CN102015765A - 用于h5亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断elisa - Google Patents
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Abstract
对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋白可用于血清学诊断哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应，但不显示与非H5流感亚型的交叉反应性。
Description
发明领域
本发明涉及开发一种用于检测禽流感病毒抗体的特异性血清学分析。更具体地，本发明涉及单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体与所有已知的H5流感病毒亚型强烈反应，但不与非H5流感亚型交叉反应，其用于开发用于检测人和非人动物中H5流感亚型的血清抗体和相关结合蛋白的表位阻断ELISA。
背景技术
禽流感病毒(AIV)是禽类常见疾病。1996年在中国广东省饲养的鹅中发现第一例家禽的H5N1亚型AIV的感染，1年后在香港发现第一例人的H5N1亚型AIV感染[1]。从那时起，H5N1 AIV造成禽流感的爆发，其波及世界许多地区。迄今为止受影响的地区包括欧洲，中东和特别是亚洲[2]。根据世界卫生组织(WHO)的最新报告，总共有328例确认的人H5N1禽流感病例，其中200例导致患者的死亡。在这328个病例中，据报道绝大多数(106例，85例死亡)来自印度尼西亚[3，4]。根据WHO，基于病毒进化为能够有效的在人与人之间传播的毒株，全球现在处于大范围流行警报的第3级(共6级)[5]。
在2006年6月，印度尼西亚33个省中的27个报道了家禽中H5N1的爆发，导致超过1600万只家禽因为患病和扑杀而死亡[6]。养禽业因为禽流感损失数百万元。这种损失影响了数百万靠家禽维生的人的收入。HPAI(H5N1)在家禽中的这种爆发以及现在人类中病例数的增加引起大家的关注。在爆发初期准确并及时检测病原体存在的能力将大大有利于控制疾病。此外，它可以减少抗生素滥用并以及时方式提供使用抗病毒治疗的选择。
可用于流感诊断的各种方法包括病毒分离，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的病毒抗原检测，通过RT-PCR的分子检测和血清测试。标准病毒分离步骤具有需要数天来获得结果的缺点，从而限制了临床医生对其的使用。RT-PCR的缺点包括涉及的高成本，技术熟练人员的要求，污染的可能性以及假阳性结果的后续风险。此外，因为抗原性漂移，PCR引物可能需要持续更新[7]。病毒中和，血细胞凝集抑制(HI)，ELISA和免疫印迹测试是血清学诊断的优选方法。但是，中和测定和HI测定不被认为是高度灵敏的和需要进一步进行亚型分析，并且是高劳动强度和耗时的[8，9]，因此不适于血清的大规模常规检验。ELISA已经被广泛用作研究大量样品的预筛选工具，但市场上只能买到针对鸡和火鸡血清的间接ELISA***，因为没有提供其他物种的种特异性二抗。间接ELISA的进一步限制是要求高的抗原纯度。但是，间接ELISA的最显著缺点在于已知HA抗原与病毒的其他亚型交叉反应。因此，间接ELISA不是可靠的检测方法。
大部分这些方法不仅是麻烦和高劳动强度的，并且耗时和包括获得假阳性结果的风险。这些技术的进一步限制是流感病毒是碎裂的基因组RNA病毒，已知其经历连续的突变和遗传重组(抗原性漂移)，使其难于检测病毒[10]。
考虑到这些常规测定的缺点，并且因为AIV感染对野生动物、家养动物和人的风险，急需一种新的测定法，其能快速、易用和特异性的用于检测AIV的H5亚型。本发明代表了在AIV H5亚型的诊断和监测方面的突破。
发明概述
根据本发明，提供了对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋白。所述抗体可用于哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染的血清学诊断。更具体地，每种抗体可用于高灵敏和特异性表位阻断ELISA以检测人和其他动物中的流感H5亚型。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应但不显示与非H5流感亚型的交叉反应性。
因此，本发明包括与禽流感病毒H5亚型的表位结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗体5F8或单克隆抗体1G5的免疫结合特性。结合蛋白可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体和优选是单克隆抗体。
本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为CNTKCQTP的AIV H5血凝素的表位结合。本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为IHPLTIGE的AIV H5血凝素的表位结合。
另一方面，本发明包括一种检测生物样品中H5亚型AIV的方法，其包括将样品与包含H5亚型血凝素糖蛋白的表位的抗原接触并确定样品中的抗体是否结合所述表位。优选通过表位阻断ELISA进行结合确定。优选H5亚型血凝素糖蛋白的表位包括序列CNTKCQTP或序列IHPLTIGE。IHPLTIGE和CNTKCQTP表位存在于所有已知的人H5N1 AIV株、基本上所有已知的鸡H5N1AIV株和基本上所有已知的其他动物和禽类的H5N1株中，并且是非常稳定和高度抗原性的，使其非常适用于诊断H5N1感染。
本发明还涉及检测生物样品中H5亚型AIV感染的试剂盒，其中所述试剂盒包括结合H5亚型AIV包膜糖蛋白的表位的结合蛋白以及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。在优选实施方案中，所述表位包括序列CNTKCQTP。在另一优选实施方案中，所述表位包括序列HPLTIGECPK。在优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有mAb 5F8的免疫结合特性。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有mAb 1G5的免疫结合特性。
附图简述
