CN101970494B - 人源化抗-C5aR抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与人C5a受体结合的人源化抗体及其作为治疗和诊断药剂的用途。本发明进一步涉及编码所述人源化抗体的核酸序列，及其在重组宿主细胞中的表达。特别地，本发明涉及来源于与人C5a受体特异性结合的小鼠抗体7F3的人源化抗体。

Description

人源化抗-C5aR抗体
技术领域
本发明涉及与人C5a受体结合的人源化抗体及其作为治疗和诊断药剂的用途。本研究中进一步涉及编码所述人源化抗体的核酸序列，及其在重组宿主细胞中的表达。特别地，本发明涉及来源于与人C5a受体特异性结合的小鼠抗体7F3的人源化抗体。
背景技术
每种补体蛋白C3-C5的蛋白水解都会产生称为过敏毒素的含有信号分子的氨基末端阳离子片段。这些片段中最有效的片段C5a引发了最广泛的反应。认为炎症反应的组成部分是白细胞边集(margination)和浸润、颗粒结合型蛋白水解酶(granule-boundproteolytic enzyme)的释放、活性氧和氮源自由基的产生、血流和毛细血管渗透性改变以及具有收缩平滑肌的能力，C5a分子是“完全的”促炎性介质。C5a分子在次纳摩尔到纳摩尔水平上引发的所有髓系细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞)的化学趋化作用，并引起血管通透，***素和循环白细胞显著地增强了血管通透性。较高的纳摩尔浓度可以引发NADPH氧化酶的脱粒和活化。这种生物活性的广度与其他炎性介质形成鲜明对比。C5a参与包括风湿性关节炎、牛皮癣、败血症、再灌注损伤和成年呼吸窘迫综合症在内的各种疾病的发病机制(Gerard and Gerard，1994；Murdoch and Finn，2000)。
C5a通过与其受体(C5aR)的结合介导C5a的活性。C5aR属于七次跨膜的G-蛋白偶联受体家族。C5aR是对C5a具有高亲和力的受体，其中Kd为～1nM，其位于包括白细胞在内的一些不同细胞类型上。每个细胞的受体数量都非常高，每个白细胞可高达200,000个位点。受体的生物活化发生在使结合饱和的范围内。
C5aR结构符合七次跨膜受体家族，紧接于细胞外N-末端之后的是七个跨膜螺旋，七个跨膜螺旋通过螺旋间结构域连接，螺旋间结构域交互地作为细胞内和细胞外环，以细胞内C-末端结构域为终点。C5aR含有延伸的N-末端细胞外结构域。这种大型的N-末端结构域是典型的结合包括IL-8和fMet-Leu-Phe(FMLP)受体家族的肽的G-蛋白偶联受体。
用C5aR拮抗剂抑制C5a反应可减少由C5a介导的急性炎性反应，而不影响其他补体成分。为了这个目的，先前已经描述了C5aR肽拮抗剂和抗-C5a受体抗体(Watanabe等人，1995；Pellas等人，1998；Konteatis等人，1994；Kaneko等人，1995；Morgan等人，1993)。例如，WO 95/00164描述了针对C5aR的N-末端肽(残基9-29)的抗体。
WO 03/062278也描述了针对C5aR的抗体。这些小鼠抗体中的三个称为7F3、6C12和12D4。这些抗体显示出优异的性质，例如可非常有效地阻断C5a结合到它的受体，中止体外中性粒细胞的C5a-定向迁移，并阻止动物模型中的炎症。为了控制慢性疾病，有必要在数月或数年内连续几次给予小鼠抗体。然而，给予小鼠抗体的一个缺点是人免疫***可产生针对小鼠抗体(HAMA反应)其自身的抗体。HAMA反应通过从血液迅速清除小鼠抗体使它们无效，从而阻止小鼠抗体与它的靶结合。
为了避免形成HAMA反应，已采取的一个方法是通过用人序列取代非表位结合区中的许多“外来”残基而“人源化”小鼠抗体。然而，这个过程通常导致抗原性的丧失。而且，人源化抗体领域的研究人员一直在努力确定能可靠生产具有人治疗中使用的所有必需要求的人源化抗体的合适方法。
人源化步骤的主要问题在于对抗原的亲和力的丧失(Jones等人，1986)，在一些情况下，损失到十分之一或更少，尤其当抗原是蛋白质时(Verhoeyen等人，1988)。当然，任何亲和力的丧失都是及其不愿意看到的。至少，它意味着必需将更多人源化抗体以更高代价和更大副作用的风险注射到病人中。更严重地，亲和力减小的抗体的生物功能如补体裂解、抗体依赖的细胞毒性或病毒中和作用较差。因而，对基于人源化的治疗或诊断应用有用的任何最后抗体的结构都是当前不可预知的，通常需要数个技术的多次重复和应用从而获得有用的人源化抗体。
需要可用于诊断和/或治疗方法中的可替换的和/或改进的C5aR拮抗剂。特别地，需要开发用于所述人的诊断和/或治疗方法的适宜的人源化抗-C5aR抗体。
发明内容
已生产了大量结合C5aR的人源化抗体，但具有结合特异性差和/或其他不期望的特性。然而，本发明的发明人生产了几种相关的人源化抗体，其具有用于人的诊断和/或治疗方法的合适活性。
第一方面，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的人源化抗体，其包含
i)包含可变区的免疫球蛋白轻链，该可变区包含与SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：48中的一个或多个序列至少93％相同的氨基酸序列，和/或
ii)包含可变区的免疫球蛋白重链，该可变区包含与SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39中的一个或多个序列至少90％相同的氨基酸序列，
其中该抗体结合人C5aR。
在优选的实施例中，免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含选自由SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36组成的组的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：36提供的氨基酸序列。
在另一个优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含选自由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：31提供的氨基酸序列。
在特别优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：31提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：36提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45提供的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：45提供的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：45。
在一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：31提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：34提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在另一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：32提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：34提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：34提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44提供的氨基酸序列。
在又一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：31提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：35提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45提供的氨基酸序列。
在另一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：32提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：35提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：35提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在另一个的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：32提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：36提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO：36提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO：43提供的氨基酸序列。
在优选的实施例中，该抗体可在人C5aR的第二细胞外环上结合抗原表位EEYFPP(SEQ ID NO：38)。在进一步的实施例中，该抗体没有在人C5aR的N-末端上可检测地结合抗原表位PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT(SEQ ID NO：59)。
在优选的实施例中，抗体结合人C5aR，该抗体的亲和力至少在7F3的8倍以内，更优选至少在7F3的4倍以内，甚至更优选在7F3的3倍以内。
在优选的实施例中，对于表达人C5aR的人中性粒细胞而言，本发明抗体的EC50小于4.5nM。在可替换的实施例中，本发明抗体的EC50小于3nM，小于2nM，或小于1nM。用于表达C5aR的人中性粒细胞抗体的EC50可按实施例3中描述的方法确定。
在另一个实施例中，本发明抗体能够使人中性粒细胞迁移降低至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，以及甚至更优选80％。在进一步的实施例中，本发明抗体阻断C5aR诱导的人中性粒细胞迁移的能力比7F3强，至少强2倍，甚至更优选强5倍。人中性粒细胞迁移的降低可按实施例5中描述的方法确定。
在进一步的实施例中，本发明抗体没有可检测地活化人中性粒细胞。中性粒细胞活化可通过分析CD62L和CD11b表达，和/或超氧化物产生确定，如实施例7中所述。
在又一个实施例中，本发明抗体没有可检测地消耗(deplete)回体法中来自血液的中性粒细胞或单核细胞。回体法中(ex vivo)中性粒细胞或单核细胞的消耗可按实施例8和9中描述的方法确定。
在进一步的实施例中，本发明抗体能够阻断C5a诱导的Ca2+向人中性粒细胞的流入，抗体的浓度小于30μg/mL，更优选小于10μg/mL，更优选小于5μg/mL，更优选小于1μg/mL。阻断C5a诱导的Ca2+流入人中性粒细胞可按实施例6中描述的方法确定。
在一个实施例中，本发明抗体是非消耗性(non-depleting)和非活化性(non-activating)的。此处描述的此种抗体的实施例是hAb-Q。在可替换的实施例中，本发明的抗体是消耗性的和非活化性的。此处描述的此种抗体的实施例是hAb-N。
在优选的实施例中，
