CN101095951B - 治疗性hbv dna疫苗、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗、制备方法及应用。该HBV双质粒DNA疫苗包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF,其真核表达载体为pVAX1。质粒体外转染非洲绿猴肾细胞(COS-7),检测到目的基因的较高水平表达。经裂解、纯化后双质粒按1∶1配伍,联合在体电脉冲技术注射Balb/c小鼠,检测到HBV DNA疫苗能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。本发明还涉及该治疗性HBV DNA疫苗在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及一类新型治疗性疫苗的构建、制备及应用。具体的说,本发明涉及治疗性HBV DNA疫苗的构建、制备及应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染呈全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎,并与肝硬化、肝癌的发病密切相关,是严重危害人类健康的感染性疾病。目前全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者,其中75%分布在亚太地区,我国的慢性无症状感染者超过1.2亿,且慢性乙型肝炎预后不良。目前的抗病毒药物主要是核苷类似物和重组干扰素类药物,但效果不十分理想。因此,急需一种更有效的治疗性疫苗,不仅能够预防HBV的感染,而且能够打破慢性乙肝患者的免疫耐受状态,使其产生体液免疫和细胞免疫,清除肝细胞的病毒,使患者痊愈。
DNA疫苗是20世纪末开发出来的新型疫苗,1990年Wolff等发现DNA免疫后,标志着新的疫苗革命。DNA疫苗与传统疫苗相比有诸多优点,尤其是其可诱导特异性CTL反应的能力,使它在抗细胞内感染中独具优势。它将编码外源性抗原蛋白的基因表达载体直接导入机体,通过宿主细胞摄取外源DNA,进入核内进行转录,然后在胞质中翻译,翻译产物进一步与MHC-1类分子结合,提呈至细胞表面,被CD8+T细胞识别,产生较强的CTL的细胞免疫。同时,有一部分短肽可进入溶酶体/内体与MHC-II类分子结合,被CD4+T细胞识别,产生CD4+T细胞介导体液免疫应答。CD4+T细胞介导的免疫应答偏向ThI,产生高水平的IFN-γ,并刺激产生IgG2同种型抗体。这种HBV DNA疫苗在宿主体内表达的抗原的免疫过程与自然免疫相似,可以提呈天然构象的乙肝表面抗原HBsAg,无抗原表位的改变,并且具有长期记忆免疫反应,不但能用于预防,且可用于治疗。因此,乙肝HBV DNA疫苗已经成为当前研究的热点。1993年Davis等开展了HBV基因免疫的研究,但由于安全性、耐受性及有效性等顾虑而仅限于动物实验。1999年Tacket等率先报道HBV DNA疫苗I期临床试验获得较好的结果,标志着HBV
DNA疫苗已从实验研究逐步走向临床应用。2004年法国巴斯德研究所报道的HBV DNA疫苗的I期临床试验取得较好结果,同年,英国和赞比亚的报道临床42例患者耐受性良好。2006年韩国Dong-A药厂的多联疫苗亦取得较好的临床试验结果。
虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人鼓舞,但其免疫效果远未达到理想水平,因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键,增强的途径有提高细胞转染率,增加抗原表达及提高机体对抗原的免疫反应性等。其中细胞因子表达质粒作为基因佐剂,克服了细胞因子基因工程蛋白的半衰期短、价格昂贵和毒副作用大等缺点,可显著增强DNA疫苗的免疫效果,而且由于其作用短暂,不会导致全身细胞因子水平增高,不会改变机体对不相关抗原的免疫反应,亦不会促进或诱导病理性自身抗体产生,因此安全性良好。基因免疫最常用的途径是经肌肉或皮肤,其他途径如腹腔、口腔、直肠及***,基因枪和肌肉注射是公认的DNA免疫有效导入方式。在HBV DNA疫苗的临床实验中,采用基因枪将包被质粒DNA的金颗粒轰击至皮内,能使有效的抗原提呈和识别相结合,但基因枪接种存在诸如免疫应答持续时间短、金颗粒制备繁琐及随温度增加包被的DNA会脱落等缺点。目前构建DNA疫苗通常包括选取表达抗原的目的基因和细菌质粒真核表达载体。在构建临床应用的质粒时,选用pWRG7077类似的载体,关键的启动子和调控元件为HCMV早期启动子/SV40早期启动子、外显子1、内含子A,加牛生长激素polyA尾(BGH pA),***抗生素抗性基因,如氨苄青霉素、卡那霉素,也有选择新霉素或潮霉素的抗性基因,还含pUCori的ColEI或pMB1复制起点便于在大肠杆菌复制。为了防止DNA在宿主细胞中复制并整合到染色体中去,载体中不能含有SV40等病毒复制基因,由于人类对青霉素的过敏反应要比卡那霉素频繁,因而用于临床的DNA疫苗载体最好只选择卡那抗性基因,尽管它比氨苄青霉素抗性基因含有的CpG核苷酸序列要少,(CpG核苷酸序列有显著增强免疫作用,有佐剂效果)。经过改构的pVAX1真核表达载体符合以上特点,而且含有增强目的基因表达的KOZAK序列,是美国FDA批准的唯一可用于临床试验的DNA疫苗载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗,包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF。
本发明的另一目的在于提供一种HBV双质粒DNA疫苗的制备方法。
治疗性HBV DNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S为目的基因的DNA疫苗质粒(简称为pS2.S)和以人IL2和IFN-γ为目的基因的佐剂质粒(简称为pIIF)。
一种HBV双质粒DNA疫苗的构建方法:
疫苗质粒pS2.S构建:本发明采用真核表达载体pVAX1,根据载体的要求,设计上游引物时加上KOZAK系列,即ANNATGG,-3为A,+4为G,以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物P1:5`GGAAGCT`TAGG ATG GGC TGG CTG CAG AGCCTG-3`,下游引物P2:5`-GGGAATT`C TTAAAT GTATAC CCAAAG ACAA-3`,于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为900bp,见图1-1所示。回收PCR片段,以HindIII和EcoRI进行双酶切,同时双酶切真核表达载体pVAX1,分别回收酶切片段并进行连接,转化DH5α感受态细菌,筛选Kana抗性的阳性克隆,按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定,见图2-2所示。
佐剂质粒pIIF的构建:设计上游引物时加上KOZAK系列,即ANNATGG,-3为A,+4为G,以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1:5`-GAAGCT`TAGG ATGGGC TAC AGG ATG CAA CTC-3`,P2:5`-GGGAATT`CTTA CTG GGA TGC TCT-3`,于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒(目的基因人IL2和IFN-γ以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为920bp,见图1-2所示。按前述的方法进行双酶切,连接,转化,挑取克隆酶切测序鉴定,见图2-3所示。
治疗性HBVDNA疫苗双质粒的体外鉴定采用体外转染非洲绿猴肾细胞(COS-7),检测到目的蛋白的较高水平表达。
按Endofree Plasmid Mega Kit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF,参照Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectamineTM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中,转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞,重悬于含血清RPMI1640培养液,按3×105细胞/孔转种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养,待贴壁细胞生长达90-95%融合度,分别取4μg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒进行转染,同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清,按“立可读”乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-γ检测试剂盒定量检测目的基因的表达量。结果显示,对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物,以pVAX1构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达,检测HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml,而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒表达的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml,显然比pVAX1载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些,这可能是因为pVAX1载体含有KOZAK序列,该序列能显著增强目的基因的表达。
同时收集含目的基因的表达产物的转染上清,浓缩后行常规SDS-PAGE,并按ECL试剂盒操作说明书进行ECL Western blotting分析,见图3-4、4-3。HBV DNA疫苗质粒pS2.S的表达产物具有较强的HBsAg生物学活性,分子大小约为30Kd,佐剂质粒pIIF表达产物具有较强的IL2生物学活性和IFN-γ,分子大小约为110Kd,推测是融合蛋白hIL2/IFNγ形成四聚体的缘故,因为天然IL2常以二聚体或四聚体的形式存在。
为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白hIL2IFNγ的生物学活性,采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白hIL2IFNγ序列进行模建分析,并和天然的IL2、IFNγ进行比对,结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hIL2IFNγ蛋白,其空间结构能够和天然IL2、IFNγ基本吻合,空间模拟其活性部位完全裸露在外,无任何屏蔽结构,见图5,可见融合蛋白hIL2IFNγ同时具有天然IL2、IFNγ的生物学活性,且二者有协同作用,这为质粒pIIF作为HBV DNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基础。
本发明的目的还在于提供一种疫苗的制备方法。
HBV DNA疫苗的制备过程:疫苗质粒(pS2.S)和佐剂质粒(pIIF)的制备方法相同,但分开生产,发酵、裂解、纯化方法过程如下:
发酵:采用BIOSTAT DL 70型发酵罐(德国B.Braun),以Yeast Extract 8g/L、Tryptone16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na2HPO4·H2O 7.08g/L、KH2PO4·12H20 1.58g/L;微量氨基酸适量为基础培养基,以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO4 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基,按10%接种量,37℃恒温培养,pO2控制在35%以下,在线检测菌密度的OD600值,计算质粒含量。发酵10h收菌,菌体量达50-70g/L,质粒含量为50-70mg/g菌。
裂解:
取检测合格的发酵菌30-32g,加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬,冰浴10min;加临用前配置的P2缓冲液900ml裂解细菌,冰浴4min;加P3缓冲液900ml中和,冰浴10min;离心,4℃,9,000g,15min,上清过G3细菌漏斗,收滤过液;滤过液再过G4细菌漏斗,真空抽滤,收滤过液;滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀,冰浴或放置(4℃)低温冷柜2h,离心,4℃,9,000g,10min,收集沉淀;70%乙醇洗沉淀后用30ml B1溶解得质粒初提液置4℃保存。
裂解所用试剂组成如下:
●P1:50mM Tris,10mM EDTA,pH8.0
●P2:200mM NaOH,1%SDS,临用前配制
●P3:3.0MKAC,pH5.5
●Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
纯化:质粒初提液经分子筛柱,收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化,最后上阴离子柱,收集质粒峰并用有机溶剂沉淀,用缓冲液溶解质粒DNA。
其优选方案如下:
质粒初提液直接上样Sepharose 4Fast Flow分子筛柱,始终用Buffer I缓冲液,以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等,收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化,用BufferIII平衡,用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱,以达到有效去除内毒素和浓缩质粒。此柱用BufferV平衡,用BufferVI洗脱,收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀,用PBS溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下:
●Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferII:3M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIII:2M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIV:2M(NH4)2SO4,1.4M NaCl 10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferV:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferVI:0.6M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●PBS溶液:Na2HPO4·12H2O 4.86g,NaH2PO4·2H2O 0.5g,NaCl 9g,定容1000ml质粒DNA纯度可达到95%。
本发明治疗性HBV DNA疫苗双质粒能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。双质粒疫苗联合在体电脉冲技术(上海交通大学研制,国内首次应用于基因导入)能显著提高大体重动物即家兔和恒河猴的免疫效果,可显著降低HBVTg(转基因)小鼠的HBsAg、HBV DNA、ALT水平,并产生特异性细胞免疫。
工具酶与主要试剂
真核表达载体pVAX1购自Invitrogen公司(CATALOG NO.V260-20);
pcDNA3.1/preS2.S和pcDNA3.1/preIL2IFNγ质粒由申请人构建保存,具体构建已在受理号为00107853.4中国发明专利申请文件中公开;
限制性内切酶,pfu聚合酶,T4DNA连接酶等均购自NEB公司;
DH5α菌株购于上海***生物技术公司;
引物合成由上海英骏生物公司完成;
质粒小量提取试剂盒为上海华舜生物公司产品;
Endofree Plasmid Mega Kit为QIAGEN公司产品;
COS-7细胞株购自上海细胞研究所;
LipofectamineTM2000转染试剂为Invitrogen公司产品;
“立可读”乙肝表面抗原试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司;
人白细胞介素(IL-2)和干扰素(IFN-γ)检测试剂盒为晶美生物工程公司;
抗人HBsAg单抗、抗人IL-2和IFN-γ单抗体均购自BD公司;
ELISpot试剂盒购自BD公司。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
附图说明
图1是本发明的目的基因的PCR产物图;
1、3分别是目的基因S2.S和融合IIF的PCR产物;2为Marker DL2000
图2双质粒的双酶切图谱
1是Marker DL15000;2.3为双质粒的EcoRI+HindIII的酶切
图3质粒pS2.S转染COS-7细胞表达产物的ECL western blot分析
1.分子量标准;2.未转染组;3.空载体组;4.pS2.S.
图4质粒pIIF转染COS-7细胞表达产物的ECL western blot分析
1.未转染组;2.空载体组;3.pIIF;4.分子量标准.
