CN101095951B

CN101095951B - 治疗性hbv dna疫苗、制备方法及应用

Info

Publication number: CN101095951B
Application number: CN2007100291115A
Authority: CN
Inventors: 陈光明; 饶桂荣; 罗显荣; 杨富强; 莫国玉; 陈阳述
Original assignee: No458 Hospital P L A
Current assignee: Guangzhou Guang Yi Gan biological products Limited by Share Ltd
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2027-07-11
Also published as: CN101095951A

Abstract

本发明涉及一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗、制备方法及应用。该HBV双质粒DNA疫苗包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF，其真核表达载体为pVAX1。质粒体外转染非洲绿猴肾细胞(COS-7)，检测到目的基因的较高水平表达。经裂解、纯化后双质粒按1∶1配伍，联合在体电脉冲技术注射Balb/c小鼠，检测到HBV DNA疫苗能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。本发明还涉及该治疗性HBV DNA疫苗在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

Description

治疗性HBV DNA疫苗、制备方法及应用

发明领域

本发明涉及一类新型治疗性疫苗的构建、制备及应用。具体的说，本发明涉及治疗性HBV DNA疫苗的构建、制备及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染呈全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，并与肝硬化、肝癌的发病密切相关，是严重危害人类健康的感染性疾病。目前全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75％分布在亚太地区，我国的慢性无症状感染者超过1.2亿，且慢性乙型肝炎预后不良。目前的抗病毒药物主要是核苷类似物和重组干扰素类药物，但效果不十分理想。因此，急需一种更有效的治疗性疫苗，不仅能够预防HBV的感染，而且能够打破慢性乙肝患者的免疫耐受状态，使其产生体液免疫和细胞免疫，清除肝细胞的病毒，使患者痊愈。

DNA疫苗是20世纪末开发出来的新型疫苗，1990年Wolff等发现DNA免疫后，标志着新的疫苗革命。DNA疫苗与传统疫苗相比有诸多优点，尤其是其可诱导特异性CTL反应的能力，使它在抗细胞内感染中独具优势。它将编码外源性抗原蛋白的基因表达载体直接导入机体，通过宿主细胞摄取外源DNA，进入核内进行转录，然后在胞质中翻译，翻译产物进一步与MHC-1类分子结合，提呈至细胞表面，被CD8+T细胞识别，产生较强的CTL的细胞免疫。同时，有一部分短肽可进入溶酶体/内体与MHC-II类分子结合，被CD4+T细胞识别，产生CD4+T细胞介导体液免疫应答。CD4+T细胞介导的免疫应答偏向ThI，产生高水平的IFN-γ，并刺激产生IgG2同种型抗体。这种HBV DNA疫苗在宿主体内表达的抗原的免疫过程与自然免疫相似，可以提呈天然构象的乙肝表面抗原HBsAg，无抗原表位的改变，并且具有长期记忆免疫反应，不但能用于预防，且可用于治疗。因此，乙肝HBV DNA疫苗已经成为当前研究的热点。1993年Davis等开展了HBV基因免疫的研究，但由于安全性、耐受性及有效性等顾虑而仅限于动物实验。1999年Tacket等率先报道HBV DNA疫苗I期临床试验获得较好的结果，标志着HBV

DNA疫苗已从实验研究逐步走向临床应用。2004年法国巴斯德研究所报道的HBV DNA疫苗的I期临床试验取得较好结果，同年，英国和赞比亚的报道临床42例患者耐受性良好。2006年韩国Dong-A药厂的多联疫苗亦取得较好的临床试验结果。

虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人鼓舞，但其免疫效果远未达到理想水平，因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键，增强的途径有提高细胞转染率，增加抗原表达及提高机体对抗原的免疫反应性等。其中细胞因子表达质粒作为基因佐剂，克服了细胞因子基因工程蛋白的半衰期短、价格昂贵和毒副作用大等缺点，可显著增强DNA疫苗的免疫效果，而且由于其作用短暂，不会导致全身细胞因子水平增高，不会改变机体对不相关抗原的免疫反应，亦不会促进或诱导病理性自身抗体产生，因此安全性良好。基因免疫最常用的途径是经肌肉或皮肤，其他途径如腹腔、口腔、直肠及***，基因枪和肌肉注射是公认的DNA免疫有效导入方式。在HBV DNA疫苗的临床实验中，采用基因枪将包被质粒DNA的金颗粒轰击至皮内，能使有效的抗原提呈和识别相结合，但基因枪接种存在诸如免疫应答持续时间短、金颗粒制备繁琐及随温度增加包被的DNA会脱落等缺点。目前构建DNA疫苗通常包括选取表达抗原的目的基因和细菌质粒真核表达载体。在构建临床应用的质粒时，选用pWRG7077类似的载体，关键的启动子和调控元件为HCMV早期启动子/SV40早期启动子、外显子1、内含子A，加牛生长激素polyA尾(BGH pA)，***抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、卡那霉素，也有选择新霉素或潮霉素的抗性基因，还含pUCori的ColEI或pMB1复制起点便于在大肠杆菌复制。为了防止DNA在宿主细胞中复制并整合到染色体中去，载体中不能含有SV40等病毒复制基因，由于人类对青霉素的过敏反应要比卡那霉素频繁，因而用于临床的DNA疫苗载体最好只选择卡那抗性基因，尽管它比氨苄青霉素抗性基因含有的CpG核苷酸序列要少，(CpG核苷酸序列有显著增强免疫作用，有佐剂效果)。经过改构的pVAX1真核表达载体符合以上特点，而且含有增强目的基因表达的KOZAK序列，是美国FDA批准的唯一可用于临床试验的DNA疫苗载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗，包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF。

本发明的另一目的在于提供一种HBV双质粒DNA疫苗的制备方法。

治疗性HBV DNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S为目的基因的DNA疫苗质粒(简称为pS2.S)和以人IL2和IFN-γ为目的基因的佐剂质粒(简称为pIIF)。

一种HBV双质粒DNA疫苗的构建方法：

疫苗质粒pS2.S构建：本发明采用真核表达载体pVAX1，根据载体的要求，设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物P1：5`GGAAGCT`TAGG ATG GGC TGG CTG CAG AGCCTG-3`，下游引物P2：5`-GGGAATT`C TTAAAT GTATAC CCAAAG ACAA-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为900bp，见图1-1所示。回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAX1，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5α感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆，按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定，见图2-2所示。

佐剂质粒pIIF的构建：设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1：5`-GAAGCT`TAGG ATGGGC TAC AGG ATG CAA CTC-3`，P2：5`-GGGAATT`CTTA CTG GGA TGC TCT-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒(目的基因人IL2和IFN-γ以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，见图1-2所示。按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定，见图2-3所示。

治疗性HBVDNA疫苗双质粒的体外鉴定采用体外转染非洲绿猴肾细胞(COS-7)，检测到目的蛋白的较高水平表达。

按Endofree Plasmid Mega Kit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF，参照Invitrogen公司脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10％新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞，重悬于含血清RPMI1640培养液，按3×10⁵细胞/孔转种于6孔培养板中，37℃、5％CO₂培养，待贴壁细胞生长达90-95％融合度，分别取4μg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒进行转染，同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清，按“立可读”乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-γ检测试剂盒定量检测目的基因的表达量。结果显示，对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物，以pVAX1构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达，检测HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒表达的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml，显然比pVAX1载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些，这可能是因为pVAX1载体含有KOZAK序列，该序列能显著增强目的基因的表达。

同时收集含目的基因的表达产物的转染上清，浓缩后行常规SDS-PAGE，并按ECL试剂盒操作说明书进行ECL Western blotting分析，见图3-4、4-3。HBV DNA疫苗质粒pS2.S的表达产物具有较强的HBsAg生物学活性，分子大小约为30Kd，佐剂质粒pIIF表达产物具有较强的IL2生物学活性和IFN-γ，分子大小约为110Kd，推测是融合蛋白hIL2/IFNγ形成四聚体的缘故，因为天然IL2常以二聚体或四聚体的形式存在。

