CN101970650B - 可溶性透明质酸酶的大规模生产 - Google Patents

可溶性透明质酸酶的大规模生产 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于制备大规模的可溶性透明质酸酶制备品的方法。该方法利用含有多个活性拷贝的编码可溶性透明质酸酶的核酸的细胞，以及利用多种加料和温度的变化，由此经编码的可溶性透明质酸酶被分泌到细胞培养基中。

Description

可溶性透明质酸酶的大规模生产
相关申请
本申请要求美国临时申请No.61/068,622的优先权，该临时申请的申请人为DavidBaker和Louis Bookbinder，发明名称为“可溶性透明质酸酶的大规模生产”，于2008年3月6日提交。
本申请涉及美国专利申请No.11/238,171，后者的申请人为Louis Bookbinder，Anirban Kundu，Gregory I.Frost，Michael F.Haller，Gilbert A.Keller和TylerM.Dylan，发明名称为SOLUBLE GLYCOSAMINOGLYCANS AND METHODS OF PREPARING ANDUSING SOLUBLE GLYCOSAMINOGLYCANS，于2005年9月27日提交并作为美国专利公开文本No.20060104968公开，其是申请人为Louis Bookbinder，AnirbanKundu，Gregory I.Frost，Michael F.Haller，Gilbert A.Keller和Tyler M.Dylan的美国专利申请No.11/065,716的部分继续申请，该美国专利申请No.11/065,716的发明名称是SOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANS AND METHODS OF PREPARING AND USING SOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANS，于2005年2月23日提交并作为美国专利公开文本No.20050260186公开，其是申请人为Louis Bookbinder，Anirban Kundu和Gregory I.Frost的美国专利申请No.10/795,095的部分继续申请，该美国专利申请No.10/795,095的发明名称是SOLUBLEHYALURONIDASE GLYCOPROTEIN(SHASEGP)，PROCESS FORPREPARING THE SAME，USES ANDPHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEREOF，于2004年3月5日提交并作为美国专利公开No.20040268425公开。通过引用将每个上述的专利申请的全部内容并入本文。
发明领域
本发明提供用于大规模生产重组人蛋白的方法。
背景技术
透明质酸酶是降解透明质酸(也知为乙酰透明质酸或透明质酸盐)的酶家族，透明质酸是胞外基质的必需组分以及间质屏障的主要成分。通过催化透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的黏度，由此提高组织的通透性。这样，透明质酸酶被用作例如与其它药剂、药物和蛋白联用的扩散或分散剂以增强它们的分散和传递。透明质酸酶也具有其它治疗和美容用途。由于对透明质酸酶用于治疗和美容用途的使用日益增加，因而需要大规模量的纯化的透明质酸酶。因此，在本发明的目标中，提供用于透明质酸酶的生产和纯化的方法是一个目标。
发明内容
本发明所提供的是用于可溶性透明质酸酶的生产和纯化的方法。特别是，本发明提供了用于可溶性rHuPH20的生产和纯化的方法。本发明也提供了含有可溶性rHuPH20的细胞培养基以及所收获的细胞培养液。本发明所提供的方法可用于生产和纯化任意量的可溶性透明质酸酶，如rHuPH20。例如，本文所描述的方法和步骤是可修改的，用于规模放大或规模缩小，这对于本领域技术人员是明显的。
本发明所提供的方法可用于生产和纯化大规模量的可溶性rHuPH20。本发明所提供的用于生产可溶性rHuPH20的方法可包括：a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物对生物反应器中的细胞培养基进行接种以产生细胞培养物，其中细胞含有150到300个拷贝的编码可溶性rHuPH20的核酸，所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物并且每100升细胞培养物接种大约1010-1011个细胞以及细胞在设定的温度进行培养；b)用含有足以提高细胞生长及峰值细胞密度并提高可溶性rHuPH20的合成的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、人胰岛素和酵母提取物的第一加料培养基(加料培养基)给所述细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；c)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及诱导细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第二加料培养基给所述细胞加料，其中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量相对于第二个步骤中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量是降低的，且酵母提取物的量相对于步骤b)中的酵母提取物的量是升高的，并且将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中，以及温度相对于步骤a)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度；d)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及提高细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第三加料培养基给所述细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量相对于步骤c)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量是降低的，而酵母提取物和丁酸钠的量相对于步骤c)中酵母提取物和丁酸钠的量是增加的，并且温度相对于步骤c)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度；e)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及提高细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第四加料培养基给所述细胞加料，其中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量相对于步骤d)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量是降低的，丁酸钠的量相对于步骤d)中丁酸钠的量是降低的，温度相对于步骤d)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度并且将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；f)培养所述细胞直至生存力跌落到低于至少或大约50％；g)获得该收获细胞培养液；以及h)将所述可溶性rHuPH20从所述收获细胞培养液中纯化。
可将所述收获细胞培养液在纯化前过滤。在某些实例中，步骤a)中的温度是37℃，步骤c)中的温度是36.5℃，步骤d)中的温度是36℃以及步骤d)中的温度是35.5℃。所述可溶性rHuPH20的纯化可由柱层析实现，如串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸盐柱层析和羟基磷灰石柱层析。
在一个实例中，生产可溶性rHuPH20的方法包括步骤：a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物对生物反应器中的细胞培养基进行接种以产生细胞培养物，其中该细胞含有150到300个拷贝的编码可溶性rHuPH20的核酸，所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物，该接种细胞的密度为或者约为4×105细胞/mL并且将该细胞在37℃培养；b)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、32mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、16.6g/L酵母提取物和33mg/L胰岛素的第一加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；c)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、16mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、33.4g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第二加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36.5℃；d)用含有或大约含有50g/L葡萄糖、10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50g/L酵母提取物和1.8g/L丁酸钠的第三加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36℃；e)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、6.6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第四加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36℃；f)继续培养该细胞直至生存力跌落到低于至少或者大约50％；g)获得所述收获细胞培养液；h)过滤所述收获细胞培养液；以及i)使用串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸柱层析及羟基磷灰石柱层析从所述收获细胞培养液中纯化rHuPH20。
在另一个实例中，生产可溶性rHuPH20的方法包括步骤：a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物对生物反应器中的细胞培养基进行接种以产生细胞培养物，其中该细胞含有150到300个拷贝的编码可溶性rHuPH20的核酸，所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物，该接种细胞的密度为或者约为4×105细胞/mL并且将该细胞在37℃培养；b)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、32mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、83.3g/L酵母提取物和33mg/L胰岛素的第一加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％或大约4％的体积加入到该培养物中；c)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、13mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、166.7g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第二加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％或大约4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36.5℃；d)用含有或大约含有50g/L葡萄糖、10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、250g/L酵母提取物和1.8g/L丁酸钠的第三加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％或大约4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36℃；e)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、6.7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、250g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第四加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％或大约4％的体积加入到该培养物中并且将温度降低至36℃；f)继续培养该细胞直至生存力跌落到低于至少或者大约50％；g)获得所述收获细胞培养液；h)过滤所述收获细胞培养液；以及i)使用串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸柱层析及羟基磷灰石柱层析从所述收获细胞培养液中纯化rHuPH20。
在某些实例中，在所述生物反应器中的细胞培养物的体积是或大约是200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000或3500升。在某些实例中，用本发明提供的方法每100L的细胞培养物所产生的可溶性rHuPH20的量是至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35或40克的可溶性rHuPH20。所述可溶性rHuPH20的比活性可以是至少或大约80000、100000、120000、140000、160000或180000单位/mg。编码可溶性rHuPH20的细胞在某些情况下可以是DG44CHO细胞。另外，所述rHuPH20可由SEQ ID NO：47所示的核酸编码。
本发明所提供的是含有可溶性rHuPH20的细胞培培养基，所述可溶性rHuPH20具有大于5000单位/mL的酶活性，如10,000、12,000、14,000、16,000、18,000、20,000、22,000或24,000单位/mL。本发明也提供含有可溶性rHuPH20的所收获的细胞培养液，所述可溶性rHuPH20具有大于5000单位/mL的酶活性，如10,000、12,000、14,000、16,000、18,000、20,000、22,000或24,000单位/mL。
发明详述
纲要
A.定义
B.概况
C.透明质酸酶
1.结构和功能
2.PH20
3.透明质酸酶的治疗用途
a.用作扩散剂
b.皮下注入中的用途
c.玻璃体切除术以及眼科病症和状况中的用途
d.基因治疗中的用途
e.美容用途
f.器官移植中的用途
g.癌症处理中的用途
h.脑中糖胺聚糖累积的处理中的用途
i.心血管疾病中糖胺聚糖累积的处理中的用途
j.肺部疾病中的用途
k.其它用途
D.表达透明质酸酶的细胞
a.3D35M细胞
b 2B2细胞
E.细胞培养物的扩增
F.蛋白生产
G.蛋白浓缩和缓冲液更换
H.纯化
1.串珠状交联琼脂糖柱
2.串珠状交联苯基取代琼脂糖柱
3.氨基苯硼酸盐柱
4.羟基磷灰石柱
6.病毒去除，蛋白浓缩和缓冲液更换
I.填充(Filling)
J.监控和测定
1.监控条件
2.监控可溶性rHuPH20生产
K.实施例
A.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的同样含义。贯穿本文全部公开中所提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网页以及其它公开的材料，除非另外注明，均通过引用将其全部内容并入本文。在本文的术语有多个定义的情况下，则由本节中的那些为主导。在援引URL或者其它此类标识符或地址的情况下，应理解的是此类标识符可以改变以及互联网上特定的信息可以出现和消失，但是等价的信息可以通过搜索互联网来找到。那里的援引证明了此类信息的可用性以及公共的传播。
如本文所用，透明质酸酶指降解透明质酸的酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，以及哺乳动物类型的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶也包括任何非人来源的，包括但不限于，鼠科、犬科、猫科、兔属、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙类、细菌、以及来任何自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的。用作示例的非人透明质酸酶包括，来自母牛的透明质酸酶(SEQIDNO：10)，来自小黄蜂的(SEQ ID NO：11和12)，来自蜜蜂的(SEQ ID NO：13)，来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO：14)，来自胡蜂的(SEQ ID NO：15)，来自小鼠的(SEQ ID NO：16-18，29)，来自猪的(SEQ ID NO：19-20)，来自大鼠的(SEQID NO：21-23，28)，来自兔的(SEQ ID NO：24)，来自绵羊的(SEQ ID NO：25)，来自猩猩的(SEQ ID NO：26)，来自食蟹猴的(SEQ ID NO：27)，来自豚鼠的(SEQ ID NO：30)，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的(SEQIDNO：31)，来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的(SEQ ID NO：32)，以及来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的(SEQ ID NO：33)。用作示例的人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO：34)，HYAL2(SEQ ID NO：35)，HYAL3(SEQ ID NO：36)，HYAL4(SEQ ID NO：37)，以及PH20(SEQ IDNO：1)。也包括在透明质酸酶中的是可溶性人PH20和可溶性rHuPH20。
提到的透明质酸酶包括前体透明质酸酶多肽和成熟的透明质酸酶多肽(如那些去除了信号序列的)，具有活性的其截短的形式，以及包括等位基因变体和种变体，剪接变体编码的变体和其它变体，包括与SEQ ID NO：1和10-37所示的前体多肽或其成熟的形式具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。例如，提到的透明质酸酶也包括SEQ IDNO：48-49所示的所述人PH20的前体多肽变体。透明质酸酶也包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含有化学或翻译后修饰的那些。此类修饰包括但不限于，聚乙二醇化(pegylation)、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化、以及其它本领域所知的多肽修饰。
如本文所用，可溶性人PH20或sHuPH20包括在C-末端缺乏全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合位点的成熟多肽从而在表达时，该多肽是可溶的。用作示例的sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO：4-9和45-46中任一个所示的氨基酸序列的成熟多肽。此用作示例的sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。用作示例的前体是SEQ ID NO：3和38-44所示的那些，其中每个都在氨基酸位置1-35含有35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽也包括那些在本文描述的生产和纯化的方法中或者之后降解的。
如本文所用，可溶性rHuPH20是指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达的人PH20的可溶形式。可溶性rHuPH20由包括所述信号序列以及在SEQ ID NO：47所示的氨基酸编码。也包括的是作为其等位基因变体或其它可溶性变体的DNA分子。编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌所述成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中产生时，在C-末端具有异质性使得该产物包括不同种的混合物，其可以各种丰度包括一种或多种的SEQ IDNO.4-9。相对应的等位基因变体和其它变体也包括在内，包括对应于SEQID NO：48-49所示的前体人PH20多肽的那些。其它的变体可以与任何SEQID NO.4具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，条件是它们保留透明质酸酶活性并且是可溶的。
如本文所用，“表达可溶性rHuPH20的细胞”是指表达可溶性rHuPH20的任何CHO细胞。作为示例的表达可溶性rHuPH20的细胞包括2B2和3D35M细胞。表达可溶性rHuPH20的细胞是其中引入了含有SEQ ID NO：55所示序列的核酸的CHO细胞。
如本文所用，透明质酸酶活性是指透明质酸酶多肽所展现的任何活性。此类活性可进行体内和/或体外的测试，并且包括但不限于，酶活性，如实现透明质酸的切割，充当扩散剂或分散剂以及抗原性的能力。透明质酸酶活性是指透明质酸酶多肽所展现的任何活性。
如本文所用，酶活性是指，由体外酶测定法所评估的，切断底物如透明质酸的透明质酸酶的活性。用于确定透明质酸酶如可溶性rHuPH20的酶活性的体外测定法，是本领域所熟知的并在本文进行了描述。用于示例的测定法包括下述的微浑浊(微浑浊度)测定法(参见例如实施例9以及I节)，其通过探测当未被切断的透明质酸结合血清白蛋白时所形成的不可溶沉淀来间接地测定透明质酸酶对透明质酸的切割。
如本文所用，关于可溶性rHuPH20的比活性是相对于可溶性rHuPH20的量的酶活性。比活性是通过用酶活性(单位/mL)除以蛋白浓度(mg/mL)来计算的。
如本文所用，“展现至少一种活性”或者“保留至少一种活性”是指变体可溶性rHuPH20所展现的活性在相同条件下与SEQ ID NO：4-9所示的任何可溶性rHuPH20相比较。典型地来说，保留或展现SEQ ID NO：4-9所示的可溶性rHuPH20的至少一种活性的变体可溶性rHuPH20保留或大约保留0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％，60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的SEQ ID NO：4-9所示的可溶性rHuPH20的活性。用作示例的活性包括但不限于，透明质酸酶活性和酶活性。
如本文所用，串珠状交联琼脂糖柱层析是指使用填充了串珠状交联琼脂糖的柱的层析。用作示例的串珠状交联琼脂糖是Q SepharoseTM。
如本文所用，串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析是指使用填充了串珠状交联苯基取代琼脂糖的柱的层析。用作示例的串珠状交联苯基取代琼脂糖是Phenyl SepharoseTM。
如本文所用，氨基苯硼酸柱层析是指使用填充了氨基苯硼酸琼脂糖的柱的层析。
如本文所用，羟基磷灰石柱层析是指使用填充了羟基磷灰石的柱的层析。
如本文所用，所收获的细胞培养液或收获细胞培养液(HCCF)是指从生物反应器收获细胞并将细胞培养基与细胞、细胞碎片和其它集合物分离之后所获得的液体。可将从生物反应器收获的细胞培养物过滤以使该培养澄清，去除细胞、细胞碎片和其它集合物以留下所收获的细胞培养液。
如本文所用，细胞密度是指在给定体积的培养基中细胞的数目。
如本文所用，细胞培养物或培养物是指在适于保持细胞生存力或使细胞生长的条件下将细胞群体悬浮于培养基中。
如本文所用，培养基、细胞培养基或细胞培养培养基是指含有足够促进培养物中细胞生长的养分的溶液。典型地来说，这些溶液含有必需的和非必需的氨基酸，维生素，能量来源，脂质和/或微量元素。培养基也可含有另外的添加物，如激素、生长因子和生长抑制剂。包括了细胞培养基的参考。
如本文所用，天然存在的α-氨基酸残基是在自然界发现的那20个α-氨基酸，其通过加载的tRNA分子与其同族mRNA人密码子特异性识别而并入蛋白。
如本文所用，当“足以提高……的量”涉及提高参数如细胞生长速率、峰值细胞密度、蛋白合成或者细胞周期停滞的物质时，其是指与该物质不存在时所观察的相比在这些参数之一中达到升高的物质的量。可在物质存在和不存在的时候对这些参数进行评估，从而可以确定与该物质不存在时相比提高该参数(如细胞生长速率、峰值细胞密度、蛋白合成或细胞周期停滞)的物质的量。与该物质不存在时的所述生长速率、峰值细胞密度、蛋白合成或细胞周期停滞相比，在该物质存在时的所述生长速率、峰值细胞密度、蛋白合成或细胞周期停滞可提高或大约提高0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当涉及探针或引物时(所述探针或引物是任选经标记的，例如用可探测的标记如荧光或放射性标记)，单链分子是被涵盖的。此类分子典型地来说是具有一种长度，从而在用于探测或引导文库时使得其靶标是统计上独特的或者具有低拷贝数的(典型地少于5，一般少于3)。一般地，探针或引物含有至少14、16或30个连续核苷酸的序列，所述序列与感兴趣的基因互补或相同。探针和引物长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度从2到40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各种氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写(表1)来识别。在各种核酸片段中出现的核苷酸以本领域常规使用的标准单字母命名法进行命名。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧基的有机化合物。多肽含有两个或以上的氨基酸。对于本文的目的，氨基酸包括那20个天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即，其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键处的化学消化(水解)所形成的氨基酸。本文所描述的氨基酸残基假定处于“L”异构体形式。指定为处于“D”异构体形式的残基，可由任何L-氨基酸取代，条件是所述多肽保留所期望的功能性质。NH2是指出现在多肽的氨基端的自由氨基团。COOH是指出现在多肽的羧基端的自由羧基团。与由J.Biol.Chem.，243：3552-3559(1969)所描述的并被37C.F.R.§§1.821-1.822采用的标准多肽命名法一致，氨基酸的缩写在表1中显示：
表1-对照表
应注意本文用化学式所表示的所有氨基酸残基的序列在常规的氨基端到羧基端的方向中具有从左到右的定向。另外，术语“氨基酸残基”广泛的定义为包括对照表(表1)中所列的氨基酸以及经修饰的和稀有氨基酸，如37C.F.R.§§1.821-1.822中提到的那些，也通过引用将其并入本文作参考。此外，应注意在氨基酸残基序列的开头或结尾的破折号表示肽键，其连接一个或多个氨基酸残基的进一步的序列，或者连接氨基端的基团如NH2或羧基端的基团如COOH。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指在多肽中出现的那20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指具有类似于天然氨基酸的结构有机化合物但其已经结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然存在的氨基酸因而包括，例如除了那20个天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于，氨基酸的D-立体异构体。用于示例的非天然氨基酸在本文中描述并且是本领域技术人员已知的。
如本文所用，DNA构建物是单链或双链的，线状或环状的DNA分子，其含有以自然界未发现的方式结合以及并列的DNA区段。DNA构建物作为人操控的结果存在，并包括受操控的分子的克隆和其它拷贝。