图5融合蛋白中IL-2活性部位(橙色)与IFN-γ活性部位(粉色)
图6HBV DNA疫苗治疗后血清HBsAg水平降低的HBV Tg小鼠个体细胞免疫状态
具体实施方式:
下面是本发明的实施例,所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。
实施例1
治疗性HBV DNA疫苗的构建
治疗性HBV DNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S为目的基因的DNA疫苗质粒(简称为pS2.S)和以人IL2和IFN-γ为目的基因的佐剂质粒(简称为pIIF)。
我们采用购自Invitrogen公司的真核表达载体pVAX1,根据载体的要求,设计上游引物时加上KOZAK系列,即ANNATGG,-3为A,+4为G,以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物P1:5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGC TGG CTG CAG AGC CTG-3`,下游引物P2:5`-GGGAATT`C TTA AAT GTA TAC CCA AAG ACA A-3`,于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为900bp,见图1-1所示。回收PCR片段,以HindIII和EcoRI进行双酶切,同时双酶切真核表达载体pVAX1,分别回收酶切片段并进行连接,转化DH5α感受态细菌,筛选Kana抗性的阳性克隆,按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定,见图2-2所示。
佐剂质粒pIIF的构建:设计上游引物时加上KOZAK系列,即ANNATGG,-3为A,+4为G,以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1:5`-GGAAGCT`T AGG ATGGGC TAC AGG ATG CAA CTC-3`,P2:5`GGGAATT`CTTA CTG GGA TGC TCT-3`,于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒(目的基因人IL2和IFN-γ以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为920bp,见图1-2所示。按前述的方法进行双酶切,连接,转化,挑取克隆酶切测序鉴定,见图2-3所示。
实施例2
治疗性HBV DNA疫苗双质粒的体外鉴定
按Endofree Plasmid Mega Kit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF,参照Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectamineTM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中,转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞,重悬于含血清RPMI1640培养液,按3×105细胞/孔转种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养,待贴壁细胞生长达90-95%融合度,分别取4μg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒进行转染,同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清,按“立可读”乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-γ检测试剂盒定量检测目的基因的表达量,见表1。结果显示,对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物,以pVAX1构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达,检测HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml,而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hIL2IFNγ质粒表达的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNγ的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml,显然比pVAX1载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些,这可能是因为pVAX1载体含有KOZAK序列,该序列能显著增强目的基因的表达。
同时收集含目的基因的表达产物的转染上清,浓缩后行常规SDS-PAGE,并按ECL试剂盒操作说明书进行ECL Western blotting分析,见图3-4、4-3。HBV DNA疫苗质粒pS2.S的表达产物具有较强的HBsAg生物学活性,分子大小约为30Kd,佐剂质粒pIIF表达产物具有较强的IL2生物学活性和IFN-γ,分子大小约为110Kd,推测是融合蛋白hIL2/IFNγ形成四聚体的缘故,因为天然IL2常以二聚体或四聚体的形式存在。
为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白hIL2IFNγ的生物学活性,我们采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白hIL2IFNγ序列进行模建分析,并和天然的IL2、IFNγ进行比对,结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hIL2IFNγ蛋白,其空间结构能够和天然IL2、IFNγ基本吻合,空间模拟其活性部位完全裸露在外,无任何屏蔽结构,见图5,可见融合蛋白hIL2IFNγ可同时具有天然IL2、IFNγ的生物学活性,且二者有协同作用,这为质粒pIIF作为HBV DNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基础。