为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白hIL2IFNγ的生物学活性，采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白hIL2IFNγ序列进行模建分析，并和天然的IL2、IFNγ进行比对，结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hIL2IFNγ蛋白，其空间结构能够和天然IL2、IFNγ基本吻合，空间模拟其活性部位完全裸露在外，无任何屏蔽结构，见图5，可见融合蛋白hIL2IFNγ同时具有天然IL2、IFNγ的生物学活性，且二者有协同作用，这为质粒pIIF作为HBV DNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基础。

本发明的目的还在于提供一种疫苗的制备方法。

HBV DNA疫苗的制备过程：疫苗质粒(pS2.S)和佐剂质粒(pIIF)的制备方法相同，但分开生产，发酵、裂解、纯化方法过程如下：

发酵：采用BIOSTAT DL 70型发酵罐(德国B.Braun)，以Yeast Extract 8g/L、Tryptone16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na₂HPO₄·H₂O 7.08g/L、KH₂PO₄·12H₂0 1.58g/L；微量氨基酸适量为基础培养基，以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO₄ 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10％接种量，37℃恒温培养，pO2控制在35％以下，在线检测菌密度的OD600值，计算质粒含量。发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌。

裂解：

取检测合格的发酵菌30-32g，加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬，冰浴10min；加临用前配置的P2缓冲液900ml裂解细菌，冰浴4min；加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min；离心，4℃，9,000g，15min，上清过G3细菌漏斗，收滤过液；滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液；滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置(4℃)低温冷柜2h，离心，4℃，9,000g，10min，收集沉淀；70％乙醇洗沉淀后用30ml B1溶解得质粒初提液置4℃保存。

裂解所用试剂组成如下：

●P1：50mM Tris，10mM EDTA，pH8.0

●P2：200mM NaOH，1％SDS，临用前配制

●P3：3.0MKAC，pH5.5

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

纯化：质粒初提液经分子筛柱，收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化，最后上阴离子柱，收集质粒峰并用有机溶剂沉淀，用缓冲液溶解质粒DNA。

其优选方案如下：

质粒初提液直接上样Sepharose 4Fast Flow分子筛柱，始终用Buffer I缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱，以达到有效去除内毒素和浓缩质粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下：

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferII：3M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIII：2M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIV：2M(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl 10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferV：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferVI：0.6M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●PBS溶液：Na₂HPO₄·12H₂O 4.86g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5g，NaCl 9g，定容1000ml质粒DNA纯度可达到95％。

本发明治疗性HBV DNA疫苗双质粒能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。双质粒疫苗联合在体电脉冲技术(上海交通大学研制，国内首次应用于基因导入)能显著提高大体重动物即家兔和恒河猴的免疫效果，可显著降低HBVTg(转基因)小鼠的HBsAg、HBV DNA、ALT水平，并产生特异性细胞免疫。

工具酶与主要试剂

真核表达载体pVAX1购自Invitrogen公司(CATALOG NO.V260-20)；

pcDNA3.1/preS2.S和pcDNA3.1/preIL2IFNγ质粒由申请人构建保存，具体构建已在受理号为00107853.4中国发明专利申请文件中公开；

限制性内切酶，pfu聚合酶，T₄DNA连接酶等均购自NEB公司；

DH5α菌株购于上海***生物技术公司；

引物合成由上海英骏生物公司完成；

质粒小量提取试剂盒为上海华舜生物公司产品；

Endofree Plasmid Mega Kit为QIAGEN公司产品；

COS-7细胞株购自上海细胞研究所；

Lipofectamine^TM2000转染试剂为Invitrogen公司产品；

“立可读”乙肝表面抗原试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司；

人白细胞介素(IL-2)和干扰素(IFN-γ)检测试剂盒为晶美生物工程公司；

抗人HBsAg单抗、抗人IL-2和IFN-γ单抗体均购自BD公司；

ELISpot试剂盒购自BD公司。

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。

附图说明

图1是本发明的目的基因的PCR产物图；

1、3分别是目的基因S2.S和融合IIF的PCR产物；2为Marker DL2000

图2双质粒的双酶切图谱

1是Marker DL15000；2.3为双质粒的EcoRI+HindIII的酶切

图3质粒pS2.S转染COS-7细胞表达产物的ECL western blot分析

1.分子量标准；2.未转染组；3.空载体组；4.pS2.S.