图1A-1B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 5F8的表征。图1A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 5F8对H5N1 AIV感染的MDCK细胞中天然HA1和杆状病毒表达的rHA1的识别。分别用H5亚型和重组杆状病毒感染MDCK和Sf-9细胞。对照是H9N2感染的MDCK细胞和Sf-9细胞。
图1B显示Western印迹中MAb 5F8对H5N1AIV的识别。通过SDS-PAGE分析从尿囊液纯化的AIV H5N1(第1-9道)，H5N2(第10道)和H5N3(第11道)，并将其固定于硝酸纤维素膜。显示对H5亚型的抗体特异性的MAb 5F8不识别阴性对照(无病毒)，H3N2(第12道)，H7N1(第13道)HA。
图2A，2B，2C和2D。MAb 5F8的表位作图。
图2A显示用于表位作图的策略。从A到E和SF1到SF8的全部指明片段作为His融合蛋白表达。图2B显示片段A到E的Western印迹分析，使用MAb 5F8作为一抗。C:rHA1蛋白用作对照。图2C显示8个进一步截短肽(SF1-SF8)的Western印迹分析结果，所述截短肽是图2A片段4的延伸但在片段5区域截短并作为组氨酸融合肽表达。图2D显示也作为组氨酸融合肽表达的点突变的Western印迹分析结果。进行分析以确定针对mAb 5F8的表位的氨基酸序列。
图3A和3B显示相对于免疫鸡血清造成的CDC/523/H5HA1表位或rH5HA1的mAb结合的50％阻断。结果表示为百分阻断值的算术平均值(n＝5/组+标准误差(SE))。
图4A-4B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 1G5的表征。图4A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 1G5识别H5N1AIV感染的MDCK细胞和Sf-9感染杆状病毒中的天然HA。分别用H5病毒或重组H5HA杆状病毒感染MDCK和Sf-9细胞。对照是H4N1感染的MDCK细胞和Sf-9细胞。
图4B显示Western印迹中mAb 1G5对H5HA的识别。所述单克隆抗体识别第1-14道每条中的H5HA。第15道的非H5病毒不被1G5识别，显示该抗体对H5亚型的特异性。
图5A-5D。mAb 1G5的表位作图。图5A显示用于表位作图的策略。从A到E和SF1到SF8的全部标明片段在实施例1中作为His融合片段表达。图5B显示片段A到E的Western印迹分析，使用mAb 1G5作为一抗。C:rHA1蛋白用作对照。图5C和5D分别显示亚片段SF1到SF8和表位确定最后一步点突变的Western印迹分析。
图6A和6B显示mAb 5F8和1G5与H5亚型特异性反应。图6A显示所述抗体与Indonesian H5N1株的15种不同样品特异性反应；图6B显示所述抗体与Indonesian H5N1株(1-9)，H5N1/PR8(10)；H5N2(11)和H5N3(12)特异性反应，但不与H4N1或H7N1(分别是13和14)反应。利用mAb 5F8，1G5或其组合作为捕获抗体和利用多克隆抗H5HA1作为检测抗体进行测定。
图7显示基于mAb 5F8-和mAb 1G5的抗原捕获ELISA检测到102TCID50单位的H5N1。包含H4N1的测定不产生显著高于背景水平的吸光度。
图8显示感染和接种样品(样品1-10：感染和回收的血清样品；样品11-15：接种的人血清样品；样品16：健康人对照血清)造成的相对于CDC/523H5HA1表位mAb 1G5的50％阻断。
图9A和9B显示免疫鸡血清造成的相对于CDC/523 H5HA1表位的mAb 1G5结合的50％阻断。在图9A中，样品1-14是按1∶30稀释的H5N1Indonesian株免疫的鸡血清样品。在图9B中，样品1-10是按1∶30稀释的H5N1 Indonesian株免疫的鸡血清样品，样品11和12是H5亚型株，样品13-17是非H5亚型株。结果表示为百分阻断值的算术平均值(n＝5/组+S.E.)。
发明详述
本发明涉及与AIV H5亚型的HA1蛋白特异性结合的mAb和相关结合蛋白，还涉及所述mAb和相关结合蛋白在表位阻断ELISA中的用途。通过IFA和Western印迹分析，所述mAb对所有已知的H5N1AIV Indonesian株和其他H5亚型检验阳性。
尤其是，一种这样的mAb或相关抗原结合蛋白具有由杂交瘤5F8产生的mAb 5F8的免疫结合特性，所述杂交瘤5F8于2007年11月6日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其分配的保藏号PTA-8757。第二种这样的mAb或相关抗原结合蛋白具有由杂交瘤1G5产生的mAb 1G5的免疫结合特性，所述杂交瘤1G5于2007年11月6日保藏于ATCC，其分配的保藏号PTA-8756。本发明还涉及检测和诊断H5亚型AIV感染的方法和包括本发明mAb或结合蛋白的检测试剂盒。常用的流感血清学测定法是HI，AGID和微量中和测定法，但如上所述，这些检验具有它们的缺点，需要一种检测针对AIV的人抗体的灵敏和特异的血清学测定法。用于检测针对流感感染的抗体的间接ELISA已被建议为快速筛选大量样品的灵敏方法，但这种测定法需要高纯化抗原并且可能在不同亚型的HA之间显示交叉反应性[18]。本发明进一步涉及用于检测H5亚型的高灵敏和特异的表位阻断ELISA(EB ELISA)。
本文使用各种术语具有下列含义：
术语mAb或相关结合蛋白的免疫结合特性，按其全部的语法形式，都是指所述mAb或结合蛋白对其抗原的特异性、亲和性和交叉反应性。
术语结合蛋白是指包括本发明mAb或具有本发明mAb的免疫结合特性的mAb的抗原结合位点的蛋白。
通过用重组H5N1HA0蛋白免疫动物来制备具有mAb 5F8或mAb1G5的结合特性的单克隆抗体。这类抗原可以用作免疫原来产生具有所需免疫结合特性的抗体。这类抗体包括但不限于单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，Fab片段和包括mAb 5F8或mAb 1G5的抗原结合序列的蛋白。
已经发现mAb 5F8识别包括氨基酸序列CNTKCQTP的特定表位，所述表位已经被证明存在于人类中发现的所有H5N1株以及迄今为止鉴定的所有已知来源包括鸡的全部毒株中的超过99％中。该表位还被证明非常稳定(不经历突变)。该表位是高度抗原性的，由此基本上在任何受感染个体的血清中都发现针对该表位的抗体，使得该表位在诊断测试中非常可靠。
已经发现mAb 1G5识别包括序列IHPLTIGE的特定表位，所述表位已被证明存在于迄今为止鉴定的所有来源的1288个H5N1株中。该表位也是非常稳定和高度抗原性的，由此基本上在任何个体的血清中都发现针对该表位的抗体，使得该表位在诊断测试中也是非常可靠的。
