CN102718863B

CN102718863B - 可用于h5禽流感诊断和监视的h5亚型特异性结合蛋白

Info

Publication number: CN102718863B
Application number: CN201210181724.1A
Authority: CN
Inventors: Y·F·胡; Q·Y·杜; F·和; J·H-S·康
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2027-05-11
Also published as: CN102718863A

Abstract

本发明提供了特异性结合禽流感病毒(AIV)H5亚型的包膜糖蛋白的单克隆抗体及相关的结合蛋白。上述单克隆抗体及相关的结合蛋白可用于检测AIV的H5亚型，包括致病性H5N1亚型。病毒可以在***防腐的、石蜡包埋的样品以及冷冻样品和生物学液体中检测。因此，本发明提供了诊断和监视危险的病毒感染的方式方法。

Description

可用于H5禽流感诊断和监视的H5亚型特异性结合蛋白

本申请是2007年5月11日提交的题为“可用于H5禽流感诊断和监视的H5亚型特异性结合蛋白”的中国专利申请200780053734.4的分案申请。

发明领域

本发明涉及检测禽流感病毒(AIV)的抗体及相关的结合蛋白。更特别地，本发明涉及可用于检测AIV的高致病性H5亚型的单克隆抗体及相关的结合蛋白，以及涉及诊断和监视动物和人体内这种AIV感染的方法和制品。

发明背景

禽流感是禽类常见疾病。AIV亚型H5N1已经在世界的许多地区导致不断蔓延的禽流感爆发(14)¹。受影响的区域包括欧洲、中东，特别是亚洲。根据世界卫生组织(WHO)报告，自2006年4月以来，大约100人死于H5N1禽流感，而且情况似乎正在恶化。见WHO网站(11)。虽然AIV感染罕见于人体，然而在过去能穿过物种屏障的新AIV亚型的出现已经导致流行性致死性流感(2,8,10)。

流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白抗原特异性分类。这些病毒主要被分为甲（A）、乙(B)、丙(C)血清型，甲型具有编码10种病毒蛋白的8个RNA节段。所有已知的甲型流感病毒均源自禽类。这种病毒可以影响其它物种，如马、猪、猫头鹰和海豹，以及对人类造成威胁(22)。根据包膜糖蛋白的抗原性质，甲型流感病毒被进一步分为亚型，根据血凝素(HA)分为H1-H16，根据神经氨酸酶(NA)分为N1-N9(10,12,19)。确认在HA1-HA2连接处的HA蛋白的蛋白酶解与禽类品系中的致病性相关，且在这个裂解位点周围的疏水性氨基酸的存在是H5亚型的特征。此外，确认HA蛋白介导sialoside受体附着于宿主细胞，且随后通过膜融合方式进入宿主细胞(17)，并且认为HA蛋白作为中和抗体的主要靶位(19)。

本发明涉及特异性结合AIV的单克隆抗体及相关的结合蛋白。单克隆抗体(mAb)是衍生自一种产生抗体的细胞的一群基本均质的抗体。因此该群中的所有抗体均相同，且对于指定表位具有相同特异性(5)。mAb应答的特异性提供了有效诊断试剂的基础。也发现了衍生自其中的单克隆抗体和结合蛋白作为治疗剂的用途。

由于AIV感染对野生动物、驯养动物和人造成危险，因此迫切需要检测组织样品中的病毒的快速、特异性及可靠的方法。特别地，检测保存的样品中病毒的能力对于诊断疾病和监测疾病进展的能力很重要，所述保存的样品例如是***固定的包埋于石蜡中的冷冻切片样品。迄今为止，还未有关于使用H5亚型单克隆抗体诊断高致病性H5N1AIV毒株的有效方法的报道。因此，本发明在H5N1及其它H5毒株的诊断和监视中取得突破。

发明概述

根据本发明，提供了特异于H5-亚型血凝素糖蛋白的线性和构象表位的单克隆抗体及相关的结合蛋白。线性H5表位的mAb能以良好的特异性和灵敏性检测变性样品如***固定的组织样品中的病毒，而靶向构象表位的那些抗体可用于检测冷冻样品及其它生物学液体中的病毒。

特别地，称作7H10的mAb靶向血凝素的线性表位，且已经证实对于***固定的组织中的病毒抗原具有高效及灵敏性，而对于冷冻的组织切片具有较小的作用。称作6B8的mAb靶向构象血凝素表位，且能结合及识别未经预处理的组织如冷冻组织样品及其它生物学组织和液体中的病毒抗原。称作8F10和2D10的单克隆抗体也靶向构象血凝素表位且提供与mAb 6B8相似的应用。

因此，本发明包含这样的结合蛋白，其基本具有如mAb 7H10对于线性H5亚型血凝素表位的免疫学结合特性。本发明进一步包含这样的结合蛋白，其基本具有如mAb 6B8、8F10或2D10对于构象H5亚型血凝素表位的免疫学结合特性。

另一方面，本发明包含检测样品中H5亚型的方法，包括检测AIV与基本具有mAb 7H10的免疫学结合特性的mAb或结合蛋白的结合。再一方面，本发明包含检测样品中AIV的方法，包括检测AIV与基本具有mAbmAb 6B8、8F10或2D10的免疫学结合特性的mAb或结合蛋白的结合。特别地，本发明涉及利用这种结合蛋白的免疫荧光测定、免疫组织化学测定以及ELISA方法。

