫反应的疫苗,所述疫苗包含:
如权利要求12所述的核酸分子,和
佐剂分子。
22.如权利要求21所述的疫苗,其中所述佐剂分子是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
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