如本文所用，两个蛋白或核酸之间的″相似性″是指蛋白的氨基酸序列之间或核酸的核苷酸序列之间的关联性。相似性可以基于残基序列及其中所含残基的相同性和/或同源性的程度。用于评估蛋白核酸之间相似性程度的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，在评估序列相似性的一个方法中，将两个氨基酸或核苷酸序列以产生序列间最大水平相同性的方式进行比对。″相同性″是指在一定程度上氨基酸或核苷酸序列是不变的。氨基酸序列的比对以及在某种程度上核苷酸序列的比对，也可以考虑氨基酸(或核苷酸)中保守性差异和/或经常性取代的因素。保守性差异是那些保持所涉及的残基的物理化学性质的差异。比对可以是全局性的(对于序列全长的所比较序列的比对，并且包括所有残基)或局部性的(只包括最相似区域的一部分序列的比对)。
″相同性″本身具有众所周知的含义并可以用已公开的技术来计算(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。存在许多用于测定两个多核苷酸或多肽之间相同性的方法，术语“相同性”是技术人员所熟知的(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文所用，同源的(关于核酸和/或氨基酸序列)意思是约大于或等于25％的序列同源性，典型地为大于或等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列同源性；如果必要的话可以指定准确的百分比。用于本文时术语″同源性″和″相同性″经常是可互换使用的，除非另有说明。为确定同源性或相同性的百分比，一般将序列进行比对以获得最高级别的匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。对于序列同源性，保守氨基酸的数目由标准比对算法程序来确定，并且可以用每个提供者所设立的默认空位罚分(gap penalties)来使用。基本上同源的核酸分子将沿所感兴趣的核酸的长度以中等的严格性或高度的严格性来杂交。也可预期的是在杂交的核酸分子中的密码子位置含有简并密码子的核酸分子。
可使用已知的计算机算法如″FASTA″程序来确定任意两个分子是否至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％″相同″或″同源″的核苷酸序列或氨基酸序列，例如使用如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中的默认参数(其它成熟包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.，et al.，JMolec Biol 215：403(1990))；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，andCarillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，National Center forBiotechnology Information database的BLAST功能可用于确定同源性。其它商业或公开可用的程序包括，DNAStar″MegAlign″程序(Madison，WI)以及University of WisconsinGenetics Computer Group(UWG)″Gap″程序(Madison WI)。蛋白和/或核酸分子的百分比同源性或相同性可通过，例如使用GAP计算机程序比较序列信息来进行确定(例如，Needlemanet al.(1970)J.Mol.Biol.48：443，由Smith and Waterman改进(1981)Adv.Appl.Math.2：482)。简短来说，GAP程序将相同性定义为经比对相似符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短那个的符号总数。用于GAP程序的默认参数可包括：(1)一元判断矩阵(comparison matrix)(含有数值1用于相同以及0用于非相同)，以及加权的判断矩阵，如Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745，Schwartz and Dayhoff，eds.，ATLASOF PROTEIN SEQUENCE AND STR UCTURE，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)对每个空位3.0的罚分以及对空位中的每个符号额外的0.10的罚分；以及(3)对末尾的空位不罚分。
因此，如本文所用，术语″相同性″或″同源性″代表了测试多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的对比。如本文所用，术语至少″90％相同″是指相对于参考核酸或多肽的氨基酸序列相同的百分比从90到99.99。90％或更高水平的相同性表明，假设用于示例的长度100个氨基酸的测试和参考多肽进行对比，测试多肽中不超过10％(即，100个中的10个)的氨基酸与参考多肽中的不同。在测试和参考多核苷酸之间可进行类似的对比。此类差异可由随机分布于多肽全长的点突变来代表或者它们可以群聚在长度变化的一个或多个位置，所述变化的长度可长至最大允许的值，例如10/100的氨基酸差异(大约90％的相同性)。差异定义为核酸或氨基酸的取代、***或缺失。在高于大约85-90％同源性或相同性的水平，结果应当不取决于程序和空位参数的设定；此类高水平的相同性可轻易地进行评估，通常通过手工比对而不依赖软件。
如本文所用，经比对的序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)来对核苷酸或氨基酸序列中相应的位置进行比对。典型地是将由50％或更高的相同性相关联的两个或更多序列进行比对。序列的比对集合是指在相对应位置进行比对的两个或更多的序列，以及可以包括比对衍生自RNA的序列，如EST和其它cDNA，与基因组DNA序列进行比对。
如本文所用，“引物”是指核酸分子，其可以在适当的条件下(例如，存在四种不同的三磷酸核苷以及存在聚合剂如DNA聚合酶、RNA聚合酶或反转录酶)在适当的缓冲液和适宜的温度中，充当模板引导的DNA合成的起始点。将受到青睐的是某种核酸分子可以充当“探针”以及“引物”。不过引物具有3’羟基用于延伸。引物可以用于各种方法中，包括，例如聚合酶链反应(PCR)、反转录(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄(panhandle)PCR、捕获(capture)PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导PCR以及其它扩增方案。
如本文所用，等位基因变体或等位基因变异是用来参考基因的两个或更多的选择性的形式中任意的形式，所述选择性的形式占据相同的染色***点。等位基因变异通过突变天然发生，并可导致种群中的表型多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于标注基因的等位基因变体所编码的蛋白。典型地来说，基因的参考形式编码来自种群或物种的单个参考成员的蛋白的野生形式和/或优势形式。典型地来说，等位基因变体，包括物种之间的变体，与来自相同物种的野生和/或优势形式具有至少80％、90％或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取决于该基因以及比较是否是物种之间或者物种之内的。一般来说，物种之内的等位基因变体与野生和/或优势形式具有至少约80％、85％、90％或95％甚至更高的相同性，包括与多肽的野生和/或优势形式具有96％、97％、98％、99％或更高的相同性。本文所提及的等位基因变体一般是指同一物种的成员之间的蛋白中的变异。
如本文所用，“等位基因”，其在本文中可与“等位基因变体”相互替换使用，是指基因或其部分的选择性的形式。等位基因在同源染色体上占据相同的位点或位置。当对象具有基因的两个相同的等位基因时，该对象即被称作是对于该基因或等位基因是纯合的。当对象具有基因的两个不同的等位基因时，该对象即被称作是对于该基因或等位基因是杂合的。特定基因的等位基因可在单个核苷酸或若干个核苷酸上彼此不同，以及可以包括核苷酸取代、缺失和***。基因的等位基因也可以是含有突变的基因的形式。
如本文所用，物种变体是指不同物种之间的多肽中的变体，包括不同的哺乳动物物种，如小鼠和人。
如本文所用，剪接变体是指基因组DNA初级转录的分化过程所产生的变体，所述分化过程导致超过一种类型的mRNA。
如本文所用，修饰是关于多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，并分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、***和替代。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，如通过使用重组DNA的方法学。
如本文所用，术语启动子意指含有基因的DNA序列中用于RNA聚合酶结合以及转录起始的部分。启动子序列通常，但并不总是，在基因的5’非编码区发现。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白或者其生物活性部分是基本上没有细胞材料或来自该蛋白所源于的细胞或组织的其它污染蛋白，或者在经化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品。如果制备品表现为没有用标准分析方法可轻易探测的杂质则其可被确定为基本上纯净，所述标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳以及高效液相层析(HPLC)，由本领域技术人员使用来评估此纯度，或者足够纯从而进一步的纯化将不会在可探测的水平上改变该物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。用于化合物的纯化以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员所熟知的。然而基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步的纯化可能会提高该化合物的比活性。
术语基本上没有细胞材料包括蛋白与细胞的细胞组分分离的蛋白制备品，其中该蛋白从所述细胞中分离或者在该细胞中重组产生。在一个实施方案中，术语基本上没有细胞材料包括含有少于约30％(干重)非酶蛋白(本文中也称作污染蛋白)的酶蛋白的制备品，一般地少于约20％的非酶蛋白或者少于约10％的非酶蛋白或者少于约5％的非酶蛋白。当该酶蛋白是重组产生时，其也基本上没有培养基，即，培养基在该酶蛋白的制备品中所占体积少于或者大约少于20％、10％或5％。
如本文所用，术语基本上没有化学前体或其它化学品包括其中蛋白与涉及该蛋白合成的化学前体或其它化学品分离的酶蛋白制备品。该术语包括具有少于约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非酶化学品或化合物的酶蛋白制备品。
如本文所用，合成的，例如关于合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽，是指由重组方法和/或由化学合成的方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，表达载体包括能够表达可操纵地与调节序列连接的DNA的载体，所述调节序列如启动区，其能够引起此DNA片段的表达。此额外的区段可包括启动子和终止子序列，以及任选地可包括一个或多个复制起点，一种或多种可选择的表示物，增强子，多腺苷酸化信号，以及类似的。表达载体一般衍生自质粒或病毒DNA，或者可以同时含有两者的元件。因而，表达载体是指重组的DNA或RAN构建物，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，其在被引入适当的宿主细胞时，导致所克隆的DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员所熟知的并且包括那些可在真核细胞和/或原核细胞中复制的以及那些保持游离的或者那些并入宿主细胞基因组的。
如本文所用，载体也包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是可操纵的与外源基因连接以将该外源基因转移(作为运载体或穿梭)至细胞内的工程化的病毒。
如本文所用的术语评估是想要包括定性和定量的测定，其是从获得样品中出现的蛋白酶或其结构域活性绝对值的意义上来说的，以及也是从获得指数、比率、百分比、图像、或其它表明活性水平的数值的意义上来说的。评估可以是直接的或者间接的，并且实际探测的化学物种类当然并不必需是蛋白水解的产物本身，而可以例如是其衍生物或其它另外的物质。例如，对补体蛋白切割产物的探测，如通过SDS-PAGE以及用考马斯蓝对蛋白染色。
如本文所用，组合物是指任意混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或者其任意组合。如本文所用，试剂盒是任选地包括其它元件的封装式的组合，所述其它元件例如额外的药剂以及用于使用该组合或其元件的说明。
如本文所用，″疾病或病症″是指生物体中的由以下原因或状况所导致的病理状况，所述原因或状况包括但不限于，感染、获得性状况、遗传状况，并且特征在于可鉴定的症状。
如本文所用，″处理″具有疾病或状况的对象意指该对象的症状被部分或完全缓解，或在处理后保持稳定。因此处理涵盖预防、治疗和/或治愈。预防是指对潜在疾病的防止和/或对症状恶化或疾病进展的防止。处理也涵盖经修饰的干扰素和本发明提供的组合物的任何药物用途。
如本文所用，药物学有效地药剂包括任何治疗性药剂生物活性药剂，包括但不限于，例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规的治疗性药物包括小分子药物和治疗性蛋白。
如本文所用，处理意指其中的状况、病症或疾病或者其它适应症的症状被改善了或者有益地改变了的任何方式。
如本文所用，患者是指人类对象。
如本文所用，有效的量是用于防止、治愈、改善、控制或部分控制疾病或病症的症状所必需的治疗性药剂的量。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类包括人、大猩猩和猴；啮齿动物如小鼠和大鼠；禽类如鸡；反刍动物如山羊、母牛、鹿、绵羊；羊、如猪和其它动物。非人动物排除人来作为预期的动物。本发明所提供的透明质酸酶来自任何开源，动物、植物、原核生物以及真菌。大多数酶是动物来源的，包括哺乳动物来源。
如本文所用，对照是指与测试样品基本上等同的样品，只是其并未用测试参数进行处理，或者，如果是血浆样品，其可以来自正常的未受感兴趣的状况影响的捐献者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，单数形式的″一″以及″该″包括其复数的指示对象，除非上下文有清楚地另外指明。因此，例如提到化合物包含″胞外结构域”，其包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以表示为“大约”一个具体的数值或范围。大约也包括该确切的量。因此“大约5mM”的意思是“大约5mM”以及“5mM”。
如本文所用，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写除非另有指定，均参照其通常用法、公认的缩写、或者IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(参见，(1972)Biochem.11：1726)。
B.概况
本发明所提供的是用于大规模生产可溶性透明质酸酶的方法，所述可溶性透明质酸酶如可溶性人透明质酸酶，包括可溶性人PH20(sHuPH20)，诸如，例如可溶性rHuPH20。该方法典型地是使用生物反应器来培养产生该可溶性透明质酸酶的细胞，如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)。用于示例的此类细胞是2B2细胞，其产生可溶性rHuPH20。该生物反应器中细胞培养物的体范围可以是从1L到5000L或更多，但典型来说是或者大约是200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000或3500升。在对生物反应器进行接种前，将细胞通过一系列提升的细胞培养物体积进行扩增以产生所需的细胞数目用于该生物反应器的播种。典型来说，将生物反应器中的细胞以105至106细胞/mL进行播种，但可以以更多或更少来进行播种。接着将该细胞在生物反应器中温育7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或更多天。
在此温育期间，将加料培养基加入到细胞培养物中以供给额外的养分和添加物。用于示例的可包括在加料培养基中的添加物或养分包括但不限于，葡萄糖、谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素以及丁酸钠。所加入的添加物的类型和量可影响细胞生长和蛋白产生。例如，可将胰岛素和谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物掺入到被加入到细胞培养物的第一加料培养基中以提高细胞生长和峰值细胞密度。后来的加料培养基可设计为促进蛋白产生多过细胞生长。可将添加物如胰岛素排除或减少其量，同样的操作也可对谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺进行。相反，可提高增强蛋白合成的添加物如酵母提取物的量。另外，增强细胞周期停滞并因此提高蛋白产生的添加物也可包括在内。用于例证的此类添加物是丁酸钠。
在生物反应器中的蛋白产生之后，收获细胞，并且在纯化过程起始前将可溶性透明质酸酶，如被分泌到细胞培养基中的可溶性rHuPH20，进行浓缩。继而使用一系列的纯化步骤将该可溶性透明质酸酶从浓缩的蛋白溶液中进行纯化。用于本文所用方法的纯化方法的示例是离子交换层析、疏水作用层析和亲和层析的组合。继而对纯化的蛋白进行浓缩和渗滤。
利用本文所述的方法，每100L的细胞培养物产生介于约0.5-50克之间的可溶性透明质酸酶，如可溶性rHuPH20。在某些实例中，每100L培养物所产生的可溶性rHuPH20是或大约是1、2、3、4、5、10、15、20、30、或40克或者更多。在某些实例中，纯化之后的可溶性透明质酸酶的产量范围可以介于或者大约介于纯化前所产生的量的10％至50％之间。例如，纯化后的产量可以是或大约是纯化前所产生的量的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。一般地，用本文的方法所生产的可溶性rHuPH20的比活性至少或大约是80000、100000、120000、140000、160000或180000单位/mg。
C.透明质酸酶
透明质酸酶是降解透明质酸(也知为乙酰透明质酸或透明质酸盐)的酶家族，透明质酸是胞外基质的必需组分以及间质屏障的主要成分通过催化透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的黏度，由此提高组织的通透性。这样，透明质酸酶被用作例如与其它药剂、药物和蛋白联用的扩散或分散剂以增强它们的分散和传递。
1.透明质酸酶的结构与功能
有三个普遍种类的透明质酸酶；哺乳动物透明质酸酶、细菌透明质酸酶和来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶。哺乳动物类型的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，其将透明质酸的β1→4糖苷键水解形成各种的寡糖长度如四糖和多聚己糖。他们具有水解和转糖苷酶活性并可以降解透明质酸和硫酸软骨素，如C4-S和C6-S。这一类型的透明质酸酶包括但不限于，来自母牛(SEQ ID NO：10)、小黄蜂(SEQ IDNO：11和12)、蜜蜂(SEQ ID NO：13)、白脸大黄蜂(SEQ ID NO：14)、胡蜂(SEQ IDNO：15)、小鼠(SEQ ID NO：16-18，29)、猪(SEQ ID NO：19-20)、大鼠(SEQ IDNO：21-23，228)、兔(SEQ IDNO：24)、绵羊(SEQ ID NO：25)、猩猩(SEQ IDNO：26)、食蟹猴(SEQ ID NO：27)、豚鼠(SEQ IDNO：30)的透明质酸酶以及人透明质酸酶。
人的基因组中有6个类透明质酸酶基因：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，而HYAL3(SEQ IDNO：36)未显示出具有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4(前体多肽在SEQ ID NO：37中列出)是软骨素酶并展现出很少的针对透明质酸的活性。HYAL1(前体多肽在SEQ ID NO：34中列出)是原型的酸活性酶而PH20(前体多肽在SEQ ID NO：1中列出)是原型的中性活性酶。酸活性透明质酸酶如HYAL1和HYAL2(前体多肽在SEQ ID NO：35中列出)在中性pH(即pH 7)一般缺乏催化活性。例如，HYAL1在体外超过pH4.5时具有很少的催化活性(Frost et al.(1997)Anal Biochemistry 251：263-269)。HYAL2是在体外具有非常低比活性的酸活性酶。类透明质酸酶的酶也可由一般通过糖基磷脂酰肌醇锚锁定在质膜上的那些来进行鉴别，如HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova，et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100(8)：4580-5)，以及一般可溶的那些如人HYAL1(Frost et al，(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1)：10-5)。通过催化间质屏障的主要成分透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的黏度，由此提高组织的通透性。其也被显示了展现出抗癌以及抗癌发生的活性。
某些透明质酸酶的N-联糖基化可对其催化活性和稳定性非常重要。当改变修饰糖蛋白的聚糖的类型时，可对蛋白的抗原性、结构折叠、溶解性以及稳定性产生剧烈的影响，许多酶并不被认为是需要糖基化来得到最佳酶活性的。透明质酸酶因此在这一点上是独特的，其中N-联糖基化的去除可导致透明质酸酶活性几乎完全的失活。对于此类透明质酸，N-联聚糖的存在对于产生有活性的酶是至关重要的。
SEQ ID NO：1中示出了在人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490的7个潜在的N-联糖基化位点。二硫键在半胱氨酸C60和C351之间以及在C224和C238之间形成从而形成核心的透明质酸酶结构域。然而，在羧基端需要另外的半胱氨酸用于中性酶催化活性，从而使SEQ IDNO：1的氨基酸26到464含有最低活性的人PH20透明质酸酶结构域。因而，对于恰当的透明质酸酶活性并不需要N-联糖基化位点N490。
N-联寡糖分属若干个主要类型(寡甘露糖、复合物、杂化物、硫酸化的)，其中所有的都具有通过Asn残基的氨基氮所连接的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心，所述Asn残基属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)。对于凝固蛋白C在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化已有报道。在某些情况下，透明质酸酶可既含有N-糖苷键也含有O-糖苷键。例如，rHuPH20(以本文所述方法产生)具有O-联寡糖以及N-联寡糖。
本文所述方法提供了用于人PH20透明质酸酶制备品的大量可溶性制备品的生产和纯化的过程。
2.PH20
人PH20(也知为***表面蛋白PH20)，如上面所记录的，是原型中性活性酶，其一般通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚被锁定在质膜上。其自然地涉及精卵黏附并通过消化透明质酸来辅助***对卵丘细胞(cumulus cell)层的穿入。PH20的mRNA转录物通常被翻译而产生509氨基酸的前体蛋白，其在N-端含有35个氨基酸的信号序列(氨基酸残基位置1-35)。成熟的PH20多肽因此是474个氨基酸的多肽，其氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。
人PH20的可溶形式(sHuPH20)可使用本文所述的方法产生和纯化。sHuPH20的产生在相关美国专利申请No.10/795,095、11/065,716和11/238,171(在这些申请中也称作sHASEGP或rHuPH20)中，以及在下文的实施例1和4中有描述。可溶形式是通过对编码成熟PH20多肽的C-端平截的核酸进行表达而产生的，所述PH20多肽的C-端平截缺乏GPI-结合位点。人PH20的可溶形式包括可溶性rHuPH20，其是使用本发明提供的方法进行产生和纯化的
3.透明质酸酶的治疗用途
各种形式的透明质酸酶已被制备和批准用于人的治疗用途。例如，源于动物的透明质酸酶制备品包括纯化的羊睾丸透明质酸酶(ISTAPharmaceuticals)和牛睾丸透明质酸酶(AmphastarPharmaceuticals)。(HalozymeTherapeutics)是人重组透明质酸酶，其通过经遗传工程修改的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生，所述CHO细胞含有编码可溶性rHuPH20的核酸。经批准的对于透明质酸酶的治疗用途包括作为佐剂使用以提高用于皮下注入(皮下液体施用)的其它所注射的药物的吸收和分散，以及在皮下尿路造影术(subcutaneous urography)中作为助剂用以改善放射造影剂(radiopaque agent)的再吸收。在这些适应症之外，透明质酸酶包括sHuPH20，可作为治疗或美容药剂用于处理另外的疾病和状况。
如上面所注明的，透明质酸酶是扩散或散播物质，其通过透明质酸的水解来改***的通透性，所述透明质酸是在***以及某些特化的组织如脐带和玻璃体液的细胞间基础物质中发现的多糖。当没有扩散因子存在时，皮下注射的材料如药物、蛋白、肽和核酸扩散的非常缓慢。而与透明质酸酶共注射可引起快速的扩散。散播速率与酶的量成比例，而散播的程度与溶液的体积成比例。所注射的药物和药剂的吸收和分散可通过在注射液中加入10-1000单位的透明质酸酶而增强。在一些实例中，加入了150U透明质酸酶。透明质酸酶具有多种用途，包括其作为扩散剂的用途以及此外的用途。透明质酸酶通常用于，例如在眼部手术前的局部麻醉中用于眼球周围阻滞(block)。所述酶的存在阻止了额外的阻滞的需要并且加快了运动不能(akinesia)(眼睛运动的丧失)的发作时间。眼球周围和眼球囊下(sub-Tenon′s)的阻滞是透明质酸酶在眼科操作中最普遍的应用。透明质酸酶也可在整容手术中促进运动不能，如眼睑成形术(blepharoplasties)以及面部整修(facelifts)。用于示例的透明质酸酶的治疗和美容用途在下文进行描述。
a.用作扩散剂
用本文所述的方法产生的透明质酸酶，如可溶性rHuPH20可用于促进或增强药剂和分子向任意的各种哺乳动物体内组织的传递。其可用于帮助散播并因此促进小分子药剂以及较大分子药剂如蛋白、核酸和核糖核酸的传递，还有可含有各组分的组合的大分子组合物的传递，所述各组分包括但不限于核酸、蛋白、碳水化合物、脂质、基于脂质的分子和药物。例如，当胞间隙之前曾经或者巧合地暴露于透明质酸酶时，则直径范围为约10nm到约500nm的分子和大分子复合物可在传递穿过胞间隙中展现出显著地增加(参见例如美国专利申请No.10/795,095、11/065,716和11/238,171)。
可与透明质酸酶一起施用的药物、治疗和美容药剂以及分子的例子包括，但不限于，麻醉剂；抗代谢物，抗肿瘤和其它抗癌剂；抗病毒物；抗感染物，包括抗菌物和其它抗生素，抗真菌物和其它抗感染物；免疫调节剂；类固醇和非类固醇的抗炎物；β-受体阻滞剂；拟交感神经药物；二十二酸类(ducosanoids)，***素和***素类似物；缩瞳药，胆碱功能药物和抗胆碱酯酶；抗变应性药物和解充血药物；激素药剂；生长因子；免疫抑制剂；疫苗和类毒素；免疫血清；抗生素；以及其任意的组合。在一个实例中，将可溶性rHuPH20与组织蛋白酶如组织蛋白酶L一起施用。
b.皮下注入中的用途
皮下注入，将液体和电解质灌注到皮肤的皮下组织内，是有用且简单的输液技术，适用于至中度脱水的成年患者，特别是老年人。虽然被认为安全且有效，但其最常发生的副作用是轻度的皮下水肿，可通过局部按摩或全身性利尿剂来处理。可以在24小时的期间内于两个分别的位点灌注大约3L。常用的灌注位点包括胸部、腹部、大腿和上臂。用于皮下注入的液体包括，例如，生理盐水，半生理盐水，具有盐水和5％葡萄糖的葡萄糖。也可将氯化钾加入该溶液。在该溶液中加入透明质酸酶可增强液体吸收并提高整体的施用速率。
c.玻璃体切除术以及眼科病症和状况中的用途
透明质酸酶可用在玻璃体切除术期间使视网膜的脱离或撕裂(tearing)最小化。这可引起例如，在去除玻璃提前使玻璃体变得与视网膜不连接或″未嵌入(disinserted)″。玻璃体的此种未嵌入或不连接可在玻璃体被去除时使得视网膜将发生进一步脱离或撕裂的可能性最小化。
透明质酸酶可用于多种眼部的应用，包括U.S.Pat.No.5,292,509中描述的玻璃体切除术助剂的应用。对于高度纯化的透明质酸酶的应用，诸如，例如由本文所述方法产生和纯化的可溶性rHuPH20，对于眼内的操作而言是优选的以使得免疫原型和毒性最小化。在一些实例中，聚乙二醇化的透明质酸酶可用于延长在玻璃体内的停留以及阻止局部的摄取。