另一方面，本发明涉及检测AIV的试剂盒，其包含基本具有mAb 7H10或者mAb 6B8、8F10或2D10的免疫学结合特性的结合蛋白。

本发明进一步涉及治疗H5AIV毒株如H5N1AIV毒株感染的对象的方法，包括给予这种对象有效量的一或多种基本具有mAb 6B8、8F10或者2D10的免疫学结合特性的单克隆抗体或者结合蛋白。

附图简述

图1：在90天期间的mAb效价分布。图1中的数据证实所述mAb在大部分期间能保持稳定。

图2：在HI测定中测量的H5亚型mAb与非H5亚型病毒和H5亚型病毒的交叉反应性。各个病毒的血清抗体效价如下所示：浅阴影，无HI活性；深阴影->16。

图3：Western印迹分析。各个mAb与在大肠杆菌总细胞裂解物中表达的H5N1病毒的HA1蛋白的反应性。RPMI 1640用作mAb对照。

图4：在不同组织样品中信号强度分布。样品是H5N1 AVI感染的鹊鸲Magpie Robin(信号/损害在图中用箭头标示)。

a)脑冷冻切片。组织与mAb 6B8一起保温。观测到作为多个红点的较大强度的阳性信号。在神经元中见到损害。

b)脑冷冻切片。RPMI 1640用作mAb 6B8阴性对照。无信号可见。

c)肝石蜡切片。组织与mAb 7H10一起保温。在胆管内皮可见较小损害。

d)肝石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。

e)肺切片。组织与mAb 7H10一起保温。仅在上皮组织的内侧可见损害。

f)肺石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。

g)肺切片。组织与mAb 7H10一起保温。在肺泡组织可见损害。

h)肺石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。

i)肾石蜡切片。组织与mAb 7H10一起保温。大量高强度信号遍布于肾细胞中。

j)肾石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。

k)肝石蜡切片。组织与mAb 7H10一起保温。在肝细胞中可见损害。

l)肝石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。

图5：H5亚型mAb能检测2002年以来载明日期的H5N1感染的组织的信号。

a)家鸦的脑组织。

b)池鹭的肺组织。

c)苍鹭的脑组织。

d)鸡的脑组织。

图6：AC-ELISA形式中的捕获和检测抗体的反应性。(a)使用AC ELISA检测的不同AIV亚型。当仅H5AIV产生阳性结果时示出这个检测的特异性。“N Ctrl”是阴性对照，其中无病毒加入孔中。(b)将不同的H5AIV用PBS连续稀释并在AC ELISA中检测。使用0.100作为阳性和阴性结果之间的截断值(cut-off)，可以用AC ELISA检测的H5AIV的最小量平均为大约0.5HA单位，7H10和6B8。

图7：7H10表位的作图。A，血凝素蛋白1的示意图，示出表达不同长度HA1片段的克隆结构及其与Mab 7H10的反应性。aa，氨基酸。B，在大肠杆菌BL21中表达的12个重组融合蛋白的Western印迹。样品来自总细胞裂解物。M，标记；NC，阴性对照；HA1，全长HA1蛋白；A-K，不同的片段。C，突变株血凝素1片段的示意图，示出表达HA1片段上不同突变的克隆构建体及其与Mab 7H10的反应性。D，在大肠杆菌BL21中表达的9个重组融合蛋白的Western印迹。样品来自总细胞裂解物。M，标记；NC，阴性对照；J，B中片段J。

发明详述

本发明涉及特异性结合AIV的H5亚型血凝素包膜糖蛋白的mAb及相关的抗原结合蛋白。特别地，所述mAb或者相关的抗原结合蛋白具有如下mAb的免疫学结合特性：mAb 7H10，由杂交瘤7H10产生，2007年3月20日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登陆号为PTA-8243；mAb6B8，由杂交瘤6B8产生，2007年3月20日保藏在ATCC，保藏号CRLPTA-8246；mAb 8F10，由杂交瘤8F10产生，2007年3月20日保藏在ATCC，保藏号PTA-8245；或者mAb 2D10，由杂交瘤2D10产生，2007年3月20日保藏在ATCC，保藏号PTA-8248。本发明进一步包含那些杂交瘤，并且提供了本发明的mAb和结合蛋白的持续来源。本发明进一步涉及检测及诊断H5亚型AIV感染的方法及包含本发明的mAb或者结合蛋白的检测试剂盒。本发明另外涉及通过给予有效量的一或多种本发明的抗体或相关结合蛋白治疗H5AIV毒株感染的对象的方法。特别地，在这个实施方案中所述对象感染AIV的H5N1亚型。本发明的抗体也可以预防性地给予可能发生流感的对象。在这种情况中，给予抗体的有效量是用于治疗H5AIV感染的有效量的大约一半左右。

本文使用许多术语，其具有如下含义：

术语mAb或者相关的结合蛋白的“免疫学结合特性”是指所述mAb或者结合蛋白对于其抗原的特异性、亲和性以及交叉反应性。

术语“线性表位”是指形成抗体结合位点的大约4-12个氨基酸的连续序列。本发明的mAb的线性表位优选是在由HA1病毒基因编码的血凝素蛋白的大约第244-251个氨基酸的区域中。结合所述mAb或结合蛋白形式的线性表位可以是基本上没有三级结构的变性蛋白质。