图4质粒pIIF转染COS-7细胞表达产物的ECL western blot分析

1.未转染组；2.空载体组；3.pIIF；4.分子量标准.

图5融合蛋白中IL-2活性部位(橙色)与IFN-γ活性部位(粉色)

图6HBV DNA疫苗治疗后血清HBsAg水平降低的HBV Tg小鼠个体细胞免疫状态

具体实施方式：

下面是本发明的实施例，所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。

实施例1

治疗性HBV DNA疫苗的构建

我们采用购自Invitrogen公司的真核表达载体pVAX1，根据载体的要求，设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGC TGG CTG CAG AGC CTG-3`，下游引物P2：5`-GGGAATT`C TTA AAT GTA TAC CCA AAG ACA A-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为900bp，见图1-1所示。回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAX1，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5α感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆，按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定，见图2-2所示。

佐剂质粒pIIF的构建：设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATGGGC TAC AGG ATG CAA CTC-3`，P2：5`GGGAATT`CTTA CTG GGA TGC TCT-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒(目的基因人IL2和IFN-γ以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，见图1-2所示。按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定，见图2-3所示。

实施例2

治疗性HBV DNA疫苗双质粒的体外鉴定

按Endofree Plasmid Mega Kit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF，参照Invitrogen公司脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10％新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞，重悬于含血清RPMI1640培养液，按3×10⁵细胞/孔转种于6孔培养板中，37℃、5％CO₂培养，待贴壁细胞生长达90-95％融合度，分别取4μg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒进行转染，同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清，按“立可读”乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-γ检测试剂盒定量检测目的基因的表达量，见表1。结果显示，对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物，以pVAX1构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达，检测HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒表达的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml，显然比pVAX1载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些，这可能是因为pVAX1载体含有KOZAK序列，该序列能显著增强目的基因的表达。

为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白hIL2IFNγ的生物学活性，我们采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白hIL2IFNγ序列进行模建分析，并和天然的IL2、IFNγ进行比对，结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hIL2IFNγ蛋白，其空间结构能够和天然IL2、IFNγ基本吻合，空间模拟其活性部位完全裸露在外，无任何屏蔽结构，见图5，可见融合蛋白hIL2IFNγ可同时具有天然IL2、IFNγ的生物学活性，且二者有协同作用，这为质粒pIIF作为HBV DNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基础。

表1双质粒转染COS-7细胞检测结果

	HBsAg(ng/ml)	IL-2(ng/ml)	IFN-γ(ng/ml)
				未转染组	----	----	----
空载体组	----	----	----
				pVAX1/preS2.S质粒	45.1	----	----
pVAX1/hIL2IFN<sub>γ</sub>质粒	----	10.03	11.5

pcDNA3.1/preS2.S质粒	26.3	----	----
				pcDNA3.1/hIL2IFN<sub>γ</sub>质粒	----	6.3	5.4

实施例3

治疗性HBV DNA疫苗双质粒的制备

发酵：采用BIOSTAT DL 70型发酵罐(德国B.Braun)，以Yeast Extract 8g/L、Tryptone16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na₂HPO₄ H₂O 7.08g/L、KH₂PO₄ 12H₂0 1.58g/L；微量氨基酸适量为基础培养基，以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO₄ 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10％接种量，37℃恒温培养，pO2控制在35％以下，在线检测菌密度的OD600值，计算质粒含量。发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌。

裂解：

取检测合格的发酵菌30-32g

↓

加P1缓冲液(临用前配置)900ml混悬，冰浴10min

↓

加P2缓冲液(临用前配置)900ml裂解细菌，冰浴4min

↓

加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min，

↓

离心，4℃，9,000g，15min

↓

上清过G3细菌漏斗，收滤过液

↓

滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液

↓

滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置(4℃)低温冷柜2h

↓

离心，4℃，9,000g，10min，收集沉淀

↓

70％乙醇洗沉淀后用30ml B1溶解得质粒初提液置4℃保存裂解所用试剂组成如下：

●P1：50mM Tris，10mM EDTA，pH8.0

●P2：200mM NaOH，1％SDS，临用前配制

●P3：3.0M KAC，pH5.5

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

纯化方案如下：

质粒初提液直接上样Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，始终用Buffer I缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱，以达到有效去除内毒素和浓缩质粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶液溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下：