本发明的单克隆抗体可以利用通过培养的连续细胞系产生抗体分子的任何技术获得。这类方法包括但不限于Kohler和Milstein最早开发的杂交瘤技术(1975，Nature 256：495-497)以及trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。可以使用人抗体，人抗体可以通过使用人杂交瘤(Cote et al.，1983，Proc.Nat＝1.Acad.Sci.U.S.A.，80：2026-2030)或用EBV病毒体外转化人B细胞(Cole et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96)来获得。此外，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”或“人源化抗体”的技术(Morrison et al.，1984，J.Bacteriol.159-870；Neuberger et al.，1984，Nature 322：604-608；Takeda et al.，1985，Nature 314：452-454)，通过引入来自本发明鼠抗体分子的序列以及来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因进行。嵌合抗体是含人Fc部分和鼠(或其他非人)Fv部分的那些抗体。
人源化抗体是其中鼠(或其他非人)互补决定区(CDR)掺入人抗体中的那些抗体。嵌合和人源化抗体都是单克隆的。这类人或人源化嵌合抗体优选用于人疾病或病症的体内诊断或治疗。
本发明的另一实施方案利用构建Fab表达文库的技术(Huse et al.，1989，Science 246：1275-1281)以快速和简便鉴别对本发明抗体具有所需特异性的单克隆Fab片段或其衍生物或类似物。
含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这类片段包括但不限于F(ab′)2片段，其可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生；Fab′片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生，以及Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生。这类抗体片段可以从本发明的任何多克隆抗体或单克隆抗体产生。
在抗体的产生中，筛选需要的抗体可以利用本领域已知的技术实现，例如放射免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定，原位免疫测定(例如使用胶体金，酶或放射性同位素标记)，Western印迹，沉淀反应，凝集测定(例如凝胶凝集测定，血凝测定)，免疫荧光测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测二抗或其他试剂与一抗的结合来检测一抗。在再一个实施方案中，所述二抗是标记的。在免疫测定中检测结合的手段是本领域已知的并且在本发明范围内。
已经发现如下文所述的本发明5F8结合蛋白识别具有氨基酸序列CNTKCQTP的H5N1 HA的表位。已经发现该表位在所有人和基本上所有鸡流感H5亚型以及动物其他物种和禽类的绝大多数流感H5亚型中高度保守。具体来说，在NCBI数据库提供的1288个流感AH5N1 HA株中，99.61％(1283)包含CNTKCQTP序列。在这1288株中，280个是人H5N1株，它们全部包含该序列。此外，在427个鸡H5N1株中，除去一个以外全部包含CNTKCQTP序列。总计只有5个非人H5株包含CNTKCQTP序列的变异：1个H5株获自具有序列CNTRCQTP的鸭，1株获自具有序列CNTRCQTP的鹅，2株获自具有序列CNTKCQTL或CNAKCQTP的鸡。总共检测了来自鸡的427株，来自苍鹭的5株，来自鸭的189株和来自鹅的62株。还发现在如火鸡，野鸭，鸽子，大拟啄木鸟(great barbet)，绿孔雀，孔雀，树雀，游隼，黑头鸥，金鸡，雕鸮(eagle owl)，鹧鸪，大天鹅(whooper swan)，鸵鸟，家鸦(house crow)，鹊，麻雀和八哥中该表位高度保守。
已经发现如下文所述的本发明1G5结合蛋白识别具有氨基酸序列IHPLTIGE的H5N1HA的表位。已经发现该表位在所有人流感H5亚型以及迄今为止已知其他物种的所有流感H5亚型中高度保守。前述抗体可用于本领域已知的关于检测或定位AIV的H5亚型的方法，例如Western印迹，ELISA，放射免疫测定，免疫荧光测定，免疫组化测定等等。此外，在优选的实施方案中，所述抗体可用于下文更详细描述的表位阻断ELISA。这些测定可用于定性和定量确定AIV的H5亚型以及诊断和监测感染该病毒的动物或人。
本发明还包括定性和/或定量检测AIV的H5亚型的测定法和检测试剂盒。这类测定***和检测试剂盒可以包括标记的成分，例如通过标记本发明的mAb或相关结合蛋白或其结合配偶体来制备。所述测定法或检测试剂盒进一步可以包括免疫测定技术领域技术人员熟知的试剂、稀释剂和使用说明书。
在本发明的一些实施方案中这类试剂盒至少包含本发明的mAb或相关结合蛋白，检测所述mAb或相关结合蛋白与生物样品中AIV的免疫特异性结合的成分，以及根据选择的方法如表位阻断、竞争性、夹心等方法的使用说明书。所述试剂盒还可以包括阳性和阴性对照。它们可以被配置成用于自动分析仪或自动免疫组化载片染色设备中。
检测试剂盒可以进一步包括二抗或结合蛋白，其可以被标记或用于附着固相支持物(或附着于固相支持物)。这类抗体或结合蛋白可是例如结合AIV的抗体或结合蛋白。这类二抗或结合蛋白可以是多克隆或单克隆抗体。
优选的试剂盒是用于表位阻断ELISA的试剂盒。这类试剂盒包括mAb或相关结合蛋白，其结合AIV H5亚型的HA1包膜糖蛋白的表位CNTKCQTP或表位IHPLTIGE，包括所述表位的氨基酸的HA1糖蛋白或其部分，以及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。
可以通过用AIV或H5蛋白或其片段免疫动物来制备针对H5亚型血凝蛋白的单克隆抗体。优选的方法包括扩增H5亚型HA0基因，随后表达该基因，回收及纯化H5重组蛋白，并且使用该蛋白作为免疫原。例如，H5N1AIV通过可利用的病毒株接种鸡胚而增殖，随后分离所述病毒RNA。从cDNA扩增HA0基因，将其克隆入细菌，然后表达。由此产生的蛋白可用于免疫小鼠或其他合适物种以产生杂交瘤。