术语“构象表位”是指以其天然三维形式存在于H5亚型血凝素糖蛋白中的mAb或相关结合蛋白结合位点。

术语“结合蛋白”是指包括下述那些的蛋白质，其包含本发明的mAb或者具有本发明mAb的免疫学结合特性的mAb的抗原结合位点。

本发明有利地提供了制备具有mAbs 8F10或2D10的结合特性的单克隆抗体的方法，通过用AIV亚型H5N1(PR8)免疫动物，通过用H5N3蛋白免疫动物制备具有6B8结合特性的单克隆抗体，以及通过用H5HA1蛋白免疫动物制备具有7H10结合特性的单克隆抗体。任何这种抗原均可用作免疫原以产生具有希望的免疫学结合特性的抗体。这种抗体包括但不限于包含mAb 7H10、6B8、8F10或2D10的抗原结合序列的单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段以及蛋白质。

本发明的mAb可以通过在培养物中由连续细胞系产生的抗体分子的任何技术产生。这种方法包括但不限于杂交瘤技术，该技术最初由Kohler和Milstein开发(1975,Nature 256:495-497)，以及trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.,1983,Immunology Today 4:72)，和EBV-杂交瘤技术已产生人单克隆抗体(Cole et al.,1985,in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。可以使用人抗体且可以通过使用人杂交瘤而获得(Cote et al.,1983,Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.,80:2026-2030)，或者通过用EBV病毒在体外转化人B细胞而获得(Cole et al.,1985,inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77-96)。此外，可以使用针对产生“嵌合抗体”或者“人源化抗体”而开发的技术(Morrisonet al.,1984,J.Bacteriol 159-870；Neuberger et al.,1984,Nature 322:604-608；Takeda et al.,1985,Nature 3/4:452-454)，一起导入本发明鼠抗体分子如mAb7H10、6B8、8F10或2D10的序列与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因而产生抗体。嵌合抗体是含有人Fc部分和鼠(或者其它非人动物)Fv部分的那些抗体。人源化抗体是其中鼠(或者其它非人动物)互补决定区(CDR)掺入人抗体中的那些抗体。嵌合抗体与人源化抗体均是单克隆抗体。这种人或者人源化嵌合抗体优选用于人疾病或病症的体内诊断或治疗中。

根据本发明，可以对针对产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)加以调整，以提供本发明的单链抗体。本发明另一实施方案利用构建Fab表达文库的技术(Huse et al.,1989,Science 246:1275-1281)，得以快速且简便地鉴别具有希望的本发明抗体特异性的单克隆Fab抗体片段或者其衍生物或类似物。

含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这种片段包括但不限于：F(ab′)₂片段，其可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生；Fab'片段，其可以通过还原F(ab')₂片段的二硫键而产生，以及Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生。这种抗体片段可以从本发明的任何多克隆抗体或单克隆抗体中产生。

在抗体的产生中，筛选希望的抗体可以利用本领域已知技术实现，例如使用放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定,、放射免疫测定、凝胶扩散沉降反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或者放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、凝血试验)、免疫荧光测定以及免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测检测第一抗体上的标记检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或者其它试剂与第一抗体的结合而检测第一抗体。在再一个实施方案中，所述第二抗体是标记的。在免疫测定中检测结合的方式为本领域所已知且在本发明范围内。

前述抗体可用于本领域已知的关于检测或定位AIV的H5亚型的方法中，例如用于Western印迹、ELISA、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定等。本文揭示的技术可用于定性和定量确定AIV的H5亚型，以及诊断和监视该病毒感染的动物或人。

本发明还包括定性和/或定量确定AIV的H5亚型的测定法和检测试剂盒。这种测定***和检测试剂盒可包含标记的成分，例如通过用放射性原子、荧光基团或者酶标记，将标记与本发明的mAb或相关的结合蛋白或者与其结合配体结合而制备。这种测定或者检测试剂盒进一步可包含免疫测定技术领域技术人员熟知的试剂、稀释剂和使用说明书。

在本发明的某些实施方案中，这种试剂盒至少包含本发明的mAb或者相关的结合蛋白，检测所述mAb或者相关的结合蛋白与生物样品中AIV的免疫特异性结合的方式方法，以及根据选择的方法如“竞争性”、“夹心”“DASP”等方法的使用说明书。该试剂盒也可含有阳性和阴性对照物。它们可以被配置成用于自动分析仪或者自动免疫组织化学载玻片染色设备中。

本发明的试剂盒可进一步包含第二抗体或结合蛋白，其可以被标记或者可以被提供用于附着于固体支持物(或者附着于固体支持物)。这种抗体或者结合蛋白可例如是结合AIV的抗体或结合蛋白。这种第二抗体或者结合蛋白可以是多克隆或单克隆抗体。

H5亚型血凝素蛋白的单克隆抗体可以通过用AIV或H5蛋白或者其片段免疫动物而制备。优选的方法包括扩增H5亚型HA1基因，随后表达该基因，回收及纯化H5亚型重组蛋白，并且使用该纯化的蛋白质作为免疫原。例如，H5N1AIV通过用可利用的毒株接种鸡胚而增殖，随后分离所述病毒RNA。HA1基因通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，然后可克隆进杆状病毒载体中，用于在昆虫细胞中表达H5蛋白质。由此产生的蛋白质然后可用于免疫小鼠或者其它合适物种以产生杂交瘤。