i)免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中的一个或多个序列至少90％相同的氨基酸序列，和
ii)免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中的一个或多个序列至少90％相同的氨基酸序列，更优选地，
i)免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID：41至少90％相同的氨基酸序列，和
ii)免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID NO：45至少90％相同的氨基酸序列。
人源化抗体可以是本领域中已知的任何适宜的结构。实施例包括，但不限于，由两条重链和两条轻链组成的四多肽链结构、单链抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或四链抗体(tetrabody)，以及抗体片段，例如，但不限于Fab片段或单域抗体。
另一方面，本发明提供了包含可变区的基本上纯化的和/或重组的免疫球蛋白轻链，该可变区包含与SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：48中的一个或多个序列至少93％相同的氨基酸序列。
在优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含与SEQ ID NO：31至少93％相同的氨基酸序列。
在进一步的实施例中，本发明提供了包含可变区的基本上纯化的和/或重组的免疫球蛋白重链，该可变区包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39中一个或多个序列至少90％相同的氨基酸序列。
在优选的实施例中，免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含与SEQ ID NO：36至少90％相同的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了包含本发明免疫球蛋白轻链和/或本发明免疫球蛋白重链的基本上纯化的和/或重组的抗体，其中该抗体可结合人C5aR。
也提供了包含本发明抗体和直接或间接结合到抗体的治疗剂的结合物。治疗剂的实施例包括，但不限于，细胞毒素、放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调节药剂、抗血管新生(angiogenic)药剂、抗-新血管形成和/或其他血管形成药剂、毒素、抗-增殖药剂、促凋亡(Pro-apoptotic)药剂、化疗剂，和治疗核酸。
在一个实施例中，毒素是假单胞杆菌(绿脓杆菌，Pseudomonas)外毒素或其衍生物。
在进一步的实施例中，治疗剂经由接头(linker)间接结合到抗体。实施例包括，但不限于4-(4′乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸性酸(AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(酰胺)和其衍生物。
另一方面，本发明提供了包含本发明抗体和直接或间接结合到抗体的可检测标签的结合物。适宜的标签的实施例包括，但不限于，放射性标签、荧光标签、酶标签和显像剂(成像剂)。
在进一步的方面，本发明提供了编码本发明抗体或其链、本发明的免疫球蛋白轻链、本发明的免疫球蛋白重链和/或本发明的结合物的分离的和/或外源的多核苷酸。
优选地，该多核苷酸包含由SEQ ID NO 52～57中任一个提供的序列。
另一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸的载体。优选地，该载体是表达载体。更优选地，该多核苷酸可操作地连接到启动子。
另一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸和/或本发明载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是任何细胞类型，例如细菌、酵母、植物或动物细胞。
也提供了包含本发明细胞的非人转基因生物。
也提供了组合物，该组合物包含本发明抗体、本发明免疫球蛋白轻链、本发明的免疫球蛋白重链、本发明结合物、本发明多核苷酸、本发明载体和/或本发明宿主细胞，以及药用载体(carrier)。
另一方面，本发明提供了生产抗体的方法，该方法包含培养本发明宿主细胞以表达多核苷酸和生产该抗体，其中宿主细胞包含至少一种本发明的多核苷酸。
在一个实施例中，免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链被一个连续多核苷酸上的两个分开的开放阅读框编码。
优选地，该方法进一步包含从宿主细胞培养物中回收(recover)抗体。
在进一步的方面，本发明提供了抑制人C5aR与其配体相互作用的方法，该方法包含使该细胞暴露到本发明抗体或本发明结合物中。
优选地，该配体是人C5a。
优选地，该抗体或结合物可阻止至少一些配体结合到该细胞。
另一方面，本发明提供了抑制细胞中人C5aR活性的方法，该方法包含使细胞暴露到本发明抗体或本发明结合物中。
关于前述两个方面，该方法可在体外或体内执行。
另一方面，本发明提供了治疗或预防对象中病症的方法，该方法包含给予所述对象本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物。
在一个实施例中，该病症是免疫病态病症，例如自身免疫疾病。
在另一个实施例中，该病症是炎性疾病，例如急性炎症或慢性炎症。
在另一个实施例中，免疫病态病症或炎性疾病涉及白细胞迁移和/或白细胞活化。
在进一步的实施例中，免疫病态病症或炎性疾病涉及补体活化。
可被治疗或预防的病症实例包括，但不限于，过敏性鼻炎、肺过敏、超敏感性肺炎、间质性肺病、过敏性反应、超敏感性反应、药物过敏、昆虫叮咬过敏、炎性肠病、脊柱关节病、硬皮病、牛皮癣、皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、风疹、血管炎、关节炎、多发性硬化、***性红斑狼疮、重症肌无力、青少年型糖尿病、肾炎、自身免疫性甲状腺炎、***(Behcet′s disease)、移植排斥、动脉硬化症、具有皮肤或器官的白细胞浸润的癌症、、再灌注损伤、中风、成人型呼吸窘迫综合征、恶性血液病、细胞因子诱导毒性、多肌炎、皮肌炎、类天疱疮、阿尔茨海默氏病(Alzheimers diseas)、肉芽肿性疾病、血友病滑膜炎、痛风、与感染有关的不良炎性反应、SAR、败血症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、类风湿性关节炎、抗磷脂综合征、年龄相关性黄斑变性、膜性增生性肾小球肾炎和致密沉积物病。
本发明的方法可与其他已知治疗联合进行。因而，在实施例中，该方法进一步包括给予至少一种其他化合物，用以治疗或预防病症。此种其他治疗可同时提供或相继提供。
技术人员(addressee)应当理解，当给予对象本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或宿主细胞时，将在适当条件下，使得抗体或结合物在体内被表达。
优选地，该抗体、结合物、多核苷酸、载体和/或宿主细胞以本发明的组合物的形式给予。
另一方面，本发明提供了递送治疗剂到对象的炎症部位的方法，该方法包括给予所述对象本发明的结合物，或为此编码的多核苷酸。
在进一步的方面，本发明提供了将遗传物质引入到呈递(present)C5aR细胞中的方法，该方法包含使该细胞与根据本发明的抗体或本发明的结合物接触，其中该抗体或结合物结合到遗传物质或与遗传物质联合。
遗传物质的实例包括DNA、RNA或其组合。在优选的实施例中，遗传物质是至少部分双链的DNA或至少部分双链的RNA。
在优选的实施例中，呈递C5aR的细胞选自由下列细胞组成的组：白细胞，例如粒细胞(例如，中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、单核细胞、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞，以及组织中的免疫细胞，例如巨噬细胞(例如，小胶质细胞、肝库普弗细胞(hepatic_Kupffer_cell)、肾小球系膜细胞)、B淋巴细胞、T淋巴细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、星形胶质细胞、神经干细胞、少突胶质细胞、滑膜细胞、关节软骨细胞(articular_chrondocytes)、刺激肝细胞、支气管上皮细胞、角质形成细胞及胸腺细胞。在特别优选的实施例中，呈递C5aR的细胞选自由下列细胞组成的组，即白细胞，例如粒细胞(例如，中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、单核细胞、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞，及组织中的免疫细胞，例如巨噬细胞(例如，小胶质细胞、肝库普弗细胞、肾小球系膜细胞)。
又一方面，本发明提供了检测样品中人C5aR存在与否的方法，该方法包含使样品与本发明的抗体，和/或本发明的结合物接触，并分析样品中人C5aR与抗体或结合物的结合。
可被测试的适宜样品的实例包括，但不一定局限于，血液、血清、血浆，及细胞或组织活检(tissue biopsy)。
另一方面，本发明提供了诊断对象的病症的方法，该方法包含使对象，或从其获得的样品与本发明的抗体，或本发明的结合物接触，并分析对象或样品中人C5aR与抗体或结合物的结合。
因而，该方法可在体外或体内进行。
在一个实施例中，使用组织学标本或从对象获得的组织或流体的亚组分在体外执行该方法。
在另一个实施例中，该方法包含在可使抗体与对象中呈递C5aR的细胞之间形成复合物的条件下给予对象用显像剂标记的本发明抗体，并使该复合物显像。
优选地，该病症是免疫病态病症。
也提供了本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物在制备用于治疗或预防对象中的病症的药物方面的用途。
也提供了本发明的结合物或为此编码的多核苷酸在制备用于将治疗剂递送到对象的炎症部位的药物方面的用途。
也提供了本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物作为治疗或预防对象中的病症的药物的用途。
也提供了本发明的结合物或为此编码的多核苷酸作为将治疗剂递送到对象的炎症部位的药物的用途。
在进一步的方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物。
显而易见地，本发明一方面的优选特征和特性也适用于本发明的许多其他方面。
技术人员应当理解，在本发明的许多方面，优选定义的分子(抗体或免疫球蛋白等)基本上由，或与包含所述序列相比，更优选由指定的SEQ ID NO序列组成。
下文通过下面非限制性实施例并参考附图描述本发明。
附图说明
图1.与小鼠7F3轻链Vk区的同源性最高的人Ig轻链序列的ClustalW比对。框出了7F3定义的CDR。示出了共有框架序列(consensus framework序列)，hVkFW Cons。
图2.与小鼠7F3重链Vh序列同源性最高的人Ig重链V区序列(A)和J区序列(B)的ClustalW比对。框出了定义为7F3的CDR。示出的V区的共有框架序列(hVhvFW Cons)和J区的共有框架序列(hVhjFW Cons)相连，从而创建共有序列(hVhFW Cons)，用于移植7F3 CDR(注意：D区包含在CDR-H3内)。