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●Buffer II：3M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIII：2M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIV：2M(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl 10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferV：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferVI：0.6M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●PBS溶液：Na₂HPO₄·12H₂O 4.86g，NaH₂PO₄·2H₂O0.5g，NaCl 9g，定容1000ml质粒DNA纯度可达到95％。

实施例4

双质粒联合电脉冲技术诱导健康BaLb/c小鼠的体液和细胞免疫

实验动物：BALB/C小鼠购自广州中医药大学，雌性，4-6周龄，19-21g，属SPF(III)级动物，有合格证书。

免疫接种和实验分组：腹腔注射戊巴比妥钠先使实验动物处于麻醉状态，在注射部位(小鼠后腿或胫前肌)褪毛，消毒，垂直接种DNA疫苗。或再将电脉冲电极以注射孔为中心垂直***，电极针***略深于注射针深度，电场强度200v/cm，放电6次，10秒后拔电极针。健康小鼠60只，每组10只，共分为8组，前4组各5只，后4组各10只：(1)pVAX1(100μg/只)；(2)pS2.S(100μg/只)；(3)pS2.S(50μg/只)；(4)pS2.S(10μg/只)；(5)pS2.S+pVAX1(5μg+5μg/只)；(6)pS2.S+pIIF(10μg+10μg/只)；(7)pS2.S+pIIF(5μg+5μg/只)；(8)pS2.S+pIIF(5μg+5μg/只)+EP；分别在接种的0、2、4周采用眼球后静脉丛穿刺法采血，分离血清并于-20℃保存，待进行一次性抗-HBs的ELISA检测，并计算抗体出现的阳性小鼠数，四周后，处死小鼠取脾脏分离淋巴细胞进行ELISPOT实验检测。

检测方法：(1)体液免疫检测，取小鼠血清严格按说明书进行(上海实业科华生物技术限公司)；(2)细胞免疫检测：小鼠淋巴细胞制备，①颈椎脱臼法处死小鼠，置盛有75％乙醇的烧杯中，使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上，然后切开小鼠腹腔，取出脾脏；②将分离的脾脏放于下置无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴)，用研磨棒(可用玻璃注射器内芯代)轻轻捻碎脾组织，研磨挤压出脾细胞，取5ml无血清1640培养液(IC)缓缓冲下细胞至烧杯中；③将5ml脾细胞悬液缓慢加入装有2.5ml淋巴细胞分离液的14ml离心管中，2,000-2,500r/min离心20min，收集分离淋巴细胞后，用IC离心洗涤细胞2次，每次1500r/min离心6min；④用适量含5％FCS-1640完全培养液重悬分离的脾淋巴细胞，台盼兰染色计数每只小鼠分离淋巴细胞活细胞总数，调整细胞密度至3×10⁵/ml，37℃5％CO₂培养箱中培养以供ELISPOT检测。

ELISPOT检测：严格按BD公司试剂盒使用说明书方法操作。判断标准：参照文献并结合本研究验证结果，同时符合以下两条者认定为ELISPOT检测HBsAg特异性Th1细胞阳性：①一定细胞密度条件下，ELISPOT检测板中同一样品HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔斑点均数(SFC)的比值应不小于2；②免疫实验组样品淋巴细胞密度为3×10⁵/孔检测时，HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔SFC均数的差值不小于5，作为小鼠特异性细胞免疫的阳性评价标准，HBV DNA疫苗免疫组的细胞免疫应答阳性率应不低于60％。