根据其稳定产生能特异性结合H5蛋白且能区分其与其它AIV亚型的高亲和性mAb的能力筛选杂交瘤。根据本发明，发现具有病毒中和能力的抗体能识别H5亚型血凝素蛋白中的构象表位。这个发现得自这样的事实，即在存在每种中和mAb的条件下在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中1-2轮选择后产生病毒逃逸突变株。通过RT-PCR从这些中和逃逸突变株中克隆HA1基因并测序以鉴别点突变。在这组抗体中，在mAb 6B8、8F10和2D10中发现3个中和表位，称作1、2和3。使用凝血抑制测定证实中和-逃逸能力。

HA1含有338个氨基酸。为了研究蛋白质上线性表位的分布，有利地例如通过Western印迹或者相似技术检测截短和突变的片段与mAb的结合。可以使用免疫组织化学染色方法鉴别线性表位，其是mAb的结合靶位，在检测如在***固定的组织中存在的变性的H5亚型蛋白中提供良好性能。以这种方式对H5亚型mAb作图提供了进一步研究平台以及对感染性H5N1AIV更有效的临床诊断。

本发明还提供了对于AIV的H5亚型的血凝素分子的抗原性结构的更好理解。本发明的mAb及相关的结合蛋白提供了检测石蜡固定的变性组织以及冷冻切片和生物样品中这种高致病原性病毒的方式方法。

检测石蜡切片中病毒的能力是非常重要的。在大多数情况中，感染的组织中的H5N1抗原由于固定处理而被破坏。***和乙醇具有除去液体包膜和包膜糖蛋白包括血凝素的潜力，因此增加了在病毒抗原检测中的难度。因此，这种形式的诊断具有提供更安全及更精确诊断H5感染的动物和人的潜力。

正如下文提供的实施例所例证，mAb 7H10对于***固定的组织中的病毒抗原是高效且灵敏的，而对于冷冻的组织切片作用最小。这个抗体使得可以在光学显微镜下简便地观测到感染区域。抗体7H10不具有凝血抑制作用或者病毒中和活性；然而其在免疫荧光测定和Western印迹分析中呈现出阳性结果，观测到相应于重组H5NI-HA蛋白(MW 36kDa)的显著条带。

相反，mAb 6B8、8F10和2D10对于冷冻的组织切片具有高效性，但是不能检测***固定的组织中的抗原。这些结果提示这两组mAb与不同的病毒表位反应。通过表位作图，确定mAb 7H10靶向线性表位。当对组织进行强力热处理时，其仅可检测病毒抗原。在这种苛刻的抗原修复方法中，病毒的表面蛋白被破坏，剩下的H5N1病毒的核蛋白暴露。因此，靶向线性表位的mAb对冷冻的组织切片不起作用。

通过表位作图确定单克隆抗体6B8、8F10和2D10靶向H5N1病毒的构象表位。在对组织切片无预处理的条件下，这些抗体能结合并识别这些病毒抗原。

在免疫组织化学分析中观测到的对于不同组织样品的染色强度的差异反映病毒对组织的不同侵润水平。例如，在脑和肾组织中，各个细胞被深度染色，且染色的细胞在脑和肾组织中也广泛分布。这些发现表明在病毒血症的晚期阶段，肺也许不是最严重感染的器官。先前已经报道了H5N1感染的动物肺中的严重损害(2，13，14)。然而，本发明的发现表明肺鱼肾相比损害较低。由于本发明实验中使用的组织样品得自感染晚期阶段的鸟类，因此这些结果也许提示肺通常在感染早期阶段具有高水平病毒血症，而在晚期阶段期间病毒将传播并集中在肾。因此这些结果表明来自怀疑感染H5N1AIV的动物的诊断样品应包括脑组织和肾组织以及肺组织。

本发明提供了检测H5亚型AIV的便利的、高特异性且灵敏的方式方法。一种这样的方式方法是ELISA。在优选的实施方案中，mAb 7H10和6B8用作捕获抗体。发现这种组合与单独的抗体或者其它组合相比在检测H5亚型AIV中提供高密度目测结果。虽然不受任何特殊理论的约束，对这些结果做出的可能的解释是这两种抗体与HA1蛋白上的不同表位反应，且是不同抗体亚类的，因此提供多个结合位点。

针对构象表位的单克隆抗体保持重要的生物学功能，如凝血抑制作用和中和活性，而针对线性表位的mAb也有利于诊断应用。因此，分别针对线性和构象表位且组合IgG和IgM免疫学性质的mAb 7H10和6B8在抗原-抗体相互作用中的应用，可显著有助于ELISA的高灵敏性。使用两种mAb的方法也可用于开发检测H5病毒的其它免疫学方法，例如通过斑点印迹(dot-blot)和原位杂交形式。