根据其稳定产生能特异性结合H5蛋白并且能区分其与其他AIV亚型的高亲和性mAb的能力筛选杂交瘤。根据本发明，发现一种免疫球蛋白mAb(确定是同种型IgM并被命名为5F8)对已知的Indonesian H5亚型株以及其他H5株显示强阳性，并且不显示与任意其他检测的亚型包括H7N1、H3N2、H4N2和H9N2的交叉反应。
在本发明的第二个实施方案中，发现另一个mAb(确定是同种型IgM并被命名为1G5)也对已知的Indonesian H5亚型株以及其他H5株显示强阳性，并且不显示与任意其他检测的亚型包括H7N1、H3N2、H4N2和H9N2的交叉反应。
mAb 5F8和1G5都识别H5N1血凝素的线性表位。当这两种抗体以相同浓度使用时，mAb 5F8的强度更大。被两种抗体识别的分离的线性表位增加了检测H5抗原的灵敏性。mAb 5F8识别的表位是通用表位并且正如以上讨论，该表位的8个氨基酸存在于所有已知的人和现在基因库中可获得的总共1288个已知的H5N1流感A序列的几乎全部序列中。1G5mAb识别存在于所有人流感H5亚型以及来自目前已知的和基因库中可用的其他物种的所有H5亚型株中的8氨基酸表位。这两个表位(氨基酸290-297和氨基酸310-317)之间的距离允许抗原结合和检测的高亲和性。
本发明提供了检测H5亚型AIV的便利的、高特异性和灵敏性的手段。一种这样的手段是表位阻断ELISA(EB ELISA)。在EB ELISA中，来自阳性血清的特异抗体抑制挑选的mAb识别其特定表位，由此当向样品添加结合所选mAb的显色试剂时颜色显影被抑制。但是，阴性血清允许强的颜色反应。该测定法取决于生物样品中存在的H5流感抗体阻断所选H5 HA1mAb与微量滴定板上吸附的H5N1流感抗原或重组抗原结合的能力。更具体地，在本发明的EB ELISA中，用于包被缓冲液中的最适浓度的重组HA1或灭活H5N1株包被ELISA平板。通过使用包被抗原的双向系列稀释和已知阳性抗体的方格板滴定并挑选在ELISA读数中产生最大光密度(O.D.)值的最佳浓度可以确定最适浓度。向包被的平板的每孔中添加检测血清样品并温育，洗涤，然后与mAb 5F8或1G5上清温育。再次洗涤平板，通过添加稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体(如HRP标记的兔抗小鼠抗体)检测结合的mAb，所述抗体结合mAb 5F8或1G5。洗涤平板，然后与3，3′，5，5′-四甲基联苯胺或其他显色剂如2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸或邻间苯二胺二盐酸温育。终止反应并读取显色。对每种血清样品计算样品中(阻断5F8或1G5mAb与抗原的结合)的抗体造成的比色反应的百分比抑制。
表位阻断ELISA提供了检测H5亚型AIV的便利、高特异性和灵敏性的手段。这种优选的检测方法能够检测AIV各种H5亚型株的HA抗原而与其他AIV亚型没有交叉反应。EB ELISA可以检测到比在其他测试中一致检测到的更低水平的抗体。
mAb 5F8和mAb 1G5的强反应性还意味着该抗体可用于抗原捕获ELISA(AC ELISA)，其中可以检测来自临床样品中活病毒或灭活或裂解病毒的抗原。AC-ELISA是检测H5抗原的快速、可靠和经济的方法，可用于检测H5N1的家禽和人分离物的H5HA抗原。
因此本发明的H5亚型mAb是非常有利的诊断工具。如上所述，它们对传染性H5N1亚型AIV是高度特异性的。这种特异性已经在获自各种来源的H5N1感染的组织样品组合中得到验证。这类高度特异的单克隆抗体体现了用于H5N1诊断的明确优势。该mAb可在用于检测H5AIV的安全和便利的诊断测试中使用。
提供下列实施例以例证本发明，其不应被理解为进行限制。
实施例1
I.实验
病毒
用于本研究和下表1所列的24种分离的Indonesian H5N1流感株(条目1-24)获自National Institute of Health，Research and Development，Indonesia。其他H5和非H5亚型由新加坡农业食品和兽医局(AVA)(表1的条目25-31)提供。
表1.本实验使用的禽流感病毒
| 系列号 | 病毒 | 亚型 |
| 1 | 人/Indonesia/CDC7/06* | H5N1 |
| 2 | 人/Indonesia/CDC326/06* | H5N1 |
| 3 | 人/Indonesia/CDC329/06* | H5N1 |
| 4 | 人/Indonesia/CDC370/06* | H5N1 |
| 5 | 人/Indonesia/CDC390/06* | H5N1 |
| 6 | 人/Indonesia/CDC523/06* | H5N1 |
| 7 | 人/Indonesia/CDC594/06* | H5N1 |
| 8 | 人/Indonesia/CDC595/06* | H5N1 |
| 9 | 人/Indonesia/CDC597/06* | H5N1 |
| 10 | 人/Indonesia/CDC610/06* | H5N1 |
| 11 | 人/Indonesia/CDC623/06* | H5N1 |
| 12 | 人/Indonesia/CDC644/06* | H5N1 |
| 13 | 人/Indonesia/CDC669/06* | H5N1 |
| 14 | 人/Indonesia/TLL01/06* | H5N1 |
| 15 | 人/Indonesia/TLL02/06* | H5N1 |
| 16 | 人/Indonesia/TLL60/06* | H5N1 |
| 17 | 人/Indonesia/TLL 177/06* | H5N1 |
| 18 | 人/Indonesia/TLL298/06* | H5N1 |
| 19 | 人/Indonesia/TLL485/06* | H5N1 |
| 20 | 人/Indonesia/TLL530/06* | H5N1 |
| 21 | 人/Indonesia/TLL540/06* | H5N1 |
| 22 | 人/Indonesia/TLL540/06* | H5N1 |
| 23 | 人/Indonesia/TLL561/06* | H5N1 |
| 24 | 人/Indonesia/TLL565/06* | H5N1 |
| 25 | 鸭/Singapore/Singapore/97 | H5N3 |
| 26 | 鸡/Singapore/Singapore/98 | H5N2 |
| 27 | 鸡/Singapore/Singapore/92 | H4N1 |