透明质酸酶可用于处理和/或阻止眼部病症，这是通过，例如阻止新血管形成以及提高从玻璃体中清除对视网膜有毒材料的速率。透明质酸酶可以按照有效地使眼睛的玻璃体液液化却不引起对眼睛的毒性损伤的量来进行施用。玻璃体液的液化提高了从玻璃体室的液体交换的速率。这一在交换中的提高去除了污染材料，所述污染材料的存在可引起眼部和视网膜的损伤。
透明质酸酶也可用于减少手术后压力。透明质酸主要作为在白内障和眼内晶状体手术操作期间的间隔物而被用于眼睛中。其也用于其它的眼睛手术操作中如青光眼，玻璃体和视网膜手术以及在角膜移植中。在手术后白内障患者中通常发生的副作用是显著地很早的，并且有时延长的，眼内压的升高。此种状况有时会很严重，特别是在具有青光眼性的视神经盘病变的患者中。透明质酸酶可与透明质酸一起在手术前共施用于眼睛以减少眼睛肿的手术后压力。透明质酸酶按照有效降低眼内压至手术前水平的量来施用，其对眼内压的降低是通过分解透明质酸并且不降低其手术期间的效用也不在患者中引起副作用(U.S.Patent No.6,745,776)。
透明质酸酶也可施用于有青光眼的患者以从小梁网中去除糖胺聚糖并减少眼内压；以及可应用于玻璃体以促进对玻璃体出血(即血液外渗进入玻璃体)的解决，其可与一些状况关联发生如糖尿病视网膜病、视网膜新血管形成、视网膜血管闭塞、晚期玻璃体脱离、视网膜撕裂、眼外伤以及类似的。典型地解决起来很慢的玻璃体出血的出现，可延迟操作、使操作复杂化或阻止操作，所述操作需要使视网膜通过玻璃体而被成像以用于诊断和/或处理操作，如激光凝固以及类似的，其经常是用于诸如增生性糖尿病视网膜病等状况的初级处理。
d.基因治疗中的用途
大部分基因传递的运载体在体内的功效并不与体外所观察的效用相符合。糖胺聚糖可阻碍DNA和病毒载体向许多细胞类型内的转移和散播。此类胞外基质材料的水平可在相当程度上阻碍该过程。透明质酸酶的施用可在胞外基质中打开通道，从而增强基因治疗的传递。例如，透明质酸酶可与胶原酶一起施用以帮助DNA在体内的转导(Dubensky et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81(23)：7529-33)。透明质酸酶也可增强使用腺伴随病毒的基因治疗(Favre et al，(2000)Gene Therapy 7(16)：1417-20)。在透明质酸酶的施用后打开的通道其大小典型地增强小分子的散播如反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及DNA复合物(以及其它感兴趣的治疗性和药物剂)。然而该孔并没有大到可以促进细胞的离位和运动。
在一些实例中，可对病毒进行工程化修改以表达透明质酸酶来帮助其在靶组织中的复制和扩散。该靶组织可以是，例如癌组织从而该病毒能够在肿瘤中选择性的复制。该病毒也可是非胞溶病毒其中该病毒在组织特异性启动子下选择性的复制。当病毒复制时，透明质酸酶与病毒基因的共表达可帮助该病毒在胞内的扩散。
e.美容用途
透明质酸酶可被施用以去除涉及脂肪团累积的糖胺聚糖以及促进淋巴流动。在一些实例中，人透明质酸酶如例如，可溶性rHuPH20，用于脂肪团的处理。透明质酸酶的施用可通过重复地皮下注射，以软膏或乳剂的形式通过经皮传递或者通过可注射的缓释配制品的使用以促进糖胺聚糖的持续降解并阻止其返回。
透明质酸酶也可用于处理诸如“猪皮”水肿或“橘皮”水肿等的状况。透明质酸酶可实现对长的黏多糖链的解聚作用，所述长的黏多糖链可在真皮中累积并且其通过对有机液体散播的毛细管压缩(capillary compression)而成为结合水以及慢化(slowing)的保持的原因，所述有机液体消除代谢废物。此种与脂细胞中的脂肪过载相关的水和废物的保持，构成了典型的″猪皮″水肿或″橘皮水肿。解聚作用可将长链的黏多糖截断成较短的链，导致结合水和废物的消除以及静脉和淋巴循环的恢复，以局部水肿的消失告终。
f.器官移植中的用途
器官中的透明质酸含量可随着炎症而增加。从来自不同器官的组织中观察到升高的透明质酸浓度，所述器官的特征在于炎性免疫损伤如齿槽炎(Nettelbladt et al.(1991)Am.Rev.Resp.Dis.139：759-762)以及心肌梗塞(Waldenstrom et al.(1991)J.Clin.Invest.88(5)：1622-1628)。其它例子包括肾移植(Ha′llgren et al.(1990)J.Exp.Med.171：2063-2076；Wells et al.(1990)Transplantation 50：240-243)、小肠移植(Wallander et al.(1993)Transplant.Int.6：133-137)或心移植(Haellgren et al.(1990)J Clin Invest 185：668-673)后的异体排斥；或者源于病毒的心肌炎症(Waldenstrdm et al.(1993)Eur.J.Clin.Invest.23：277-282)。与器官移植相关联的间质水肿的出现在移植手术领域构成了严重的问题。具有间质水肿的移植物可膨大至某程度使得功能暂时性丧失。在一些情况下，该膨大可引起肾脏的破坏，导致大出血。透明质酸酶可用于降解器官移植物中累积的糖胺聚糖。此类糖胺聚糖的去除促进了从移植物中的水的去除并因而增强了器官功能。
g.癌症处理中的用途
透明质酸酶具有直接的防癌作用。透明质酸酶阻止了移植到小鼠中的肿瘤的生长(De Maeyer et al.，(1992)Int.J.Cancer 51：657-660)以及抑制暴露于致癌剂的肿瘤形成(Pawlowski et al.(1979)Int.J.Cancer 23：105-109)。透明质酸酶是脑癌的处理中唯一有效的治疗性药剂(神经胶质瘤)(WO198802261)。在这些作用之外，透明质酸酶也可用于增强化疗剂向实体瘤内的渗透。它们可与抗癌剂一起进行瘤内注射或静脉注射用于弥散性癌症或难以接触的肿瘤。抗癌剂可以是化疗剂、抗体、肽或者基因治疗载体、病毒或DNA。另外，透明质酸酶可用于征集肿瘤细胞进入循环库，该循环库用于在获得多种药物抗性的先前的化学耐受肿瘤中的致敏作用(St Croix et al.，(1998)Cancer Lett September 131(1)：35-44)。透明质酸酶如例如可溶性rHuPH20，也可增强生物制剂的传递如单克隆抗体、细胞因子以及针对累积糖胺聚糖的肿瘤的其它药物。
透明质酸酶也可用于提高对常规化疗有抗性的肿瘤的敏感性。例如，透明质酸酶如可溶性rHuPH20，可施用于具有与HYAL1缺陷相关的肿瘤的患者，施用的量为有效地提高肿瘤位点周围的散播(例如，帮助化疗剂在肿瘤位点或其周围的循环和/或集中)，抑制肿瘤细胞的活动性，如通过透明质酸降解和/或降低肿瘤细胞凋亡的阈值。这可将肿瘤细胞带入失巢凋亡的阶段，其使得该肿瘤细胞更易受到化疗剂作用的影响。透明质酸酶的施用可诱导胰腺、胃、结肠、卵巢和***中先前的化疗抗性肿瘤的反应性(Baumgartner et al.(1988)Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.(1986)Proc.Amer.Assoc.CancerRes.27：390)。
在一个实例中，透明质酸酶用于转移性和肺转移性癌症的处理，包括相对于非癌细胞降低了内源透明质酸酶活性的那些。透明质酸酶可单独用作化疗剂或者与其它化疗药物组合使用。用于例证的癌症包括但不限于，小细胞性肺癌，鳞状肺细胞癌，及***、卵巢、头部和颈部的癌症，或者任何其它与受压制水平的透明质酸酶活性或降低的透明质酸分解代谢相关联的癌症。
h.脑中糖胺聚糖累积的处理中的用途
透明质酸的水平在许多脑脊病理状况中提升。脑脊透明质酸的水平通常在成人中低于200μg/L(Laurent et al.(1996)Acta Neurol Scand September94(3)：194-206)，但是在疾病中可提升至超过8000μg/L的水平，如脑膜炎、脊柱狭窄、头部损伤以及大脑梗塞。透明质酸酶如例如可溶性rHuPH20，可被利用来降解水平被关键地提升的底物。
脑部有效***的缺乏也可在头部外伤后导致威胁生命的水肿。透明质酸累积是由透明质酸合酶进行的合成的增加以及降解的减少所产生的结果。透明质酸的累积最初可提供有益的作用，即在受损组织中提高水分含量以帮助白细胞外渗，但是持续的累积可以是致命的。透明质酸酶对患有头部外伤的患者的施用，如鞘内或静脉内施用，可帮助去除组织透明质酸累积以及与其相关联的水分。
透明质酸酶也可用于处理与脑肿瘤相关的水肿，尤其是与成胶质细胞瘤的多种形式相关联的。与脑肿瘤相关的水肿是由于透明质酸在邻近肿瘤的脑部非癌部分中的累积。对透明质酸累积的位点施用透明质酸酶(例如，用静脉注射或通过分流术(shunt))可通过降解这些位点过量的透明质酸来减轻与此类恶性肿瘤相关联的水肿。
i.心血管疾病中糖胺聚糖累积的处理中的用途
透明质酸酶可用于一些心血管疾病的处理。在实验性心肌梗塞之后的动物模型中施用透明质酸酶可减少梗塞大小(Maclean，et al(1976)Science194(4261)：199-200)。其发生的一个可能机制是通过减少局部缺血再灌注后发生的透明质酸累积。梗塞大小的减小据相信是由于增加的淋巴***以及增加的心肌水分的氧化和还原。
透明质酸酶也可用于限制冠状斑块形成动脉硬化。此类斑块累积糖胺聚糖并介导巨噬细胞和泡沫细胞黏着(Kolodgie et al.(2002)Arterioscler Thromb Vasc Biol.22(10)：1642-8)。
j.肺部疾病中的用途
来自正常个体的支气管肺泡灌洗(BAL)中透明质酸水平一般低于15ng/ml。然而，在呼吸道痛苦的状况中BAL的透明质酸水平显著提高(Bjermer et al.(1987)Br Med J(Clin Res Ed)295(6602)：803-6)。肺部中增加的透明质酸可阻止氧气散播和气体交换以及活化嗜中性粒细胞和巨噬细胞应答。可溶性rHuPH20纯化的制备品，如用本文所述的方法产生的那些，可由肺部或静脉的传递而递送给呈现此类状况的患者以减少透明质酸水平。透明质酸酶也可被施用给患有其它与提升的糖胺聚糖相关联的肺部并发症患者或者增强其它共传递的分子向肺部的传递。
k.其它用途
在其治疗性用途进一步的实例中，透明质酸酶可用作局部坏死解毒剂的作用，所述局部坏死来自坏死性物质的静脉旁注射，如长春花生物碱(vinka alkaloids)(Few etal.(1987)Amer.J.Matem.Child Nurs.12，23-26)，神经节囊肿的处理(Paul et al.(1997)J Hand Surg.22(2)：219-21)以及由于静脉功能不全的组织坏死的处理(Elder et al.(1980)Lancet 648-649)。透明质酸酶也可用于处理腱鞘囊肿(也知为手腕囊肿，圣经囊肿，背腱囊肿)，其是最常见的手部软组织肿胀并且是可在皮下感觉到的充满液体的囊。
透明质酸酶可通过降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)而用脊髓损伤的处理。在脊髓损伤之后，含有CSPG的神经胶质疤痕由星形胶质细胞产生。CSPG在轴突生长的抑制中发挥至关重要的作用。另外，CSPG的表达已显示为可提高随后的中枢神经***(CNS)的损伤。透明质酸酶也可被利用来在已知为化学核溶解(chemonucleolysis)的过程中对椎间盘突出进行处理。软骨素酶ABC，一种切割与透明质酸酶类似底物的酶，可诱导腰椎中间盘内亚的降低。有三种类型的间盘损伤。突出的(protruded)间盘是一个完整但却凸出的(bulging)间盘。在挤压的间盘中，纤维性包裹已撕裂且NP已渗出，但仍与该间盘连接。在隔离的(sequestered)间盘中，NP的片段已松散地从该间盘断开并在椎管内游离。化学核溶解是典型地对挤压的和突出的间盘有效，但对骨坏死的间盘损伤无效。
D.表达可溶性rHuPH20的细胞
本文所述方法可用于产生和纯化大量的可溶性rHuPH20。可溶性rHuPH20在大规模的细胞培养物中生长的CHO细胞中表达。使用含有编码SEQ ID NO：3(相应于SEQ ID NO：1所示的前体人PH20多肽的氨基酸1至482)所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达载体来实现表达。在翻译之后，35个氨基酸的信号序列被切断并且可溶性rHuPH20被分泌到培养基中。该载体也在可溶性rHuPH20编码区的下游含有IRES，小鼠二氢叶酸还原酶基因以及SV40pA序列。该表达载体被引入二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr-)的DG4细胞，其已经适应在化学限定的、无动物产物的培养基中的悬浮培养中生长。所得的表达可溶性rHuPH20的细胞包括实施例1和4、下文中所描述的那些，以及包括命名为3D35M、B2、3E10B、1B3、5C1、1G11和2G10的细胞。
其它细胞可用于生产类似rHuPH20的透明质酸。一般使用的是适于在透明质酸酶上引入关键的N-联糖基化的蛋白表达***。此类细胞包括，例如，酵母细胞，真菌细胞，植物细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多用于哺乳动物表达的细胞系是可用的包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡以及仓鼠细胞。用于示例的细胞系包括但不限于CHO(包括DG44细胞和CHO-S细胞)、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)和其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤(heterohybridoma)细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8以及HKB细胞。适于无血清培养基的细胞系也是可得到的，其帮助将分泌的蛋白从细胞培养基中进行纯化。
a.3D35M细胞
用于示例的表达可溶性rHuPH20的细胞是3D35M细胞，在实施例1、下文以及美国专利公开No.20040268425、20050260186和20060104968中有描述。3D35M细胞是表达可溶性rHuPH20的二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr-)DG44CHO细胞。对该细胞转化具有SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列的HZ24表达载体。此载体含有CMV启动子推动编码482个氨基酸(SEQIDNO：3)的多肽的表达，该多肽相应于SEQ ID NO：1中所示全长人PH20的氨基酸位置1至482。其包括35个氨基酸的N-端信号序列。该载体在PH20编码序列后也含有内部核糖体进入位点(IRES)，其后为小鼠二氢叶酸还原酶基因以及SV40多腺苷酸化序列。在翻译之后，所述482个氨基酸的多肽被处理以去除所述35个氨基酸的信号序列，导致可溶性rHuPH20的分泌。
3D35M细胞的鉴别证明了编码可溶性rHuPH20的核酸区在细胞中以大约318拷贝/细胞的拷贝数出现。由3D35M细胞通过本文方法产生的可溶性rHuPH20是多个种类的混合物，可包括一种或多种具有SEQ ID NO：4-9所示序列的多肽。在这些种类一个用于示例的鉴别中(在实施例11中描述)，SEQ ID NO：4中所示种类以0.2％的丰度出现，SEQ ID NO：5中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至446)以18.4％的丰度出现，SEQ ID NO：6中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至445)以11.8％的丰度出现，SEQ ID NO：7中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至444)以56.1％的丰度出现；以及SEQ ID NO：8中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至443)以13.6％的丰度出现。在可溶性rHuPH20制备品中的此种异质性很可能是在本文所述的生产和纯化的方法期间出现的由肽酶对C-端的切割所致。
所述3D35M可在具有或不具有甲氨蝶呤的细胞培养基中生长。也可加入另外的添加物如谷氨酰胺。在一些实例中，所述细胞在含有，例如，50nM、100nM、500nM、1μM、或2μM甲氨蝶呤并且缺乏次黄嘌呤和胸苷的细胞培养基中生长。在一个实例中，将3D35M细胞于37℃5-7％CO2中在培养基中进行培养(如CD CHO培养基，Invitrogen)，所述培养基不具有次黄嘌呤和胸苷而具有100nM甲氨蝶呤和谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一个稳定化的L-谷氨酰胺的二肽形式。其它适于CHO细胞的细胞培养基可用于培养3D35M细胞，包括但不限于，Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM)、Eagle极限必需培养基(EMEM)、Iscove修饰Eagle培养基(IMEM)、F12以及RPMI。3D35M细胞在摇瓶中此类条件下生长可产生超过1000单位/mL的透明质酸酶活性。当在生物反应器中培养时，如下文实施例3中所描述的，3D35M细胞可产生具有超过2000单位/mL酶活性的可溶性rHuPH20。
b.2B2细胞
表达可溶性rHuPH20的细胞用于在本发明所提供的方法中生产rHuPH20的示例在实施例4中进行描述并命名为2B2细胞。2B2细胞的产生是通过使3D35M细胞适应更高的甲氨蝶呤水平(即20μM)并选择在更高的甲氨蝶呤浓度中生长的克隆。此适应提高了由所述细胞所产生的透明质酸酶活性。DG44细胞是二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr-)，并且因此不能制造核。在3D35M和2B2细胞中出现的表达载体在PH20基因之外，还含有小鼠二氢叶酸还原酶的编码序列。甲氨蝶呤是强竞争性二氢叶酸还原酶抑制剂。因此，通过提高培养基中甲氨蝶呤的浓度，表达透明质酸酶的细胞被迫使产生更多的小鼠二氢叶酸还原酶以保持存活。这可以通过，例如，整合的DNA的基因扩增或重排成更稳定和更多产的排列方式来实现。因而，迫使小鼠二氢叶酸还原酶的产生升高也可导致sHuPH20生产的增加。由2B2细胞和3D35M细胞所产生的可溶性rHuPH20的酶活性的对比表明活性典型地来说在2B2细胞中(参见例如下文实施5)比在3D35M细胞中高80％到100％。
2B2细胞是在用20μM甲氨蝶呤选择之后被分离的细胞系中，作为产生的可溶性rHuPH20具有最大酶活性的细胞系而被选出的(参见例如实施例4)。在被鉴别的时候，据观察编码可溶性rHuPH20的核酸区在2B2细胞中以大约206拷贝/细胞的拷贝数出现。使用特异于编码可溶性rHuPH20的核酸区的探针，对经Spe I-、Xba I-和BamH I/Hind III-消化的基因组2B2细胞DNA进行的DNA印迹分析显示了如下的限制性消化情况：对Spe I消化的DNA是一个主要的～7.7kb的杂交条带以及四个次要的杂交条带(～13.9，～6.6，～5.7和～4.6kb)；对Xba I消化的DNA是一个主要的～5.0kb的杂交条带以及两个次要的杂交条带(～13.9和～6.5kb)；以及使用由BamHI/Hind III消化的2B2DNA观察到一条单一的～1.4kbkb的杂交条带。
2B2可在有或没有甲氨蝶呤的细胞培养基中生长。也可加入另外的添加物如谷氨酰胺、胰岛素和酵母提取物。在一些实例中，所述细胞在含有，例如，50nM、100nM、500nM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM或更多甲氨蝶呤并且缺乏次黄嘌呤和胸苷的细胞培养基中生长。在一个实例中，将2B2细胞于37℃5-7％CO2中在培养基中进行培养(如CD CHO培养基，Invitrogen)，所述培养基不具有次黄嘌呤和胸苷而具有20μM甲氨蝶呤和谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一个稳定化的L-谷氨酰胺的二肽形式。其它适于CHO细胞的细胞培养基可用于培养2B2细胞，包括但不限于，Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM)、Eagle极限必需培养基(EMEM)、Iscove修饰Eagle培养基(IMEM)、F12以及RPMI。2B2细胞在摇瓶中此类条件下生长可产生超过3000单位/mL的透明质酸酶活性。当在生物反应器中培养时，如下文实施例8中所描述的，2B2细胞可产生具有超过17000单位/mL酶活性的可溶性rHuPH20。
由本文的方法从2B2细胞中产生的可溶性rHuPH20是具有SEQ IDNO：4-9中所示序列的多肽种类的混合物。在一个用于示例的鉴别中由2B2细胞产生的可溶性rHuPH20产物(在实施例11中描述)，SEQ ID NO：4中所示种类以1.9％的丰度出现，SEQ ID NO：5中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至446)以46.7％的丰度出现，SEQ ID NO：6中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至445)以16.7％的丰度出现，SEQ ID NO：7中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至444)以27.8％的丰度出现；以及SEQID NO：8中所示种类(相应于SEQ ID NO：4的氨基酸1至443)以6.9％的丰度出现。如对3D35M细胞所产生的可溶性rHuPH20所注明的那样，在来自2B2细胞的可溶性rHuPH20制备品中的异质性很可能是在本文所述的生产和纯化的方法期间出现的由肽酶对C-端的切割所致。
E.细胞培养物的扩增
本文所述方法利用生物反应器来培育大体积的细胞培养物以产生大量的可溶性rHuPH20。如下文的细节所述，这些方法包括细胞扩张阶段，蛋白生产阶段，蛋白浓缩和缓冲液更换阶段，以及纯化阶段。表达可溶性rHuPH20的细胞，如2B2细胞，最初从原始接种物如来自工作细胞库(WCB)或主细胞库(MCB)的细胞的整分试样进行扩增，在于生物反应器内的培养前达到较大的体积用于生产阶段。在扩增阶段中最终的培养体积直接与接下来生产阶段所用的生物反应器的体积成比例。典型地，相比较小的生物反应器而言，较大的生物反应器使用来自扩增阶段的更大的最终培养体积进行接种。
所述表达可溶性rHuPH20的细胞通过一系列的培养进行扩增，每次都从前一次的增加体积，并且每次都被用为下一次的接种物。用作示例的此类细胞是2B2细胞。原始接种物是典型的一种，其中细胞的纯度和种类以及细胞数目是确定的。这些细胞可冷冻保存，如在-20℃、-70℃或-80℃，或可在液体培养基中维持于，例如4℃，或在培养物中维持于，例如37℃。在某些情况下，原始接种物是冷冻保存的主细胞库或工作细胞库的整分试样。在这类情形中，该接种物在例如37℃的水浴中解冻。原始细胞培养物典型地是经离心的并且细胞在适当的细胞培养基中重悬。例如，2B2可被重悬于冰继而被培养于，碱性培养基中，如CDCHO培养基(Invitrogen)，或再生粉末状CD CGO AGTTM培养基(Invitrogen)，添加了8mM谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以及20μM甲氨蝶呤。在另一个实例中，细胞可在添加了8mM谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以及100mM甲氨蝶呤的碱性培养基中生长。任何其它适宜的细胞培养基也可用于扩增表达透明质酸酶的细胞。例如，细胞可培养于Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)、Eagle极限必需培养基(EMEM)、Iscove改进Eagle培养基(IMEM)、F 12、RPMI或其它有或没有额外添加物的化学限定的或未限定的培养基。所述细胞典型地是在无血清的培养基中生长，但也可在含有血清的培养基中生长。本领域技术人员可以使用可添加各种养分的其它碱性培养基来制备细胞培养基以制造在其中培养表达可溶性rHuPH20的细胞的细胞培养基。
将细胞接种物加入到一系列体积升高的细胞培养基的第一个中，扩增该细胞培养物。在最初的接种之后，将该细胞在处于适当温度并具有适当量CO2的加湿的培养箱或生物反应器中扩增。典型地来说，CO2的量是介于4％至9％之间，典型地介于6.0％至8.0％之间，如7.0％而温度介于35℃至39℃之间，典型地介于36℃至38℃之间，如37℃。例如，2B2和3D35M可在37℃加湿的具有7％CO2的培养箱中生长。在此过程中可摇动该培养物，如以90-130rpm。当该细胞达到所期望的密度时，如例如超过1.0×106细胞/mL(例如介于1.5×106细胞/mL和2.5×106细胞/mL之间)，该细胞培养物用于接种较大体积的新鲜的细胞培养基。例如，细胞可以4×104至4×106细胞/mL的密度接种至下一个培养中，典型地是2×105至6×105细胞/mL，如4×105细胞/mL。重复该过程直至将该细胞扩增至所期望的体积以及细胞密度，以用于例如，将4×104至4×106细胞/mL播种在生物反应器中。
在一个实例中，表达可溶性rHuPH20的细胞，如2B2细胞，最初被加入到125mL摇瓶中大约20mL的细胞培养基中，导致20-30mL的培养物体积，典型地是25mL。在37℃、7％CO2中的温育以及细胞扩增至密度超过1.5×106细胞/mL之后，将新鲜培养基加入到瓶中以使该细胞培养物扩增至40mL。将该细胞再次温育直至达到超过1.5×106细胞/mL的密度，之后将整个细胞培养物(大约40mL)加入到新鲜培养基中以构成125mL转瓶中的100mL培养物体积。通过将整个培养物(大致100mL)转移到含有足够新鲜培养基的250mL转瓶中来重复此过程以构成200mL的最终培养物体积，接着是含有足够新鲜培养基的1L转瓶以构成800mL的最终培养物体积，接着是含有足够新鲜培养基的6L转瓶以构成5L的最终培养物体积，而最后是是含有足够新鲜培养基的36L转瓶以构成32L的最终培养物体积。在每次转移之间，将细胞温育直至该培养物达到超过1.5×106细胞/mL的密度。在一些实例中，在最后的36L转瓶的温育之后达到更高的细胞密度。例如，该36L转瓶中的细胞可被扩增至3.55×106细胞/mL到6.05×106细胞/mL的细胞密度。此过程可被用来在引入到400L生物反应器(300L培养物体积)用于蛋白生产阶段前扩增表达可溶性rHuPH20的细胞(参见，例如实施例8)。较小体积的细胞培养物和不同的细胞密度可用于较小的生物反应器。例如，在引入到125L生物反应器前，可将细胞扩增至具有介于1.8×106细胞/mL和2.5×106细胞/mL之间的细胞密度的大约20L的体积中。在另一个实例中，在引入到5L生物反应器前，可将表达可溶性rHuPH20的细胞扩增至具有介于1.5×106细胞/mL和2.5×106细胞/mL之间的细胞密度的大约800mL的体积中。
此过程，与本文所述的任何过程一样，也可由本领域技术人员进行放大以将细胞引入到具有超过300L体积的生物反应器中。例如，可对该过程进行放大以将细胞引入到具有2500L培养物体积的生物反应器中，如实施例12中所描述的。因而，在本发明所提供方法的一个实例中，在解冻后，将细胞通过125mL摇瓶(20-30mL的工作体积，如25mL)、250mL摇瓶(45-55mL的工作体积，如50mL)，1L摇瓶(190-210的工作体积，如200mL)，两个2L摇瓶(每瓶350-450mL的工作体积，如每瓶400mL)，六个2L摇瓶(每瓶350-450mL的工作体积，如每瓶400mL)，25L波浪(wave)生物反应器(14-16L的工作体积，如15L)，100L波浪生物反应器(75-85L的工作体积，如80L)，以及600L种子(seed)生物反应器(440-520L的工作体积，如480L)，进行连续地扩增。
F.蛋白生产
在细胞扩增后，将所述表达可溶性rHuPH20的细胞转移到生物反应器中用于生产阶段，其间大量的可溶性rHuPH20被分泌到细胞培养基中。此阶段被典型地设计为使得在生物反应器运行的前半部分细胞生长被最大化，而可溶性rHuPH20的生产在在生物反应器运行的后半部分被最大化。在贯穿整个过程的特别的时间点向该细胞提供一系列的加料培养基以调节该过程。生物反应器的条件也典型地被监控以保证在整个过程中保持最佳条件。本文所述用于蛋白的方法可由本领域技术人员来进行放大或缩小。此外，对例如细胞培养基、温育时间、加料方案的改进。本领域技术人员可凭经验对任何给定的生物反应器以及任何类型来确定用于进行蛋白生产适当条件。
不同大小和设计的生物反应器可用于本文的方法。具有介于1L至5000L之间或更大的工作体积的生物反应器可用于本文的方法。在一些实例中，5L、36L、125L、400L或3500L的生物反应器被用于本文的方法以分别在大约4L、23L、100L、300L和2500L的体积中培养细胞。典型地来说，生物反应器在加入细胞培养基或细胞前被灭菌。灭菌可由高压灭菌来实现或者对于某些生物反应器用蒸汽处理，或用杀菌溶液处理，如稀释的氢氧化钠，稀释的硝酸或次氯酸钠。在一些实例中，生物反应器在121℃，20PSI用蒸汽灭菌30分钟。在灭菌后，可将细胞培养基加入到生物反应器中并接着评估污染，如微生物污染，在一段时间后保证灭菌过程有效。