图3.图1中的共有人Vk框架序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化7F3Vk轻链序列，h7Vk。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到hVkFW共有框架序列中。星号标记的三个氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。
图4.人RNOK203VL序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化的7F3Vk轻链序列，h7aVk。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到RNOK203VL框架序列中。
图5.KV2F-人源的VLCD18-Q序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化的7F3Vk轻链序列，h7bVk。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到VLCD18-Q框架序列中。
图6.人源化7F3Vk序列与小鼠7F3Vk序列的比对。共有序列h7F3VkCons是三个人源化序列的共有序列。框出了CDR。人源化7F3Vk序列之间的差异由黑色背景上的白色字体表示。
图7.图2A和2B中共有的人Vh框架序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源化7F3Vh重链序列，h7Vh。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到hVhFW共有的框架序列中。星号(*)标记的氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。用#标记的氨基酸突变成替代残基(alternate residue)，如文中讨论的。
图8.人SGI-VH序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源化7F3Vh重链序列，h7aVh。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到SGI-VH框架序列中。星号(*)标记的氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。
图9.人HG3序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源化的7F3Vh重链序列，h7bVh。小鼠7F3CDR(框出的)被移植到HG3框架序列中。星号(*)标记的氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。
图10.人源化7F3Vh序列与小鼠7F3Vh序列的比对。共有序列h7F3VhCons是三个人源化序列的共有序列。框出了CDR。人源化7F3Vh序列之间的差异由黑色背景上的白色字体表示。
图11.竞争性配体结合试验，该试验比较了人源化7F3抗体和小鼠7F3从人中性粒细胞上hC5aR中取代125I-C5a的能力。
图12.竞争性配体结合试验，该试验比较了人源化7F3抗体和小鼠7F3从L1.2/hC5aR转染子上hC5aR中取代125I-C5a的能力。
图13.在4℃下抗-C5aR抗体对人中性粒细胞的饱和结合，用log10(上方图(top panel))和线性(下方图(bottom panel))比例对x-轴作图。
图14.肽ELISA：人源化抗-C5aR抗体hAb-J(图A)和hAb-Q(图B)对一系列重叠肽(no.1-22)的结合，该重叠肽包含来自人C5aR的第二个细胞外环的12mer序列(每个被一个偏移)，和包含来自SEQ ID NO：37(no.23)的残基173-205的33mer。hAb-J(图C)和hAb-Q(图D)与来自人C5aR(no.A1)的第二个细胞外环的12mer序列的结合，一系列突变肽(no.A2-A13)包含带有单个Ala突变和杂乱(scrambled)肽(no.A14)的12mer。
图15.在不同稀释度下，人源化抗-C5aR mAb hAb-J和Q或抗-C5aR mAb S5/1(在5μg/ml)与包被在ELISA板上的肽PEP1(SEQID NO：37的残基9-29)的结合。
图16.化学趋化试验：在5μg/ml 7F3和各种人源化7F3抗体的存在下人中性粒细胞向1nM C5a的迁移。
图17.抗-C5aR抗体hAb-Q(闭合菱形，closed diamond)和7F3(开放方形)对C5a诱导的人中性粒细胞的化学趋化的抑制。4个单独实验的平均(±sem)结果表示为无抗体对照样本(上图)的最大迁移的百分比，或表示为迁移细胞(下图)的平均数目。X轴上的单位是log10μg/ml的Ab浓度，。
图18.亲本小鼠抗体7F3和人源化抗体J和Q对C5a定向的hC5aR/L1.2转染子细胞迁移的抑制。
图19.在与高浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q一起孵育之后C5a诱导的人中性粒细胞的化学趋化被抑制。
图20.在C5a诱导的与各种浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q预孵育细胞的化学趋化之前和之后，在游离C5aR和人中性粒细胞上结合的抗-C5aR抗体hAb-Q水平之间观测到的反比关系。
图21.人中性粒细胞上结合的抗-C5aR抗体hAb-Q水平(C5a诱导的化学趋化之前和之后)与各种浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q预孵育的细胞迁移的抑制之间观测到的关系。
图22.C5a诱导的CD11b在与各种浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q预孵育的人中性粒细胞上的表达的抑制。
图23.C5a诱导的CD62L在与各种浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q预孵育的人中性粒细胞上的下调的抑制。
图24.在人全血与人源化抗-C5aR抗体hAb-Q和hAb-J、PBS或粒细胞活化剂fMLP一起孵育1小时之后，中性粒细胞上CD11b(图A)和CD62L(图B)的表达。
图25.在人全血与人源化抗-C5aR抗体hAb-G或hAb-J或C5a一起孵育20分钟之后，相对PBS对照，中性粒细胞上CD11b(图A)和CD62L(图B)的表达。
图26.在与hAb-Q、单独的hIgG同种型对照抗体，或hIgG抗体加100nM人C5a一起孵育的人全血中，以相对CD11b表达(图A)和CD62L表达(图B)中的变化表示的中性粒细胞的活化。
图27.hAb-Q(称为抗-C5aR ab)自身没有刺激结合在固体载体上的人中性粒细胞从而生产超氧化物，但可阻碍C5a引起的生产。
图28.与人源化抗-C5aR抗体hAb-Q或对照(利妥昔，不相关的人IgG4，PBS)回体法中孵育4小时之后，每毫升人血液中B细胞、单核细胞和中性粒细胞的平均数目(±sd)。
图29.与人源化抗-C5aR抗体hAb-Q或对照(利妥昔，不相关的人IgG4)回体法中孵育4小时之后，相对每毫升人血液中B细胞、单核细胞和中性粒细胞的PBS对照的平均消耗(±sd)百分数。
图30.在存在1％兔补体的情况下，与100μg/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4或20μg/ml多克隆抗-C5aR抗体孵育之后，特异性CDC(％ToPro3+ve(lysed)Ramos E2细胞)。
图31.在存在10％人血清的情况下，与1-100μg/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4孵育之后，特异性CDC(不可存活的Ramos E2细胞％)。与10％热灭活的牛血清的每个样品的非特异性裂解已被扣除。
图32.特异性ADCC(在扣除‘仅有介质’和‘仅有靶’背景之后，‘靶+效应子’样品中的靶细胞裂解％)：与人PBMC效应细胞及100μg/ml抗体在带有10％热灭活的胎牛血清的介质中孵育之后，不可存活的(TP3+ve)Ramos E2靶细胞％。
图33.特异性ADCC(在扣除‘仅有介质’和‘仅有靶’背景之后，‘靶+效应子’样品中的靶细胞裂解％)：与人供体PBMC效应细胞及1-100μg/ml抗体在带有10％人供体血清的介质中孵育之后，不可存活的(TP3+ve)Ramos E2靶细胞％。
图34.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药10mg/kg抗-hC5aR抗体G、M和N之后第5天，组中平均临床得分的变化表明K/BxN血清诱导的hC5aR敲入(knock-in)小鼠(每组n＝6)中炎症逆转。
图35.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药1-10mg/kg抗-hC5aR抗体C和J之后第5天，组中平均临床得分的变化表明K/BxN血清诱导的hC5aR敲入小鼠(每组n＝4-5)中炎症逆转。
图36.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药1-10mg/kg hAb-Q之后第5天，组中爪尺寸平均变化(A)和平均临床得分(B)的平均变化表明K/BxN血清诱导的hC5aR敲入小鼠(每组n＝10+)中炎症逆转。
图37.体内给予各种剂量的人源化抗-C5aR抗体、对照抗体或PBS之后，随着时间的推移占位(occupied)的C5aR的水平。
图38.体内给予各种剂量的人源化抗-C5aR抗体、对照抗体或PBS之后，随着时间的推移游离的C5aR水平。
图39.在治疗性地给予带有关节炎症的小鼠后第5天，hAb-Q随时间推移的血清浓度。
图40.临床得分(爪和关节炎症水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第5天用10mg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓度之间的关系。
图41.临床得分(爪和关节炎症水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第5天用3mg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓度之间的关系。
图42.临床得分(爪和关节炎症水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第5天用1mg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓度之间的关系。
图43.在转基因小鼠的毒理研究和药理研究中，hAb-Q的整合PK/PD模型的图解表示。
图44.在毒理研究(图中以Tox表示)和药理研究(图中以KRN表示)中，对于hAb-Q(称为抗-C5aR ab)的各种静脉给药、皮下给药，和腹腔给药剂量，相对时间预测的和观测到的浓度(左)和占位(右)。对于毒理研究，在第1天给药之后和在第43天给药之后取PK样品。第43天的数据假定处于平稳状态，并持续到第六次之后。平均组值：菱形，单个小鼠：开放圆圈，通过靶隔室(targetcompartment)的模型拟合：粗线。