| 28 | 鸡/Singapore/Singapore/02 | H3N2 |
| 29 | 黑翅雀鹎/Indonesia/F89/11/95 | H7N1 |
| 30 | 鸡/Singapore/Singapore/98 | H9N2 |
| 31 | 鸳鸯/Singapore/Singapore/98 | H10N5 |
*高致病性AIV
将高致病性和低致病性病毒接种11天龄的含胚鸡蛋的尿囊腔。孵育48小时后从鸡蛋收集尿囊液。使用血凝测定法确定病毒效价。然后将病毒净化，保存在-80EC。在3级生物安全水平3防护实验室进行所有活病毒实验，所有动物实验都按照CDC/NIH和WHO推荐[12，13]并且得到新加坡农业食品和兽医局(AVA)和***(MOH)的批准在3级动物生物安全水平(ABSL3)防护实验室进行。
分子克隆
利用β-丙内酯灭活H5N1(CDC/669/Indonesia/06)[14]并使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。从cDNA扩增HA0基因并使用用于在细菌中表达的标准克隆技术将其克隆入pQE-30载体(Qiagen，Germany)。将该克隆物转化大肠杆菌(Escherichia coli)M15pREP4感受态细胞以表达蛋白。将来自相同株的HA1基因克隆入pFASTBAC-HT(用于构建载有H5N1HA1基因的重组杆状病毒的载体(Invitrogen，Carlsbad，CA))，其然后用于感染在Sf-900 II培养基中增殖的Sf-9细胞以开发免疫荧光测定法来筛选H5 HA1-特异性mAb。
重组H5N1 HA0蛋白(rHA0)的产生
转化的大肠杆菌M15细胞在包含氨苄青霉素(100μg/ml)的Luria-Bertani(LB)培养基中37EC生长到OD600为0.5-0.6，通过添加1mmol/L IPTG振摇3小时以诱导蛋白表达。沉淀细胞，将其重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)。在Ni-NTA柱(Quiagen，Germany)上纯化组氨酸融合蛋白并将该蛋白用于SDS-PAGE和Western印迹分析。
单克隆抗体的产生
用于0.1ml PBS中的25μg重组H5N1HA0蛋白肌内免疫4只成年雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)3次，所述重组H5N1HA0蛋白用等体积佐剂(SEPPIC，France)乳化。利用IFA和间接酶联免疫吸附测定(ELISA)监测小鼠体液免疫应答。融合前3天，经静脉内给予小鼠于0.1ml PBS的25μg重组H5N1HA0蛋白加强免疫，收集脾细胞，按照先前描述[15]与SP2/0细胞融合。将所述融合细胞种入96孔板，如下所述利用模拟感染或重组杆状病毒感染的Sf9细胞、H5N2和H5N3感染的MDCK细胞作为抗原通过免疫荧光测定筛选它们的上清。通过有限稀释将阳性孔的杂交瘤克隆两次。按照制造商实验方案所述使用一分钟分型试剂盒(Amersham Bioscience，England)检查阳性克隆的同种型。收集杂交瘤培养物，通过在400xg离心10分钟去除细胞碎片。收集上清并保存于-20EC。
免疫荧光测定(IFA)
分别用载有截短的H5N1 HA1基因的重组杆状病毒或AIV H5N1Indonesian株，H5N2和H5N3株感染96孔板中的Sf-9和MDCK细胞。感染后第36小时(对于Sf-9细胞)和24-48小时(对于MDCK细胞)，细胞在室温下用4％低聚甲醛固定30分钟，再用PBS，pH 7.4清洗3次。将固定的细胞与杂交瘤培养液在37EC温育1小时。用PBS清洗细胞3次，再将其与1∶40稀释的偶联异硫氰酸荧光素(FITS)的兔抗小鼠Ig(Dako，Denmark)温育。再次用PBS清洗细胞，之后在表面荧光显微镜(Olympus，Japan)中利用合适的屏障和激发滤波器以优化FITC显色来计数结果。
一种免疫球蛋白IgM MAb(称为5F8)对所有Indonesian株都是强阳性。它被挑选用于表位作图和进一步开发阻断ELISA。
免疫印迹
通过免疫印迹测定评价挑选的mAb 5F8。在非还原性条件下在12％SDS-PAGE上分离重组H5N1 HA0蛋白和完整纯化的H5N1Indonesian株和H5N2和H5N3株。将分离的蛋白电转并固定到硝酸纤维素膜上。在37EC用于含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)中的5％脱脂乳封闭膜1小时。随后将该膜与杂交瘤上清温育，PBST清洗，再与偶联HRP的兔抗小鼠Ig温育。利用与HRP偶联的兔抗小鼠检测膜结合的抗体。通过与ECL试剂(Amersham Biosciences)[16]温育对膜进行显色。
5F8的表位作图
为了定位5F8的表位，将rHA1蛋白分解为5个重叠片段(参见图2A)。利用基因特异性引物PCR扩增DNA的相应片段并将其克隆入pQE-30载体(Qiagen，Germany)。所述克隆转化大肠杆菌M15pREP4感受态细胞(Qiagen，Germany)以表达组氨酸融合蛋白。转化的大肠杆菌M15细胞在含氨苄青霉素(100μg/ml)的Luria-Bertani(LB)培养基中37EC生长到OD600为0.5-0.6，通过添加1mmol/L IPTG振摇3小时诱导蛋白表达。沉淀细胞并重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)。通过Western印迹对表达的融合肽进行表位作图。
对于表位作图的第二步，表达8个进一步截短的肽，其是片段4的延伸但在片段5区被截短(图2B)。这8个亚片段还可以如上所述表达为组氨酸融合(His-融合)肽，用于Western印迹分析。对于最后一步，产生具有点突变以突变氨基酸287-300的14种突变体。将除了Ala-297以外的所有氨基酸突变为丙氨酸，而Ala-297在一系列突变中被突变为甘氨酸。利用基于PCR的定点诱变方案产生点突变体。
这些突变体还可以如上所述表达为His融合肽，并进行Western印迹以精确确定形成对于mAb 5F8的表位的氨基酸。
血清检测
为了确定使用所选mAb 5F8的表位阻断ELISA的特异性，检测人和鸡血清样品并将结果与HI测定的结果进行比较。将用于当前研究的样品分为人和鸡组。人组由分成三组的25份人血清样品组成。组1包括源自H5N1流感感染并且康复的患者的10份血清样品，获自印度尼西亚***(MOH)。所述感染通过PCR确认并得到印度尼西亚MOH证实。组2由前6个月内接种商品化流感病毒疫苗(FLUARIX7)的5位健康志愿者组成。FLUARIX7包含下列3种病毒株每种的血凝素(HA)：A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)，A/Wisconsin/67/2005(H3N2)和B/Malaysia/2506/2004。组3由已知没有流感感染史并且未使用流感疫苗的10位健康志愿者组成。所有样品得到印度尼西亚MOH开出的关于他们状况的证明。