表1双质粒转染COS-7细胞检测结果
HBsAg(ng/ml) | IL-2(ng/ml) | IFN-γ(ng/ml) | |
未转染组 | ---- | ---- | ---- |
空载体组 | ---- | ---- | ---- |
pVAX1/preS2.S质粒 | 45.1 | ---- | ---- |
pVAX1/hIL2IFN<sub>γ</sub>质粒 | ---- | 10.03 | 11.5 |
pcDNA3.1/preS2.S质粒 | 26.3 | ---- | ---- |
pcDNA3.1/hIL2IFN<sub>γ</sub>质粒 | ---- | 6.3 | 5.4 |
实施例3
治疗性HBV DNA疫苗双质粒的制备
HBV DNA疫苗的制备过程:疫苗质粒(pS2.S)和佐剂质粒(pIIF)的制备方法相同,但分开生产,发酵、裂解、纯化方法过程如下:
发酵:采用BIOSTAT DL 70型发酵罐(德国B.Braun),以Yeast Extract 8g/L、Tryptone16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na2HPO4 H2O 7.08g/L、KH2PO4 12H20 1.58g/L;微量氨基酸适量为基础培养基,以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO4 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基,按10%接种量,37℃恒温培养,pO2控制在35%以下,在线检测菌密度的OD600值,计算质粒含量。发酵10h收菌,菌体量达50-70g/L,质粒含量为50-70mg/g菌。
裂解:
取检测合格的发酵菌30-32g
↓
加P1缓冲液(临用前配置)900ml混悬,冰浴10min
↓
加P2缓冲液(临用前配置)900ml裂解细菌,冰浴4min
↓
加P3缓冲液900ml中和,冰浴10min,
↓
离心,4℃,9,000g,15min
↓
上清过G3细菌漏斗,收滤过液
↓
滤过液再过G4细菌漏斗,真空抽滤,收滤过液
↓
滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀,冰浴或放置(4℃)低温冷柜2h
↓
离心,4℃,9,000g,10min,收集沉淀
↓
70%乙醇洗沉淀后用30ml B1溶解得质粒初提液置4℃保存裂解所用试剂组成如下:
●P1:50mM Tris,10mM EDTA,pH8.0
●P2:200mM NaOH,1%SDS,临用前配制
●P3:3.0M KAC,pH5.5
●Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
纯化方案如下:
质粒初提液直接上样Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱,始终用Buffer I缓冲液,以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等,收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化,用BufferIII平衡,用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱,以达到有效去除内毒素和浓缩质粒。此柱用BufferV平衡,用BufferVI洗脱,收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀,用PBS溶液溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下:
●Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●Buffer II:3M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIII:2M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIV:2M(NH4)2SO4,1.4M NaCl 10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferV:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferVI:0.6M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●PBS溶液:Na2HPO4·12H2O 4.86g,NaH2PO4·2H2O0.5g,NaCl 9g,定容1000ml质粒DNA纯度可达到95%。
实施例4
双质粒联合电脉冲技术诱导健康BaLb/c小鼠的体液和细胞免疫
实验动物:BALB/C小鼠购自广州中医药大学,雌性,4-6周龄,19-21g,属SPF(III)级动物,有合格证书。
免疫接种和实验分组:腹腔注射戊巴比妥钠先使实验动物处于麻醉状态,在注射部位(小鼠后腿或胫前肌)褪毛,消毒,垂直接种DNA疫苗。或再将电脉冲电极以注射孔为中心垂直***,电极针***略深于注射针深度,电场强度200v/cm,放电6次,10秒后拔电极针。健康小鼠60只,每组10只,共分为8组,前4组各5只,后4组各10只:(1)pVAX1(100μg/只);(2)pS2.S(100μg/只);(3)pS2.S(50μg/只);(4)pS2.S(10μg/只);(5)pS2.S+pVAX1(5μg+5μg/只);(6)pS2.S+pIIF(10μg+10μg/只);(7)pS2.S+pIIF(5μg+5μg/只);(8)pS2.S+pIIF(5μg+5μg/只)+EP;分别在接种的0、2、4周采用眼球后静脉丛穿刺法采血,分离血清并于-20℃保存,待进行一次性抗-HBs的ELISA检测,并计算抗体出现的阳性小鼠数,四周后,处死小鼠取脾脏分离淋巴细胞进行ELISPOT实验检测。