将来自上述扩增阶段的细胞培养物，加入到经灭菌的含有新鲜细胞培养基的生物反应器中。一般将所述表达可溶性rHuPH20的细胞以104至107细胞/mL，如105至106细胞/mL的细胞密度接种到该新鲜的细胞培养基中。例如，细胞可以1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、4×106、或1×107细胞/mL的密度接种。在一个实例中，将表达可溶性rHuPH20的细胞以4×105细胞/mL的细胞密度接种。因此在接种后总的细胞计数可以是介于107至1014之间，取决于生物反应器的大小和细胞密度。例如，100L体积的细胞培养物可在接种后具有大约109、1010、1011或1012个细胞的细胞密度。在另一个实例中，2500L体积的细胞培养物可在接种后具有大约1010、1011、1012或1013个细胞的细胞密度。
所使用的接种细胞培养物和新鲜培养基的体积取决于生物反应器的大小和接种物的细胞密度。例如，大约30L的表达可溶性rHuPH20的细胞，如2B2细胞，可被加入到含有230L新鲜培养基的400L的生物反应器中，得到总体积大约260L以及4×105细胞/mL的接种细胞密度(大约1011个细胞的总细胞计数)。这可在需要使放大或缩小，取决于生物反应器。例如，大约20L的表达可溶性rHuPH20的细胞，如3D35M细胞，可被加入到含有65L新鲜培养基的125L生物反应器中，得到总体积大约85L以及4×105细胞/mL的接种细胞密度(大约3.4×1010个细胞的总细胞计数.在另一个实例中，对在3500L生物反应器中的生产，将2B2加入到新鲜细胞培养基中得到1900-2300L的总细胞培养体积，如2100L。
该新鲜细胞培养基含有适当的添加物以向细胞提供必要的养分从而促进细胞生长。可加入到碱性培养基的添加物包括但不限于，葡萄糖、胰岛素、丁酸钠、酵母提取物和谷氨酰胺或谷氨酰胺取代物，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在某些情况下，该碱性培养基含有足够的葡萄糖从而需要进一步加入葡萄糖。在其它情况下，葡萄糖在生产过程的后期加入到培养基中，如在接下来的加料培养基中。在培养基中加入胰岛素可促进细胞生长并提高峰值细胞密度。谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物，如或者L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，可支持细胞周期的进行并且也增强细胞生长。本领域技术人员可凭经验确定可加入到碱性培养基中的养分的量和品质。在一些实例中，将谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM或20mM加入到碱性细胞培养基中。可以将胰岛素以，例如0.5mg/L至50mg/L，如1mg/L至40mg/L、2mg至30mg/L、或5mg/L至20mg/L加入到细胞培养基中。例如，添加了5mg/L胰岛素和8mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的碱性细胞培养基可用作新鲜细胞培养基，其中接种所述表达可溶性rHuPH20的细胞。也可加入另外的添加物，如抗生素、抗真菌剂、指示剂、盐、维生素、氨基酸以及生长因子。
生物反应器的个别参数可设置为在整个蛋白生产过程中维持最佳条件。可设定的具体条件取决于所用的生物反应器，并可以包括但不限于，温度、pH、溶解氧、叶轮速度、容器压力、空气喷射和空气覆盖。在一个实例中，含有100L的3D35M细胞培养物的125L生物反应器的条件被设置为；温度：37℃；溶解氧：25％±10％；叶轮速度：50RPM；容器压力：3psi；空气喷射：1L/分钟；空气覆盖：1L/分钟，pH：7.2在另一个实例中，含有最初的260L细胞培养物体积的400L生物反应器的条件被设置为；温度：37℃；叶轮速度40-55RPM；容器压力：3psi；空气喷射：0.5-1.5L/分钟；空气覆盖：1L/分钟。在另一个实例中，含有含有最初的2100L细胞培养物体积的3000L生物反应器的条件被设置为；温度：37℃(或介于36.5℃至37.5℃之间；叶轮速度：35RPM(或70-80RPM)；容器压力：5psi(或3-7psi)；空气喷射：12L/分钟(或11-13L/分钟)；溶解氧：25％，或＞25％；接种前pH：7.2(或pH 7.1-7.3)；接种后pH：≤7.2(或≤7.3)。本领域技术人员可凭经验确定用于特定的生物反应器中特定的表达可溶性rHuPH20的细胞的适当条件。
所述表达可溶性rHuPH20的细胞典型地是在生物反应器中被培养10至25天之间。在一些实例中，将所述表达可溶性rHuPH20的细胞在收获前于生物反应器中培养12、13、14、15或16天。在其它的实例中，the cells are harvested当活细胞计数(VCC)降到某特定水平时，如例如，25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或70％，收获细胞。在一个实例中，当VCC在30％至35％之间时收获细胞。在另一个实例中，在VCC跌倒低于50％的24小时内收获细胞。
在生物反应器培养期间，细胞可作为分批培养而进行培育，其中培养物生长至结束而不加入另外的养分。在其它实例中，细胞作为加料分批培养而进行培育并在特定的时间点被供给一些列的加料培养基以始终补充养分和葡萄糖。在某些情况下，提供到细胞所接种的细胞培养基中的养分在接种后3、4、5、6、7天或更多而被耗尽。因而，提供额外的养分和添加物相比分批培养可产生更高的蛋白产量。在一个实例中，在接种后第6、9和11天向细胞提供加料培养基。在另一个实例中，在接种后第7、9和11天向细胞提供加料培养基。在又一个实例中，在接种后第5、7、9和11天向细胞提供加料培养基。加入到生物反应器培养物中的加料培养基的体积的范围可介于，例如，0.5％至20％之间，如1-20％、2-15％、3-10％或4-5％的细胞培养物体积。在某些情况下，将所述加料培养基以等于细胞培养物体积4％的体积加入。
向加料培养基中加入各种添加物也可用于调节细胞的生长和/或细胞周期。用于示例的可包括在加料培养基中的的养分和添加物包括但不限于，谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素、酵母提取物、葡萄糖和丁酸钠或者丁酸钠。此外，用于加料培养基的碱性培养基也可进行浓缩，从而提供额外的养分，如细胞培养期间可能已耗尽的必需氨基酸。加料培养基中的碱性培养基可以是2×，3×，4×，5×，6×或更浓。在其它实例中，碱性培养基比生物反应器中的细胞培养基浓度低或具有相同的浓度。
加料培养基中所包括的添加物可用于调节细胞生长和蛋白生产。例如，加入到细胞培养物中的第一加料培养基可包括增强细胞周期进行、细胞生长及峰值细胞密度的养分。接下来的加料培养基可促进细胞生长停滞和/或蛋白合成。每个加料培养基中的每种添加物的量可以变化，如从一个加料培养基到下一个是增加或减少的，或者可以从一个加料培养基到下一个是相同的。在一些实例中，从一个加料培养基到下一个中的添加物的量是增加的，如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。在其它实例中，从一个加料培养基到下一个中的添加物的量减少了，如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一个实例中，从加料培养基中省略了一种添加物。在其它实例中，加料培养基中一种添加剂的量保持相同。本领域技术人员可凭经验确定用于每个加料培养基的每种添加物的最佳量以促进所期望的细胞生长以及蛋白生产的量。
用于示例的可包括在加料培养基中的的养分和添加物包括但不限于，葡萄糖、谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、胰岛素、和丁酸钠。所加入的添加物的类型和量可影响细胞生长及蛋白生产。例如，胰岛素和谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物可被掺入到加入细胞培养物中的第一加料培养基中以提高细胞生长和峰值细胞密度。接下来的加料培养基可被设计为促进蛋白生产多于细胞生长。添加物如胰岛素可被排除或减少其量，也可如此处理谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。相反，增强蛋白合成的添加物如酵母提取物可提高其量。另外，也可包括增强细胞周期停滞并因此提高蛋白合成的添加物。用于例证的此类添加物是丁酸钠。
在一个实例中，将胰岛素加入到一种或多种加料培养基中。胰岛素的加入可使峰值细胞密度提高，例如2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。尽管可将胰岛素掺入到任何加料培养基中，典型地来书，将胰岛素加入到早期的加料培养基中，如第一加料培养基，或者第一个和第二加料培养基中，以在生物反应器运行的初始阶段促进最大的细胞生长。例如，加料培养基，第一加料培养基，可含有的胰岛素的量为或大约为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L或更多。相反，加入到后期加料培养基中的胰岛素的量可减少或者可以完全省略掉。
谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，也可被加入到加料培养基中。在某些情况下，加入到第一加料培养基中的谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物的量多于加入到随后的加料培养基中的谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物的量。在特定的实例中，加入到每个随后的加料培养基中的谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物的量比加入到其前面的加料培养基中的量要低。加入到每个加料培养基钟的最佳量可由本领域技术人员凭经验确定，并且可以包括，例如，谷氨酰胺或谷氨酰胺-取代物的浓度为或大约为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或等多。
典型地来说，用于加料培养基中的碱性培养基也补加了葡萄糖。加入到每个加料培养基中的葡萄糖的量相对于前面的加料培养基可以是增加的或减少的，或者可以保持大致恒定。在一些实例中，加入到加料培养基中的葡萄糖的量是或大约是10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、75g/L、80g/L或更多。
另外，也可包括促进蛋白合成的添加物。此类养分包括，例如酵母提取物。在某些情况下，加料培养基中所包括的酵母提取物的量在生物反应器运行期间使增加的。例如，第三加料培养基中酵母提取物的量相比于第二加料培养基中的量可以是增加的，其相比于第二加料培养基中的量可以是增加的。在一些实例中，加入到加料培养基中的酵母提取物的量在5至1000g/L之间，如或者大约如10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、75g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L、400g/L或更多。
也可包括增强细胞周期停滞并因此提高蛋白生产的添加物。典型地来说，此类添加物被包括在与生物反应器运行后期所加入的加料培养基中而未被包括在第一加料培养基中。例如，可在第二加料培养基和随后的加料培养基中加入增强细胞周期停滞的添加物。用于示例的此类添加物是丁酸钠.在一些实例中，加入到加料培养基中的丁酸钠的量在0.1g/L至10g/L之间，如或者大约如0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L或更多。
此外，在所述生产阶段期间可改变生物反应器任何一个或多个条件以使蛋白生产最优化。在一个实例中，温度被降低。这可帮助促进细胞周期停滞，延长细胞生存力(从而提高总的蛋白生产)，并帮助使已分泌的透明质酸酶稳定。例如，生物反应器的温度可在每次加料时降低，如在第二次加料时从37℃到36.5℃，在第三次加料时到36℃以及在第四次加料时到35.5℃。本领域技术人员可凭经验确定适当的加料培养基和加料的时间，以及生物反应器中适当的条件。
在一个实例中，在接种后第6、9和11天向细胞提供加料培养基。在另一个实例中，在接种后第7、9和11天向细胞提供加料培养基。在又一个实例中，在接种后第5、7、9和11天向细胞提供加料培养基。在每个时间点提供的加料培养基可以是相同的或不同的，以及可以包括添加物如，但不限于，葡萄糖、丁酸钠、胰岛素、谷氨酰胺或谷氨酰胺取代物以及酵母提取物。例如，在400L生物反应器中的260L培养物中生长的2B2细胞可在第5天被提供含有10.4L的4×碱性培养基(例如CD CHO培养基)的第一次加料，该碱性培养基含有33g/L葡萄糖、32mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、16.6g/L酵母提取物以及33mg/L胰岛素；在第7天的第二次加料含有10.8L的2×碱性培养基(如CD CHO培养基)，33g/L葡萄糖、16mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、33.4g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠；在第9天的第三次加料含有10.8L 1×碱性培养基(如CD CHO培养基)，50g/L葡萄糖、10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50g/L酵母提取物和1.80g/L丁酸钠；以及在第11天的第四次加料含有1×碱性培养基(如CD CHO培养基)，33g/L葡萄糖，6.6mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺，50g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠。这可由本领域技术人员放大或缩小用于分别在较大或较小的生物反应器中rHuPH20的生产。此外，本领域技术人员可改变多一种加入到培养基中的添加物的类型的量以增强细胞生长和/或蛋白生产。
在另一个实例中，将如下的加料培养基在第5、7、9和11天提供给细胞：加料#1培养基：碱性培养基+33g/L葡萄糖+26.6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺+83.3g/L Yeastolate+33mg/L rHuInsulin；加料#2：碱性培养基+33g/L葡萄糖+13.4mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺+166.7g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠；加料#3：碱性培养基+50g/L葡萄糖+10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺+250g/L Yeastolate+1.8g/L丁酸钠；加料#4：碱性培养基+33.3g/L葡萄糖+6.7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺+250g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠。
G.细胞培养物的收获、蛋白浓缩和缓冲液更换
在蛋白生产阶段后，收获细胞并在纯化过程开始前将分泌到细胞培养基中的可溶性rHuPH20浓缩。在浓缩蛋白之外，该细胞培养基可在此时用适当的缓冲液进行更换。多种实现蛋白浓缩和缓冲液更换的***和过程是本领域已知的并且可用于本文的方法中。下文描述的是用于示例的此类方法，并且本领域技术人员将认识到这些方法可以修改或用其它有效的方法取代以实现满意的水平的蛋白浓度和缓冲液的更换。
从生物反应器中收获细胞并将其通过细胞去除和净化***处理来使含有透明质酸酶的细胞培养液与细胞核细胞碎片分离。此***的例子是含有一系列过滤器的一种，其只允许通过以及被收集。可使用能够将透明质酸酶从细胞和细胞碎片中分离的任何过滤器或过滤器系列。例如，可使细胞培养物的收获通过一系列的囊式过滤器，如聚苯醚砜过滤器。这些可具有逐渐缩小的孔的大小以渐增的去除例如，细胞、细胞碎片和更小的粒子如病毒。在一些实例中，具有8.0μm、0.65μm、0.22μm和0.22μm孔大小的一些列四个过滤器被用于净化细胞培养物以获得收获的细胞培养液(HCCF)。可用于本文方法的另一个细胞去除和净化***的例子是在第一阶段并行含有四个模块的一系列过滤器，每个模块含有一层分级至4-8μm的硅藻土和一层分级至1.4-1.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜。第二阶段含有单独的模块，其含有一层分级至0.1-0.11μm的硅藻土一层分级至＜0.1μm的硅藻土随后是纤维素膜，以及第三阶段是0.22μm的聚苯醚砜囊式过滤器。
一旦所述细胞和碎片已经与HCCF分离，典型地来说HCCF中的蛋白就被浓缩并且将细胞培养基用适当的缓冲液进行更换。该蛋白可被浓缩了2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、11×、12×、13×或更多。在一些实例中，该蛋白被浓缩了10×。在其它实例中，该蛋白被浓缩了6×。可利用任何本领域已知的蛋白浓缩方法。用于示例的此类方法包括使用具有分子量截断值(MWCO)过滤器的切向流过滤(TFF)***进行浓缩。例如，可使净化的HCCF通过一系列的两个30kDa MWCO螺旋形聚苯醚砜过滤器来将蛋白浓缩10×。在另一个实例中，使HCCF通过一系列的四个30kDaMWCO过滤器。对于大规模的透明质酸酶的生产，如例如，100L和300L培养物，典型地是利用具有介于0.5至5平方米之间表面积的过滤器来用于此目的。在一些实例中，使用具有1.2平方米或2.8平方米表面积的过滤器。
缓冲液更换在蛋白浓缩之后进行。本领域技术人员可凭经验确定适当的缓冲液。用于示例的适宜的缓冲液是10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.0的缓冲液；或10mM Tris，20mMNa2SO4，pH 7.5的缓冲液。在收获之后，浓缩以及缓冲液更换，经浓缩的蛋白溶液典型地是在储存到灭菌储存袋之前，通过另一个过滤器，如0.22μm囊式过滤器。
在一些实例中，对经浓缩的蛋白溶液进行处理以使任何流的病毒污染失去活性。病毒的失活可通过任何本领域已知的方法来实现。例如，可将经浓缩的蛋白溶液与10％Triton X-100，3％三丁基磷酸酯(TNBP)混合达到1％Triton X-100，0.3％TNBP的最终浓度于室温持续15及75分钟。在一些实例中，将蛋白暴露于病毒失活溶液30-45分钟。
H.纯化
使用一系列的纯化步骤将所述可溶性rHuPH20从所述经浓缩的蛋白溶液中纯化出来。许多纯化技术使本领域已知的并可以用于本文的方法中。此类方法可包括但不限于，层析法如离子交换层析、大小排阻层析、亲和层析(AC)、高效液相层析(HPLC)、反相层析(RPC)和疏水作用层析(HIC)，以及凝胶过滤法，或者其任意组合。
用作示例的用于本文方法的纯化方法是离子交换层析、疏水作用层析以及亲和层析的组合。在离子交换层析中，可基于蛋白带电官能团与层析柱基质带电官能团之间的静电力而将该蛋白从复合溶液或混合物中分离。阳离子交换树脂具有吸引蛋白带正电官能团的带负电官能团，而阴离子交换树脂具有吸引蛋白带负电官能团的带正电官能团。通过静电力与基质结合的蛋白可通过随着时间提高层析柱中缓冲液的离子强度而进行洗脱。在疏水作用层析中，可基于蛋白的疏水性而将其从复合溶液或混合物中分离。将含有所述蛋白的复合溶液应用于层析柱，该层析柱已用帮助蛋白结合到树脂的高盐缓冲液进行了平衡化。接着将具有渐减离子强度的盐梯度流动相引入到该层析柱中以从基质上释放结合的蛋白。或者，疏水作用层析可以将单体蛋白从复合溶液或混合物中分离，其是通过结合疏水性杂质包括失活的蛋白二聚体和聚集体，而允许单体蛋白相对未受阻碍地流过层析柱。在亲和层析中，可基于蛋白对共价结合于基质上的配体或配体结合的实体的亲和性，而将其从复合溶液中分离。复合溶液或混合物中对所述配体或配体结合的实体具有很弱亲和性或缺乏亲和性的其它蛋白则未受阻碍的流过层析柱，留下结合在基质上的感兴趣的蛋白。接着可通过改变缓冲液条件以降低对于所述配体或配体结合的实体的亲和性而将该蛋白从层析柱上洗脱。
在一个实例中，将所述可溶性rHuPH20用顺序纯化从所述经浓缩的蛋白溶液中纯化出来，所述顺序纯化是通过串珠状交联琼脂糖柱，如Q SepharoseTM柱(离子交换层析)，串珠状交联苯基取代琼脂糖柱，如Phenyl SepharoseTM柱(疏水作用层析)，氨基苯硼酸盐柱(亲和层析)以及最后通过羟基磷灰石柱(离子交换层析)。这些柱的每一个展现出对于透明质酸酶不同的结合特性，这样所述串珠状交联琼脂糖柱(例如Q SepharoseTM柱)是捕获步骤(即可溶性rHuPH20结合到树脂上而其它的一些蛋白则流过)，所述串珠状交联苯基取代琼脂糖(例如Phenyl SepharoseTM柱)是流过的步骤(即可溶性rHuPH20流过该柱而一些其它蛋白被捕获)，所述氨基苯硼酸盐柱是另一个捕获步骤，而所述羟基磷灰石柱是精琢(polishing)步骤以进一步纯化所述可溶性rHuPH20。
在使用前，所述柱典型地是经灭菌并平衡化的。灭菌可由任何本领域已知的方法来实现，包括但不限于，用1.0M NaOH灭菌。平衡化可通过在所述柱中加入适当的缓冲液来实现，如使用类似于或相同于接下来用于洗涤所述柱的缓冲液或蛋白载入前所在的缓冲液。本领域技术人员可轻易的确定适用于对每个柱进行平衡化的缓冲液。用于示例的缓冲液在下提供。在每个层析步骤之间，可将洗脱的蛋白过滤，如通过a 0.22μm过滤器，以去除任何污染的微生物或大的聚集体。在一些实例中，在下一步的使用前将过滤的洗脱物储存起来，如在无菌存储袋中。在柱层析之后，经纯化的透明质酸酶可接着经受病毒去除的步骤，随后是蛋白浓缩和缓冲液更换用于最后的配置。用于示例的纯化方法在下文中进行详细描述。
1.串珠状交联琼脂糖柱
可将由收获的细胞培养液(HCCF)中所获得的浓缩的蛋白装载入串珠状交联琼脂糖柱，如例如，Q SepharoseTM柱，其实强阴离子交换物并捕获可溶性rHuPH20而允许其它蛋白流过。结合的可溶性rHuPH20可继而用适当的缓冲液洗脱。所用柱的容积典型地是取决于从HCCF所获得的浓缩蛋白的体积。例如，从100L生物反应器培养中的表达透明质酸酶的细胞的培养物所获得的浓缩蛋白可装载到20cm高，14cm直径以及含有3L树脂的柱中。在另一个实例中，从300L生物反应器培养物中的表达可溶性rHuPH20的细胞的培养物所获得的浓缩蛋白可装载到29cm高，20cm直径以及含有9L树脂的柱中。这在必需时可以放大或缩小，取决于所浓缩的蛋白的体积以及所预期的蛋白的量。例如，从20L生物反应器培养中的表达可溶性rHuPH20的细胞的培养物所获得的浓缩蛋白可以被载入28cm高，7cm直径以及含有1.1L树脂的Q SepharoseTM柱中，而从2500L生物反应器培养中的表达可溶性rHuPH20的细胞的培养物所获得的浓缩蛋白可以被载入26cm高，63cm直径以及含有81L树脂的Q SepharoseTM柱中。
在载入蛋白前，所述柱典型地是经平衡化的。平衡化可由通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多的柱体积的缓冲液来实现。在一些实例中，将5个柱体积的缓冲液通过该柱用于平衡化。适宜于平衡化的缓冲液包括那些类似于将在装载蛋白后用来洗涤所述柱的缓冲液。例如，串珠状交联琼脂糖柱，如Q SepharoseTM柱可用10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.5来进行平衡化。可以使用其它中性pH的缓冲液，这将由本领域技术人员来辨别。
在装载蛋白浓缩物后，所述柱被洗涤并且蛋白被洗脱。用于洗涤这种含有结合的可溶性rHuPH20的柱的适宜缓冲液包括，例如，10mM Hepes，25mL NaCl，pH 7.0；10mMHepes，50mM NaCl，pH 7.0；以及10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5。可用一种或多种类型的缓冲液来洗涤所述柱。例如，所述柱可用20mM Na2SO4，pH 7.5和10mM Hepes，50mM NaCl，pH7.0来洗涤。洗涤典型地是由通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多的柱体积的缓冲液来实现的。在一些实例中，用5个柱体积的缓冲液来洗涤该柱。继而所述可溶性rHuPH20用具有较高盐浓度缓冲液来洗脱，如例如，10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0。在一些实例中，监测在A280的光吸收以确定何时收集洗脱物，因为在此过程期间的任何光吸收一般表明可溶性rHuPH20的存在。因而，在一个实例中，当光吸收开始读数是0.025时收集所述洗脱物。所述洗脱物在用例如无菌存储袋存储前典型地是通过适当的过滤器进行过滤的，如0.22μm过滤器。
2.串珠状交联苯基取代琼脂糖柱
在通过串珠状交联琼脂糖柱纯化后，所述蛋白溶液可使用串珠状交联苯基取代琼脂糖柱来进行疏水作用层析，如Phenyl SepharoseTM柱，其中所述可溶性rHuPH20流过该柱而其它污染蛋白则被捕获。本文方法中所用的柱的大小范围可以取决于通过其来纯化的蛋白的体积和量。用于示例的大小包括，29cm高，20cm直径具有9L树脂的柱，其用于对来自100L生物反应器培养中所生长细胞的可溶性rHuPH20进行纯化；29cm高，30cm直径具有19-21L树脂的柱，其用于对来自300L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化；以及35cm高，80cm直径具有176L树脂的柱，其用于对来自2500L生物反应器培养中所生长细胞的可溶性rHuPH20进行纯化。本领域技术人员可酌情进行扩大或缩小。
所述经灭菌的串珠状交联苯基取代琼脂糖柱，如Phenyl SepharoseTM柱，可在装载所述蛋白前用适当的缓冲液进行平衡化，如例如，5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH7.0。来自Q Sepharose柱纯化的蛋白洗脱物也补加硫酸铵、磷酸钾和CaCl2。这些可补加到蛋白中达到最终浓度为，例如，约5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2，pH 7.0。在装载蛋白后，也将5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2，pH 7.0加入到柱中并收集经过滤的流出物，如收集到无菌袋中。
3.氨基苯硼酸盐柱
在疏水作用层析后，可将经柱纯化的蛋白载入到氨基苯硼酸盐柱上进行进一步的纯化。氨基苯硼酸盐配体介导的层析与许多其它用于亲和层析的配体不同。大多数配体通过非共价相互作用的混合结合到蛋白的特定结合位点，而苯硼酸盐主要通过与1，2-顺式-二醇基团形成临时共价键而进行相互作用。所述硼酸盐配体将将结合任何含有适当基团的分子，包括高度糖基化的可溶性rHuPH20。
用于本文方法中的氨基苯硼酸盐柱的大小范围可以取决于通过其来纯化的蛋白的体积和量。用于示例的大小包括，29cm高，20cm直径具有6.3L树脂的柱，其用于对来自100L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化；29cm高，30cm直径具有19-21L树脂的柱，其用于对来自300L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化；以及，35cm高，80cm直径具有176L树脂的柱，其用于对来自2500L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化本领域技术人员可酌情进行扩到或缩小。适宜于对氨基苯硼酸盐柱进行平衡化的缓冲液包括，例如，含有5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0的缓冲液。
在将经Phenyl Sepharose柱纯化的蛋白载入到氨基苯硼酸盐柱上之后，用适宜的洗涤缓冲液洗涤该柱。用于示例的洗涤缓冲液包括但不限于，5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH7.0；和20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH 9.0以及20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mMNaCl，pH 9.0。在一个实例中，将具有结合的透明质酸酶的氨基苯硼酸盐柱首先用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤，继而用20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH 9.0以及最后用20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mM NaCl，pH 9.0进行洗涤。继而所述结合的透明质酸酶用例如50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0进行洗脱。本领域技术人员可将一种或多种所述缓冲液修改为类似有效的纯化过程。所述洗脱的可溶性rHuPH20典型地也要过滤以去除任何微生物污染或大的聚集体。