本发明优选的ELISA试验能从在中国感染禽类及在越南感染人类的H5N1禽流感病毒中检测HA抗原，表明本发明在检测禽类和人类H5N1感染中的用途。

本发明的H5亚型mAb作为诊断工具具有超过目前使用的其它方法的至少三个优势。首先，所述mAb对于高感染性H5亚型AIV具有高特异性。这种特异性已经在从2002-2006年得自各个来源的H5N1感染的组织样品的分类中证实。这种高特异性单克隆抗体代表禽流感诊断领域的突破。其次，这些mAb在感染的***固定的组织以及在血清学检测如HI和IFA中检测和精确定位H5病毒抗原的能力是一独特优势。第三，这些mAb提供了检测H5AIV的安全且便利的诊断方法。其在石蜡切片中检测病毒抗原的能力便于感染的样品的转运和诊断，所述感染的样品不感染人类或者具有将感染性病毒粒子释放进环境中的潜力。此外，冷冻切片可以长期低温贮存，便于感染的进一步诊断和监视。

本发明的另一实施方案涉及H5禽流感的中和逃逸突变株。术语“中和逃逸突变株”是指编码血凝素的基因中的点突变产生的突变病毒，导致H5病毒中抗原性漂移及影响中和表位。中和逃逸突变株可以通过某些单克隆抗体逃逸中和作用，有效中和其亲代病毒。在人工筛选逃逸突变株中，将亲代病毒与某中和抗体一起保温并接种于宿主中，所述宿主如MDCK细胞或鸡胚。在筛选2-3次之后，克隆中和mAb的逃逸突变株并进行HA1基因测序。突变的氨基酸通过与亲代病毒序列进行对比而确定，突变的位点准确地表示出包含所述中和mAb识别的中和表位的氨基酸之一。

在本发明中，6B8逃逸突变株通过6B8中和单克隆抗体从H5N3AIV中产生。8F10逃逸突变株通过8F10中和抗体从H5N1(PR8)AIV中产生，2D10逃逸突变株通过2D10中和单克隆抗体从H5N1(PR8)AIV中产生。突变位点列于下文实施例3表3中。

中和逃逸突变株与其亲代病毒不同，其不再可由特异性结合亲代病毒的某些中和抗体识别。在这点上，这些突变株可用于免疫小鼠，根据上述教导产生新的单克隆抗体。在所述新的mAb中，可以筛选出精确识别突变的表位的单克隆抗体，然后可将其用于提供互补性监视除了其亲代病毒之外的禽流感病毒。通过重复这个过程至几个世代，可以发现进一步的逃逸突变株以及获得进一步的中和抗体。这些抗体可用于本发明的方法中。

在本发明的进一步实施方案中，可以给予本发明的抗体及相关的结合蛋白以治疗H5AIV感染对象，特别是AIV亚型H5N1感染对象。本发明的抗体及相关的结合蛋白也可以在流感流行或即将流行的情况中作为预防措施给予对象。所述抗体及相关的结合蛋白可以单一剂量给予或者重复给予，任选以缓释形式给予。可以通过使抗体达到治疗对象机体中其作用部位的任何方式给予，例如通过静脉内、肌内、皮内、口服或经鼻给予。典型地，所述抗体在药物可接受的稀释剂或载体如无菌水溶液中给予，且所述组合物可进一步包含一或多种稳定剂、佐剂、增溶剂、缓冲液等。精确的给予方法、组合物和特定剂量根据对象的个体需要、考虑到如对象年龄、体重、一般状况及其症状的性质和程度以及给予治疗的频率等因素，在治疗时予以确定和调整。通常地，当给予所述抗体以治疗H5AIV感染患者时，给予的抗体的剂量在大约0.1mg/kg-l mg/kgbody体重范围内。典型地，当作为预防措施给予时，所述剂量减少大约一半，即在大约0.05mg/kg-0.5mg/kg体重范围内。

对于治疗目的可以给予本发明的单一抗体或者结合蛋白，或者可以给予两或多种抗体或结合蛋白的组合。如果已经产生了一或多个世代的中和逃逸突变株的抗体，这种抗体与上述6B8、8F10和/或2D10抗体可以作为治疗性抗体“鸡尾酒混合物”给予对象。

提供如下实施例是为了例证实施本发明的优选模式。本发明非限于所述实施例的描述，而是与所附权利要求书的全部范围一致。

实施例1

杂交瘤的产生

称作H5N1/PR8的病毒得自美国疾病控制中心。其是非致病性重组H5N1流感病毒，含有在越南感染人类的AIV H5N1病毒(A/越南/1203/2004)的HA和NA基因。另一AIV亚型H5N3(A/鸡/新加坡/97)得自新加坡农业食品和兽医局(AVA)。这两个病毒原种用于感染9-11天龄含胚鸡蛋(Chew'sPoultry Farm,Singapore)，并使其复制两个世代。然后从含胚鸡蛋中抽取尿囊液，使用血凝素测定(HA)确定病毒效价。纯化这些H5N1和H5N3病毒，通过在10,000rpm离心30分钟含有病毒的尿囊液以除去碎片，随后对上清在40,000rpm超离心3小时。将病毒沉淀物重悬于PBS中。

单克隆抗体(IgG和IgM)纯化自澄清液，使用蛋白质A亲和柱(SigmaAldrich；St.Louis,MO,USA)和ImmunopureIgM纯化试剂盒(PierceBiotechnology；Rockford,Illinois,USA)根据厂商指导进行。IgG和IgM的浓度通过使用ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies；Wilmington,Delaware,USA)测量。