图45.在药理研究中，用于hAb-Q对实验诱导的关节炎的抑制效果的PK/PD模型的图解表示。这个模型并入了图43中示出的PK/PD模型中计算的占位率。
图46.在转基因小鼠中在第0天发炎，在第5天以不同的剂量hAb-Q腹腔给药之后，相对时间，占位率(左)和爪尺寸变化(右)。平均组测量：彩色的实线菱形，单个小鼠值：彩色的开放圆圈。每组中的模型拟合：彩线。
图47.应用于人预测的PK/PD模型的图解表示。该模型由利用用靶介导的处理扩大的典型IgG参数的两区室模型组成。V1＝中间体积。V2＝周边体积。CL＝清除率。Q＝分配清除率。kof/kon＝缔合/解离的速率常数。逆转(turnover)＝更新靶和除去结合抗体所需的时间。两个靶区室用于反映被认为在血液内部分配和在血液外部分配的靶。
图48.在抗-C5aR(hAb-Q)的静脉给药之后，用于药物动力学(左)和占位率(右)的模型预测。最低量化限由水平线表示。
图49.在抗-C5aR(hAb-Q)的皮下给药之后，用于药物动力学(左)和占位率(右)的模型预测。最低量化限由水平线表示。
序列表说明
SEQ ID NO：1-7F3可变轻链蛋白序列。
SEQ ID NO：2-7F3可变重链蛋白序列。
SEQ ID NO：3-7F3可变轻链编码序列。
SEQ ID NO：4-7F3可变重链编码序列。
SEQ ID NO：5-KV2F_人的人轻链可变区。
SEQ ID NO：6-KV2E_人的人轻链可变区。
SEQ ID NO：7-KV2D_人的人轻链可变区。
SEQ ID NO：8-KV2B_人的人轻链可变区。
SEQ ID NO：9-KV2A_人的人轻链可变区。
SEQ ID NO：10-X12691的人轻链可变区。
SEQ ID NO：11-U41645的人轻链可变区。
SEQ ID NO：12-U41644的人轻链可变区。
SEQ ID NO：13-M31952的人轻链可变区。
SEQ ID NO：14-人轻链可变序列的hVkFW Cons共有序列，如图1中提供的。
SEQ ID NO：15-HvlAv_人的人重链可变区。
SEQ ID NO：16-HvlBv_人的人重链可变区。
SEQ ID NO：17-HvlCv_人的人重链可变区。
SEQ ID NO：18-HvlGv_人的人重链可变区。
SEQ ID NO：19-M99641.aa的人重链可变区。
SEQ ID NO：20-M99642.aa的人重链可变区。
SEQ ID NO：21-X62109.aa的人重链可变区。
SEQ ID NO：22-X92343.aa的人重链可变区。
SEQ ID NO：23-Z12305.aa的人重链可变区。
SEQ ID NO：24-人重链可变(V)区序列的hVhvFW Cons共有序列，如图2A中提供的。
SEQ ID NO：25-Hvl Cj_人的人重链连接区。
SEQ ID NO：26-Hv2Ij_人的人重链连接区。
SEQ ID NO：27-Hv3Hj_人的人重链连接区。
SEQ ID NO：28-Hv3Kj_人的人重链连接区。
SEQ ID NO：29-Hv3Tj_人的人重链连接区。
SEQ ID NO：30-人重链连接(J)区序列的hVhjFW Cons共有序列，如图2B中提供的。
SEQ ID NO：31-人源化7F3 V区轻链h7Vk氨基酸序列。
SEQ ID NO：32-人源化7F3 V区轻链h7aVk氨基酸序列。
SEQ ID NO：33-人源化7F3 V区轻链h7bVk氨基酸序列。
SEQ ID NO：34-人源化7F3 V区重链h7Vh氨基酸序列。
SEQ ID NO：35-人源化7F3 V区重链h7aVh氨基酸序列。
SEQ ID NO：36-人源化7F3 V区重链h7bVh氨基酸序列。
SEQ ID NO：37-人C5aR。
SEQ ID NO：38-人C5aR的第二细胞外环上的抗原表位。
SEQ ID NO：39-本发明人源化7F3重链可变区的h7F3VhCons共有序列，如图10所提供的。
SEQ ID NO：40-人轻链恒定区hCκ-R。
SEQ ID NO：41-人轻链恒定区hCκ。
SEQ ID NO：42-人重链恒定区hCγ4。
SEQ ID NO：43-人重链恒定区hCγ4PE。
SEQ ID NO：44-人重链恒定区hCγ1。
SEQ ID NO：45-人重链恒定区hCγ4p。
SEQ ID NO：46-人源化RNOK203VL序列。
SEQ ID NO：47-KV2F-人源的VLCD18-Q序列。
SEQ ID NO：48-本发明人源化7F3轻链可变区的h7F3VkCons共有序列，如图6中所提供的。
SEQ ID NO：49-hVhFW Cons共有的人重链VJ框架序列
SEQ ID NO：50-人SGI-VH序列。
SEQ ID NO：51-人种系(germline)HG3序列。
SEQ ID NO：52-编码人源化7F3V区轻链h7Vk氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：53-编码人源化7F3V区轻链h7aVk氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：54-编码人源化7F3V区轻链h7bVk氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：55-编码人源化7F3V区重链h7Vh氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：56-编码人源化7F3V区重链h7aVh氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：57-编码人源化7F3V区重链h7bVh氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：58-人C5aR的第二细胞外环的片段。
SEQ ID NO：59-人C5aR的N-末端细胞外结构域的片段。
具体实施方式
一般技术
除非另外具体限定，在本文中使用的所有科技术语应当理解为与本领域中(即细胞培养技术，分子遗传学、抗体技术、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的含义相同。
除非另外指明，本发明中采用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术均是标准操作，是本领域中技术人员众所周知的。此种技术描述和解释在下面来源的文献中，这些来源为，例如，J.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，volumes 1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editor)，DNA Cloning：A Practical Approach，volumes 1-4，IRL Press(1995和1996)，and F.M.Ausubel等人.(editor)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988，包括至今的所有更新)，Ed Harlow andDavid Lane(editor)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory，(1988)，以及J.E.Coligan等人.(editor)CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括至今的所有更新)。
选择的定义
如本文中使用的，“C5a受体”、“C5aR”、“C5aR1”或“人C5aR”和其变化形式是指人补体成分5受体1，其在本领域中也叫做C5a过敏毒素受体和CD88抗原。C5aR属于七次跨膜G-蛋白-偶联受体家族，并结合C5a(Gerard和Gerard，1991)。人C5a氨基酸序列的实例提供在SEQ ID NO：37中，然而，技术人员将意识到还存在这些分子的天然存在的等位基因变体，这些变体也包括在术语“C5aR”中。人C5aR的各种结构域定义如下：
氨基酸    1-37    细胞外结构域-N-末端
氨基酸    38-61   跨膜结构域
氨基酸    62-71   细胞内结构域
氨基酸    72-94   跨膜结构域
氨基酸    95-110  细胞外结构域-细胞外环1
氨基酸    111-132 跨膜结构域
氨基酸    133-149 细胞内结构域
氨基酸    150-174 跨膜结构域
氨基酸    175-206 细胞外结构域-细胞外环2
氨基酸    207-227 跨膜结构域
氨基酸    228-242 细胞内结构域
氨基酸    243-264 跨膜结构域
氨基酸    265-283 细胞外结构域-细胞外环3
氨基酸    284-307 跨膜结构域
氨基酸    308-350 细胞内结构域-C-末端
术语“对象”，如在本文中使用的，是指任何动物，特别是哺乳动物，例如人、马、牛、猫和狗，并在适当时，可以与术语“病人”交换使用。优选地，对象是人。
如在本文中使用的术语“治疗”及其变化形式包括给予治疗有效量的本发明抗体，该有效量足以减轻或消除病症的至少一个症状。
如在本文中使用的术语“预防”或其变化形式是指保护对象不患疾病的至少一个症状，或减轻病症症状的严重性。
如在本文中使用的，术语“暴露细胞”是指提供抗体，以便能够接触/结合人C5aR，条件是C5aR存在于细胞上。
术语“有效浓度50％”(缩写为“EC50”)表示抗体靶向的分子特定效果(例如，抑制/取代(displace)人C5a与人C5aR的结合)的50％所需的本发明抗体浓度。本领域人员应当理解较低的EC50值相当于更有效的抗体。
如这里使用的，术语“抑制”是指降低，和可能彻底破坏确定的活性。优选地，确定的活性被降低至少50％，更优选至少75％，甚至更优选至少90％。
如在本文中使用的，术语“约”是指具体值的+/-5％的范围。
整个本说明书中，术语“包含”，或其变化形式应当理解为包括陈述的成分、整体或步骤，或成分、整体或步骤的组，但不包括任何其他成分、整体或步骤，或成分、整体或步骤的组。在一个实施例中，分子“基本上由”定义的序列“组成”。在其它实施例中，分子“由”定义的序列“组成”。
人源化抗-C5aR抗体
术语免疫球蛋白是指一类结构上相关的糖蛋白，该糖蛋白由两对多肽链组成，一对低分子量的轻(L)链和一对重(H)链，所有四条链通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已定性清楚，参见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.RavenPress，N.Y.(1989))。简言之，每条重链典型地由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。每条轻链典型地由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为CL)组成。轻链恒定区典型地由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分成高变的区(或序列上高变的高变区和/或结构确定的环的形式)，也称为互补决定区(CDR)，中间穿插着较其保守的区，称为框架区(FR)。在优选的实施例中，本发明抗体至少包含VL结构域和VH结构域。