4.羟基磷灰石柱
在苯硼酸盐柱层析之后，可在最后的精琢步骤中将含有所述可溶性rHuPH20的蛋白溶液载入到羟基磷灰石柱上。羟基磷灰石磷酸钙的晶体形式具有分子式Ca10(PO4)6(OH)2。其可用作精琢步骤来分离紧密共纯化的蛋白，其操作是通过因包含带正电和带负电的部分而成的混合模式的离子交换。各种羟基磷灰石层析介质是商业可购得的，并且该材料任何可用的形式均可用于本文的方法中。羟基磷灰石的例子包括但不限于，附结而形成颗粒并在高温下烧结成稳定的多孔陶瓷块的那些。所述颗粒大小可以变化，如范围是直径从大约1μm到大约1,000μm。多孔性也可以变化，如从大约100A到大约10,000A。
用于本文方法中的羟基磷灰石柱大小范围可以取决于通过其来纯化的蛋白的体积和量。用于示例的大小包括，20cm高，30cm直径具有13L树脂的柱，其用于对来自300L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化；以及23cm高，80cm直径具有116L树脂的柱，其用于对来自2500L生物反应器培养中所生长细胞的透明质酸酶进行纯化。本领域技术人员可酌情进行扩大或缩小。
对于本文所述方法，可用5mM磷酸钾，200mM NaCl或5mM磷酸钾，200mM NaCl，0.1mMCaCl2，pH 7.0对所述羟基磷灰石柱进行平衡化。用如这些的溶液进行的平衡化使得所述柱适合于部分纯化的透明质酸酶，其本身补加了磷酸钾和CaCl2分别至5mM和0.1mM的终浓度。在将所述蛋白载入到所述柱上之后，可用例如，10mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mMCaCl2，pH7.0洗涤该柱以去除任何未被结合的污染蛋白。继而经结合的可溶性rHuPH20可用适当的洗脱缓冲液进行洗脱。例如，可通过加入70mM磷酸钾，pH 7.0而实现洗脱。在一些实例中，洗脱物被过滤，如通过0.22μm过滤器。
6.病毒去除，蛋白浓缩和缓冲液更换
在柱层析后获得的可溶性rHuPH20可接受纯化后步骤，该步骤帮助将该蛋白配置成在所期望的缓冲液中的所期望的浓度。该蛋白也可接受病毒去除步骤以保证其没有污染并且适宜于用作治疗剂。病毒去除典型地是通过使用过滤器来实现的，其只允许所述可溶性蛋白通过而捕捉任何病毒(以及其它大小等于或大于病毒的污染物。此类过滤器是商业可得的，并且任意的都可以用于本文的方法中。用于病毒去除的过滤器的孔大小包括但不限于，10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、75nm以及100nm。在一个实例中，所述纯化的透明质酸酶通过含有20nm孔德过滤器进行过滤。该蛋白可用例如，蠕动泵或通过使用压力槽而被泵送入过滤器。
在去除病毒后，所述可溶性rHuPH20可被浓缩并接受缓冲液更换。所述可溶性rHuPH20可被浓缩2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、11×、12×、13×或更多。在一些实例中，蛋白被浓缩了大约6×。这可导致，例如，介于0.1mg/mL至50mg/mL之间的浓度。在一些实例中，所述纯化的透明质酸酶被浓缩至大约1mg/mL。在其它实例中，所述纯化的透明质酸酶被浓缩至大约10mg/mL。本领域已知的任何蛋白浓缩方法都可以使用。用于示例的此类方法包括使用具有分子量截断值(MWCO)过滤器的切向流过滤(TFF)***浓缩。例如，所述被纯化的透明质酸酶可通过10kDa MWCO螺旋形聚苯醚砜过滤器以将蛋白浓缩为10×。在另一个实例中，将蛋白通过一系列的四个30kDaMWCO的过滤器。对于大规模透明质酸酶的生产，如例如，100L和300L的培养，典型地是使用具有表面积在0.5至5平方米之间的过滤器来用于此目的。在一些实例中，使用具有表面积1.2平方米或2.8平方米的过滤器。
缓冲液更换一般是在蛋白浓缩后进行以将蛋白配置在所期望的缓冲液中用于接下来的用途，例如，作为治疗剂。本领域技术人员可凭经验确定适当的缓冲液。用于示例的适当的缓冲液是盐缓冲液，包括但不限于，10mMHepes，130mM NaCl，pH 7.0，以及10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.0。所述纯化的透明质酸酶刻在一些实例中，于储存到无菌环境前通过另一个过滤器，如0.22μm囊式过滤器。
I.填充
本文所述用于可溶性rHuPH20的生产和纯化的方法也可包括填充的步骤，在其中将所述纯化的蛋白无菌地填充到较小的容器用于长期储存和使用。所述可溶性rHuPH20可以液体的形式被填充到所述容器中，或者作为粉末，如在冷冻干燥之后。对于大规模的生产，典型地使用并且广泛地可以得到的是自动化的填充***包括，例如，转移蛋白至所述容器的泵和测量填充容积的过秤台。然而也可以手动地或者自动和手动的组合地进行容器填充。适宜的容器包括但不限于，玻璃或塑料小瓶、泡罩式包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、注射器、瓶、或任何其它适宜的容器。也可使用适宜的密封或盖子来封住该容器。所述填充过程可包括首先在填充前使可溶性rHuPH20通过过滤器以去除微生物污染物和较大的聚集体或沉积物。例如，在被整分入适宜的容器前可使该蛋白通过0.22μm的过滤器来进行过滤。本领域技术人员可确定适当的填充容积并可以包括，例如，体积范围从0.1mL到100mL。在一些实例中，用1mL、5mL或20mL可溶性rHuPH20填充小瓶。在所述容器加盖或密封后，该容器可被储存在适当的温度。在一些实例中，该容器被速冻并储存在-15℃至-35℃之间。在其它实例中，该容器被冷藏，例如在3℃至15℃之间。液体的长期储存典型地使再较低的温度以使降解最小化。粉末形式的可溶性rHuPH20可长期储存在室温而没有显著的降解。
J.监控和测定
本文所述方法可在一个或多个步骤进行监控，在每个点测量一个或多个条件、参数或产物。这可保证始终保持最佳的条件，并且也可用于评估过程的效率和生产力。监控可在例如以下阶段发生一次或多次：在细胞扩增阶段、蛋白生产阶段(即在生物反应器中)、和/或蛋白纯化阶段期间，以及任何期间、之前或之后的时间，如在浓缩/缓冲液交换或填充期间。监控科包括但不限于，测量pH、温度、体积、污染、纯度、蛋白浓度、酶活性、细胞生存力和细胞数目。在监控贯穿整个过程的条件、参数或产物之外，也可对作为终产物生产的所述纯化的可溶性rHuPH20进行评估和鉴别，所述评估和鉴别时关于，例如，蛋白浓度、酶活性、杂质、污染、摩尔渗透压浓度、降解、翻译后修饰和单糖含量。
1.监控条件
可对本发明提供的方法中一个或多个步骤期间的条件进行监控以保证在在该过程始终保持最佳条件。如果监控表明条件不在最佳范围之内，则可改变条件。对于每个过程可监控的条件不同。例如，在细胞培养阶段(即在生物反应器中的细胞扩增和蛋白生产)，要监控的条件包括但不限于，温度、细胞培养物pH、细胞培养物物养分(例如葡萄糖)、CO2水平和O2水平。所述条件典型地是用例如培养箱或生物反应器中的嵌入***进行自动监控的。
在蛋白纯化阶段期间，可监控的条件包括但不限于，pH，传导率和流动率。这些条件可在一个或多个柱层析步骤之前、期间和/或之后进行监控。例如，可监控用于对柱进行平衡化洗涤或洗脱的缓冲液。这可在该缓冲液被载入该柱前或流过该柱后进行。
2.监控可溶性rHuPH20的生产
在贯穿整个过程中也可监控可溶rHuPH20的生产，以及与可溶性rHuPH20生产相关联的参数。这些包括但不限于，细胞数目、细胞生存力、污染、蛋白浓度、酶活性、纯度、摩尔渗透压浓度、翻译后修饰。可使用任何评估这些参数的方法。例如，哺乳动物细胞生存力的评估可通过区细胞培养物的小整分试样并用台盼蓝染色，其只渗透损坏的细胞膜，因而只对死细胞染色。该细胞可在显微镜下显像并用例如血细胞计数器进行计数。其它方法包括通过测量代谢活动来评估细胞生存力。例如，可将细胞培养物的整分试样与四氮唑盐(例如MTT、XTT或WST-1)一起温育，所述四氮唑盐由代谢活性细胞切断成为有颜色的甲臜(formazan)产物。
在特定样品中的可溶性rHuPH20浓度可用本领域熟知的方法进行评估，包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)；SDS-PAGE；Bradford、Lowry、和/或BCA法；UV光吸收和其它可定量的蛋白标记方法，例如但不限于，免疫学、放射性和荧光的方法以及相关的方法。另外，降解的存在和程度可用标准的技术进行评估如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经电泳的含有透明质酸酶样品的蛋白印迹以及层析，如例如，RP-HPLC。含有透明质酸酶样品的纯度可由例如，SDS-PAGE，RP-HPLC，大小排阻层析，离子交换层析和等电聚焦(IEF)进行评估。含有可溶性rHuPH20的样品，如含有纯化的透明质酸酶的样品，可通过评估唾液酸和单糖含量来进行进一步的鉴别。这可通过例如，用40％三氟乙酸水解该样品、将释放出的单糖荧光标记并用RP-HPLC将其分离(参见实施例10)来完成。
用本发明提供的方法生产和纯化的可溶性rHuPH20也可对翻译后修饰的存在进行评估。此类测定法是本领域已知的并包括测量糖基化、羟基化、和羧基化的测定法。在用于示例的对糖基化的测定中，可进行碳水化合物分析，例如，用SDS page对暴露于肼解作用或内切糖苷酶处理的可溶性rHuPH20进行的分析。肼解作用通过与无水肼温育而从糖蛋白中释放N-和O-联聚糖，而内切糖苷酶的释放涉及PNGase F，其从糖蛋白释放大部分的N-聚糖。可溶性rHuPH20多肽的肼解作用或内切糖苷酶处理产生可添加荧光团或发色团标记作标签的还原末端。经标记的可溶性rHuPH20多肽可用荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)进行分析。聚糖的荧光标签也可用于单糖分析、通过HPLC对复合糖基化的特征分析(profiling)或指纹分析。用于示例的HPLC方法包括亲水作用层析，电子作用，离子交换，疏水作用和大小排阻层析。用于示例的聚糖探针包括，但不限于，3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)和邻氨基苯甲酸(2-AA)。碳水化合物部分也可通过使用识别糖基化透明质酸酶多肽的特定抗体来探测。
用于示例的测量β-羟基化的测定法包含经过碱水解的可溶性rHuPH20多肽的反相HPLC分析(Przysiecki et al.(1987)PNAS 84：7856-7860)。透明质酸酶多肽的羧基化和γ-羧基化可使用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析进行评估，如本领域中所述(参见例如Harvey et al.J Biol Chem 278：8363-8369，Maum et al.Prot Sci14：1171-1180)。
样品中可溶性rHuPH20的酶活性可在本文所述方法期间的任何点进行评估。在一个实例中，使用微浑浊测定法测量活性(参见例如实施例10)。其基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成的不可溶的沉淀。活性的测量是通过将可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)温育规定的时间(例如10分钟)并继而通过加入酸化的血清白蛋白使未消化的透明质酸钠沉淀。在额外的发展期之后于640nm测量结果样品的浑浊读。对透明质酸钠底物的酶活性导致的浑浊性的降低可溶rHuPH20酶活性的度量。在另一个实例中，酶活性用微量滴定测定法来测量，其中在与含有可溶性rHuPH20的样品温育后测量残留的生物素化的透明质酸(参见例如Frost and Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，U.S.Patent PublicationNo.20050260186)。透明质酸的葡糖醛酸残基上的自由羧基是生物素化的，并且该生物素化的透明质酸底物共价结合于微滴定板。在与含有可溶性rHuPH20的样品温育后，残留的生物素化的透明质酸底物用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应来探测，并与在跟已知活性的透明质酸酶标准反应后所得结果进行对比。其它测量酶活性的测定法也是本领域已知的并且可用于本文的方法(参见例如Delpech et al.，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashiet al.，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。
也可监控任何污染的出现。污染可包括但不限于，微生物污染(例如病毒、细菌和支原体)，微生物产物污染(例如内毒素)，或其它过程相关的杂质。可使用任何适宜的方法和测定法。例如，病毒和细菌可用本领域熟知的方法进行培养以确定其是否出现在样品中，并且如果存在的话，是以什么样的量。也可使用显微镜来探测微生物污染。例如，可用透射电子显微镜(TEM)来评估样品中病毒或细菌的存在。支原体的探测可使用，例如生化或分子技术来实现，包括但不限于，PCR来扩增支原体特异性核酸，生化测试来衣原体酶以及基于细胞的荧光来探测支原体抗原或核酸。
也可监控微生物产物如细菌内毒素的出现。用于探测内毒素的出现的测定法的例子是鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法。可使用两类的LAL测定法：胶凝块和光度计(生色计和浊度计(turbometric))。LAL是来自鲎血细胞(变形细胞)的水提物。内毒素引发级联的酶反应，其导致凝固酶(clotting enzyme)的活化。细菌内毒素存在时，在提升的温度下，LAL试剂将在加入试剂后凝固。胶凝块的形成与内毒素的浓度成比例。在动力测定中，当LAL中的酶原与革兰氏阴性菌产生的内毒素接触时其被活化。活化速率直接与存在的内毒素浓度成比例。活化的水平可通过接下来的用分光光度计测量的底物反应来进行测量。
K.实施例
下面的实例只为了说明性的目的而被包括在内，而并不是意图对本发明的范围进行限制。
实施例1：可溶性rHuPH20-表达细胞系的产生
HZ24质粒(SEQ ID NO：50中所示)被用于转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如相关申请No.10,795,095、11/065,716和11/238,171)。用于可溶性rHuPH20表达的该HZ24质粒载体含有pCI载体骨架(Promega)、编码人PH20透明质酸酶(SEQ ID NO：47)1-482氨基酸的DNA，来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)，以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。所述pCI载体骨架也包括编码B-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA，f1复制原点，巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)，嵌合内含子，以及SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建物的DNA在编码氨基酸位置1的甲硫氨酸的DNA之前含有NheI位点以及Kozak共有序列，所述位置1的甲硫氨酸是人PH20序列天然的35个氨基酸信号序列的氨基酸位置1；以及在编码相应于SEQ ID NO：1中所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA之后含有终止密码子，其后是BamHI限制性酶切位点。该构建物pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)，因此导致了由CMV启动子推动的单一的mRNA种类，其编码人PH20(SEQ ID NO：3中所示)的氨基酸1-482以及小鼠二氢叶酸还原酶(SEQID NO：51中所示)的氨基酸1-186，由内部核糖体进入位点(IRES)将其分开。
将在用于DHFR(-)细胞的GIBCO改进CD-CHO培养基中生长的未转染的DG44CHO细胞，以0.5x 106细胞/ml播种于摇瓶中以准备转染，所述GIBCO改进CD-CHO培养基补加了4mM谷氨酰胺和18ml/L PlurionicF68/L(Gibco)。细胞在5％CO2中37℃于加湿的培养箱内生长，以120rpm摇动。在转染前测试指数生长的未转染DG44CHO细胞的生存力。
将未转染DG44CHO细胞培养物的六千万存活细胞沉淀并在0.7mL的2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM Hepes，pH 7.0，274mM NaCl，10mM KCl，1.4mM Na2HPO4，12mM右旋糖)中重悬成2×107细胞的密度。对重悬细胞的每个整分试样，加入0.09mL(250μg)的线性HZ24质粒(通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化而线性化)，并将细胞/DNA溶液于室温转移到0.4cm间距的BTX(Gentronics)电穿孔小杯中。用没有混合DNA的细胞进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒的混合物用在330V和960μF或者在350V和960μF通电的电容器来进行电穿孔。
在电穿孔后将细胞从小杯中移出并转移到5mL的用于DHFR(-)细胞的改进CD-CHO培养基中，所述培养基补加了4mM谷氨酰胺和18ml/LPlurionic F68/L(Gibco)，并使其在6孔的组织培养平板的孔中，在5％CO2中37℃于加湿的培养箱内无选择的生长2天。
电穿孔后两天，将0.5mL组织培养基从每个孔移出并使用实施例9中所述的微浑浊测定法测试透明质酸酶活性的存在。
从组织培养孔中收集来自转染2(350V)的细胞，计数并稀释至每mL 1×104到2×104存活细胞。将0.1mL的细胞悬液整分试样转移到5个96孔圆底组织培养平板的每个孔中。将含有4mM GlutaMAXTM-I添加物(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)且不含次黄嘌呤和胸苷添加物的一百微升的CD-CHO培养基(GIBCO)加入到含有细胞的孔中(最终体积0.2mL)。
从无甲氨蝶呤培育的5个平板中鉴定出10个克隆。
表2.所鉴定的克隆的透明质酸酶活性
平板/孔ID 相对透明质酸酶
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
将6个HZ24克隆在培养物中扩增并作为单一细胞悬液转移到摇瓶中。将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11、和4D10用二维无限稀释策略在96孔圆底组织培养平板上铺板，所述二维无限稀释策略中将细胞沿平板向下以1∶2稀释，并横向以1∶3稀释，在顶端左手边的孔以5000个细胞开始。稀释的克隆在每孔500个未转染的DG44CHO细胞的背景生长，以为培养物中初始的几天提供必要的生长因子。每个亚克隆做出10个平板，其中5个平板含有50nM甲氨蝶呤而5个平板不含甲氨蝶呤。
克隆3D3产生24个看得见的亚克隆(13个来自无甲氨蝶呤的处理，而11个来自50nM甲氨蝶呤处理。来自该24个亚克隆中的8个的悬液中测出了明显的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)，并将这8个亚克隆扩增至T-25组织培养瓶中。将从甲氨蝶呤处理的方案中分离的克隆在存在50nM甲氨蝶呤的情况下进行扩增。克隆3D35M进一步在500nM甲氨蝶呤中扩增使得克隆在摇瓶中产生超过1,000单位/ml(克隆3D35M；或Gen13D35M)。继而制备出所述3D35M细胞的主细胞库(MCB)。
实施例2：3D35M细胞中编码可溶性rHuPH20的核酸区拷贝数的确定
3D35M细胞中编码可溶性rHuPH20的核酸区拷贝数用定量PCR进行确定。从来自MCB的3D35M细胞中提取总基因组DNA。制备了该DNA的6个独立的稀释用于一式两份的分析，其中每一个含有大约6.6ng DNA(等价于大约100个细胞)。也制备了不含模板的隐形对照，以及含有质粒和等价于1000个CHO细胞(6.6ng)DNA的阳性对照。反应按照TaqManUniversalPCR Master Mix的方案(Applied Biosystems)进行组合并以一式两份运行。用代表大约5×106至49个质粒DNA的拷贝范围的HZ24A质粒的8个稀释来产生标准曲线。该标准在CHO对照基因组DNA(等价于100个细胞)中稀释。反应按照TaqManTM Univeral PCR Master Mix的方案(Applied Biosystems)进行组合，使用HZM3.P1正向引物和HZM3.P2反向引物(分别在SEQ ID NO：52和53中列出)以及HZM3探针(SEQ ID NO：54)，其含有荧光燃料6FAM(6-羧基荧光素)和TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该反应使用以下循环条件一式双份运行：50℃2分钟，95℃10分钟，随后40各循环的95℃15秒以及60℃1分钟。也进行了标准的定量PCR反应以测定每个DNA样品的GAPDH拷贝。数据用ABI Prism 7700TM Sequence Detection System软件版本1.9(Applied Biosystems)进行收集。
对于所述3D35M基因组DNA的6个稀释，将每个细胞的靶标基因的拷贝数计算为靶标拷贝(可溶性rHuPH20)与归一化的拷贝(GAPDH)的比率。将Dixon Q Outlier统计检验应用于该数据组。3D35M细胞中的sHuPH20区的拷贝数被发现为317.87±11.64。
实施例3：Gen1可溶性rHuPH20的生产和纯化
A.5L生物反应器过程
将一小瓶3D35M解冻并从T-25瓶通过1L转瓶在添加了100nM甲氨蝶呤和40mL/LGlutaMAXTM-I(Invitrogen；200mM stock solution)的CDCHO(Invitrogen，CarlsbadCalif.)中扩增。将细胞从转瓶以5L培养基中每mL 4×105个存活细胞的接种密度转移到5L生物反应器(Braun)中。参数为温度选定值37℃，pH 7.2(开始选定值)，具有溶解氧选定值25％以及0-100cc/min的空气覆盖。在168小时，加入了250ml的加料#1培养基(CDCHO具有50g/L葡萄糖)。在216小时，加入了250ml的加料#2培养基(CDCHO具有50g/L葡萄糖和10mM丁酸钠)，以及在264小时加入了250ml的加料#2培养基。此过程导致了每mL 1600单位具有6×106细胞/ml最大细胞密度的最终生产力。丁酸钠的加入是为了在生产的最终阶段增强可溶性rHuPH20的产生。
来自所述3D35M克隆的条件培养基通过深层过滤和切向流渗滤澄清入10mM HepespH 7.0中。继而通过在Q Sepharose(Pharmacia)离子交换、Phenyl Sepharose(Pharmacia)疏水作用层析，氨基苯硼酸盐(ProMedics)和羟基磷灰石层析(Biorad，Richmond，CA)上的顺序层析对可溶性rHuPH20进行纯化。
可溶性rHuPH20结合到Q Sepharose上并在相同缓冲液的400mMNaCl洗脱。将洗脱物用2M硫酸铵稀释至500mM硫酸铵的最终浓度并通过Phenyl Sepharose(low sub)柱，在同样条件下结合到苯硼酸盐树脂上。在pH 9.0没有硫酸铵的50mM N-二羟乙基甘氨酸中洗涤后，将所述可溶性rHuPH20在Hepes pH 6.9中从Phenyl Sepharose树脂洗脱。将该洗脱物在pH 6.9的5mM磷酸钾中和1mM CaCl2中载入到陶瓷羟基磷灰石树枝上并用具有0.1mM CaCl2的80mM磷酸钾，pH 7.4来洗脱。
通过微浑浊测定法的方式，作为结果的可溶性rHuPH20具有超过65,000单位/mg蛋白的比活性(见实施例9)。纯化的可溶性rHuPH20从24到26分钟作为单一峰从Pharmacia5RPC苯乙烯二乙烯基苯柱上被洗脱，该柱具有介于0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/90％乙腈/10％H2O之间的梯度，所述经洗脱的纯化的可溶性rHuPH20通过SDS电泳被辨别为为单一的宽61kDa条带，其经PNGASE-F处理还原成尖细的51kDa条带。N-短氨基酸测序反映出前导肽已被有效的去除。
B.上游细胞培养物扩增过程进入100L生物反应器的细胞培养物中
使用扩大过程将来自4个不同小瓶的3D35M细胞的可溶性rHuPH20分别纯化以产生4个分别批次的sHuPH20；HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C和HUA0420C。每个小瓶分别通过125L生物反应器进行扩增和培养，继而用柱层析纯化。样品的提取贯穿整个过程以对如酶产量这样的参数进行评估。下文提供的该过程的描述列出了对于如生物反应器启动和加料培养基体积、转移细胞密度、以及洗涤和洗脱体积的这类事情具有代表性的规范。准确的数字对每个批次稍有变化，并在表3到10中详细说明。
将4小瓶的3D35M细胞在37℃水浴中解冻，加入含有100nM甲氨蝶呤和40mL/LGlutaMAXTM-I的CD CHO并将该细胞离心。用20mL的新鲜培养基在125mL摇瓶中将该细胞重悬并置于37℃，7％CO2的培养箱中。将该细胞在125mL摇瓶中扩增至40mL。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL时，将该培养物扩增到在125mL转瓶内的100mL的培养物体积中。将该瓶在37℃，7％CO2温育。当细胞密度达到1.5-2.5x 106细胞/mL时，将该培养物扩增到在250mL转瓶内的200mL的培养物体积中，并且将该瓶在37℃，7％CO2温育。当细胞密度达到1.5-2.5x 106细胞/mL时，将该培养物扩增到在1L转瓶内的800mL的培养物体积中并且在37℃，7％CO2中温育。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL时，将该培养物扩增到在6L转瓶内的5L的培养物体积中并且在37℃，7％CO2中温育。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL时，将该培养物扩增到在36L转瓶内的20L的培养物体积中并且在37℃，7％CO2中温育。
用蒸汽在121℃，20PSI对125L的反应器进行灭菌并加入65L的CDCHO培养基。在使用前，检查该反应器的污染。当在所述36L转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x 106细胞/mL时，将20L细胞培养物从该36L转瓶转移到所述125L生物反应器(Braun)，结果得到85L的终体积以及大约4×105细胞/mL的播种密度。参数是温度选定值，37℃；pH：7.2；溶解氧：25％±10％；叶轮速度50rpm；容器压力3psi；空气喷射1L/分钟.；空气覆盖：1L/min。每日对该反应器取样用于细胞计数，pH确认，培养基分析，蛋白生产和保持。在运行期间加入养分加料。在第6天，加入了3.4L的加料#1培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-I)，并将培养温度变为36.5℃。在第9天，加入了3.5L的加料#2(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-I+1.1g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36℃。在第11天，加入3.7L的加料#3(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-I+1.1g/L丁酸钠)，并将培养温度变为35.5℃。该反应器在14天收获或者当细胞的生存力降低到低于50％时收获。该过程导致了具有1600单位/ml酶活性具有8百万细胞/ml的最大细胞密度的可溶性rHuPH20的产生。在收获时，对该培养物取样用于支原体、生物负荷、内毒素、和体外以及体内的病毒、透射电子显微镜(TEM)用于病毒粒子、以及酶活性。
将一百升生物反应器的细胞培养收获通过一系列的一次性具有聚苯醚砜介质的囊式过滤器(Sartorius)进行过滤：首先通过8.0μm深的囊，0.65μm，0.22μm囊，以及最后通过0.22μm Sartopore 2000cm2过滤器并进入100L无菌存储袋。使用具有螺旋形聚苯醚砜30kDa MWCO过滤器的两个TFF(Millipore)将该培养物浓缩10×，随后是用10mM HEPES，25mM Na2SO4，pH 7.0进行的6×缓冲液更换进入0.22μm最终过滤器进入20L无菌存储袋。表3提供了涉及该细胞培养物、收获、浓缩和缓冲液更换步骤的监控数据。
表3.细胞培养物、收获、浓缩和缓冲液更换步骤的监控数据