失活的H5N1AVI(A/鹅/广东/97)用作RNA来源以通过RT PCR扩增HA1基因进行表位作图。病毒RNA分离自病毒感染的细胞，使用LS Trizol试剂(Invitrogen)根据厂商指导进行。使用H5亚型的HA1基因的特异性引物进行逆转录反应和PCR。然后通过标准方法对PCR产物测序。将扩增的DNA克隆进pQE-30载体中，随后用于转化大肠杆菌BL-21感受态细胞。对于杆状病毒介导的蛋白质表达，将基因克隆进pFASTBAC Ta载体中，构建含有H5N1HA1基因的重组杆状病毒。该杆状病毒随后用于感染SF9细胞系以扩增所述重组病毒。对于逃逸突变株的选择，H5N1AIV(A/越南/1203/2004/H5Nl)用作RNA来源。

然后将来自杆状病毒的这些纯化的H5亚型病毒或者纯化的H5HA1蛋白用于免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，间隔两周肌内注射两次。每个动物均接种用等体积佐剂(SEPPIC,France)乳化的20-60μg纯化的H5-亚型AIV。在细胞融合前3天，经腹膜内给予该小鼠相同剂量的病毒加强免疫。然后通过Western印迹筛选该小鼠的血清，选择具有最高抗体效价的小鼠进行细胞融合。将得自选择的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1:10比率在50%聚乙二醇(Sigma,mol.wt.3350)中组合，以融合细胞并产生杂交瘤(21)。

使用活病毒的所有实验均在生物安全3级密闭实验室(20)中进行，该实验室符合CDC/NIH生物安全要求，如Biosafety in Microbiological andBiomedical Laboratories(BMBL)第四版指定。所述实验也遵照可适用的WHO要求进行，且由新加坡AVA和***(MOH)许可。

实施例2

杂交瘤的筛选

如下述通过血凝素抑制作用(HI)检验和免疫荧光测定(IFA)筛选杂交瘤培养上清。

血凝反应抑制作用试验得自CDC的H5N1/PR8病毒用于感染9-11天龄的含胚鸡蛋(Chew's Poultry Farm，新加坡)，并在35℃保温72-96小时。在病毒增殖后，从该鸡胚中提取尿囊液并用作H5N1病毒抗原。如先前所述(15)对各个杂交瘤培养上清进行HI检验，使用鸡红细胞凝集及4个血凝单位H5N1/PR8病毒株。连续稀释的杂交瘤上清最初以1:50稀释，然后与在鸡胚中增殖的4个HA单位的H5N1/PR8病毒(用0.1%β-丙内酯失活)和每孔0.5%(vol/vol)鸡红细胞悬浮液一起保温。相应于抑制血凝反应的最高稀释度倒数的抗体效价以几何平均值效价(GMT)表示。

免疫荧光测定用得自各个尿囊液的H5N1/PR8、H5N2和H5N3病毒感染在96孔平板中生长24小时的Madin Darby犬肾细胞(MDCK)。平板孔交替用作阴性对照(未感染的MDCK细胞)。将该96孔平板置于湿化的35℃、5%CO₂保温仪中18-22小时。当感染的细胞达到75%细胞病理效应(CPE)时，将其用100μl无水乙醇在室温固定10分钟。然后将96孔平板中的细胞用pH 7.4的PBS洗涤3次。随后，将固定的细胞与50μl各个杂交瘤上清在37℃保温1小时。在洗涤3次后，将所述抗原与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗小鼠Ig(1:100DAKO，Denmark)在37℃反应及保温1小时。对于通过IFA筛选mAb的更具识别力的方式而言，应用额外的对照。如先前所提及，未感染的MDCK细胞用作阴性对照。作为额外的阴性对照，将细胞与RPMI1640一起保温。对于阳性对照，使用得自免疫的小鼠的100倍稀释的血清。通过对比与具有不同对照的各个杂交瘤上清保温的MDCK细胞，选择提供阳性染色的杂交瘤上清用于通过限制稀释克隆。通过这种方法获得稳定产生mAb的杂交瘤。

实施例3

H5-亚型单克隆抗体的鉴定

mAb的稳定性对在不同时期(第7、30、45、60、70和90天)获得的各个杂交瘤上清进行血凝反应抑制作用试验，以测量细胞系的稳定性。进行稀释以计算终点。mAb 6B8的杂交瘤上清的HI效价为29。该效价在甚至低90天仍保持稳定(见图1)。因此，分泌H5抗原的mAb的杂交瘤能长期保持高效价值。

mAb分型(Isotyping) 使用小鼠mAb分型试剂盒(Amersham Bioscience,England)进行分型(数据未示出)。同种型6B8、8F10和2D10被确定为IgM，7H10被确定为IgG1。

mAb特异性分析将H5-亚型mAb与相关的H5亚型AIV H5N2和H5N3以及也与非H5亚型流感病毒H3N2、H4N1、H7N1、H9N2和H10N5交叉反应。使用HI试验检测交叉反应性。在图2中示出的结果示出当H5亚型mAb暴露于非H5亚型病毒H3N2、H4N1、H7N1、H9N2和H10N5时无交叉反应性。mAb 6B8、2D10和8F10与H5N2和H5N3具有交叉反应性。表1示出各个H5亚型mAb对于冷冻的和***固定的组织的效力。在表1中，如下在感染的组织中观测到的信号强度赋予半定量评分：无信号(-)、轻(+)、中(++)、强(+++)及极强(++++)。RPMI 1640用作H5亚型mAb的对照物，感染鸡新城疫的鸡组织用作H5N1感染组织的对照物。得自其它来源的AI和H5mAb用于与本发明的H5亚型mAb对比。