使用来自未接种疫苗的健康群体的鸡组(n＝5)产生阳性血清。用全部24种灭活的Indonesian H5N1株(表1)和非H5亚型如H3N2，H4N1，H7N1和H9N2肌内接种鸡共两次，间隔两周，所述毒株用ISA-70(SEPPIC，France)佐剂乳化。分别在第一次和第二次免疫后第10天收集血清样品并如上所述通过IFA和间接ELISA评价针对抗适当毒株的抗体。在病毒攻击后两周从实验感染低致病性H5N2或H5N3的小鸡获取其他阳性血清。
表位阻断ELISA
通过方格板滴定确定H5N1病毒抗原/重组HA1和5F8mAb的最适浓度以提供5F8mAb的接近最大结合。在合适的生物防范条件下以100μL/孔用高度纯化、最适浓度的重组HA1或CDC/523 H5N1灭活病毒株包被U型底96孔ELISA平板，在包被缓冲液(0.1mol/L碳酸盐/重碳酸盐，pH 9.6)4EC温育过夜。将抗原包被的平板用PBS-T(含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水[ph 7.5])清洗3次，非特异性位点用100μL封闭缓冲液(含5％脱脂乳的PBS)在37EC封闭1小时。测试血清样品用PBS-T进行两倍系列稀释，每孔添加100μL，然后在37EC温育45分钟。所述板用PBS-T清洗4次，再与100μLMAb上清在37EC温育1小时。再次将所述板清洗4次，通过添加100μL1∶1000稀释的过氧化物酶标记的兔抗小鼠Ig检测结合的MAb，在37EC温育1小时。用PBS-T清洗后，将所述板与100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma，USA)温育。通过添加0.1N硫酸终止反应，在450nm读取显色。通过使用如下所示的百分比抑制公式计算每种血清在不同稀释度下由样品抗体阻断MAb与抗原结合造成的比色反应的百分比抑制：
抑制百分比＝100-[OD(测试血清)/OD(阴性对照)×100]。测试血清50％抑制的阈值被认为＞阳性＝对于H5HA抗体。相对于测试样品造成的抑制，结果表示为MAb结合的百分比抑制。
II.结果
单克隆抗体的表征
针对所有24种Indonesian H5N1流感株和其他H5和非H5亚型通过免疫荧光(IFA)筛选一组分泌针对H5HA1抗原的mAb的杂交瘤克隆。所述结果显示5F8MAb与感染所有H5亚型的所有MDCK细胞以及感染表达重组HA1的杆状病毒的Sf-9细胞强烈反应并产生与利用兔抗H5N1血清所获得的相同的阳性细胞质免疫荧光模式(图1A-1和1A-3)。所有其他亚型如H7N1，H3N2，H4N2和H9N2感染的MDCK细胞不产生荧光信号(图1A-2和1A-4)。通过Western印迹筛选mAb 5F8检测H5N1株或H5亚型的天然HA1和rHA1的能力(图1B)。利用Western印迹，mAb 5F8与所有Indonesian H5N1株和H5亚型强烈反应，但没有观察到与任意其他亚型如H7N1，H3N2，H4N2和H9N2的交叉反应。基于IFA和Western印迹得到的单克隆抗体的灵敏性和特异性，选择5F8mAb用于表位作图及之后用于EB-ELISA。mAb 5F8的同种型确定为IgM型。
mAb的表位作图
表位作图的第一步，Western印迹结果显示mAb 5F8与片段5(氨基酸256到337)反应(图2A和2B；在图2B中，第一个″C″代表对照，“A B C DE″代表图2A中提及的片段的名称)。
对于表位作图的第二步，表达截短的肽，其是片段4的延伸但在片段5区被截短(用图2A的示意图代表)。这8个亚片段还可以如上所述表达为组氨酸融合肽并用于Western印迹分析(图2C)。Western印迹结果显示mAb5F8与片段8，7，6，5和4反应，提示所述表位位于区域287到300内。在第三步和最后一步，将第4个片段的氨基酸287到300中的每一个突变为丙氨酸，该蛋白在大肠杆菌中表达为组氨酸融合蛋白。Western印迹结果显示与突变体Y287A，G288A，N289A，M298A，Ga99A和A300G的阳性结果。突变体C290A，N291A，T292A，K293A，C294A，Q295A，T296A和P297A在Western印迹中显示阴性结果。这些数据表明显示阴性结果的氨基酸突变涉及所述表位，因此在突变后不被mAb 5F8识别。而其他突变体尽管有突变也被mAb识别，表明它们不参与形成所述表位。这些数据表明涉及所述表位的具体氨基酸是CNTKCQTP。
表位阻断ELISA
通过其检测人和鸡血清样品中H5HA抗体的能力表征表位阻断ELISA测定的诊断效力。根据感染的恢复时间，按照稀释度＞96、利用平均阻断值＞50％的mAb 5F8进行的表位阻断ELISA中，所有从H5N1流感感染恢复的人血清样品经检测都为阳性(表3B)。HI测试也显示HI效价为24(log 24-25)。在1∶5稀释度下样品与非H5接种的人血清显示10-15％抑制。但是，血细胞凝集抑制测定显示HI效价为14.4(log 23-28)，表明交叉反应性。正常人血清显示MAb结合其抗原位点的＜7％阻断。
在第一次免疫后第10天，按照＞47(40-57.6)的平均血清稀释度、用＞50％平均阻断值的mAb 5F8进行的表位阻断ELISA中所有H5N1免疫的鸡血清样品经检测都为阳性。第二次免疫后第10天显示阻断mAb结合其相应表位的平均血清稀释度为＞296.46(256-328)。但是，血细胞凝集抑制测定显示在所述天数(第7天和第14天)HI效价为log 23-24和log 28 29。在1∶2到1∶4稀释度，非H5亚型感染的血清样品显示15％到20％的最大阻断。在检测的非H5亚型中，H3N2免疫的血清在第二次免疫后第10天的HI测试中显示阳性(log 24)达到峰值(表3a)。
此外，如图3A和3B所示，在利用rH5HA和H5N1两种病毒抗原用于阻断时所述抗体应答显示类似的动力学。该研究证明重组H5HA抗原可以作为用于抗体检测的阻断ELISA的可选择的H5N1病毒抗原。
表3a
a)50％阻断mAb结合的血清效价表示为每种单独鸡血清进行印迹，发现平均值并表示为(n＝5/组
S.E.)
表3B
a)50％阻断mAb结合的血清效价表示为每种单独人血清进行印迹，发现平均值并表示为(平均值/组
S.E.)