统计学结果处理，组间均数及百分率差异显著性统计分别采用t检验及查统计简表法。

血清-HBs≥10mIU被认为是机体保护性有效浓度。结果见表2，pVAX1空载接种正常小鼠后血清抗-HBs浓度均＜10mIU/ml，抗-HBs的小鼠阳性数为0。与之相比，pS2.S高(100μg/只)，中(50μg/只)、低(10μg/只)三组剂量一次性免疫健康小鼠均能在2周诱导抗-HBs产生(＞10mIU/ml)。血清抗体水平比较，高剂量组(82.9±30.0)mIU/ml较中剂量组(42.2±25.6)mIU/ml、低剂量组(24.6±7.5)mIU/ml差异分别具显著性(t＝2.308，P＜0.05)及非常显著性(t＝4.216，P＜0.01)。这表明疫苗pS2.S质粒能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的产生，且具有剂量相关性。pS2.S+pVAX1空载以5+5μg/只的低剂量免疫组2周后阳性鼠数为1，而采用pIIF作为佐剂免疫质粒且剂量相同情况下，2周后阳性鼠数为3，并产生较高的保护性抗体水平，4周后阳性鼠为50％，而增加剂量达10+10μg/只免疫组2周后阳性鼠为50％，4周后抗体阳性鼠为100％，比较此三组的细胞免疫结果，以pS2.S+pIIF按10+10μg/只免疫组的ELISPOT阳性率达80％为最好，组间数据具显著性差异(P＜0.01)，说明pIIF佐剂可增强pS2.S的免疫效果。在前几组的基础上，按pS2.S+pIIF+EP按5+5μg/只的免疫组，2周保护性抗体阳性为80％，4周后检测达100％，细胞免疫ELISPOT阳性率达100％。这充分表明，EP技术能显著提高疫苗pS2.S和佐剂pIIF双质粒的体液和细胞免疫效果，差异具非常显著性。分析其原因是EP技术可瞬间增加细胞膜的通透性，有效介导质粒进入效应细胞表达目的抗原，通过MHC-II或MHC-I类抗原递呈途径诱导T细胞增殖并向Th1亚群分化，提高了IL2/IFNγ的分泌水平，有效增强细胞免疫应答。

表2佐剂pIIF质粒和EP技术增强疫苗pS2.S的免疫效果

实施例5

在体电脉冲技术显著提高pS2.S/pIIF在大体重动物的免疫效果

实验动物：新西兰兔：购自广州市出入境检验检疫局动物检验所，具广东省动物监测中心颁发的动物合格证书。灵长类动物：食蟹猴及恒河猴，体重3-5kg，年龄2-5岁，由广东省顺德实验动物所提供。

健康家兔免疫实验：接种部位为兔两小腿内侧腓肠肌，褪毛消毒后，先将DNA注入肌肉，再将3路6点电极中心对准DNA注射孔(DNA注射深度应略比电极针浅)***肌肉，10秒后放电拔针即可。电场强度：200v/cm，放电6次。按接种pS2.S/pIIF不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将动物分为4组，每组5只。各组pS2.S/pIIF剂量分别为：A组：(5+5)μg/只；B组：(25+25)μg/只；C组：(50+50)μg/只；D组：(1000+1000)μg/只，非在体电脉冲法接种，作对照组。于接种后第10周各组均增强免疫1次，剂量与方法同初免，并分别于初免后第2、4、13周时采血留样，ELISA法检测血清抗体-HBs水平。

健康猴免疫实验：接种部位为两腿胫前肌，其他同家兔注射。按不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将健康猴分为5组(3只/组)进行实验。A组：pS2.S/pIIF剂量为(1000+1000)μg/只；B组：(500+500)μg/只；C组：(100+100)μg/只；D组：(1000+1000)μg/只，非在体电脉冲法接种，作对照组。各组于接种后第4、10周均增强免疫1次，剂量与方法同初免，并分别于初免后第2、4、8、13周时采血留样，ELISA法检测血清抗体-HBs水平。

统计学处理，组间均数及百分率差异显著性统计分别采用t检验及查统计简表法。

采用电脉冲肌注双质粒DNA疫苗免疫新西兰家兔2周时，在大剂量(50μg)和中剂量(25μg)组联合免疫最早分别有3/5、1/5只血清抗HBs水平阳性，至4周时阳性动物数虽无变化，但两组抗体水平明显升高。较同期对照组(1mg)和小剂量组的差异具显著性(P＜0.05)。初免后的13周，在体电脉冲的三个剂量组动物血清均有抗-HBs出现，分别为4、4、5只，而对照组始终为阴性，差异具显著性意义(P＜0.05)，但免疫组间差异无显著性。见表3。对于恒河猴的免疫结果与新西兰家兔近乎相同。