制备了Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(3L树脂，高度＝20cm，直径＝14cm)。收集洗涤样品用于pH、传导率和内毒素(LAL)测定的确定。该柱用5个柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5进行平衡化。将浓缩的经渗滤的收获物以100cm/小时的流速装载到所述Q柱上。用5个柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5和10mM Hepes，50mM NaCl，pH7.0洗涤该柱。用10mM Hepes，400mM NaCl，pH 7.0洗脱蛋白病通过0.22μm的最终过滤器过滤到无菌袋中。
接下来进行了Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用层析。制备了Phenyl-Sepharose(PS)柱(9.1L树脂，高度＝29cm，直径＝20cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0对该柱进行平衡化。对上述的蛋白洗脱物补加2M硫酸铵，1M磷酸钾和1M CaCl2储备溶液分别至5mM，0.5M和0.1mM的终浓度。将蛋白以100cm/小时的流速装载到PS柱上。以100cm/小时加入5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mMCaCl2 pH 7.0。将流出物通过0.22μm的最终过滤器进入无菌袋。
将经PS纯化的蛋白载入到氨基苯硼酸盐柱上(ProMedics)(6.3L树脂，高度＝20cm，直径＝20cm)，该柱已用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行了平衡化。将蛋白以100cm/小时的流速通过该柱，并用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤该柱。接着用20mMN-二羟乙基甘氨酸，100mM NaCl，pH 9.0洗涤该柱以及用50mM Hepes，100mM NaCl pH 6.9洗脱蛋白通过无菌过滤器并进入20L无菌袋内。测试洗脱物的生物负荷、蛋白浓度以及酶活性。
用5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mM CaCl2 pH 7.0对羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad)(1.6L树脂，高度＝10cm，直径＝14cm)进行平衡化。收集洗涤样品并测试pH，传导率和内毒素(LAL测定)。对经氨基苯硼酸盐纯化的蛋白添加磷酸钾和CaCl2以产生5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2的终浓度并将其以100cm/小时的流速装载到HAP柱上。用5mM磷酸钾pH 7.0，100mMNaCl，0.1mM CaCl2，接着10mM磷酸钾pH 7.0，100mM NaCl，0.1mM CaCl2pH洗涤该柱。用70mM磷酸钾pH 7.0洗脱蛋白并通过0.22μm过滤器过滤到5L无菌存储袋内。测试该洗脱物的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
将经过HAP纯化的蛋白经压力槽泵送通过20nM病毒去除过滤器。将该蛋白加入到DV20压力槽和过滤器(Pall Corporation)，通过具有20nm孔的Ultipor DV20过滤器(PallCorporation)进入无菌的20L存储袋内。测试滤出液的蛋白浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征，以及过程相关的杂质。接着将滤出液中的蛋白用10kD分子量截断值(MWCO)的Sartocon Slice切向流过滤(TFF)***(Sartorius)浓缩至1mg/mL。过滤器首先通过用Hepes/盐溶液(10mM Hepes，130mM NaCl，pH 7.0)洗涤而进行准备以及对渗透物进行取样用于pH和传导率。在浓缩后，对浓缩的蛋白取样并测试蛋白浓度和酶活性。对浓缩的蛋白进行了6×的缓冲液更换而进入最终的缓冲液：10mM Hepes，130mM NaCl，pH 7.0。使浓缩的蛋白通过0.22μm过滤器进入20L无菌存储袋。对该蛋白进行取样并测试蛋白浓度、酶活性、自由的巯基、寡糖特征和摩尔渗透压浓度。
对于每个3D35M细胞批次，表4至10对提供了涉及上述每个纯化步骤的监控数据。
表4.Q sepharose柱数据
表5.Phenyl Sepharose柱数据
表6.氨基苯硼酸盐柱数据
表7.羟基磷灰石柱数据
表8.DV20过滤数据
表9.最终浓缩数据
参数 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
起始体积(mL) 4575 3298 2963 3492
浓缩物体积(mL) 562 407 237 316
浓缩物的蛋白浓度(mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73
蛋白产量(％) 111 102 103 98
表10.缓冲液更换进入最终配置的数据
将经纯化和浓缩的可溶性rHuPH20蛋白无菌填充到具有5mL和1mL填充容积的无菌小瓶中。将该蛋白通过0.22μm的过滤器至由操作员控制的泵，该泵用于通过重量分析读数来填满所述小瓶。该小瓶用塞子封闭并用皱褶盖(crimped caps)保护。通过视觉检查该封闭的小瓶的外来粒子并继而加上标签。在加标签后，将该小瓶通过在液氮中浸没不超过1分钟来进行速冻并储存在≤-15℃(-20±5℃)。使用此方法对可溶性rHuPH20进行的生产和纯化产生了大约400-700mg具有96,000单位/mg到144,000单位/mg比活性的可溶性rHuPH20。
实施例4：Gen2可溶性rHuPH20的生产
使上述的Gen13D35M细胞系适应较高的甲氨蝶呤水平从而产生了Gen2克隆。将3D35M细胞由已建立的含甲氨蝶呤的培养物播种到含有8mM GlutaMAXTM-I和1.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中。通过将该细胞在37℃，7％CO2加湿的培养箱中于46天期间培养和传代9次而使其适应较高的甲氨蝶呤水平。将扩增的细胞群体通过在含有具有2.0μM甲氨蝶呤的培养基的96孔组织培养平板中进行有限稀释而克隆出来。大约4星期后，对克隆进行鉴定并选择克隆3E10B用于扩增。使3E10B细胞在含有8mMGlutaMAXTM-I和2.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中生长20次传代，并通过台盼蓝染色和用血细胞计数器计数来测试细胞生存力，以及通过微浑浊测定法测试酶活性(在下文实施例9中描述)。创建了3E10B细胞系的主细胞库(MCB)，将其冷冻并用于接下来的研究。
该细胞系的扩增通过将3E10B细胞在含有8mM GlutaMAXTM-I和4.0μM甲氨蝶呤的CDCHO培养基中培养而继续进行。在第12次传代后，将细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。将一小瓶的RCB解冻并在含有8.0μM甲氨蝶呤的培养基中培养。5天后，将该培养基中的甲氨蝶呤浓度提高到16.0μM，继而18天后20.0μM。将来自含有20.0μM甲氨蝶呤的培养基中第8次传代的细胞，通过在含有具有4mM GlutaMAXTM-I和20.0μM甲氨蝶呤的培养基的96孔组织培养平板中进行有限稀释而克隆出来。5-6星期后鉴定出克隆1B3、2B2和5C1。来自3D35M第9次传代的细胞也通过在含有具有8mM GlutaMAXTM-I和20.0μM甲氨蝶呤的培养基的96孔组织培养平板中进行有限稀释而克隆出来，并鉴定出克隆1G11、2E10和2G10。
将1B3、2B2、5C1、1G11、2E10和G10每个的细胞培养物以4×105细胞/mL的密度播种在250mL摇瓶内的50mL体积中。使该培养物在不加入额外的加料的情况下生长和衰亡10-14天以确定细胞的生长速率和生产力。周期性的取样并测定样品的透明质酸酶活性(表11和12)。
表11.1B3、2B2和5C1细胞的透明质酸酶活性
表12.1B3、2B2和2E10细胞的透明质酸酶活性
将四个细胞系(2B2、2G10、1G11和2E10)在研究中进行对比，在该研究中中所有的均以4×105细胞/mL的密度播种在250mL摇瓶内的50mL体积中。所有的均在第8天接受10％(v/v)的加料以及5％的加料，所述加料为含加料培养基的CD CHO培养基其中补加了50g/L葡萄糖、40g/L酵母提取物和1.1g/L丁酸钠。在第15天收获该细胞。周期性地取样并测定样品的可溶性rHuPH20酶活性(表13)。
表13.2E10、1G11、2G10和2B2细胞的透明质酸酶活性
在分批和分批加料的条件下，2B2细胞的培养物展现出较高的酶活性，尽管其它细胞(例如2G10细胞)也展现出良好的酶生产力，因而该2B2细胞系被选择用于在含有20.0μM甲氨蝶呤的培养基中进行扩增。在第11次传代后，将2B2在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。
实施例5：3E10B和2B2细胞中产生的可溶性rHuPH20的酶活性
使用微浑浊测定法来测定由3E10B和2B2细胞产生的可溶性rHuPH20的酶活性(实施例9)。将3E10B和2B2细胞库的冷冻小瓶解冻并将细胞在生长培养基中(具有8mMGlutaMAXTM-I和或者2.0μM甲氨蝶呤用于3E10B细胞，或者20.0μM甲氨蝶呤用于2B2细胞的CDCHO培养基)于37℃，6％CO2的加湿培养箱中分别培养两个传代。将细胞以5×105细胞/mL接种到125mL Erlenmeyer瓶(Corning)内的20mL生长培养基中，并在37℃，6％CO2加湿的培养箱中用摇动平台以大约100rpm摇动培养。在第8天和第10天，该培养物接受5％v/v含加料培养基的CD CHO培养基其中补加了50g/L葡萄糖、50g/L酵母提取物、和2.2g/L(20mM)丁酸钠，从而开始生产阶段。在生产阶段期间于第8天(190小时)、第10天(240小时)、第14天(332小时)、第15天(258小时)、第16天(382小时)和第18天(427小时)对该培养物进行取样，并且生存力允许衰退至零。继而分析样品的透明质酸酶活性。
表14和15列出了所述3E10B盒2B2细胞在每个时间点的生存力(存活细胞密度(VCD)和生存力百分比)以及活性(单位/瓶)。2B2细胞产生的可溶性rHuPH20的酶活性始终比3E10B细胞所产生的要高。例如，在第8天，2B2细胞产生的可溶性rHuPH20的酶活性比3E10B细胞所产生的要高69％(2484单位/mL对比1469单位/mL)。类似的趋势在整个生产阶段均可观察到。细胞培养物的生存力以类似的速率衰退。当计算细胞的生产速率时，观察到3E10B细胞在第8天每个细胞每天(pcd)产生了0.23皮克的可溶性rHuPH20而在第15天为0.38pcd。作为比较，2B2细胞在第8天pcd产生了0.46皮克可溶性HuPH20而在第15天为0.69pcd，分别比3E10B在第8天和第15天的生产高100％和82％。继而制备了2B2细胞的主细胞库(MCB)用于接下来的研究。
表14.克隆3E10B的生存力和活性
表15.克隆2B2的生存力和活性
实施例6：2B2细胞的遗传学稳定性测试
A.2B2细胞中编码可溶性rHuPH20的核酸区拷贝数的确定
2B2细胞中编码可溶性rHuPH20的核酸区拷贝数通过PCR确定。使用QIAamp DNeasy试剂盒(Qiagen)从2×107来自MCB的2B2细胞中提取总基因组DNA。也从DG-44CHO中提取基因组DNA作为阴性对照。所提取的DNA的纯度用琼脂糖凝胶电泳和UV分光光度计进行验证。为产生DNA的片段(相对于高分子量的DNA)，将所述基因组DNA用超声处理进行剪切。这保证了更准确的吸移和模板的可接近性。制备了来自2B2和DG-44细胞的基因组DNA的6个独立的稀释(至稀释的量等价于大约1000细胞/μl)并将其在两个测定中一式双份的进行分析；定向测定，其定向于并扩增特异于编码可溶性rHuPH20质粒DNA的核酸区的序列，以及内源对照，其定向于并扩增GAPDH序列。所述内源对照被用作将结果归一化。所述定向测定包括由已知量的HZ24质粒的系列稀释混入DG-44CHO基因组DNA所产生的标准曲线。所述内源对照包括由DG-44CHO基因组DNA的系列稀释混入HZ24质粒DNA所产生的标准曲线。哺乳动物基因组大假定为3×109碱基对。每个测定包括阴性对照(无模板)阳性对照(HZ24质粒DNA用于定向测定以及宿主细胞DNA用于内源归一化测定)。反应的准备是用HZM3.P1正向引物和HZM3.P2反向引物(分别在SEQ ID NO：52和53中列出)以及HZM3探针(SEQ ID NO：54)，其含有荧光染料6FAM(6-羧基荧光素)和TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。将样品用AppliedBiosystems 7900Sequence Detection System以标准循环条件(50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒以及60℃1分钟进行40个循环)进行扩增。
对2B2基因组DNA的6个稀释，每个细胞的靶标基因拷贝数被计算为靶标拷贝与归一化的拷贝(GAPDH)的比率。将Dixon Q Outlier统计检验应用于数据组。2B2细胞中编码可溶性rHuPH20质粒的核酸区拷贝数被发现为206.61±8.35。
B.mRNA序列分析
确定了由2B2细胞中HZ24质粒所产生的PH20mRNA。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从2×107来自MCB的2B2细胞中提取RNA。将样品用DNase I处理以去除污染的DNA，而RNA的纯度通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计进行验证。用所提取的RNA和寡聚d(t)以及任意的引物进行了使用SuperScriptTM反转录酶(Invitrogen)的反转录反应以及缺乏反转录酶的对照反应。继而将作为结果的cDNA产物癌PCR扩增中用作模板。使用了两个不同组的引物对；AP01/AP03和AP10/AP12。AP01/AP03设计为扩增1719个碱基对的区域，而引物对AP10/AP12设计为扩增较大的区域(1811个碱基对)以获得3’末端的反向链。表5列出了引物的序列。每个PCR反应包括单一的引物对照，阴性对照使用所述无反转录酶的对照(如上述)作为模板，以及使用对照引物和对照模板的阳性对照。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化并被确认为预期的大小，继而通过凝胶萃取或EXOSAP(USB)进行纯化以去除过量的引物和dNTP。
经纯化的产物使用Terminator v 1.1Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biosystems)以及表16中所列引物进行测序。将测序数据进行组合并使用Sequencher软件版本4.1.2(Gene Code Corporation)将衍生出的共有序列(SEQ ID NO：55)与参考序列进行对比。总共产生了测序数据的1449个碱基对。该序列被发现为与参考序列(SEQ ID NO：47)相同除了在位置1131有一个碱基对的差异，其观察为胸苷(T)而不是所预期的胞嘧啶I。这是个沉默突变，对氨基酸序列无影响。
表16.用于PCR扩增和测序的引物
引物名称 序列 SEQ ID NO.
AP01 TTCTCTCCACAGGTGTC 56
AP02 AAGATTTCCTTACAAGAC 57
AP03 TGGCGAGAGGGGAAAGAC 58
AP04 CCATTTATTTGAACACTC 59
AP06 CCGAACTCGATTGCGCAC 60
AP07 AGCCATTCCCAAATTGTC 61
AP08 CTCCCAGTTCAATTACAG 62
AP09 CGTTAGCTATGGATCCTC 63
AP10 CGAGACAGAGAAGACTCTTGCG 64
AP12 CATTCAACAGACCTTGCATTCC 65
C.2B2细胞的DNA印迹分析
对2B2细胞进行DNA印迹分析以获得结构图。使用***(Promega)从1×1072B2细胞和1×107对照DG-44细胞中提取总DNA。用琼脂糖凝胶电泳评价所提取的DNA以及HZ24质粒对照构建物的纯度。用Spe I、Xba I、和使用BamH I/Hind III的双消化来消化来自2B2细胞、DG-44细胞和HZ24质粒对照的DNA。对HZ24质粒进行另一次BamHI/Hind消化并将大约的1.4kb用凝胶萃取来纯化以及用α-32P进行放射性标记以产生标记的探针。将经过消化的2B2DNA和DG-44DNA的每个大约10μg，以及10μg DG-44DNA与250pg HZ24质粒DNA，在琼脂糖凝胶上进行电泳。在电泳后对凝胶拍摄图片，接着进行DNA印迹的转移。将尼龙膜与所述经标记的探针杂交继而在室温洗涤30分钟接着两次在55℃30分钟。初始的放射自显影曝光24小时并通过视觉进行检查。经确定需要更长的曝光，于是第二次放射自显影曝光3天，是为了杂交条带更深的曝光。冲洗胶卷后，用(Alpha Innotech)确定条带的大小。
对DG-44阴性对照的消化物未观察到杂交条带而在HZ24消化物中观察到单一的杂交条带(BamH I/Hind III消化物：～1.4kb；Spe I消化物：～6.6kb；Xba I消化物：～6.5kb)。使用Spe I消化的2B2DNA观察到一个～7.7kb的主要杂交条带和4个次要杂交条带(～13.9，～6.6，～5.7和～4.6kb)，使用XbaI消化的2B2DNA观察到一个～5.0kb的主要杂交条带和2个次要杂交条带(～13.9和～6.5kb)，以及使用BamH I/Hind III消化的2B2DNA观察到～1.4kb的单一杂交条带。在BamH I/Hind III中出现的～1.4kb的单一杂交条带表明在探测区域内没有大序列的***或缺失。来自单一Xba I和Spe I消化物的结果表明在2B2细胞基因组内有多重的HZ24质粒的整合位点。
实施例7：Gen2可溶性rHuPH20在30L生物反应器细胞培养中的生产
使用36L生物反应器(30L培养物体积)从2B2细胞生产和纯化可溶性rHuPH20以确定扩大至400L生物反应器(300L培养物体积)的最佳过程。在下文A到D节详述了4个分别的36L生物反应器的运行。
A.可溶性rHuPH20批次056-099和056-100的生产和鉴别
将一小瓶的2B2(1×107细胞)解冻并在37℃，7％CO2于补加了20μM甲氨蝶呤和40mL/L GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养8个传代，之后将其扩增至600mL。一星期后，将该培养物在补加了40mL/L GlutaMAXTM-I而没有甲氨蝶呤的CD CHO培养基中扩增至5L。含有补加了1L GlutaMAXTM-I和30mL硫酸庆大霉素的25LCDCHO培养基的36L生物反应器用所述的5L培养物以3.6×105细胞/mL的初始播种密度进行接种。该生物反应器搅动的设定值设为75RPM；温度：37℃；pH：7.15；溶解氧：30％。该生物反应器接受经过滤的空气覆盖及空气/氧/CO2喷射，由Applikon控制器进行控制。
在整个生物反应器运行期间对该培养物加料7次，在接种后161、184、237、256、280、304和328小时。通过蠕动泵将加料培养基过滤进入生物反应器。整个运行期间每个加料培养基的成分以及该生物反应器的加料参数分别在表17和18中提供。
表17.加料培养基配置
表18.生物反应器参数
对该生物反应器进行收获并通过***进行过滤，该***含有分别具有孔大小8μm、0.65μm、0.45μm和0.22μm的一系列囊式过滤器(Sartorius)。收获用蠕动泵进行并在大约5小时内完成，产生大约32L所收获的细胞培养液(HCCF)。对该HCCF添加EDTA和Tris至每个10mM的终浓度，pH 7.6。继而将该HCCF在浓缩和接收缓冲液更换前储存在2-8℃。
为浓缩蛋白，将具有30kDa MWCO的2.5ft2 Millipore螺旋形缠绕式滤芯首先在150mM NaCl，10mM Hepes，10mM EDTA，pH 7.5中进行平衡化。将15L的HCCF浓缩15×至1L。用150mM NaCl，10mM Hepes，10mMEDTA，pH 7.5的缓冲液对该浓缩物进行10×的缓冲液更换，并将渗余物通过0.2μm囊过滤到2L储存袋内，至1.1L的终体积。该渗余物继而被储存在2-8℃。
经浓缩和缓冲液更换的蛋白溶液继而用柱层析通过Q Sepharose柱、phenylSepharose柱、氨基苯基柱和羟基磷灰石柱进行过滤。对每个层析步骤之前和之后该蛋白溶液中的透明质酸酶单位进行评估并用于确定每个步骤的产量。
简要地，将具有1.1L柱床的Q sepharose柱用2.8L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用2.5L的10mM Hepes，400mMNaCl，pH 7.0对其进行清洁，在4.1L注射用无菌水(SWFI)中清洗并用2.5L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.0进行平衡化。将经过缓冲液更换的蛋白(1L 170,160单位/mL)装载到该柱上。流出物为1.0L 479单位/mL，表明几乎所有的产物均结合到树脂上。用4L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH7.0和4.2L的10mM Hepes，50mM NaCl，pH 7.0洗涤该柱。继而将产物在3.0L的10mM Hepes，400mM NaCl，pH 7.0中洗脱，产生3L 49,940单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有2.1L柱床的Phenyl Sepharose柱用4.8L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用5.0L SWFI对其进行清洗并用4.6L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁以及用6.8L SWFI再次清洗。继而将该柱在5.5L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵中进行平衡化。将10.3mL的1M磷酸钾一元碱，10.3mL 1M磷酸钾二元碱和0.42mL 1mLCaCl2加入到QSepharose柱的洗脱物中。继而将其装载到所述柱上并收集流出物和追踪物(chase)(1L的5mM磷酸钾，0.5mM硫酸铵)，产生7.4L20,030单位/mL。将该产物通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有1.8L柱床的氨基苯硼酸盐柱用4.5L 1.0N NaOH消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用3.9L SWFI对其进行清洗，用4.2L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁并用4.0L SWFI再次清洗。继而将该柱用7.5L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行平衡化。将来自Phenyl Sepharose柱的流出材料补加硫酸铵至0.5M的终浓度后装载到所述氨基苯硼酸盐柱上。用6.5L的5mM磷酸钾pH 7.0，继而用7.8L的20mM N-二羟乙基甘氨酸，pH 9.0再用9.0L的20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mM NaCl，pH9.0对该柱进行洗涤。用4.8L 50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0将产物洗脱，得到4.8L 22,940单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有0.8L柱床的羟基磷灰石柱用2.7L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。用2.1L的200mM磷酸钾，pH 7.0对该柱进行中和继而在2.2L的5mM磷酸钾，100mM NaCl中进行平衡化。将9.1mL的1M磷酸钾一元碱，9.1mL 1M磷酸钾二元碱和0.452mL1mLCaCl2加入到来自氨基苯硼酸盐柱的洗脱物中。继而将其装载到所述柱上而流出物为4.5L 10单位/mL，表明可溶性HuPH20良好的结合。用3.3L的5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而用2.9L的10mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0对该柱进行洗涤。用1.0L的70mM磷酸钾，pH 7.0将产物洗脱，得到1L 130,000单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
使用已在130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0中平衡化的2.5ft2Millipore 30kDaMWCO滤芯对所述纯化的产物进行浓缩。将该产物浓缩74mL，并用130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0的缓冲液进行10×的缓冲液更换继而通过0.2μm过滤器进行过滤。进行A280的测量并且其表明蛋白浓度是11.3mg/mL。加入另外的9.6mL的130mM NaCl，10mM Hepes，pH7.0缓冲液使该蛋白浓度成为10mg/mL(批次056-99)。将10mL的该10mg/mL蛋白溶液在缓冲液中稀释以产生1mg/mL的溶液(批次056-100。两个溶液均通过0.2μm过滤器进行过滤。
将配置好的产物填充到10mL和1mL的玻璃小瓶中，其总的结合产生了761mg可溶性rHuPH20。将所述小瓶在-80℃冷冻继而转移到-20℃储存。继而对批次056-99和056-100的活性和纯度进行鉴别。批次056-99和056-100展现出1,350,786单位/mL和129,982单位/mL的酶活性，以及130,00单位/mg和124,00单位/mg的比活性(从酶活性和蛋白浓度计算)。可溶性rHuPH20样品的纯度用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、反相高压液相层析(RP-HPLC)、大小排阻层析(SEC)和离子交换层析进行确定。经RP-HPLC确定，该两个批次的纯度据观察为大约95％。经SEC确定，该两个批次的纯度据观察为大约99％。内毒素水平对批次056-99和056-100分别显示为≤0.5EU/mL和0.1EU/mL。摩尔渗透压浓度据测量对批次056-99和056-100分别为271mOsm/kg和291mOsm/kg。
B.提高可溶性rHuPH20生产的改进：生物反应器批次2B2-20K.5
对上文A节中描述的方法做出了改进。这些改进意为提高产物产量并改善加工的效率和可测量性。下文描述的加工步骤包括将来自研究细胞库的冷冻细胞解冻，在连续的培养中扩增细胞，分批加料生物反应器***的操作，细胞培养液的收获和净化，以及大批量产物的浓缩和缓冲液更换。改进包括，例如，将重组人胰岛素加入到生物反应器培养基中以提高细胞的生长速率和产物表达的水平。加料的次数也从7次降低到5次。还做出了上述方法的其它改进。
将一小瓶的2B2(1×107细胞)解冻并在补加了20μM甲氨蝶呤和40mL/LGlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养，之后将其在补加了40mL/L GlutaMAXTM-I而没有甲氨蝶呤的CD CHO培养基中扩增至100mL、450ml继而至4.5L。含有补加了800LGlutaMAXTM-I、30mL硫酸庆大霉素和100mg重组人胰岛素的20L CDCHO培养基的36L生物反应器用3.6L 2B2培养物以4.3×105细胞/mL的初始播种密度进行接种。该生物反应器搅动的设定值设为80RPM；温度：37℃；pH：7.15；溶解氧：25％。该生物反应器接受经过滤的空气覆盖及空气/氧/CO2喷射，由Applikon控制器进行控制。
在整个13天的生物反应器运行期间对该培养物加料5次，在接种后117、143、196、235、及283小时。通过蠕动泵将加料培养基过滤进入生物反应器。整个运行期间每个加料培养基的成分以及该生物反应器的加料参数分别在表19和20中提供。
表19.加料培养基配置
表20.生物反应器参数
对该生物反应器进行收获并通过含有一系列Millipore Pod过滤器D0HC(0.5m2)和A1HC堆叠组(stack)的***进行过滤，所述堆叠组含有多层经分级孔大小的(graded-pore-size)硅藻土，随后是通过囊式过滤器(Sartorius Sartobran 300)最终过滤到50L储存袋中。收获用蠕动泵进行并在大约2小时内完成，产生大约30L所收获的细胞培养液(HCCF)。对28L的HCCF补加EDTA和Tris至每个10mM的终浓度，及pH 7.5。剩余的21HCCF保留为没有Tris/EDTA，以评估加入Tris/EDTA对浓缩/缓冲液更换步骤的影响。继而将该HCCF在浓缩和接收缓冲液更换前储存在2-8℃。