表1

mAb	mAb的来源	冷冻切片组织	石蜡切片组织
				6B8	F59/04/98	++++	-
7H10	A/鹅/广东/97	-	++++
				AI	其它来源	++	-
H5	其它来源	++	-

下文论述的免疫组织化学染色进一步证实这些H5亚型mAb对于H5NAIV的特异性。

mAb的病毒中和作用 MDCK细胞和10天龄的胚胎分别用于确定50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)和50%胚胎感染剂量(EID₅₀)。使MDCK细胞(2×10⁴/ml)生长至70%-90%铺满。检测使用10^-1-10^-8倍连续稀释的各个病毒感染的尿囊液的TCID₅₀和EID₅₀，通过在其指数生长期(对于病毒感染最高程度敏感)和10天龄鸡胚感染MDCK细胞进行检测。未感染的MDCK细胞和尿囊液用作阴性对照物。细胞在35℃保温，并观测CPE。使用Reed andMuench数学方法(9)，感染性效价表示为TCID₅₀/100μl和1000EID₅₀/200μl，且将各个病毒均稀释为在50μl和100μl分别具有100TCID₅₀和500EID₅₀。连续稀释的mAb 6B8能中和感染的MDCK细胞和胚胎中终浓度为100TCID₅₀和500EID₅₀的病毒。见表2。表2中的数据也示出mAb 6B8能与H5N1病毒产生中和活性。表2中的数字反映出H5N1病毒的最高稀释比率，在此稀释比率所述mAb仍能检测并中和感染的MDCK细胞和胚胎中终浓度为100TCID₅₀和500EID₅₀的病毒。

表2

逃逸突变株的选择将10倍系列稀释的亲代病毒与等体积的mAb混合。在室温保温1小时后，将该混合物接种于DMEM培养基中单层MDCK细胞上，所述DMEM培养基含有200μg/ml TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma)和0.001%DEAE-葡聚糖(Sigma)。在35℃培养7天后，收集病毒上清进行进一步选择。为了选择逃逸突变株，H5N1AIV(A/越南/1203/2004/H5N1)用作RNA来源。克隆所述逃逸突变株并与亲代序列对比。使用中和mAb6B8选择逃逸突变株。确定与mAb 6B8中和抗性相关的点突变发生在HA1序列的第614位核苷酸。所述突变包含第614位核苷酸由“A”改变为“C”，由此导致在第205位的氨基酸由赖氨酸改变为苏氨酸。这个突变使得突变病毒逃逸mAb 6B8中和作用的能力通过中和测定及血凝反应抑制作用测定而证实。这个结果表明mAb 6B8靶向含有血凝素上第205位氨基酸的表位。通过相同方法分别鉴别了mAb 8F10和2D10的两个其它中和表位。结果示于表3，表3示出AIV(A/越南/1203/2004H5N1)血凝素分子上mAb中和表位的位置。

表3

Western印迹对重组H5N1-HA1蛋白进行10%SDS-PAGE。分离的蛋白质固定于硝化纤维膜上。将该膜用在含有Tween-20的PBS中5%脱脂乳封闭1小时。在用PBS-Tween洗涤3次（5分钟/次）后，将该膜与各个mAb一起保温，随后与HRP-缀合的兔抗小鼠Ig(1:2000)一起保温。然后将该膜与3,3'-二氨基联苯胺(DAB)反应(develop)5分钟。通过用PBS-Tween漂洗终止反应。在每次保温后，用PBS-Tween洗涤反应物3次（5分钟/次）。mAb7H10用作阳性对照物，因为其衍生自纯化的重组HA1，而RPMI 1640用作阴性对照物。如图3所例证，H5-亚型mAb 7H10能与重组H5N1-HA1蛋白反应。在硝化纤维膜上形成的条带是36kDa。这等于所述重组蛋白质的分子量。另一方面，mAb 6B8、8F10、2D10和RPMI 1640提供阴性结果。由于6B8及其它mAb一起天然形式靶向病毒蛋白，因此这组mAb不能通过Western印迹检测病毒蛋白。Western印迹中使用的SDS-PAGE不能使天然的蛋白质折叠且使其线性化，因此不能检测。

实施例4

mAb 7H10线性表位的作图

将H5亚型AIV的HA1基因通过PCR切割成3个重叠片段，并且表达为组氨酸融合蛋白。通过用mAb 7H10进行Western印迹分析表明表位最初在片段B和C的重叠区域(第201-266位氨基酸)中发现。为了定位这个表位的C末端，设计8个截短的片段，使用mAb 7H10通过Western印迹筛选(图7a和b)。发现HA1上的第251位氨基酸是7H10的表位的C末端。为了定位这个表位的N末端，设计8个突变的片段，使用mAb 7H10筛选。在这8个突变体中，HA1上的第240-247位氨基酸通过某些引物被逐个改变为丙氨酸。根据Western印迹结果，该表位的N末端氨基酸是HA1上的第244位氨基酸(图7c和d)。这些结果表明由mAb 7H10靶向的线性表位位于H5亚型AIV的血凝素上第244-251位氨基酸。