实验结果表明，在体电脉冲技术对体重相对大的动物新西兰家兔(表3)及恒河猴(表4)的免疫效果都有着质的提高：pS2.S联合pIIF免疫接种二种动物在剂量为(1+1)mg的条件下均不能诱导血清抗-HBs的产生，而应用电脉冲技术肌肉给药可促进恒河猴(500μg/只)及新西兰兔(25μg/只)产生良好的免疫反应。说明电穿孔技术可从本质上提高质粒体内转染率，从而降低质粒有效接种剂量。这从技术上解决了文献报道的HBVDNA疫苗对小动物有效而对大动物无效的问题，在疫苗使用方法上为其向临床应用提供实验依据。

表3电穿孔法接种DNA疫苗诱导新西兰家兔血清抗-HBs水平结果

表4电穿孔法接种DNA疫苗诱导恒河猴血清抗-HBs水平结果

实施例6

联合电脉冲技术对HBV转基因小鼠(Tg)药效学实验

实验动物：HBV转基因(Tg)小鼠，由解放军第458医院全军肝病中心转基因动物实验室提供，有广东省实验动物质量合格证书，由HBV全基因(ayw型)随机转染，稳定传至11代，经剪尾，组织DNA提取，PCR检测HBV DNA呈阳性，再以固相放免及萤光定量PCR法分别定量检测筛选血清HBsAg和HBV DNA阳性鼠备用。

HBV Tg小鼠60只，随机分3组，每组20只，分别为单质粒pS2.S直接肌注组(剂量为100μg/只)、pS2.S+pIIF+EP组(30+30μg/只)及PBS+EP对照组。接种3次，每次间隔4周，接种期间和末次接种后每4周采血，一次性检测观察血清HBV DNA、HBsAg及ALT水平变化。ELISPOT检测按实施例4方法进行。

血清HBV DNA水平检测结果：末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBV DNA水平降低1个或以上数量级的有效数及有效率分别为3/20(15％)只、6/20(30％)只及1/20(5％)只，仅pS2.S+pIIF+EP与PBS+EP组比较差异具显著性(p＝0.037，x²＝4.329)，见表5。

血清HBsAg水平检测结果：末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBsAg水平降低差值≥5ng/ml的有效数及有效率(％)分别为9/20(45％)只、10/20(50％)只及3/20(15％)只，pS2.S及pS2.S+pIIF+EP组均明显较PBS+EP组高，差异具显著性(p＝0.018，x²＝5.584；p＝0.038，x²＝4.286)，见表6。

血清HBsAg水平降低(差值≥5ng/ml)的HBV Tg小鼠细胞免疫检测：pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及组ELISPOT检测阳性数分别为5/5只，5/5只及2/3只；HBsAg特异性IFN-γSFC计数依次为pS2.S+pIIF+EP组(47.5±26.2)最高，pS2.S(19.4±10.3)及PBS组(15.0±14.0)次之。三组中血清HBsAg无降低的HBV Tg小鼠特异性IFN-γSFC计数均低于阳性标准。

血清ALT水平检测结果：比较免疫前后及其过程中三组血清ALT水平检测结果，pS2.S+pIIF+EP组水平较pS2.S及PBS+EP组偏高，第1次免疫后pS2.S+pIIF+EP组水平(39.65±10.96IU/L)较PBS+EP组(22.84±11.66IU/L)差异具显著性(p＜0.05，t＝2.326)。血清ALT较各组免疫前平均水平升高2倍以上的动物数于pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组分别为1/20只、8/20只及1/20只，其中pS2.S+pIIF+EP组升高例数较多，经简查表法检验较pS2.S组差异具显著性(p＜0.05)。pS2.S组1例血清ALT的升高与其血清HBsAg水平降低及ELISPOT结果阳性一致，见表7。