为浓缩蛋白，将具有30kDa MWCO的0.1m2 Millipore Pellicon 2biomax A筛选盒首先在20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5中进行平衡化。将2L具有和不具有Tris/EDTA的HCCF浓缩10×并用20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5的缓冲液进行10×的缓冲液更换。蛋白水平通过在A260的光吸收而测量。继而将剩余的HCCF(大约26.5L)浓缩并接收缓冲液更换。将两个具有30kDa MWCO的0.1m2Millipore Pellicon 2biomax A筛选盒在TFF中进行组装并在20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5中进行平衡化。将该HCCF浓缩10×至2.5L，并用20mMNa2SO4，10mM Tris，pH 7.5进行10×的缓冲液更换。将渗余物通过0.2μm真空过滤器过滤到1L和500mL的储存袋内，至2.6L的终体积。该渗余物继而被储存在2-8℃。用RP-HPLC分析浓缩和缓冲液更换期间取的样品以确定加入Tris/EDTA对该样品的影响。据观察Tris/EDTA的加入推动了更有效的处理步骤。
C.可溶性rHuPH20批次056-122和056-123(生物反应器批次2B2-20K.6)的生产和鉴别
将上文C节所述的改进并入加工步骤以产生和纯化可溶性rHuPH20的两个批次；批次056-122和056-123。下文描述的过程包括将来自研究细胞库HZ24-2B2的冷冻细胞解冻；在连续的培养中扩增细胞；在30L的规模对36L分批加料生物反应器***的操作；大批量产物的细胞去除、净化和缓冲液更换；4步柱层析；以及配置、填充和终结操作。
将一小瓶的2B2(1×107细胞)解冻并在37℃，7％CO2于补加了20μM甲氨蝶呤和40mL/L GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养，之后在补加了40mL/L GlutaMAXTM-I而没有甲氨蝶呤的CD CHO培养基中将其扩增至400mL继而至4.4L。含有补加了800LGlutaMAXTM-I、100mg重组人胰岛素和30mL硫酸庆大霉素的20L CDCHO培养基的36L生物反应器(Bellco 1964系列)用4L培养物以4.9×105细胞/mL的初始播种密度进行接种。该生物反应器搅动的设定值设为80RPM；温度：37℃；pH：7.15；溶解氧：25％。该生物反应器接受经过滤的空气覆盖及空气/氧/CO2喷射，由Applikon ADI 1030控制器进行控制。
在整个13天的生物反应器运行期间对该培养物加料4次，在接种后127、163、208和小时。通过蠕动泵将加料培养基过滤进入生物反应器。该生物反应器的温度选定值在第7天从37℃降低至36.5℃，在第9天至36.0℃以及最终在第11天至35.5℃。整个运行期间每个加料培养基的成分以及该生物反应器的加料参数分别在表21和22中提供。
表21.加料培养基配置
表22.生物反应器参数
对该生物反应器进行收获并通过含有一系列Millipore Pod过滤器D0HC(0.5m2)和A1HC堆叠组(0.1m2)的***进行过滤，所述堆叠组含有多层经分级孔大小的硅藻土，随后是通过囊式过滤器(Sartorius Sartobran 300)最终过滤到20L储存袋中。收获用蠕动泵进行并在大约1小时内完成，产生大约34L所收获的细胞培养液(HCCF)。这包括29L生物反应器的体积加上大约5L的PBS追踪物。对该HCCF补加EDTA和Tris至每个10mM的终浓度，及pH7.5。继而将该HCCF在浓缩和接收缓冲液更换前储存在2-8℃。
为浓缩蛋白，将具有30kDa MWCO的7.0ft2 Sartorius Sartocon 2交流式盒首先在20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5中进行平衡化。将34L的HCCF浓缩10×至3L并用20mMNa2SO4，10mM Tris，pH 7.5的缓冲液对该浓缩物进行10×的缓冲液更换。将渗余物通过0.2μm囊式过滤器过滤到5L储存袋内，至3.0L的终体积。该渗余物继而被储存在2-8℃。
经浓缩和缓冲液更换的蛋白溶液继而用柱层析通过Q Sepharose柱、phenylSepharose柱、氨基苯基柱和羟基磷灰石柱进行过滤。对每个层析步骤之前和之后该蛋白溶液中的透明质酸酶单位进行评估并用于确定每个步骤的产量。
简要地，将具有1.1L柱床、直径7cm、高28cm的Q sepharose柱用2.1L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用2.5L的10mM Hepes，400mM NaCl，pH 7.0对其进行清洁，在4.5L注射用无菌水(SWFI)中清洗并用4.3L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH7.0进行平衡化。将经过缓冲液更换的蛋白(3L 94,960透明质酸酶单位/mL)装载到该柱上。流出物和第一次洗涤是5830mL 75透明质酸酶单位/mL，表明几乎所有的产物(99.8％)均结合到树脂上。用4.2L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.0和4.6L的10mM Hepes，50mM NaCl，pH7.0洗涤该柱。继而将产物在2.9L的10mM Hepes，400mM NaCl，pH 7.0中洗脱，产生2880mL96,080单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有2.2L柱床的Phenyl Sepharose柱(高28cm，直径10cm)用5.0L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用4.5LSWFI对其进行清洗并用4.6L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁以及用6.8L SWFI再次清洗。继而将该柱在4.6L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵中进行平衡化。将9.6mL的1M磷酸钾一元碱，9.6mL 1M磷酸钾二元碱和0.4mL 1mLCaCl2加入到来自Q Sepharose柱的洗脱物中。继而将其装载到所述柱上并收集流出物和追踪物(5mM磷酸钾，0.5mM硫酸铵)，产生6905mL 36,280单位/mL。将该产物通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有2.2L柱床的氨基苯硼酸盐柱(高29cm，直径10cm)用3.8L 1.0N NaOH消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用5.0L SWFI对其进行清洗，用5.0L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁并用5.0L SWFI再次清洗。继而将该柱用5.0L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行平衡化。将来自Phenyl Sepharose柱的流出材料装载到所述氨基苯硼酸盐柱上。用9.9L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而用9.7L的20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH9.0再用9.9L的20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mM NaCl，pH 9.0对该柱进行洗涤。用5.0L50mM Hepes，100mMNaCl，pH 7.0将产物洗脱，得到4460mL 48,400单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有1.1L柱床的羟基磷灰石柱(直径7cm，高28cm)用2.7L 1.0NNaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。用2.1L的200mM磷酸钾，pH 7.0对该柱进行中和继而在2.2L的5mM磷酸钾，100mM NaCl中进行平衡化。将11.2mL的1M磷酸钾一元碱，11.2mL 1M磷酸钾二元碱和0.45mL 1mL CaCl2加入到来自氨基苯硼酸盐柱的洗脱物中。继而将其装载到所述柱上并接下来用3.5L的5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而用3.5L的10mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0对该柱进行洗涤。用1.4L的70mM磷酸钾，pH 7.0将产物洗脱，得到1260mL 152,560单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
使用已在130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0中平衡化的0.05ft2Millipore 30kDaMWCO滤芯对所述纯化的产物进行浓缩。将该产物从1250mL 1.04/mg/mL浓缩至120mL并用130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0的缓冲液进行10×的缓冲液更换继而通过0.2μm过滤器进行过滤。进行了A280的测量并且其表明剩余118ml的可溶性rHuPH20浓度为11.45mg/mL.加入另外的17mL的130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0缓冲液使该蛋白浓度成为10mg/mL(批次056-122)。将10mL的该10mg/mL蛋白溶液在缓冲液中稀释以产生1mg/mL的溶液(批次056-123。两个溶液均通过0.2μm过滤器进行过滤。
将配置好的产物填充到10mL和1mL的玻璃小瓶中，其总的结合产生了1308mg可溶性rHuPH20。将所述小瓶在-80℃冷冻继而转移到-20℃储存。继而对批次056-122和056-123的活性和纯度进行鉴别。批次056-122和056-123展现出1,376,992单位/mL和129,412单位/mL的酶活性，以及136,900单位/mg和124,400单位/mg的比活性(从酶活性和蛋白浓度计算)。可溶性rHuPH20样品的纯度用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、反相高压液相层析(RP-HPLC)、大小排阻层析(SEC)和离子交换层析进行确定。经RP-HPLC确定，该两个批次的纯度据观察为大约96.2％。经SEC确定，该两个批次的纯度据观察为大约99％。内毒素水平对批次056-122和056-123分别显示为≤0.8EU/mL和0.09EU/mL。摩尔渗透压浓度据测量对批次056-122和056-123分别为265mOsm/kg和256mOsm/kg。每个的pH为7.2。
D.在30L生物反应器细胞培养中Gen 2可溶性rHuPH20生产的可重复性
上述对于批次B2-20K.6的过程被用于接下来的批次以证明该过程的可重复性。该过程通过在紧接柱层析步骤前加入了病毒失活的步骤而稍微进行了改变。
将一小瓶的2B2(1×107细胞)解冻并在37℃，7％CO2于补加了20μM甲氨蝶呤和40mL/L GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养7个传代，之后将其在补加了40mL/L GlutaMAXTM-I而没有甲氨蝶呤的CD CHO培养基中扩增至400mL继而至4.4L。含有补加了800mL GlutaMAXTM-I、100mg重组胰岛素和300mg硫酸庆大霉素的20LCD CHO培养基的36L生物反应器用3L培养物以4.7×105细胞/mL的初始播种密度进行接种。该生物反应器搅动的设定值设为80RPM；温度：37℃；pH：7.15；溶解氧：25％。该生物反应器接受经过滤的空气覆盖及空气/氧/CO2喷射，由Applikon ADI 1030控制器进行控制。
在整个13天的生物反应器运行期间对该培养物加料4次，在接种后127、163、208和小时。通过蠕动泵将加料培养基过滤进入生物反应器。该生物反应器的温度选定值在第7天从37℃降低至36.5℃，在第9天至36.0℃以及最终在第11天至35.5℃。整个运行期间每个加料培养基的成分以及该生物反应器的加料参数分别在表23和24中提供。
表23.加料培养基配置
表24.生物反应器参数
对该生物反应器进行收获并通过含有一系列Millipore Pod过滤器D0HC(0.5m2)和A1HC堆叠组(0.1m2)的***进行过滤，所述堆叠组含有多层经分级孔大小的硅藻土，随后是通过囊式过滤器(Sartorius Sartobran 300)最终过滤到20L储存袋中。收获用蠕动泵进行并在大约75分钟内完成，产生大约30L的所收获的细胞培养液(HCCF)。这包括28L生物反应器的体积加上大约2L的PBS追踪物。对该HCCF补加EDTA和Tris至每个10mM的终浓度，及pH7.5。继而将该HCCF在浓缩和接收缓冲液更换前储存在2-8℃。
为浓缩蛋白，将具有3×1.0ft2 Sartocon Slice交流式盒(30kDa MWCO)的Sartorius Slice***首先在20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5中进行平衡化。将30L的HCCF浓缩10×至3L并用20mM Na2SO4，10mM Tris，pH 7.5的缓冲液对该浓缩物进行10×的缓冲液更换。浓缩期间的平均流通率是115mL/分钟而平均跨膜压是16psig。渗滤期间的平均流通率是150mL/分钟而平均跨膜压是15psig。将渗余物通过0.2μm囊式过滤器过滤到5L储存袋内，至3.0L的终体积。该渗余物继而被储存在2-8℃。
病毒失活是通过，将235mL经过滤的10％w/w Triton X-100溶液，SWFI中的35w/w磷酸三丁酯与2.15L的室温浓缩和更换缓冲液的蛋白在以30-40rpm搅拌的玻璃转瓶中混合，而进行的。45分钟后，将该蛋白溶液装载到Q sepharose柱上(如下文所述)。该装载耗时24分钟，其致使总共的对该洗涤剂溶液的暴露时间为69分钟。
将具有1.1L柱床、直径7cm、高28cm的Q sepharose柱用2.1L 1.0NNaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用2.5L的10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0对其进行清洁，在4.5L注射用无菌水(SWFI)中清洗并用4.5L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.0进行平衡化。将经过缓冲液更换、病毒失活的蛋白(2385mL 133,040透明质酸酶单位/mL)装载到该柱上。The用4.5L的10mM Hepes，25mM NaCl，pH 7.0和4.5L的10mM Hepes，50mM NaCl，pH7.0洗涤该柱。继而将产物在2.5L的10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0中洗脱，产生2500mL133,680单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有2.2L柱床的Phenyl Sepharose柱(高28cm，直径10cm)用5.0L 1.0N NaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用6.0LSWFI对其进行清洗并用4.6L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁。加入9.6mL的1M磷酸钾一元碱，9.6mL 1M磷酸钾二元碱和0.4mL1mL CaCl2以对该柱进行洗脱。继而将其装载到所述柱上并收集流出物和追踪物(5mM磷酸钾，0.5mM硫酸铵)，产生6450mL 43,840单位/mL。将该产物通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有2.2L柱床的氨基苯硼酸盐柱(高29cm，直径10cm)用3.5L 1.0N NaOH消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。继而用5.0L SWFI对其进行清洗，用9.0L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵进行清洁。将来自PhenylSepharose柱的流出材料装载到所述氨基苯硼酸盐柱上。用9.9L的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而用9.9L of 20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH 9.0对该柱进行洗涤。用4.4L 50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0将产物洗脱，得到4389mL 33,840单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
将具有1.1L柱床的羟基磷灰石柱(直径7cm，高28cm)用2.7L 1.0NNaOH进行消毒并在使用前储存在0.1N NaOH中。用3.6L的200mM磷酸钾，pH 7.0对该柱进行中和，继而在3.2L的5mM磷酸钾，100mMNaCl中进行平衡化。将11mL的1M磷酸钾一元碱，11mL 1M磷酸钾二元碱和0.44mL 1mL CaCl2加入到来自氨基苯硼酸盐柱的洗脱物中。继而将其装载到所述柱上并接下来用4.8L的5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而应3.8L的10mM磷酸钾，100mM NaCl，0.5M硫酸铵，pH 7.0对该柱进行洗涤。用1.5L的70mM磷酸钾，pH 7.0将产物洗脱，得到1500mL 114,320单位/mL，并通过0.2μm过滤器进行过滤。
使用已在130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0中平衡化的0.05ft2Millipore 30kDaMWCO滤芯对所述纯化的产物进行浓缩。将该产物从1500mL 0.961mg/mL浓缩至125mL并用130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0的缓冲液进行10×的缓冲液更换继而通过0.2μm过滤器进行过滤。进行了A280的测量并且其表明剩余122ml的蛋白浓度是11.431mg/mL。加入另外的17.5mL的130mM NaCl，10mM Hepes，pH 7.0缓冲液使该蛋白浓度成为10mg/mL(批次056-135)。将10mL的该10mg/mL蛋白溶液在缓冲液中稀释以产生1mg/mL的溶液(批次056-136)。两个溶液均通过0.2μm过滤器进行过滤。
将配置好的产物填充到5mL和1mL的玻璃小瓶中，其总的结合产生了1324mg可溶性rHuPH20。将所述小瓶在-80℃冷冻继而转移到-20℃储存。继而对批次056-135和056-136的活性和纯度进行鉴别。批次056-135和056-136展现出1,301,010单位/mL和127,661单位/mL的酶活性，以及121,600单位/mg和127,700单位/mg的比活性(从酶活性和蛋白浓度计算)。可溶性rHuPH20样品的纯度用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、反相高压液相层析(RP-HPLC)、大小排阻层析(SEC)和离子交换层析进行确定。经RP-HPLC确定，该两个批次的纯度据观察为介于93.5％至93.7％之间。经SEC确定，该两个批次的纯度据观察为超过99％。内毒素水平对批次056-135和056-136分别显示为≤0.84EU/mL和0.09EU/mL。摩尔渗透压浓度据测量对批次056-135和056-136分别为255mOsm/kg和260mOsm/kg。每个的pH为7.2。
实施例8
A.Gen2可溶性rHuPH20在300L生物反应器细胞培养中的生产
将上文实施例7中详述的生产和纯化方法扩大为使用400L生物反应器进行生产。将一小瓶的2B2细胞(1×107细胞)解冻并将其从摇瓶通过转瓶在补加了20μM甲氨蝶呤和8mM GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中扩增。简要地，将该小瓶的细胞在37℃水浴中解冻，加入培养基并将细胞离心。将该细胞在125mL摇瓶中用20mL的新鲜培养基进行重悬并置于37℃，7％CO2的培养箱中。将该细胞在该125mL摇瓶中扩增直至40mL。当细胞密度达到超过1.5x 106细胞/mL时，将培养物扩增到125mL转瓶内的100mL培养物体积中。在37℃，7％CO2温育该瓶。当细胞密度达到超过1.5x 106细胞/mL时，将该培养物扩增到250mL转瓶内的200mL培养物体积中，并将该瓶在37℃，7％CO2温育。当细胞密度达到超过1.5x 106细胞/mL时，将该培养物扩增到1L转瓶内的800mL培养物体积中并在37℃，7％CO2温育。当细胞密度达到超过1.5x 106细胞/mL时将该培养物扩增到6L转瓶内的5000mL培养物体积中并在37℃，7％CO2温育。当细胞密度达到超过1.5x 106细胞/mL时将该培养物扩增到36L转瓶内的32L培养物体积中并在37℃，7％CO2温育。
将400L反应器用蒸汽在121℃灭菌30分钟并加入230mL补加了8mM GlutaMAXTM-I和5mg/L rHuInsulin的CD CHO培养基。在使用前，检查该反应器的污染。将大约30L的细胞以每毫升4.0×105个存活细胞的接种密度和260L的总体积从所述36L转瓶转移到该400L生物反应器(Braun)中。参数是温度选定值，37℃；叶轮速度40-55RPM；容器压力：3psi；空气喷射0.5-1.5L/Min.；空气覆盖：3L/分钟。每日对该反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白产生和保持。在运行期间也加入了养分加料。在120小时(第5天)，加入了10.4L的加料#1培养基(4×CDCHO+33g/L葡萄糖+160mL/L GlutaMAXTM-I+16.6g/L Yeastolate+33mg/LrHuInsulin)。在168小时(第7天)，加入了10.8L的加料#2(2×CD CHO+33g/L葡萄糖+80mL/LGlutaMAXTM-I+33.4g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入了10.8L的加料#3(1×CD CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L GlutaMAXTM-I+50g/LYeastolate+1.80g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36℃。在264小时(第11天)，加入了10.8L的加料#4(1×CD CHO+33g/L葡萄糖+33mL/LGlutaMAXTM-I+50g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为35.5℃。据观察加料培养基的加入显著地增强了最终生产阶段中可溶性rHuPH20的生产。在14天或者当细胞的生存力跌至低于40％时对该反应器进行收获。该过程导致了最终每ml 17,000单位的生产力与一千两百万细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，对该培养物取样用于支原体、生物负荷、内毒素和体外以及体内的病毒，TEM用于病毒粒子、以及酶活性。
将该培养物用蠕动泵泵送通过四个并行的Millistak过滤***模块(Millipore)，所述模块每个含有一层分级为4-8μm的硅藻土和一层分级为1.4-1.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，继而通过第二个单一的Millistak过滤***(Millipore)其含有一层分级为0.4-0.11μm的硅藻土和一层分级为＜0.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，并继而通过0.22μm的最终过滤器进入具有350L容量的无菌一次性软袋。向所收获的细胞培养液补加10mMEDTA和10mM Tris至7.5的pH。由使用四个Sartoslice TFF 30kDa分子量截断值(MWCO)聚苯醚砜(PES)过滤器(Sartorius)的模型切向流过滤(TFF)装置将该培养物浓缩10×，随后是用10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5进行的10×缓冲液更换而进入0.22μm最终过滤器到50L无菌存储袋内。
对该经过浓缩和渗滤的收获物进行病毒失活。在病毒失活前，制备了10％TritonX-100，3％磷酸三正丁酯(TNBP)的溶液。在紧接的Q柱上的纯化前，将该经过浓缩和渗滤的收获物在36L反应锅中暴露于1％Triton X-100，0.3％TNBP1小时。
B.Gen2sHuPH20的纯化
制备了Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。收集洗涤样品用于pH、传导率和内毒素(LAL)测定的确定。用5个柱体积的10mM Tris，20mMNa2SO4，pH 7.5对该柱进行平衡化。在病毒失活后，将所述浓缩的、经渗滤的收获物以100cm/小时的流速载入到该Q上。用5个柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5和10mMHepes，50mM NaCl，pH 7.0对该柱进行洗涤。用10mM Hepes，400mM NaCl，pH 7.0将蛋白洗脱入0.22μm的最终过滤器而进入无菌袋内。测试该洗脱物样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。在更换起始和结尾取得A280光吸收的读数。
接着进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用层析。制备了Phenyl-Sepharose(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤物并取样用于pH、传导率和内毒素(LAL测定)。用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0对该柱进行平衡化。向上述的蛋白洗脱物补加2M硫酸铵，1M磷酸钾和1M CaCl2储备溶液分别产生5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。将该蛋白以100cm/小时的流速装载到PS柱上。以100cm/小时加入5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2 pH 7.0。将流出物通过0.22μm的最终过滤器进入无菌袋。对该流出物进行取样用于生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
制备了氨基苯硼酸盐柱(ProMedics；21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤物并取样用于pH、传导率和内毒素(LAL测定)。用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵对该柱进行平衡化。将PS纯化的蛋白以100cm/小时的流速装载到该氨基苯硼酸盐柱上。用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤该柱。用20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH 9.0洗涤该柱。用20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mM氯化钠，pH 9.0洗涤该柱。用50mM Hepes，100mMNaCl，pH 6.9洗脱蛋白并通过无菌过滤器进入无菌袋。测试该洗脱的样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
制备了羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad；13L树脂，H＝20cm，D＝30cm)。收集洗涤物并测试pH、传导率和内毒素(LAL测定)。用5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH 7.0对该柱进行平衡化。将经氨基苯硼酸盐纯化的蛋白补加终浓度为5mM的磷酸钾和0.1mM CaCl2并将其以100cm/小时的流速装载到HAP柱上。用5mM磷酸钾，pH 7，100mMNaCl，0.1mMCaCl2洗涤该柱。接着用10mM磷酸钾，pH 7，100mM NaCl，0.1mM CaCl2洗涤该柱。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白并使其通过0.22μm无菌过滤器进入无菌袋。测试该洗脱的样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