每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下面顺序排布，FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见Chothia和Lesk，1987)。典型地，在这区中氨基酸残基的编号可通过Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991)(短语可变结构域残基编号，如Kabat中或根据Kabat，在本文中指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号***)中描述的方法执行。使用这个编号***，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，对应于可变结构域FR或CDR的缩短，或***可变结构域FR或CDR。
术语“人源化抗体”，如在本文中使用的，在本文中指来源于非人抗体，典型地鼠科动物的抗体，该抗体保留或基本保留亲本抗体(parent antibody)的抗原结合的性质但它在人中的免疫性低。由于本发明抗体由结构和功能特征限定，因此术语“人源化抗体”可与“抗体”交换使用。
术语互补决定区(CDR)，如在本文中使用的，是指多种氨基酸序列，该多种氨基酸序列共同限定免疫球蛋白结合位点的可变片段(Fv)区的结合亲和力和特异性。
术语框架区(FR)，如在本文中使用的，是指***在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在适当的位置(允许CDR结合抗原)。可变区，轻的或重的，均包含框架区和典型地三个CDR。
术语恒定区(CR)，如在本文中使用的，是指赋予效应子功能的抗体分子的部分。题述人源化抗体的恒定区来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可选自五种同种型：α、δ、ε、γ或μ。进一步地，各种亚类的重链(例如，重链的IgG亚类)可引起不同效应子功能，并因而，通过选择期望的重链恒定区，可生产具有期望的效应子功能的抗体。优选的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)，更优选γ4(IgG4)。更优选的是γ4(IgG4)同种型的可结晶片段(Fc)区，带有突变Ser228Pro(称为“P”突变)和/或Leu235Glu(称为“E”突变)。特别优选的重链恒定区序列由SEQ IDNO 42～45提供。轻链恒定区可以是κ或λ型，优选为κ型。特别优选的轻链恒定区序列由SEQ ID NO 40和41提供。
在优选的实施例中，在本文中描述的免疫球蛋白轻链可变区直接连接到在本文中描述的免疫球蛋白轻链恒定区。类似地，在进一步优选的实施例中，在本文中描述的免疫球蛋白重链可变区直接连接到在本文中描述的免疫球蛋白重链恒定区。因而，在优选的实施例中，由SEQ ID NO：31提供的氨基酸序列的C-末端直接连接到由SEQ ID NO：41提供的氨基酸序列N-末端，由SEQ ID NO：36提供的氨基酸序列的C-末端直接连接到SEQ ID NO：45的氨基酸序列N-末端。
技术人员应当理解免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区可按照描述的通过使用标准的重组DNA技术连接，从而创建可在适宜的宿主中被表达(从而产生所述免疫球蛋白链(一种或多种))的多核苷酸，或可通过使用肽化学合成连接的可变区和恒定区。
本发明的人源化抗体保存了亲本抗体的结合性质的重要部分，即单克隆抗体，该亲本抗体也就是称为7F3的单克隆抗体，由杂交瘤产生，该杂交瘤于2000年11月6日保藏在ECACC，编号为00110609。特别地，本发明的人源化抗体保留了特异性结合亲本抗体识别抗原的能力，该亲本抗体用于生产此种人源化抗体。优选地，人源化抗体展现出与亲本抗体相同或基本相同的抗体结合亲和力(affinity)和亲合力(avidity)。理想地，抗体的亲和力(KD)将不大于亲本抗体亲和力的10倍，更优选不大于5倍，更优选不大于亲本抗体亲和力的3倍。分析抗原结合亲和力的方法是本领域中众所周知的，并包括半最大结合试验、竞争试验和Scatchard分析。适宜的抗原结合试验描述在本申请中(参见，例如，实施例3)。
技术人员应当理解，“亲合力(avidity)”是指两个分子之间，例如抗体和抗原之间相互作用的总强度。亲合力取决于相互作用的亲和力和价态。而且，“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与配体(例如，抗原)之间结合的强度。分子X对配体Y的亲和力可由解离常数(Kd)表示，解离常数是占据溶液中存在的一半的X分子的结合部位所需的Y浓度。更小的Kd表示更强或更高的亲和力相互作用，和需要更低的配体浓度来占据该部位。
术语“人源化抗体”或“抗体”，如本发明中使用的，包括完整分子以及能与表位决定簇结合的它们的片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。这些抗体片段保留了选择性结合到人C5aR的一些能力，这些片段的实施例包括，但不限于下面：
(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，该片段可通过酶木瓜蛋白酶将全抗体(whole antibody)降解生成完整的轻链和一个重链的一部分；
(2)Fab’，可通过以下方式获得抗体分子片段，用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原，从而生成完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子可得到两个Fab’片段；
(3)(Fab’)2，可通过用酶胃蛋白酶处理但没有随后还原以获得抗体片段；(Fab)2是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab’片段的二聚体；
(4)Fv，定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；
(5)单链抗体(“SCA”)，定义为基因工程分子，其含有通过适宜的多肽接头连接成基因融合的单链分子的轻链可变区和重链可变区，此种单链抗体可以是多聚体形式，例如，双链抗体、三链抗体，和四链抗体等，这些抗体可以是或不可以是多特异性的(参见，例如，WO 94/07921和WO 98/44001)和
(6)单链结构域抗体，典型地无轻链的可变重链结构域。
人源化抗体片段包括独立的重链、轻链、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、无任何重链的可变轻结构域、无轻链的可变重结构域和Fv。多种片段可通过重组DNA技术，或通过完整的免疫球蛋白的酶分离或化学分离生产。
“人源化抗体”或本发明抗体也可以是异源结合抗体(heteroconjugate antibody)。异源结合抗体由两个共价连接的抗体组成。已提出，例如，此种抗体可使得免疫***细胞靶向不需要的细胞(US 4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373、EP 586505)。考虑了，该抗体可通过使用合成蛋白质化学中包括涉及交联剂的那些方法在内的已知方法在体外制备。
关于效应子功能，理想的是修饰本发明抗体，以便增强，例如，该抗体治疗在本文中描述的病症，例如关节炎的效力。例如，可将半胱氨酸残基(一种或多种)引入Fc区中，从而允许这个区中链间二硫键的形成。因而产生的同种型二聚体人源化抗体可改进内化能力和/或增大补体-介导的细胞杀伤和抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Caron等人，1992；Shopes，1992)。活性增强的同种型二聚体抗体也可使用异型双功能交联剂制备，如Wolff等人(1993)描述的。可替换地，可改造具有双Fc区的抗体并可从而增强补体裂解和ADCC能力(Stevenson等人，1989)。
如在本文中使用的，“非消耗性抗体”是指可结合到其靶，但不募集(recruit)影响靶细胞裂解的免疫***效应子功能的抗体。免疫***效应子功能依赖于Fc-结构域与Clq-补体级联的第一成分，和/或受体(FcR)的相互作用。补体依赖的细胞毒性(CDC)可被与Clq相互作用的多Fc-结构域启动，该多Fc-结构域可最终导致靶细胞通过形成膜攻击复合物(MAC)裂解。另外，免疫***细胞，例如粒细胞、巨噬细胞和NK细胞，可通过FcR与结合到靶细胞的mAb相互作用。靶细胞的裂解可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用引发。非消耗性抗体包括无Fc结构域的抗体片段，该抗体片段包括例如，单价(例如，Fab、scFv、纳米抗体和dAbs)、二价(例如，F(ab′)2和双链抗体)和多价(例如，三链抗体和五链抗体)形式。另外，非消耗性抗体包括被修饰从而除去效应子功能而不影响药物动力学(pharmokinetic)的抗体，例如，可修饰在与Clq和FcR的相互作用中发挥着主导作用的Fc-结构域中的氨基酸残基，或可除去CH2结构域中的N-连接的糖基化位点。技术人员应当了解，改造非消耗性抗体的可能性与用于生产抗体的恒定区相联系。IgG3恒定区比IgG1恒定区更有可能生产消耗性抗体，IgG1恒定区又比IgG2恒定区更有可能生产消耗性抗体，而IgG4恒定区一般表示抗体是非消耗性的。技术人员也应当理解对恒定区的修饰可使消耗性抗体转化成非消耗性抗体，反之亦然。
如在本文中使用的，“非活化抗体”是指结合细胞表面受体，和否定(negate)或阻断内源配体作用的抗体。
本发明人源化抗体可通过人的介入生产。因而，并不期望它们是天然存在的。但是，在优选的实施例中，本发明抗体或免疫球蛋白链是“基本上纯化的”或“纯化的”。“基本上纯化的”或“纯化的”，表示从在天然状态上与其关联的一种或多种脂质、核酸、其他多肽，或其他污染分子分离的抗体。优选基本上纯化的多肽的至少60％，更优选至少75％，更优选至少90％不包含与其天然关联的其他成分。在另一个实施例中，“基本上纯化的”或“纯化的”表示在组合物中为优势种类(predominant species)的分子，其中，它所属于的该类分子即在该种组合物中发现(即，它构成组合物中该类分子的至少约50％，典型地构成组合物中该种类的分子，例如肽的至少约70％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或更多)。
在抗体或免疫球蛋白链上下文中的术语“重组”是指细胞或在无细胞表达***中生产的，与天然状态相比，量或比率改变的抗体或免疫球蛋白链。在一个实施例中，该细胞是不能天然生产抗体或免疫球蛋白链的细胞。然而，该细胞可以是包含非内源基因的细胞，该非内源基因可改变，优选增大待生产的多肽量。本发明的重组抗体或免疫球蛋白链包括未与生产它的转基因(重组)细胞，或无细胞表达的其他成分***分离的多肽，和在本文中细胞或无细胞***中生产，随后从至少其他一些成分中纯化出来的抗体或免疫球蛋白链。
多肽(免疫球蛋白链)的同一性％可通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，其中缺口生成罚分(gapcreation penalty)＝5，而缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝0.3。查询序列为至少50个氨基酸长度，GAP分析在至少50个氨基酸的区上排列该两个序列。甚至更优选地，查询序列为至少100个氨基酸长度，GAP分析在至少100个氨基酸的区中排列该两个序列。更优选地，将该两个序列在它们的全长上排列。