检测方法:(1)体液免疫检测,取小鼠血清严格按说明书进行(上海实业科华生物技术限公司);(2)细胞免疫检测:小鼠淋巴细胞制备,①颈椎脱臼法处死小鼠,置盛有75%乙醇的烧杯中,使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上,然后切开小鼠腹腔,取出脾脏;②将分离的脾脏放于下置无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴),用研磨棒(可用玻璃注射器内芯代)轻轻捻碎脾组织,研磨挤压出脾细胞,取5ml无血清1640培养液(IC)缓缓冲下细胞至烧杯中;③将5ml脾细胞悬液缓慢加入装有2.5ml淋巴细胞分离液的14ml离心管中,2,000-2,500r/min离心20min,收集分离淋巴细胞后,用IC离心洗涤细胞2次,每次1500r/min离心6min;④用适量含5%FCS-1640完全培养液重悬分离的脾淋巴细胞,台盼兰染色计数每只小鼠分离淋巴细胞活细胞总数,调整细胞密度至3×105/ml,37℃5%CO2培养箱中培养以供ELISPOT检测。
ELISPOT检测:严格按BD公司试剂盒使用说明书方法操作。判断标准:参照文献并结合本研究验证结果,同时符合以下两条者认定为ELISPOT检测HBsAg特异性Th1细胞阳性:①一定细胞密度条件下,ELISPOT检测板中同一样品HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔斑点均数(SFC)的比值应不小于2;②免疫实验组样品淋巴细胞密度为3×105/孔检测时,HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔SFC均数的差值不小于5,作为小鼠特异性细胞免疫的阳性评价标准,HBV DNA疫苗免疫组的细胞免疫应答阳性率应不低于60%。
统计学结果处理,组间均数及百分率差异显著性统计分别采用t检验及查统计简表法。
血清-HBs≥10mIU被认为是机体保护性有效浓度。结果见表2,pVAX1空载接种正常小鼠后血清抗-HBs浓度均<10mIU/ml,抗-HBs的小鼠阳性数为0。与之相比,pS2.S高(100μg/只),中(50μg/只)、低(10μg/只)三组剂量一次性免疫健康小鼠均能在2周诱导抗-HBs产生(>10mIU/ml)。血清抗体水平比较,高剂量组(82.9±30.0)mIU/ml较中剂量组(42.2±25.6)mIU/ml、低剂量组(24.6±7.5)mIU/ml差异分别具显著性(t=2.308,P<0.05)及非常显著性(t=4.216,P<0.01)。这表明疫苗pS2.S质粒能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的产生,且具有剂量相关性。pS2.S+pVAX1空载以5+5μg/只的低剂量免疫组2周后阳性鼠数为1,而采用pIIF作为佐剂免疫质粒且剂量相同情况下,2周后阳性鼠数为3,并产生较高的保护性抗体水平,4周后阳性鼠为50%,而增加剂量达10+10μg/只免疫组2周后阳性鼠为50%,4周后抗体阳性鼠为100%,比较此三组的细胞免疫结果,以pS2.S+pIIF按10+10μg/只免疫组的ELISPOT阳性率达80%为最好,组间数据具显著性差异(P<0.01),说明pIIF佐剂可增强pS2.S的免疫效果。在前几组的基础上,按pS2.S+pIIF+EP按5+5μg/只的免疫组,2周保护性抗体阳性为80%,4周后检测达100%,细胞免疫ELISPOT阳性率达100%。这充分表明,EP技术能显著提高疫苗pS2.S和佐剂pIIF双质粒的体液和细胞免疫效果,差异具非常显著性。分析其原因是EP技术可瞬间增加细胞膜的通透性,有效介导质粒进入效应细胞表达目的抗原,通过MHC-II或MHC-I类抗原递呈途径诱导T细胞增殖并向Th1亚群分化,提高了IL2/IFNγ的分泌水平,有效增强细胞免疫应答。
表2佐剂pIIF质粒和EP技术增强疫苗pS2.S的免疫效果
实施例5
在体电脉冲技术显著提高pS2.S/pIIF在大体重动物的免疫效果
实验动物:新西兰兔:购自广州市出入境检验检疫局动物检验所,具广东省动物监测中心颁发的动物合格证书。灵长类动物:食蟹猴及恒河猴,体重3-5kg,年龄2-5岁,由广东省顺德实验动物所提供。
健康家兔免疫实验:接种部位为兔两小腿内侧腓肠肌,褪毛消毒后,先将DNA注入肌肉,再将3路6点电极中心对准DNA注射孔(DNA注射深度应略比电极针浅)***肌肉,10秒后放电拔针即可。电场强度:200v/cm,放电6次。按接种pS2.S/pIIF不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将动物分为4组,每组5只。各组pS2.S/pIIF剂量分别为:A组:(5+5)μg/只;B组:(25+25)μg/只;C组:(50+50)μg/只;D组:(1000+1000)μg/只,非在体电脉冲法接种,作对照组。于接种后第10周各组均增强免疫1次,剂量与方法同初免,并分别于初免后第2、4、13周时采血留样,ELISA法检测血清抗体-HBs水平。
健康猴免疫实验:接种部位为两腿胫前肌,其他同家兔注射。按不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将健康猴分为5组(3只/组)进行实验。A组:pS2.S/pIIF剂量为(1000+1000)μg/只;B组:(500+500)μg/只;C组:(100+100)μg/只;D组:(1000+1000)μg/只,非在体电脉冲法接种,作对照组。各组于接种后第4、10周均增强免疫1次,剂量与方法同初免,并分别于初免后第2、4、8、13周时采血留样,ELISA法检测血清抗体-HBs水平。
统计学处理,组间均数及百分率差异显著性统计分别采用t检验及查统计简表法。