EB-ELISA和HI测试(常用于针对流感感染的抗体的血清测试)的结果说明EB-ELISA与现有血清测试相比的能力。利用10份确定的阳性人H5N1血清样品和15份确定的阴性血清样品(包括来自非H5接种供体的5份血清)检测的结果证明EB-ELISA的可靠性，其能够鉴定所有抗H5N1阳性血清并且不与非H5接种血清交叉反应。当在EB ELISA和HI测试中检测系列稀释的血清样品时，ELISA能够比HI检测更低的抗体水平并且不与非H5接种血清样品交叉反应。相反，HI测试与非H5接种血清样品的异源抗HA抗体反应。
还通过检测来自24份H5N1 Indonesian株以及H5N2和H5N3株的确定阳性样品的鸡血清样品确定EB ELISA的灵敏性。此外，所述结果显示阻断测试比HI测试检测更低的抗体水平并且还检测了特异性。EB ELISA不与非H5亚型的异源抗HA抗体的系列稀释交叉反应。但是在HI测试中，观察到与H3HA抗体的交叉反应性，发现在第一次和第二次免疫后第10天平均HI效价分别是log 22.4和log 24.2。在检测人和鸡血清时通过EB ELISA和HI确定的抗体效价的比较显示前者在灵敏性和特异性方面更好。尽管HI测试是有效和灵敏的，但它要求危险的病毒制备和处理，这对其理想性是显著的限制。相反，重组H5HA抗原可以在具有细胞培养设备的任何实验室制备，因为该抗原不具有传染性，对易感动物没有危险。
利用HI测定法检测哺乳动物种属包括人中针对禽流感病毒的抗体通常失败，甚至在通过病毒分离确认实验性感染的情况下也是如此[25]。此外，已经证明H1、H2、H3、H5和H6亚型的HA含有被抗HA抗体识别的交叉反应性表位[26，27]。本研究开发的EB-ELISA对流感H5亚型高度特异。它可用于大规模血清流行病学研究以确定病毒的传播方式和与人类、动物和禽类中流感H5感染有关的危险因素。
已经发现mAb 5F8识别的表位CNTKCQTP序列(aa 290-297)在所有人类和基本上所有鸡流感H5亚型中高度保守。它在动物和禽类其他物种的几乎所有H5亚型株中也是保守的。该区域不存在于除了H1亚型之外的任何非H5血凝素中，而且在后者中只发现该区域的突变形式。因此5F8mAb是特别有用的，因为所述表位的稳定性和高免疫原性使得所述抗体对于诊断H5亚型非常特异。
实施例2
I.实验
按照实施例1的常规步骤获得杂交瘤上清以产生第二种单克隆抗体(称为1G5)。产生针对克隆自H5N1流感病毒株A/鹅/Guangdong/97的重组HA0蛋白的mAb。
免疫荧光测定(IFA)
将Sf-9和MDCK细胞种入960孔板并分别与载有截短的H5N1HA1基因的重组杆状病毒和H5N1病毒温育。感染后第36小时，细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟。所用清洗都是利用PBS，pH7.4进行。将固定的细胞与杂交瘤培养液在37℃温育1小时，清洗并与1∶50稀释的偶联异硫氰酸荧光素(FITC)的兔抗小鼠Ig温育。清洗细胞，使用合适的屏障和激发滤波器在Olympus IX71显微镜上观察荧光。
通过IFA和Western印迹分析检测出一种mAb(称为1G5，确定为IgMmAb)对所有24种已知Indonesian株以及其他H5亚型显示阳性。它被挑选用于表位作图和进一步开发阻断ELISA。
免疫印迹
按照实施例1的常规步骤进行免疫印迹。
1G5的表位作图
利用片段化蛋白过表达方案对mAb 1G5的表位作图。为了定位1G5的表位，利用实施例1阐述的方案将rHA1蛋白分割成5个重叠片段，如图5A所示。
对于表位作图的第二步，表达8个进一步截短的肽，其是片段4的延伸但在片段5区被截短。这8个亚片段还可以如实施例1所述表达为组氨酸融合肽。对于最后一步，产生具有点突变以突变氨基酸308-320的13种突变体。在一系列突变体中全部氨基酸被突变为丙氨酸。利用基于PCR的定点诱变方案产生点突变。所述突变体还可以如实施例1所述表达为His-融合肽并进行Western印迹分析以确切确定形成针对mAb 1G5的表位的氨基酸。
血清测试
根据实施例1所述步骤确定使用mAb 1G5的表位阻断ELISA的特异性。
表位阻断ELISA
根据实施例1的教导在表位阻断ELISA中使用MAb 1G5。
II.结果
单克隆抗体的表征
针对所有24种已知Indonesian H5N1流感株和其他H5和非H5亚型通过免疫荧光(IFA)筛选一组分泌针对H5A1抗原的mAb的杂交瘤克隆。所述结果显示mAb 1G5与所有H5亚型感染的所有MDCK细胞以及感染表达重组HA1的杆状病毒的Sf-9细胞强烈反应并产生与利用兔抗H5N1血清获得的相同的阳性细胞质免疫荧光模式(图4A-1和4A-3)。所有其他亚型如H7N1(图4A-2和4A-4)，H3N2，H4N1，H9N2和H10N5不产生荧光信号。通过Western印迹筛选mAb 1G5检测H5N1株或H5亚型的天然HA1和rHA1的能力(图4B)。MAb 1G5与所有已知Indonesian H5N1株和H5亚型强烈反应；通过Western印迹没有观察到与其他亚型的交叉反应。基于IFA和Western印迹得到的单克隆抗体的灵敏性和特异性，选择1G5mAb用于表位作图及之后用于EB-ELISA。mAb 1G5的同种型经确定为IgM型。
mAb 1G5的表位作图
在表位作图的第一步，所述片段的Western印迹分析显示mAb 1G5与位于氨基酸256和337之间的第5个片段反应(图5B)。
表4
Western印迹的结果
为了进一步对表位作图，在第二步，第5个片段的8个亚片段表达为第4个片段的延伸并表达为His-融合蛋白。Western印迹结果(图5C)显示1G5与片段6、7和8反应，表明表位位于氨基酸308到320之间的区域。
表5
Western印迹的结果
| 氨基酸编号 | ]Western印迹结果 | |
| 亚片段1 | 256-270 | - |
| 亚片段2 | 256-280 | - |
| 亚片段3 | 256-290 | - |
| 亚片段4 | 256-300 | - |
| 亚片段5 | 256-310 | - |
| 亚片段6 | 256-320 | + |
| 亚片段7 | 256-330 | + |
| 亚片段8 | 256-337 | + |
这些结果表明表位存在于氨基酸308到320之间的区域。1G5的假定表位确定为HNIHPLTIGECPK。
第三步，将点突变导入克隆SF6，这样的话从308到320的所有氨基酸被突变为丙氨酸，一次一个氨基酸，所述蛋白片段再次被表达为His-融合蛋白。在Western印迹中观察到mAb不与在氨基酸310到317突变的蛋白片段反应，但显示与其它蛋白片段的阳性反应(图5C)。根据这些结果，总结出mAb 1G5识别的表位是IHPLTIGE。
表6
点突变片段的Western印迹分析
已发现mAb 1G5识别的表位的IHPLTIGE序列在迄今为止鉴定的所有人和鸡流感亚型中高度保守。该区域不存在于任何非H5血凝素中(除了某些H1亚型)，其中所述表位区域包含突变并且与所述抗体没有反应性。因此1G5mAb是非常有用的，因为所述表位的稳定性和高免疫原性使得所述抗体对于诊断H5亚型非常特异。
表位阻断ELISA
通过其检测人和鸡血清样品中H5HA抗体的能力表征表位阻断ELISA测定的诊断效力。对于鸡按照1∶30的平均血清稀释度(参见图8和图9A和9B)和对于恢复的人血清样品(图8)按照1∶10稀释度利用50％平均阻断值的mAb 1G5进行的EB-ELISA中，所有H5N1免疫的人和鸡血清样品都是检测阳性。此外，在1∶5稀释度下样品与非H5接种的人血清显示7-13％抑制。相反，HI测定显示HI效价为log22。
实施例3
抗原捕获ELISA(AC-ELISA)的开发