关于定义的免疫球蛋白链，应当理解，高于上面提供的那些的同一性％数字将包括优选的实施例。因而，适当时，根据最小的同一性％数字，优选免疫球蛋白链包含这种氨基酸序列，即，与指定的有关序列SEQ ID NO至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，和甚至更优选至少99.9％的同一性的氨基酸序列。
在另一个实施例中，指定的SEQ ID NO中添加了一个残基，指定的SEQ ID NO中删除了一个残基，与指定的SEQ ID NO相比，添加了一个残基并删除了一个残基，指定的SEQ ID NO中添加了二个残基，指定的SEQ ID NO中删除了二个残基，指定的SEQ ID NO中改变了一个残基，指定的SEQ ID NO中改变了两个残基，指定的SEQ ID NO中一个残基改变且删除了一个残基，或者指定的SEQ IDNO中改变了一个残基且添加了一个残基，或者其任何组合。
在优选的实施例中，该序列比对中没有缺口。更具体地，该算法不需在氨基酸的毗邻延伸(contiguous stretch)中创建缺口，从而获得理想的(最高的同一性％)序列比对。
本发明的抗体和/或免疫球蛋白链的氨基酸序列突变可通过引入适当的核苷酸改变到本发明核酸中制备，或通过体外合成期望的多肽制备。此种突变包括，例如，氨基序列内残基的缺失、***或置换。可组合使用缺失、***和置换，从而到达最后的构建体，条件是最后的多肽产物具有期望的特性。
突变的(改变的)多肽可使用本领域中已知的任何技术制备。例如，本发明多核苷酸可经体外诱变。此种体外诱变技术包括将多核苷酸子克隆成适宜的载体，将载体转换成“增变”菌株，例如E.coliXL-1 red(Stratagene)，并繁殖该转化的细菌，以获得合适数目的代数。可使用在本文中描述的技术快捷地(readily)筛选从突变/改变DNA获得的产物，从而确定它们是否具有受体结合和/或受体抑制活性。
在设计氨基酸序列突变时，突变位点的位置和突变的性质取决于待修饰的特性(一种或多种)。用于突变的位点可单独修饰或成批地(in series)修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸选择物置换，然后根据获得的结果用更激进的选择置换，(2)删除靶残基，或(3)***与定位位点(located site)相邻的其他残基。
氨基酸序列缺失范围一般为约1～15个残基，更优选为约1～10个残基，以及典型地为约1～5个连续的残基。
置换突变(substitution mutants)去除了抗体和/或免疫球蛋白链分子中的至少一个氨基酸残基，并在该位置***了不同的残基。对于置换突变，最感兴趣的位点包括被鉴定为对抗原结合重要的位点。这些位点，尤其是属于人抗体和/或免疫球蛋白链中至少三个其他相同的保守位点的序列的那些位点，优选以相对保守的方式被置换。此种保守置换在标题为“示例性置换”的表1中给出。置换的具体实施例提供在图6和10中，其中在给定位点处的氨基酸可被存于其他人源化链中相同位点处的另外的氨基酸置换。
表1.示例性置换
  原残基  示例性置换
  Ala(A)  val；leu；ile；gly
  Arg(R)  lys
  Asn(N)  gln；his
  Asp(D)  glu
  Cys(C)  ser
  Gln(Q)  asn；his
  Glu(E)  asp
  Gly(G)  pro，ala
  His(H)  asn；gln
  Ile(I)  leu；val；ala
  Leu(L)  ile；val；met；ala；phe
  Lys(K)  arg
  Met(M)  leu；phe
  Phe(F)  leu；val；ala
  Pro(P)  gly
  Ser(S)  thr
  Thr(T)  ser
  Trp(W)  tyr
 Tyr(Y)   trp；phe
 Val(V)   ile；leu；met；phe；ala
而且，如果需要的话，非天然氨基酸或氨基酸化学类似物可以置换或添加的形式引入到本发明抗体和/或免疫球蛋白链中。此种氨基酸包括，但不限于，通用氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计的(designer)氨基酸，例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，和一般的氨基酸类似物。
本发明多肽可以多种方式生产，包括重组多肽的生产和回收，及多肽的化学合成。在一个实施例中，本发明分离的多肽可通过培养能够在有效生产多肽的条件下表达多肽和能够回收多肽的细胞来生产。优选培养的细胞是本发明的重组细胞。有效培养条件包括，但不限于，允许多肽生产的有效介质、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效介质指的是在其中培养细胞生产本发明多肽的任何介质。此种介质典型地包含具有可吸收的碳、氮和磷酸盐源，及适当的盐、矿物、金属和其他营养物，例如维生素的水介质。本发明的细胞可在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘(microtiter dish)和陪替氏平皿(petri plates)中培养。培养可在适合重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。此种培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
多核苷酸及其表达
“分离的多核苷酸”，包括正向或反向或二者结合的单链或双链DNA、RNA或这些的组合、dsRNA或其他，其是表示从在天然状态下与其关联或联系的多核苷酸序列至少部分分离的多核苷酸。优选地，该分离的核苷酸的至少60％，优选至少70％，更优选至少90％不包含与其天然关联的其他成分。而且，术语“多核苷酸”在本文中与术语“核酸”和“遗传物质”交换使用。
在多核苷酸上下文中，术语“外源的”是指细胞，或无细胞表达***中存在的，与其天然状态相比，量改变的多核苷酸。在一个实施例中，该细胞是天然不包含该核苷酸的细胞。然而，该细胞可以是包含非内源核苷酸的细胞，该非内源核苷酸可改变，优选增大编码的多肽的产生量。本发明多核苷酸包括未与包含它的转基因(重组)细胞，或无细胞表达***中其他成分分离的多核苷酸，和在本文中细胞或无细胞***中生产，随后从至少一些其他成分中纯化出来的多核苷酸。外源核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的毗邻延伸，或可包含来自不同来源(天然存在和/或合成)，连接从而形成同一多核苷酸(single polynucleotide)的核苷酸的两种或多种毗邻延伸。典型地，此种嵌合的多核苷酸包含至少一个开放阅读框，该阅读框编码可操作地连接到启动子的本发明的多肽，该启动子为适合驱动感兴趣的细胞中开放阅读框的转录。
本发明涉及编码SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：39中一个或多个的多核苷酸，和/或与编码SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39中一个或多个的多核苷酸至少67％同一性的多核苷酸。此种多核苷酸的实例包括，但不限于，包含由SEQ ID 52～57的任何一个中提供的序列的那些多核苷酸。
核苷酸的同一性％可通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，其中缺口生成罚分(gap creation penalty)＝5，而缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝0.3。除非另有说明，查询序列为至少45个氨基酸长度，GAP分析在至少45个氨基酸的区上排列该两个序列。更优选地，查询序列为至少100个氨基酸长度，GAP分析在至少100个氨基酸的区中排列该两个序列。更优选地，将该两个序列在它们的全长上排列。
关于定义的多核苷酸，应当理解，高于上面提供的那些的同一性％数字将包括优选的实施例。因而，适当时，根据最小的同一性％数字，优选本发明多核苷酸包含这种氨基酸序列，即，与指定的有关序列SEQ ID NO至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，和甚至更优选至少99.9％的同一性的氨基酸序列。
本发明也涉及与编码SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：39中一个或多个的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。术语“严格杂交条件”或“严格条件”及其类似术语，如在本文中使用的，是指该领域熟悉的参数，该参数包括杂交温度随着多核苷酸或寡聚核苷酸长度的变化。核酸杂交参数可在编写此种方法的参考文献，Sambrook等人(上文)，和Ausubel等人(上文)中找到。例如，严格杂交条件，如在本文中使用的，可以指在65℃下在杂交缓冲液(3.5xSSC、0.02％聚蔗糖、0.02％聚乙烯基吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中杂交，并在65℃下在0.2xSSC，0.1％SDS中洗涤两次，其中每个洗涤步骤约30分钟。
本发明抗体和免疫球蛋白链典型地可通过重组表达生成。编码轻链和重链可变区的核酸，***在表达载体中，其中该可变区可选地连接到恒定区。该轻链和重链可在相同或不同的表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的DNA节段可操作地连接到表达载体(一种或多种)中的控制序列(control sequence)，该表达载体可确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括，但不限于，启动子(例如，天然关联的或异源性启动子)、信号序列、增强子元件，和转录终止序列。优选地，该表达控制序列是在能够转换或转染真核宿主细胞的载体中的真核生物启动子***。该载体并入在适当的宿主中后，该宿主将在适合核苷酸序列高水平表达，和适合抗体和/或免疫球蛋白链的采集和纯化的条件下保存。
典型地，这些表达载体在宿主细胞中是可复制的，或者作为游离基因，或者作为宿主染色体DNA中完整的部分。一般地，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性(ampicillin-resistance)、潮霉素抗性(hygromycin-resistance)、四环素抗性(tetracyclineresistance)、新霉素抗性(neomycin resistance)、G418-抗性、DHFR(二氢叶酸还原酶)、ADA(腺苷脱氨酶)、GS(谷氨酰胺(gluatamine)合成酶)，从而得以检测用期望的DNA序列转化的那些细胞(参见，例如，U.S.4,704,362)。