采用电脉冲肌注双质粒DNA疫苗免疫新西兰家兔2周时,在大剂量(50μg)和中剂量(25μg)组联合免疫最早分别有3/5、1/5只血清抗HBs水平阳性,至4周时阳性动物数虽无变化,但两组抗体水平明显升高。较同期对照组(1mg)和小剂量组的差异具显著性(P<0.05)。初免后的13周,在体电脉冲的三个剂量组动物血清均有抗-HBs出现,分别为4、4、5只,而对照组始终为阴性,差异具显著性意义(P<0.05),但免疫组间差异无显著性。见表3。对于恒河猴的免疫结果与新西兰家兔近乎相同。
实验结果表明,在体电脉冲技术对体重相对大的动物新西兰家兔(表3)及恒河猴(表4)的免疫效果都有着质的提高:pS2.S联合pIIF免疫接种二种动物在剂量为(1+1)mg的条件下均不能诱导血清抗-HBs的产生,而应用电脉冲技术肌肉给药可促进恒河猴(500μg/只)及新西兰兔(25μg/只)产生良好的免疫反应。说明电穿孔技术可从本质上提高质粒体内转染率,从而降低质粒有效接种剂量。这从技术上解决了文献报道的HBVDNA疫苗对小动物有效而对大动物无效的问题,在疫苗使用方法上为其向临床应用提供实验依据。
表3电穿孔法接种DNA疫苗诱导新西兰家兔血清抗-HBs水平结果
表4电穿孔法接种DNA疫苗诱导恒河猴血清抗-HBs水平结果
实施例6
联合电脉冲技术对HBV转基因小鼠(Tg)药效学实验
实验动物:HBV转基因(Tg)小鼠,由解放军第458医院全军肝病中心转基因动物实验室提供,有广东省实验动物质量合格证书,由HBV全基因(ayw型)随机转染,稳定传至11代,经剪尾,组织DNA提取,PCR检测HBV DNA呈阳性,再以固相放免及萤光定量PCR法分别定量检测筛选血清HBsAg和HBV DNA阳性鼠备用。
HBV Tg小鼠60只,随机分3组,每组20只,分别为单质粒pS2.S直接肌注组(剂量为100μg/只)、pS2.S+pIIF+EP组(30+30μg/只)及PBS+EP对照组。接种3次,每次间隔4周,接种期间和末次接种后每4周采血,一次性检测观察血清HBV DNA、HBsAg及ALT水平变化。ELISPOT检测按实施例4方法进行。
血清HBV DNA水平检测结果:末次免疫后4周,pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBV DNA水平降低1个或以上数量级的有效数及有效率分别为3/20(15%)只、6/20(30%)只及1/20(5%)只,仅pS2.S+pIIF+EP与PBS+EP组比较差异具显著性(p=0.037,x2=4.329),见表5。
血清HBsAg水平检测结果:末次免疫后4周,pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBsAg水平降低差值≥5ng/ml的有效数及有效率(%)分别为9/20(45%)只、10/20(50%)只及3/20(15%)只,pS2.S及pS2.S+pIIF+EP组均明显较PBS+EP组高,差异具显著性(p=0.018,x2=5.584;p=0.038,x2=4.286),见表6。
血清HBsAg水平降低(差值≥5ng/ml)的HBV Tg小鼠细胞免疫检测:pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及组ELISPOT检测阳性数分别为5/5只,5/5只及2/3只;HBsAg特异性IFN-γSFC计数依次为pS2.S+pIIF+EP组(47.5±26.2)最高,pS2.S(19.4±10.3)及PBS组(15.0±14.0)次之。三组中血清HBsAg无降低的HBV Tg小鼠特异性IFN-γSFC计数均低于阳性标准。
血清ALT水平检测结果:比较免疫前后及其过程中三组血清ALT水平检测结果,pS2.S+pIIF+EP组水平较pS2.S及PBS+EP组偏高,第1次免疫后pS2.S+pIIF+EP组水平(39.65±10.96IU/L)较PBS+EP组(22.84±11.66IU/L)差异具显著性(p<0.05,t=2.326)。血清ALT较各组免疫前平均水平升高2倍以上的动物数于pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组分别为1/20只、8/20只及1/20只,其中pS2.S+pIIF+EP组升高例数较多,经简查表法检验较pS2.S组差异具显著性(p<0.05)。pS2.S组1例血清ALT的升高与其血清HBsAg水平降低及ELISPOT结果阳性一致,见表7。
以上研究结果表明,治疗性双质粒HBV DNA疫苗能抑制HBV Tg小鼠体内HBVDNA的复制,有效降低其血清HBV DNA及HBsAg表达水平。
本研究还发现HBV Tg小鼠血清ALT水平升高个体与其ELISPOT检测细胞免疫应答阳性以及血清HBV DNA和HBsAg水平降低有一定相关性,HBV DNA疫苗疗效作用机理与其诱导Tg小鼠产生的特异性细胞免疫应答有关,在一定程度上近似临床急性肝炎及动物HBV实验感染病毒自然清除过程。受小鼠外周血淋巴细胞分离量少的限制,我们难以在HBV Tg小鼠观察双质粒HBV DNA疫苗诱导机体特异性免疫应答与其血清生化学、组织学及病原学指标的实时动态变化。
本发明表明EP接种双质粒HBV DNA疫苗能更有效地诱导产生特异性细胞免疫应答,以提高对HBV Tg小鼠体内HBV DNA的复制和血清HBsAg的表达的抑制效果,这为寻找更有效的抗HBV感染基因免疫治疗方法提供了依据。
表5HBVDNA疫苗免疫前后比较HBVTg小鼠个体血清HBVDNA水平降低1个或以上数量级的有效数及百分率
表6HBV DNA疫苗免疫前后比较HBV Tg小鼠个体血清HBsAg水平降低差值≥5ng/ml的有效数及百分率
表7HBVDNA疫苗免疫前后HBVTg小鼠血清ALT检测结果(IU/L,x±s)
Claims (1)
1.HBV双质粒DNA疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)疫苗质粒pS2.S的构建
将目的基因HBV的包膜中蛋白preS2.S基因***载体pVAX1的启动子pCMV下游,并在目的基因起始处引入-3为A,+4为G的KOZAK序列ANNATGG;
其中构建pS2.S采用的上游引物P1:5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGCTGG CTG CAG AGC CTG-3`,下游引物P2:5`-GGGAATT`C TTA AAT GTATAC CCA AAG ACA A-3`,并于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点;