继而使经HAP纯化的蛋白通过去除病毒的过滤器。首先通过用2L的70mM磷酸钾，pH7.0进行洗涤来制备无菌的Virosart过滤器(Sartorius)。在使用前，对经过滤的缓冲液取样用于pH和传导率。经HAP纯化的蛋白由蠕动泵泵送通过20nM的去除病毒的过滤器。使70mM磷酸钾，pH 7.0中经过滤的蛋白通过0.22μm的最终过滤器而进入无菌袋。测试该过滤了病毒的样品的蛋白浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征(如下文实施例9至10中所述)。
继而用10kD分子量截断值(MWCO)Sartocon Slice切向流过滤(TFF)***(Sartorius)将滤出液中的蛋白浓缩至10mg/mL。该过滤器首先通过用10mM组氨酸，130mMNaCl，pH 6.0进行洗涤而制备并对渗透物取样用于pH和传导率。浓缩之后，对经浓缩的蛋白取样并测试其蛋白浓度和酶活性。对经浓缩的蛋白进行6×的缓冲液更换而进入最终的缓冲液：10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.0。在缓冲液更换后，使经浓缩的蛋白通0.22μm过滤器而进入20L的无菌存储袋。对该蛋白取样并测试蛋白浓度、酶活性、自由巯基、寡糖特征和摩尔渗透压浓度(如下文实施例9至10中所述)。
接着将经无菌过滤的大批量蛋白以20mL分配到30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)中。继而将该小瓶速冻并储存在-20±5℃。用此方法进行的可溶性rHuPH20生产和纯化产生了大约11和15克，具有95,000单位/mg至120,000单位/mg的比活性。
C.Gen1与Gen2sHuPH20的生产以及纯化的比较
在300L生物反应器细胞培养中Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化与在100L生物反应器细胞培养与中Gen1可溶性rHuPH20的生产和纯化相比在方案上含有一些变化(在实施例4中描述)。在单纯的扩大的表便之外，表25列出了方法之间用于示例的差异。
表25.使用100L和300L生物反应器细胞培养的方法进行的可溶性rHuPH20生产及纯化时，Gen1与Gen2之间用于示例的差异
实施例9：可溶性rHuPH20酶活性的确定
使用浊度计测定法来确定样品中如细胞培养物、纯化馏分和纯化的溶液中可溶性rHuPH20的酶活性，所述浊度计测定法基于透明质酸结合血清白蛋白时索性成的不可溶沉淀。通过将可溶性与透明质酸钠(透明质酸)温育一组时间段(10分钟)并加入酸化的血清白蛋白使未消化的透明质酸钠沉淀来测量活性。作为结果的样品的浑浊度在30分钟发展期后于640nm测量。由于对透明质酸钠底物的酶活性而造成的浑浊度的降低是可溶性rHuPH20酶活性的量度。该方法通过由可溶性rHuPH20测定的工作参考标准的稀释所产生的校准曲线来运行，并且样品活性的测量时相对于此校准曲线而做出的。
样品的稀释在酶稀释溶液中制备。该没喜事溶液通过将33.0±0.05mg水解的明胶溶解在25.0mL的50mM PIPES反应缓冲液(140mM NaCl，50mM PIPES，pH 5.5)和25.0mL的SWFI中，以及将0.2mL的25％Buminate溶液稀释到该混合物种并涡动搅拌30秒。这在使用前2小时内进行并储存在冰上直至需要的时候。将样品稀释到估计为1-2U/mL。一般每步最大的稀释不超过1∶100并且用于第一次稀释的初始样品大小不少于20μL。用于进行测定所必需的最小体积是：进程中样品，FPLC馏分：80μL；组织培养物上清：1mL；浓缩的材料80μL；纯化的或最终步骤的材料：80μL。所述稀释在低蛋白结合的96孔平板中以一式三份制备，并将每个稀释的30μL转移到Optilux黑/透明底平板(BD BioSciences)。
在酶稀释溶液中制备具有2.5U/mL浓度的已知可溶性rHuPH20的稀释以产生标准曲线并将其一式三份加入到Optilux平板中。所述稀释包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。含有60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔被包括在该平板中作为阴性对照。继而盖上该平板并将其在加热单台(heat block)上于37℃温热5分钟。去掉盖子并将该平板摇动10秒钟。摇动后，将平板放回加热台并用温热的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg的透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解在20.0mL的SWFI而制备。这通过在2-8℃轻柔的旋转和/或摇摆2-4小时而混合，或直至完全溶解)对MULTIDROP384液体操作装置进行打底。将反应平板转移到该MULTIDROP 384并通过按开始键将30μL透明质酸钠分配到每个孔而使反应开始。继而将该平板从MULTIDROP 384移开并盖上盖子在转移到加热台前摇动10秒钟。将该平板在37℃温育10分钟。
通过用血清工作溶液对所述MULTIDROP 384进行打底并改变体积设置为240μL，来准备好该机器用于停止反应。(25mL的血清储备溶液[将1体积的马血清(Sigma)用9体积的500mM醋酸缓冲溶液稀释并用盐酸将pH调至3.1]在75mL的500mM醋酸缓冲溶液中)。将该平板从加热台上移开并置于MULTIDROP 384上，并将240μL的血清工作溶液分配到孔中。移开所述平板并将其在平板读数器上摇动10秒钟。再过15分钟后，在640nm测量样品的浑浊度而每个样品的酶活性(以U/mL)通过与标准曲线比对而进行确定。
比活性(单位/mg)通过用酶活性(U/ml)除以(mg/mL)而计算。
实施例10：唾液酸和单糖含量的确定
可溶性rHuPH20的唾液酸和单糖含量可通过用三氟乙酸水解后的反相液相层析(RPLC)来进行评估。在一个实例中，确定了纯化的透明质酸酶批次#HUB0701E(1.2mg/mL；基本按照实施例8中所述进行生产和纯化)的唾液酸和单糖的含量。简要地，将100μg样品一式两份用40％(v/v)的三氟乙酸在100℃水解4小时。水解后，将样品完全干燥并在300μL水中重悬。将来自每个重悬样品的45μL整分试样转移到新的管中并完全干燥，并向每个加入10μL的10mg/mL乙酸钠溶液。通过加入50μL在甲醇中含有30mg/mL邻氨基苯甲酸、20mg/mL氰基硼氢化钠、大约40mg/mL乙酸钠和20mg/mL硼酸的溶液，而将所释放的单糖荧光标记。在80℃于黑暗中将该混合物温育30分钟。通过加入440μL的流动相A(0.2％(v/v)正丁胺，0.5％(v/v)磷酸，1％(v/v)四氢呋喃)而使衍生反应猝灭。也按照对透明质酸酶的描述而对水的基质空白进行了水解和衍生以作为阴性对照。通过使用Octadecyl(C18)反相柱(4.6x 250mm，5μm粒子大小；J.T.Baker)的RPLC而将所释放的单糖分离并通过荧光探测(360nm激发，425nm发射)来对其进行监控。单糖含量的定量化是通过将来自透明质酸酶样品的层析图与来自单糖标准的层析图进行对比，所述单糖标准包括N-D-葡萄糖胺(GlcN)、N-D-半乳糖胺(GalN)、半乳糖、海藻糖和甘露糖。表26呈现了每个单糖与透明质酸酶分子的摩尔比率。
表26.可溶性rHuPH20的单糖含量
*GalN结果在检测极限之下
实施例11：来自3D35M和2B2细胞的可溶性rHuPH20的C-端异质性
对量个批次的sHuPH20进行了C-端测序，所述两个批次从100L生物反应器体积中的3D35M细胞(批次HUA0505MA)和300L生物反应器体积中的2B2细胞(批次HUB0701EB)中生产和纯化。所述批次分别用内切蛋白酶Asp-N消化，其特异性地在天冬氨酸和半光磺酸的N-端切断肽键。这在SEQID NO：4位置431的天冬氨酸处释放了可溶性rHuPH20的C-端部分。C-端片段被分离并鉴别以确定s在批次HUA0505MA和批次HUB0701EB中每个种群的序列和丰度。
据观察来自3D35M细胞与2B2细胞的可溶性rHuPH20制备品展现出了异质性，并含有在其C-端序列中与彼此不同的多肽(表27和28)。此异质性很可能是由生产和纯化过程期间在细胞培养基或其它溶液中出现的肽酶对所表达的447个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4)的C-端进行剪切而造成的结果。可溶性rHuPH20制备品中的多肽具有对应于SEQ ID NO：4所示可溶性rHuPH20序列的氨基酸1-447、1-446、1-445、1-444和1-443的氨基酸序列。这些多肽中每一个的完整氨基酸序列分别在SEQ ID NO：4至8中列出。如表27和28所注明的，每个多肽在来自3D35M细胞和2B2细胞的可溶性rHuPH20制备品中的丰度是不同的。
表27.对来自批次HUA0505MA的C-端片段的分析
表28.对来自批次HUB0701EB的C-端片段的分析
实施例12：在2500L生物反应器细胞培养中生产和纯化可溶性rHuPH20
可溶性rHuPH20的生产和纯化可从300L分批加料的生物反应器过程(实施例8中所述)扩大至2500L分批加料的生物反应器过程。与在300L生物反应器细胞培养中rHuPH20的生产相似，在2500L生物反应器细胞培养中rHuPH20生产的进行首先是将一小管的2B2解冻和扩增，在生物反应器中培养，收获和净化培养物，对收获物进行浓缩和缓冲液更换，随后是病毒失活。继而使用一系列利用Q sepharose、Phenyl sepharose、氨基苯硼酸盐和羟基磷灰石硼酸盐的纯化步骤从浓缩物中对rHuPH20进行纯化，随后是病毒过滤。
1.细胞培养物扩增
为产生对2500L生物反应器细胞培养进行播种所需的，相对于300L培养而言更高的细胞数目，将细胞培养物通过125mL摇瓶、250mL摇瓶、1摇瓶、两个2L摇瓶，六个2L摇瓶、25L WAVE生物反应器TM(GE Healthcare Life Sciences)、100L WAVE生物反应器TM、以及600L搅拌罐种子生物反应器(ABEC，Inc.Bethlehem，PA；Stainless Technology division)而进行连续的扩增。在每次扩增，目标播种密度时4x105细胞/mL。贯穿整个扩增的温度是37℃(或介于36℃至38℃之间)具有7％CO2(或介于6-8％之间的CO2)。所述的瓶用大约110RPM(或90-130RPM)搅动，所述25L盒100L WAVE生物反应器TM以20RPM(或者分别是15-25或18-22RPM)摇摆而所述600L种子生物反应器是以90RPM(或85-95RPM)搅动。
首先，将一小瓶来自工作细胞库的2B2细胞(1×107cells)在37℃水浴中解冻大约2分钟(优选不超过5分钟)之后加入培养基并将细胞离心。将该细胞用新鲜的培养基(具有40mL/L(8mM)GlutaMAXTM-I和20μM甲氨蝶呤的CD CHO AGTTM在125mL摇瓶中重悬至大约25mL(或介于20-30mL之间)，并将其置于37℃，7％CO2培养箱中。当细胞密度达到大约8x105细胞/mL时，将该培养物转移到250mL摇瓶内的50mL培养物体积中(或45-55mL)。温育后，当细胞密度达到大约1.6x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至1L摇瓶内的200mL培养物体积中(或190-210mL)并温育。当该1L种的细胞密度达到大约1.6x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至2x 2L的瓶中，每个具有大约400mL的总培养物体积(或每瓶介于350-450mL之间)，并温育。当该2L瓶中的细胞密度达到大约1.2x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至6x 2L的瓶中，每个具有大约400mL的总培养物体积(或每瓶介于350-450mL之间)，并温育。当该2L瓶中的细胞密度达到大约2.5x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至25L WAVE生物反应器TM，具有大约15L的总培养物体积(或介于14-16L之间)并在具有1.5L/分钟的气流的情况下温育。
当该25L WAVE生物反应器TM中的细胞密度达到大2.2x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至100L WAVE生物反应器TM中，具有大约80L的总培养物体积(或介于75-85L之间)，其使用补加了3.6g/L甲氨蝶呤，40mL/LGlutaMAXTM-I和1mL/L 1N NaOH的CD-CHO AGTTM培养基，并在具有1.5L/分钟的气流的情况下温育。当该100L WAVE生物反应器TM中的细胞密度达到大约2.6x 106细胞/mL时，将该培养物扩增至600L种子生物反应器ABEC，Inc.Bethlehem，PA；Stainless Technology division)具有大约480L的总培养物体积(或介于440-520L之间)其使用补加了40mL/LGlutaMAXTM-I的CD-CHO AGTTM培养基，并温育直至该600L生物反应器中的细胞密度达到大约1.6x106细胞/mL。
2.rHuPH20生产
具有3523L总容积和500-2500L工作容积的3500L生物反应器(ABEC，Inc，Bethlehem，PA)被用于rHuPH20高产量的生产。在灭菌后，将约1800-2000L含有24.3g/L粉末化的CD-CHO AGTTM并补加了40mL/LGlutaMAXTM-I和5mg/L rHuInsulin的CD-CHO AGTTM培养基加入到该生物反应器。参数设置为：温度选定值，37℃；叶轮速度75RPM；容器压力：5psi；空气喷射18L/min；溶解氧：25％；pH ≤7.2。使用前，检查该反应器的污染。将大约介于300-500L之间(取决于细胞计数)来自所述600L种子生物反应器培养物的细胞，以每ml 4.0×105存活细胞的接种密度接种到该3500L生物反应器内的细胞培养基中，已达到2100L的总体积。在14天的细胞温育期间，每天对该生物反应器进行取样用于生存力、细胞密度、pH验证和酶活性。温度和溶解氧也受到密切的监控。
在14天的生物反引起运行期间加入养分加料，每次大约4％v/v。在第5天，加入大约84L(或4％v/v)的加料#1培养基(81g/L粉末化CD-CHOAGTTM+33g/L葡萄糖+13.3mL/LGlutaMAXTM-I+83.3g/L Yeastolate+33mg/L rHuInsulin)。在第7天，加入大约87L(或4％v/v)的加料#2(40.5g/L粉末化的CD-CHO AGTTM+33g/L葡萄糖+66.7mL/L GlutaMAXTM-I+166.7g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36.5℃。在第9天，加入大约91L(或4％v/v)的加料#3(20.3g/L粉末化CD-CHO AGTTM+50g/L葡萄糖+50mL/L GlutaMAXTM-I+250g/L Yeastolate+1.8g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36℃。在第11天，加入大约94L(或4％v/v)的加料#4(20.3g/L粉末化CD-CHO AGTTM+33.3g/L葡萄糖+33.3mL/LGlutaMAXTM-I+250g/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为35.5℃。在14天对该反应器进行收获，产生2400-2600L收获物(典型的大约为2500L)。
将该培养物加压转移通过20个并行的Millistak过滤***模块(Millipore)，每个含有一层分级为4-8μm的硅藻土和一层分级为1.4-1.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，继而通过第二个含有10个模块的Millistak过滤***(Millipore)，每个模块具有一层分级为0.4-0.11μm的硅藻土和一层分级为＜0.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，以及再通过0.22μm最终过滤器而进入具有350L容积的无菌一次性软袋。向所收获的细胞培养液补加10mMEDTA和10mM Tris，pH 8.4，至7.5的目标pH。由使用18-21m2Sartoslice TFF 30kDa分子量截断值(MWCO)聚苯醚砜(PES)过滤器(Sartorius)的切向流过滤(TFF)装置(Pall)将该培养物浓缩10×，随后是用10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5进行10×的缓冲液更换至0.22μm的最终过滤器内而进入350L的无菌存储袋。
对经浓缩渗滤的收获物进行病毒失活。在病毒失活前，制备了10％Triton X-100，3％三丁基磷酸酯(TNBP)的溶液。在紧接的Q柱上的纯化之前，在500L不锈钢反应锅内将经浓缩渗滤的收获物暴露于1％TritonX-100，0.3％TNBP至2小时。
B.Gen2rHuPH20的纯化
制备了Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(81L树脂，H＝26cm，D＝63cm)。用5个柱体积的10mM Tris，20mM Na2SO4，pH 7.5对该柱进行平衡化。在病毒失活后，将大约250L的经浓缩渗滤病毒失活的收获物以150cm/小时的流速装载到所述。用5个柱体积的10mMTris，20mM Na2SO4，pH 7.5和10mM Hepes，50mM NaCl，pH 7.0对该柱进行洗涤。用10mMHepes，400mM NaCl，pH 7.0将蛋白洗脱至0.22μm的最终过滤器内而进入无菌袋。测试洗脱物样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。在更换的开始和结尾取得A280光吸收的读数。
接下来进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用层析。制备了Phenyl-Sepharose(PS)柱(176L树脂，H＝35cm，D＝80cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，0.1mM CaCl2，pH 7.0对该柱进行平衡化。向来自上述的蛋白洗脱物补加2M硫酸铵，1M磷酸钾和1M CaCl2储备溶液以分别产生5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。将该蛋白以100cm/小时的流速装载到PS柱上。以100cm/小时加入5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2 pH 7.0。使流出物通过0.22μm的最终过滤器而进入无菌袋。对该流出物取样用于生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
继而制备了氨基苯硼酸盐柱(ProMedics；176L树脂，H＝35cm，D＝80cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵对该柱进行平衡化。将经过PS纯化的蛋白以50cm/小时装载到氨基苯硼酸盐柱上。将流速提高至100cm/小时用于该过程的剩余部分。首先用5mM磷酸钾，0.5M硫酸铵，pH 7.0，继而用20mM N-二羟乙基甘氨酸，0.5M硫酸铵，pH 9.0，接着再用20mM N-二羟乙基甘氨酸，100mM氯化钠，pH 9.0对该柱进行洗涤。用50mM Hepes，100mMNaCl，pH 6.9洗脱蛋白并使其通过无菌过滤器而进入无菌袋。测试洗脱物的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
制备了羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad；116L树脂，H＝23cm，D＝80cm)。The用5mM磷酸钾，100mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH 7.0对该柱进行平衡化。经氨基苯硼酸盐纯化的蛋白被补加至5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2的终浓度并以100cm/小时的流速被装载到HAP柱上。首先用5mM磷酸钾，pH 7，100mM NaCl，0.1mM CaCl2，继而用10mM磷酸钾，pH 7，100mMNaCl，0.1mMCaCl2对该柱进行洗涤。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白并使其通过0.22μm的过滤器而进入无菌袋。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
经HAP纯化的蛋白继而通过病毒去除过滤器。已灭菌的Viosart过滤器(Sartorius)首先通过用2L的70mM磷酸钾，pH 7.0洗涤而进行准备。经HAP纯化的蛋白由蠕动泵泵送通过20nM的病毒去除过滤器。在70mM磷酸钾，pH 7.0中经过滤的蛋白继而通过0.22μm的最终过滤器而进入无菌袋。对该经过病毒过滤的样品测试其蛋白浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征(如实施例9至10、下文所述)。
继而用3个10kD分子量截断值(MWCO)的Sartocon PES盒将滤出液中的蛋白浓缩8-12×，每个所述盒具有0.7m2的过滤表面积，总表面积2.1m2。在浓缩后，对经浓缩的蛋白取样并测试其蛋白浓度和酶活性。继而对该浓缩的蛋白进行10×的渗滤。这可以用以下两种途径之一进行：1)使用20mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5的缓冲液以及1％聚山梨醇酯80；或者2)使用10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5的缓冲液。所述经浓缩渗滤的大批量蛋白为大约10mg/mL的浓度。在缓冲液更换后，使该浓缩的蛋白通过0.22μm的过滤器而进入20L的无菌存储袋。
继而将所述无菌过滤的大批量蛋白以400mL无菌分配到1L的无菌PFA Nalgene瓶中。继而将所述瓶在液氮浴中速冻并将不含聚山梨醇酯80的大批量蛋白储存在低于-20℃，而含有聚山梨醇酯80的大批量蛋白储存在低于-70℃。
表29列出了一些用于示例的在300L与2500L的生物反应器培养物中rHuPH20生产之间的差异
表29.用于示例的在300L与2500L的生物反应器培养物中rHuPH20生产之间的差异
由于修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，因而本发明仅仅由所附权利要求的范围限定。

Claims (6)

1.用于产生可溶性rHuPH20的方法，包括：
a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物接种生物反应器中的细胞培养基以产生细胞培养物，其中：
所述细胞是已转染编码rHuPH20的表达载体的DG44中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；
rHuPH20包含可溶性人PH20多肽；
所述细胞包含150至300个拷贝的编码所述可溶性人PH20多肽的核酸；所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物；
接种细胞密度是4×105细胞/mL；以及
将所述细胞在37℃培养；
b)用含有33g/L葡萄糖、32mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、16.6g/L酵母提取物和33mg/L胰岛素的第一加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；
c)用含有33g/L葡萄糖、16mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、33.4g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第二加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至36.5℃；
d)用含有50g/L葡萄糖、10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50g/L酵母提取物和1.8g/L丁酸钠的第三加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至36℃；
e)用含有33g/L葡萄糖、6.6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第四加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至35.5℃；
f)继续培养该细胞直至生存力跌落到低于50％；和
g)获得收获细胞培养液。
2.用于产生可溶性rHuPH20的方法，包括：
a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物接种生物反应器中的细胞培养基以产生细胞培养物，其中：
所述细胞是已转染编码rHuPH20的表达载体的DG44中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；
rHuPH20包含可溶性人PH20多肽；
所述细胞包含150至300个拷贝的编码所述可溶性人PH20多肽的核酸；所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物；
接种细胞密度是4×105细胞/mL；以及
将所述细胞在37℃培养；
b)用含有33g/L葡萄糖、32mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、83.3g/L酵母提取物和33mg/L胰岛素的第一加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；
c)用含有33g/L葡萄糖、13mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、166.7g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第二加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至36.5℃；
d)用含有50g/L葡萄糖、10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、250g/L酵母提取物和1.8g/L丁酸钠的第三加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至36℃；
e)用含有33g/L葡萄糖、6.7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、250g/L酵母提取物和0.92g/L丁酸钠的第四加料培养基给该细胞加料，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的4％的体积加入到该培养物中；并且
将温度降低至35.5℃；
f)继续培养该细胞直至生存力跌落到低于50％；和
g)获得收获细胞培养液。
3.一种收获的细胞培养液，包含所收获的具有大于5000单位/mL酶活性的可溶性rHuPH20，其中所收获的细胞培养液是指从细胞、细胞碎片和集合物分离的液体，其未进行进一步纯化或浓缩，其中所述收获的细胞培养液通过权利要求1或2的方法制备。
4.权利要求3的收获的细胞培养液，其中所述酶活性是10,000单位/mL、12,000单位/mL、14,000单位/mL、16,000单位/mL、18,000单位/mL、20,000单位/mL、22,000单位/mL或24,000单位/mL。
5.权利要求1的方法，进一步包括：
h)过滤所述收获细胞培养液；
i)使用串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸柱层析或羟基磷灰石柱层析从所述经过滤收获的细胞培养液中纯化rHuPH20。
6.权利要求2的方法，进一步包括：
h)过滤所述收获细胞培养液；以及
i)使用串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸柱层析或羟基磷灰石柱层析从所述经过滤收获的细胞培养液中纯化rHuPH20。
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