大肠杆菌是对克隆本发明多核苷酸(例如，DNA序列)特别有用的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆状菌(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)，和各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，也可以得到表达载体，该表达载体将典型地含有与宿主细胞(复制起点)相容(compatible)的表达控制序列。另外，存在任何数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子***、色氨酸(Trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***、来自λ噬菌体的T7启动子或启动子***。该启动子典型地可选地用操纵子序列控制表达，并具有用于启动和结束转录和翻译的核糖体结合位点序列等。
其他微生物，例如酵母，也对表达有用。酵母菌属(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，适宜的载体具有表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列及所需的类似物。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖解酶。可诱导的酵母启动子包括，其中，来自醇脱氢酶、异细胞色素C(isocytochrome C)，及引起麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。对表达有用的酵母的另一个实施例是毕赤酵母(Pichia pastoris)。
除了微生物之外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和生产本发明抗体和/或免疫球蛋白链(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)(参见，Winnacker，From Genes to Clones，VCHPublishers，N.Y.，N.Y.(1987))。实际上优选真核细胞，因为本领域中已经开发能够分泌异源蛋白(例如，完整的免疫球蛋白)的许多适宜的宿主细胞系，且该宿主细胞系包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、NSO细胞、HEK293细胞、PerC6细胞、HeLa细胞，优选地，骨髓瘤细胞系，或转化的B-细胞或杂交瘤。优选地，该细胞是非人细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子及增强子(Queen等人，1986)，和必要的处理信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点及转录终止子序列。优选的表达控制序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒、巨细胞病毒及类似病毒的启动子(参见Co等人，1992)。
可替换地，抗体编码序列可并入转基因中，用以引入到转基因动物的基因组中和转基因动物的乳汁随后的表达中(参加，例如，U.S.5,741,957、U.S.5,304,489和U.S.5,849,992)。适宜的转基因包括与启动子可操作地连接的轻链和/或重链的编码序列，和来自乳腺特异性基因的增强子，例如酪蛋白或β-乳球蛋白。
含有感兴趣的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型改变。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪(biolistics)或基于病毒的转染可用于其他的细胞宿主(一般参见，Sambrook等人，上文)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔法和显微注射。对于转基因动物的生产，可将转基因显微注射到受精的***中，或可将其并入到胚胎干细胞的基因组中，和转染到去核***中的此种细胞的细胞核中。
当在单独的表达载体上克隆重链和轻链时，该载体被共转染，从而获得完整的免疫球蛋白的表达和组装。被表达后，全抗体、它们的二聚体、各个重链和轻链，或本发明的其他免疫球蛋白形式可根据本领域的标准步骤纯化，该步骤包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、HPLC纯化、凝胶电泳及类似方法(一般参见Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。
结合物
本发明也提供了结合物(免疫结合物)，其包含结合到直接和间接结合抗体的治疗剂上的本发明抗体。治疗剂的实例包括，但不限于，细胞毒素、放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调节剂、抗血管新生剂、抗新血管形成和/或其他血管形成剂、毒素、抗增殖药剂、促凋亡(Pro-apoptotic)药剂、化疗剂，和治疗核酸。
细胞毒素包括损害(例如，杀伤)细胞的任何药剂。对于本领域中众所周知的这类药物的描述及其作用机制，参见Goodman等人，Goodman and Oilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，8th edition，Macmillan Publisher，1990。有关抗体免疫毒素制备的另外技术提供在，例如Vitetta(1993)和US 5,194,594中。
用于形成本发明免疫结合物的适宜的治疗剂包括
紫杉酚(taxol)、细胞松弛素(cytochalasin)B、短杆菌肽(gramicidin)D、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、表鬼臼毒(etoposide)、tenoposide、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺红菌素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素(actinomycin)D、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)，和嘌呤霉素(puromycin)、抗代谢药物(antimetabolites)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氨烯咪胺(decarbazine)、羟基脲(hydroxyurea)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine))、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、thioepa、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、亚硝脲氮芥(carmustine)(BSNU)、环己亚硝脲(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、氮烯唑胺(dacarbazine)(DTIC)、甲基苄肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)C、顺铂(cisplatin)和其他的铂衍生物，例如卡铂(carboplatin))，抗生素(antibiotics)(例如更生霉素(dactinomycin)(原放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、道诺红菌素daunorubicin(原道诺霉素(daunomycin))、阿霉素(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(plicamycin)、氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、白喉毒素(diphtheria toxin)和相关分子(例如白喉(diphtheria)A链和其活性片段和杂交分子)、蓖麻毒素(ricin toxin)(例如蓖麻毒蛋白(ricin)A或deglycosylated ricinA chain toxin)、霍乱毒素(cholera toxin)、志贺样毒素(Shiga-liketoxin)(SLT-I、SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素(Shiga toxin)、百日咳毒素(pertussis toxin)、破伤风毒素(tetanustoxin)、大豆鲍曼-比尔克蛋白酶抑制剂(soybean Bowman-Birkprotease inhibitor)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、alorin、皂草素(saporin)、蒴莲根毒素(modeccin)、gelanin、相思豆毒蛋白A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii proteins)、石竹素蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(Phytolacca americanaproteins)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordica charantiainhibitor)、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、sapaonariaofficinalis inhibitor、白树因(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)，和伊诺霉素毒素(enomycintoxins)。
适宜的血管新生抑制剂的实施例(抗血管新生药剂)包括，但不限于，尿激酶抑制剂，基质金属蛋白酶抑制剂(例如马马司他(marimastat)、新伐司他(neovastat)、BAY12-9566、AG3340、BMS-275291和类似药剂)、内皮细胞迁移和增殖的抑制剂(例如TNP-470、角鲨胺(squalamine)、2-甲氧雌甾二醇(2-methoxyestradiol)、考布他汀(combretastatins)、内皮他丁(endostatin)、血管稳定蛋白(angiostatin)、青霉胺(penicillamine)、SCH66336(Schering-Plough公司，Madison，NJ)、R115777(JanssenPharmaceutica有限公司，Titusville，NJ)及类似药剂)，血管新生生长因子的拮抗剂(例如ZD6474、SU6668、对抗血管新生药剂的抗体和/或它们的受体(例如VEGF、bFGF和血管生成素-1)、沙利度胺(thalidomide)、沙利度胺类似物(例如CC-5013)、Sugen5416、SU5402、抗血管新生核酶(例如angiozyme)、干扰素α(例如干扰素α2a)、苏拉明(suramin)和类似药剂)，VEGF-R激酶抑制剂和其他抗血管新生的酪氨酸激酶抑制剂(例如SU011248)，内皮特异性整联蛋白/生存信号的抑制剂(例如vitaxin和类似药剂)，铜拮抗剂/螯合剂(例如，四硫钼酸盐、卡托普利(captopril)和类似药剂)，羧胺***(CAI)，ABT-627，CM101，白介素-12(IL-12)、IM862，PNU145156E及抑制血管新生的核苷酸分子(例如反义-VEGF-cDNA、为血管稳定蛋白编码的cDNA、为p53编码的cDNA和为缺陷VEGF受体-2编码的cDNA)和类似药剂。血管新生、心血管形成，和/或其他血管形成的抑制剂的其他实施例为抗-血管新生的肝素衍生物和相关分子(例如，heperinaseIII)，替莫唑胺(temozolomide)、NK4、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、环氧合酶-2抑制剂、低氧诱导因子1的抑制剂、抗血管新生的大豆异黄酮、奥替普拉(oltipraz)、烟曲霉素及其类似物、抑生长素类似物、pentosan polysulfate，tecogalan sodium，dalteparin，肿瘤抑素(tumstatin)、血小板反应蛋白(thrombospondin)、NM-3、combrestatin，血管能抑制素(canstatin)、avastatin、抗其他相关靶的抗体(例如抗-α-v/β-3整联蛋白和抗-kininostatin mAbs)和类似药剂。