以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为900bp,回收PCR片段,以HindIII和EcoRI进行双酶切,同时双酶切真核表达载体pVAX1,分别回收酶切片段并进行连接,转化DH5α感受态细菌,筛选Kana抗性的阳性克隆;
(2)佐剂质粒pIIF的构建
将融合的人IL2IFNγ基因***载体pVAX1的启动子pCMV下游,并在目的基因起始处引入-3为A,+4为G的KOZAK序列ANNATGG;
构建pIIF采用的上游引物为P1:5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGC TACAGG ATG CAA CTC-3`,P2:5`-GGGAATT`C TTA CTG GGA TGC TCT-3`,于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点;
以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒为模板,采用pfu高保真聚合酶,按95℃5min,94℃50sec,55℃30sec,72℃90sec,30cycles,72℃10minPCR扩增出目的片段,电泳检测大小约为920bp,按前述的方法进行双酶切,连接,转化,挑取克隆酶切测序鉴定;
其中融合的人IL2IFNγ基因中的IL2和IFN-γ通过AGSGGGGS连接肽融合;
(3)HBV双质粒DNA疫苗制备
疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF的制备方法同上,但分开生产,发酵、裂解、纯化方法过程如下:
发酵:以Yeast Extract 8g/L、Tryptone 16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na2HPO4·H2O 7.08g/L、KH2PO4·12H20 1.58g/L;微量氨基酸适量为基础培养基,以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO4 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基,按10%接种量,37℃恒温培养,pO2控制在35%以下,在线检测菌密度的OD600值,计算质粒含量,发酵10h收菌,菌体量达50-70g/L,质粒含量为50-70mg/g菌;
裂解:以发酵菌30-32g计,加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬,冰浴10min;加临用前配置的P2缓冲液900ml裂解细菌,冰浴4min;加P3缓冲液900ml中和,冰浴10min;离心,4℃,9,000g,15min,上清过G3细菌漏斗,收滤过液;滤过液再过G4细菌漏斗,真空抽滤,收滤过液;滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀,冰浴或放置4℃低温冷柜2h,离心,4℃,9,000g,10min,收集沉淀;70%乙醇洗沉淀后用30ml Buffer I溶解得质粒初提液置4℃保存;
裂解所用试剂组成如下:
●P1:50mM Tris,10mM EDTA,pH8.0
●P2:200mM NaOH,1%SDS,临用前配制
●P3:3.0M KAC,pH5.5
Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
纯化:纯化步骤为:质粒初提液直接上样Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱,始终用Buffer I缓冲液,以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等,收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect即PS柱特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化,用BufferIII平衡,用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱,所述柱用BufferV平衡,用BufferVI洗脱,收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀,用PBS溶解质粒DNA;
纯化所用试剂的组成如下:
●Buffer I:10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●Buffer II:3M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIII:2M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferIV:2M(NH4)2SO4,1.4M NaCl 10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferV:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
●BufferVI:0.6M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH7.0
PBS溶液:Na2HPO4·12H2O 4.86g,NaH2PO4·2H2O 0.5g,NaCl 9g,定容1000ml;
质粒初提液经分子筛柱,收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化,最后上阴离子柱,收集质粒峰并用有机溶剂沉淀,用缓冲液溶解质粒DNA。
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