以上研究结果表明，治疗性双质粒HBV DNA疫苗能抑制HBV Tg小鼠体内HBVDNA的复制，有效降低其血清HBV DNA及HBsAg表达水平。

本研究还发现HBV Tg小鼠血清ALT水平升高个体与其ELISPOT检测细胞免疫应答阳性以及血清HBV DNA和HBsAg水平降低有一定相关性，HBV DNA疫苗疗效作用机理与其诱导Tg小鼠产生的特异性细胞免疫应答有关，在一定程度上近似临床急性肝炎及动物HBV实验感染病毒自然清除过程。受小鼠外周血淋巴细胞分离量少的限制，我们难以在HBV Tg小鼠观察双质粒HBV DNA疫苗诱导机体特异性免疫应答与其血清生化学、组织学及病原学指标的实时动态变化。

本发明表明EP接种双质粒HBV DNA疫苗能更有效地诱导产生特异性细胞免疫应答，以提高对HBV Tg小鼠体内HBV DNA的复制和血清HBsAg的表达的抑制效果，这为寻找更有效的抗HBV感染基因免疫治疗方法提供了依据。

表5HBVDNA疫苗免疫前后比较HBVTg小鼠个体血清HBVDNA水平降低1个或以上数量级的有效数及百分率

表6HBV DNA疫苗免疫前后比较HBV Tg小鼠个体血清HBsAg水平降低差值≥5ng/ml的有效数及百分率

表7HBVDNA疫苗免疫前后HBVTg小鼠血清ALT检测结果(IU/L，x±s)

Claims

1.HBV双质粒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)疫苗质粒pS2.S的构建

将目的基因HBV的包膜中蛋白preS2.S基因***载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG；

其中构建pS2.S采用的上游引物P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGCTGG CTG CAG AGC CTG-3`，下游引物P2：5`-GGGAATT`C TTA AAT GTATAC CCA AAG ACA A-3`，并于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点；

以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为900bp，回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAX1，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5α感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆；

(2)佐剂质粒pIIF的构建

将融合的人IL2IFNγ基因***载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG；

构建pIIF采用的上游引物为P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGC TACAGG ATG CAA CTC-3`，P2：5`-GGGAATT`C TTA CTG GGA TGC TCT-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点；

以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定；

其中融合的人IL2IFNγ基因中的IL2和IFN-γ通过AGSGGGGS连接肽融合；

(3)HBV双质粒DNA疫苗制备

疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF的制备方法同上，但分开生产，发酵、裂解、纯化方法过程如下：

发酵：以Yeast Extract 8g/L、Tryptone 16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na₂HPO₄·H₂O 7.08g/L、KH₂PO₄·12H₂0 1.58g/L；微量氨基酸适量为基础培养基，以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO₄ 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10％接种量，37℃恒温培养，pO2控制在35％以下，在线检测菌密度的OD600值，计算质粒含量，发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌；

裂解：以发酵菌30-32g计，加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬，冰浴10min；加临用前配置的P2缓冲液900ml裂解细菌，冰浴4min；加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min；离心，4℃，9,000g，15min，上清过G3细菌漏斗，收滤过液；滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液；滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置4℃低温冷柜2h，离心，4℃，9,000g，10min，收集沉淀；70％乙醇洗沉淀后用30ml Buffer I溶解得质粒初提液置4℃保存；

裂解所用试剂组成如下：

●P1：50mM Tris，10mM EDTA，pH8.0

●P2：200mM NaOH，1％SDS，临用前配制

●P3：3.0M KAC，pH5.5

Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

纯化：纯化步骤为：质粒初提液直接上样Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，始终用Buffer I缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect即PS柱特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱，所述柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶解质粒DNA；

纯化所用试剂的组成如下：

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●Buffer II：3M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIII：2M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIV：2M(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl 10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferV：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferVI：0.6M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

PBS溶液：Na₂HPO₄·12H₂O 4.86g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5g，NaCl 9g，定容1000ml；

质粒初提液经分子筛柱，收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化，最后上阴离子柱，收集质粒峰并用有机溶剂沉淀，用缓冲液溶解质粒DNA。