用于50μl碳酸盐缓冲液(73mM碳酸氢钠和30mM碳酸钠)的纯化mAb5F8和/或1G5包被96孔板(Nunc，Denmark)，在37℃温育1小时或在4℃温育过夜。在每个温育步骤后，用含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤平板3次，所有稀释均在含1％脱脂乳的PBST中进行。将平板通过与100μl封闭溶液(于PBS-T的5％脱脂乳)在37℃温育1小时进行封闭，清洗并且与50μl纯化的高致病性H5N1 Indonesian株/低致病性AIV H5亚型(H5N1/PR8，H5N2和H5N3)/其他非H5亚型在37℃温育1小时。清洗后，添加100μl豚鼠单特异性抗体IgG(1∶500稀释)，在37℃温育1小时，清洗，然后与100μlHRP偶联的兔抗豚鼠免疫球蛋白(1∶1000稀释)进一步温育。通过添加100μlTMB底物溶液进行显色；添加4M H2SO4终止反应，使用sunrise Tecan Remote ELISA平板阅读器测量A450值。mAb和单特异性抗体的工作浓度通过方格板滴定确定。
为了优化AC-ELISA，单克隆抗体和多克隆抗体可以互换用做捕获和检测抗体。与用mAb作为捕获抗体包被平板时记录的吸光度相比，当用豚鼠抗rHA1多克隆抗体包被微量滴定板时记录的吸光度要低得多。因此，使用mAb作为捕获抗体，而多克隆抗体用作检测抗体。mAb 5F8和mAb 1G5用作捕获抗体的组合比任意单一单独的mAb产生更强的检测信号(图6A和6B)。在AC-ELISA中这两种单克隆抗体的组合显示检测H5抗原的高亲和性和特异性。没有观察到与任意其他亚型的交叉反应。基于mAb 5F8和mAb1G5的测定法检测到102TCID50单位的H5N1(图7)。含H4N1的测定不产生显著高于背景水平的吸光度。
对这两种mAb作图显示它们针对相同HA1抗原的两种不同表位。它们分离的线性表位增加检测H5抗原的灵敏性。mAb 5F8识别的表位是通用表位，该表位的8个氨基酸存在于基因库中几乎所有可获得的1288种流感H5N1序列中。mAb 1G5识别的表位存在于当前已知的和基因库中可获得的所有1288种流感H5亚型株中。这两种表位间的距离对于抗原结合和检测产生高亲和性。
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Claims (32)
1.一种与禽流感病毒H5亚型的表位特异性结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗体5F8的免疫结合特性。
2.权利要求1的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体。
3.权利要求1的结合蛋白，其是单克隆抗体。
4.由杂交瘤5F8产生的单克隆抗体5F8，所述杂交瘤5F8保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8757。
5.一种结合蛋白，其结合H5血凝素的表位CNTKCQTP。
6.权利要求5的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体。
7.权利要求6的结合蛋白，其是单克隆抗体。
8.一种与禽流感病毒H5亚型的表位特异性结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗体1G5的免疫结合特性。
9.权利要求8的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体。
10.权利要求8的结合蛋白，其是单克隆抗体。
11.由杂交瘤1G5产生的单克隆抗体1G5，所述杂交瘤1G5保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8756。
12.一种结合蛋白，其结合H5血凝素的表位IHPLTIGE。
13.权利要求12的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体。
14.权利要求13的结合蛋白，其是单克隆抗体。
15.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括将样品与包含禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的表位的抗原接触并确定所述样品中的抗体是否与所述表位结合，所述表位包含序列CNTKCQTP。
16.权利要求15的方法，其进一步包括将所述样品和抗原与基本上具有单克隆抗体5F8的免疫结合特性的结合蛋白接触并确定有多少所述结合蛋白与所述抗原结合。
17.权利要求16的方法，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
18.权利要求17的方法，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤5F8产生的抗体5F8，所述杂交瘤5F8保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8757。
19.权利要求15的方法，其中所述确定通过表位阻断测定法进行。
20.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括将样品与包含禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的表位的抗原接触并确定所述样品中的抗体是否与所述表位结合，所述表位包含序列IHPLTIGE。
21.权利要求20的方法，其进一步包括将所述样品和抗原与基本上具有单克隆抗体1G5的免疫结合特性的结合蛋白接触并确定有多少所述结合蛋白与所述抗原结合。
22.权利要求21的方法，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤1G5产生的抗体1G5，所述杂交瘤1G5保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8756。
24.权利要求20的方法，其中所述确定通过表位阻断测定法进行。
25.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包括结合禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的表位CNTKCQTP的结合蛋白、包含所述表位的氨基酸的糖蛋白或其部分以及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述结合蛋白具有单克隆抗体5F8的免疫学结合特性。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述试剂可以检测所述结合蛋白与所述糖蛋白的结合是否被所述生物样品中抗体的存在所阻断，所述抗体识别所述糖蛋白的所述表位。
28.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包括结合禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的表位IHPLTIGE的结合蛋白、包含所述表位的氨基酸的糖蛋白或其部分以及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述结合蛋白具有单克隆抗体1G5的免疫学结合特性。
30.权利要求28的试剂盒，其中所述试剂可以检测所述结合蛋白与所述糖蛋白的结合是否被所述生物样品中抗体的存在所阻断，所述抗体识别所述糖蛋白的所述表位。
31.一种试剂盒，其包括结合表位IHPLTIGE的结合蛋白和结合表位CNTKCQTP的结合蛋白。
32.一种试剂盒，其包括单克隆抗体5F8和单克隆抗体1G5。
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- 2010-12-29 HK HK10112162.5A patent/HK1145842A1/zh unknown
Patent Citations (1)
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