实施例5

免疫组织化学

检测从2002-2006年的30个H5N1感染的组织样品。它们包括不同类型的组织器官如脑、肾、肝、肺和胰腺。这些样品是石蜡切片样品或者冷冻样品。可商购的免疫过氧化物酶染色***(Dako Cytomation EnVision+System-HRP(AEC))用于这些样品。染色技术包括两个步骤(16)以基于与第二抗体缀合的辣根过氧化物酶标记的聚合物识别结合的抗体(20)。由于这个试剂盒不含有抗生物素蛋白或生物素，因此非特异性内源抗生物素蛋白-生物素活性被充分降低。

石蜡切片样品石蜡切片样品的染色结果示于图4。在感染的肾组织中观测到极强阳性信号。在整个肾组织中普遍可见信号分布，且每个信号均具有较高强度。相反，肺组织在信号分布和强度方面未反映出这种强信号。肺组织中仅上皮内层被轻度染色。对于肝组织，信号稀疏分布。然而，检测到的每个信号均是强烈的。也注意到对于感染的肝组织，信号通常沿着胆管上皮被检测到。在更接近的检测中，观测胆管被感染。这些结果示出mAb 7H10是H5-亚型AIV单克隆抗体，其能从H5N1感染的***固定的组织中找回H5抗原。

冷冻切片样品冷冻切片样品的染色结果示于图5。抗体6B8可检测不同年度的所有样品上的强阳性信号。这些染色组织的显微照片清晰示出被染色的是这些感染的脑组织的神经元。对于冷冻和石蜡切片样品，清晰可见不论组织类型如何，组织中仅核被染色。H5N1病毒感染的鸟类的主要损害(20)是肾和脑组织。表1的数据证实本发明的mAb区分H5亚型AIV与其它来源禽流感病毒的能力。

实施例6

AC-ELISA的开发

如下所述在ELISA中评估单克隆抗体7H10和6B8。将6B8(IgM)以半对数增加量连续稀释，并用于包被96孔平底微滴定平板(Nunc,Demark)。将捕获抗体悬浮于50μl碳酸盐缓冲液(73mM碳酸氢钠和30mM碳酸钠)中。然后将该微滴定平板在37℃保温1小时或者在4℃保温过夜。在所有随后的保温步骤之间用含有0.05%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBS-T)洗涤该平板3次，所有稀释均在含有1%脱脂乳的PBST中进行。将该平板通过与50μl封闭溶液(在PBS-T中5%脱脂乳)在37℃保温1小时而封闭，漂洗，且与50μl纯化的重组H5N1重组HA1(100ng)或者H5AIV在37℃保温1小时。在漂洗后，加入50μl豚鼠单一特异性抗体IgG(1:480稀释)，在37℃保温1小时，洗涤，并且与50μl的1:1000稀释的HRP-缀合的兔抗豚鼠免疫球蛋白保温。通过加入50μl新鲜制备的底物溶液(o-苯二胺(OPD))生色，使用ELISA阅读器(Tecan,Switzerland)在490nm读吸光度。mAb和单特异性抗体的最佳工作稀释度通过方格板滴定法确定。最佳条件通过对比H5AIV(H5N1、H5N2、H5N3)与非-H5AIV(H7N1和H9N2)反应确定，以达到对于这个测定最高信号-噪音比。所述信号-噪音比通过用同源抗原的吸光度除以异源抗原吸光度而计算。

单克隆抗体6B8在AC-ELISA用作捕获抗体也用作检测抗体。单克隆抗体6B8与其它单克隆抗体相比在ELISA中示出较强的反应性。这种使用6B8进行的AC-ELISA特别适用于H5亚型AIV检测，且与任何其它AIV亚型不反应(图6a)。AC-ELISA的检测限度低于0.5HA单位(图6b)。在方格滴定法检测之后，确定对于捕获ELISA而言的最佳抗体浓度是600ng/孔/mAb(捕获抗体)以及800ng/孔(检测多克隆抗体)。

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Claims

1.由保藏在美国典型培养物保藏中心、保藏号为PTA-8246的杂交瘤6B8产生的单克隆抗体6B8。

2.权利要求1的单克隆抗体在制备用于治疗感染了H5亚型禽流感病毒的对象的药物中的应用。

3.权利要求1的单克隆抗体在制备用于检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。

4.检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包含权利要求1的单克隆抗体以及检测所述抗体与禽流感病毒H5亚型的血凝素包膜糖蛋白结合的至少一种试剂。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述单克隆抗体固定化于固体表面上。

6.权利要求4的试剂盒，其还包含特异性结合禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的结合蛋白，其中所述单克隆抗体是捕获抗体，所述结合蛋白是含有或缀合有可检测元件的检测结合蛋白。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。

8.权利要求6的试剂盒，其中所述单克隆抗体固定化于固体表面上。

9.权利要求6的试剂盒，其中所述结合蛋白含有放射性原子，与荧光分子缀合，或者与酶缀合。