有多种放射性核素可用于生产放射性结合的(radioconjugated)抗体，实例包括，但不限于212Bi、131I、90Y和186Re。
抗体和治疗剂的结合物可使用多种双功能的蛋白质偶联剂制备，这些蛋白质偶联剂为，例如，但不限于，4-(4′乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸性酸(AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(酰胺)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)，酰亚胺酯的双功能衍生物(例如，二甲基己二亚酰胺化物HCL)、活化酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双偶氮化合物(例如双(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(p-二重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯-2，6-二异氰酸酯)、和双-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，及其衍生物。例如，蓖麻免疫毒素可按Vitetta等人(1987)描述的方法制备。碳-14-标记1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性螯合剂，用于放射性核苷酸与抗体的结合(WO94/11026)。
在另一个实施例中，该抗体可以结合到“受体”(例如链霉亲和素)上，以便应用于C5a-表达细胞预靶向中，其中向病人给予抗体-受体结合物，接着使用清除剂从循环中除去未结合的结合物，然后给予结合到治疗剂(例如放射性核苷酸)上的“配体”(例如亲和素)。
在一个实施例中，本发明抗体可用于递送遗传物质。该遗传物质可通过本领域中已知的任何技术结合到抗体上。实例包括，但不限于，利用生物素-亲和素相互作用、二硫桥键的形成、胺偶联(参见，例如Hendrickson等人，1995)、硫醇偶联(参见，例如Niemeyer等人，2003)，或醛-肼相互作用(参见，例如Kozlov等人，2004)。其他偶联剂在本领域是已知的，包括m-马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯或相关化合物、碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二乙基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，和戊二醛交联剂。
信号分析
配体，例如激动剂或C5a，与C5aR的结合可以形成通过这个G蛋白偶联受体的信号转导，和G蛋白的活化或刺激其他细胞内信号分子。在适宜的试验中利用配体，并评估抗体抑制配体诱导的活性的能力，可以确定本发明抗体的抑制活性。
G蛋白活性，例如GTP水解为GDP，或后来受体结合触发的信号事件，例如对细胞内(细胞浆)游离钙浓度的快速和暂时增大的诱导可通过本领域中已知方法或其他适宜的方法分析(参见，例如Neote等人，1993；Van Riper等人，1993；和Dahinden等人，1994)。
US 5,284,746中描述了利用杂交G蛋白偶联受体的功能试验可用于监测配体结合到受体和活化G蛋白的能力。
此种试验可在存在待分析的抗体的情况下执行，抗体抑制配体诱导的活性的能力可使用已知方法和/或在本文中描述的方法确定。
化学趋化和细胞刺激的试验
化学趋化试验可用于评估本发明抗体阻断配体与C5aR的结合的能力，和/或抑制与配体和受体的结合相关联的功能的能力。这些试验以化合物(化学引诱物)体外或体内诱导的细胞的功能迁移为基础。化学趋化可通过任何适宜的方式分析，例如利用96孔化学趋化板分析，或利用其他技术验证的方法来评估化学趋化。例如，Springer等人(WO 94/20142)和Berman等人(1988)描述了体外经内皮趋化试验的应用。也描述了跨内皮迁移到胶原凝胶(Kavanaugh等人，1991)。小鼠LI.2前B细胞或其他能够化学趋化的适宜的宿主细胞的稳定转染子可用于化学趋化试验。
一般地，化学趋化试验可监测适宜细胞(例如白细胞(例如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱粒细胞、中性粒细胞))定向移动或迁移进入或通过屏障(例如内皮或滤膜(filter))，朝向化合物水平增大方向，从屏障的第一表面向相反的第二表面。膜或滤膜提供了便利的屏障，因此可以监测适宜细胞定向运动或迁移进入或通过滤膜，朝向化合物水平增大方向，从滤膜的第一表面向相反的第二表面。在一些试验中，用物质，例如ICAM-1、纤连蛋白或胶原包被该膜，以促进粘附。此种试验提供了体外近似的白细胞“归巢(homing)”。
例如，可以检测或确定对细胞在适宜的容器(容纳装置)中迁移的抑制，细胞从第一室迁移进入或通过微孔膜进入到含有化学引诱物和抗体的第二室，该室与第一室被膜分开。选择具有适宜孔径大小的，可用于监测对包括诸如消化纤维、聚碳酸酯的化合物的特异性迁移反应的膜。例如可以使用约3-8微米，以及优选的约5-8微米的孔径大小。滤膜上的孔径大小可以是统一的或在适宜的孔径大小范围内。
为了评估迁移和迁移的抑制，迁移到滤膜中的距离、跨过滤膜仍粘附于滤膜的第二表面的细胞数目，和/或聚集于第二室的细胞数目可使用标准技术(例如，显微术和流式细胞术)确定。在一个实施例中，用可检出的标记物(例如，放射性同位素、荧光标记物、抗原或抗原表位标记物)标记细胞，并通过用适当的方法(例如通过检测放射性、荧光、免疫分析)确定粘附于膜和/或出现于第二室中的标记物，可以在存在或不存在抗体时评估迁移。可以确定相对于一个适宜的对照物(例如，比较于不存在抗体时确定的背景迁移、比较于第二化合物(即，标准的)所诱导的迁移程度、比较于抗体所诱导的未转染细胞的迁移)的抗体拮抗剂所诱导的迁移程度。在一个实施例中，特别是对于T细胞、单核细胞或表达C5aR的细胞，可以监测经内皮的迁移。在这个实施例中，评估了经过内皮细胞层的移行(transmigration)。为了制备细胞层，可以将内皮细胞培养在微孔滤膜或膜上，可选地用例如胶原、纤连蛋白或其他的细胞外基质蛋白等物质包被，以促进内皮细胞的连接。优选地，培养内皮细胞直到形成了融合的单层细胞。有多种哺乳动物的内皮细胞可以用于形成单层细胞，包括，例如静脉、动脉或微血管内皮细胞，例如人脐静脉内皮细胞(Clonetics公司，San Diego，Calif)。为了评估应答于特殊哺乳动物受体的化学趋化作用，优选同种哺乳动物的内皮细胞；但也可使用来自异源的哺乳动物物种或属的内皮细胞。
在一个用于测试C5a信号的抗体抑制剂的实施例中，将包含能够迁移和表达C5aR的细胞的组合物放置于第一室中。将包含一种或多种能够诱导第一室中细胞化学趋化的配体或启动子的组合物(具有化学趋化功能)放置于第二室中。优选地，在将细胞放置于第一室前不久，或和细胞同步，将包含待测试抗体的组合物优选放置于第一室内。本实验中可结合受体并通过表达C5aR的细胞的配体或启动子抑制化学趋化的诱导，是受体功能的抑制剂(例如刺激功能的抑制剂)。存在抗体时的配体或启动子诱导的迁移程度的减少是抑制活性的提示。可以执行单独的结合研究，从而确定抑制是否是抗体与受体结合的结果或经由不同的机制发生的。
下面描述了监测应答于组织内注射化合物(例如化学因子或抗体)的组织内白细胞浸润的体内试验(见炎症模型)。这些体内归巢模型可测量细胞通过游走化学趋化到炎症部位，应答于配体或启动子的能力，以及评估抗体或其片段阻断这种游走的能力。
除了所述方法之外，还可利用含有受体的合适的宿主细胞，通过监测活性受体所诱导的细胞应答，评估抗体对C5aR的刺激功能的影响。
化学趋化分析的其他实施例描述在本文中，参见，例如实施例4。
炎症模型
体内炎症模型是可获得的，它可用于评估体内抗体作为治疗剂的作用。例如，将化学因子以及与C5aR发生反应的抗体皮内注射到合适的动物，例如兔、小鼠、豚鼠或猕猴中之后，监测白细胞的浸润(参见，例如，Van Damme等人，1992；Zachariae等人，1990；Jose等人，1994)。
在一个实施例中，组织学评估了浸润白细胞(例如嗜酸性粒细胞、粒细胞)的皮肤活体组织检查。在另一个实施例中，将能够化学趋化和外渗(extravasation)的标记的细胞(例如，表达C5aR的稳定转染的细胞)给予动物。在将标记的细胞给予测试动物之前、同时或之后，将抗体给予测试动物。比较于无抑制剂时的浸润程度，抗体存在时浸润程度的减少是抑制的提示。
用途
本发明抗体在各种应用中都是有用的，包括研究、诊断和治疗应用。
C5aR对于白细胞聚集有着重要作用。C5aR是用于天然免疫***细胞的化学引诱物受体，该细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和小胶质细胞，因此C5aR抗体可用于抑制(减少或阻止)白细胞迁移，特别是和中性粒细胞组织损伤相关的迁移，例如再灌注损伤和中风，或与单核细胞介导的病症相关的迁移，例如动脉粥样硬化症。
在本文中描述的抗体可以作为抑制(减少或阻止)(a)与受体的结合(例如，配体、抑制剂)，(b)受体信号功能，和/或(c)刺激功能的抑制剂。作为受体功能抑制剂的抗体可以直接或间接地(例如通过引起构象改变)阻断配体的结合。例如，抗体可以通过抑制配体的结合或通过脱敏作用(有或没有对配体结合的抑制)抑制受体功能。
在一方面，本发明提供了治疗或阻止对象的病症的方法。如在本文中使用的，“病症”是对正常功能的破坏或干扰。
在一个实施例中，该病症是免疫病态病症。
免疫病态是对具有免疫原因的疾病的研究，免疫疾病是由抗体对抗原反应导致的任何病况。因而“免疫学病症”可定义为抗体对抗原反应引起的病症—这包括自身免疫学疾病和超敏感性反应(例如，I型：过敏、荨麻疹、食物变应性、哮喘；II型：自身免疫性溶血性贫血、输血反应；III型：血清病、坏死性血管炎、肾小球肾炎、风湿性关节炎、狼疮；IV型：接触性皮炎、移植排斥)。
自身免疫疾病的出现，其中免疫***未能清除发育期间的自反应性淋巴细胞(self-reacting lymphocyte)，和随后的调节故障，导致自反应性T或B细胞克隆的活化，产生对抗自身抗原的可严重损害细胞和器官的体液或细胞介导的反应。
在另一个实施例中，该病症是炎性疾病。
炎症是机体组织对刺激或损伤的保护性反应，其可以是急性的或慢性的。因而，炎性病症包括涉及中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞的疾病，其中发生了细胞因子释放、组胺释放、氧爆发、吞噬作用、其他颗粒酶的释放和化学趋化作用。超敏感性反应(上面定义的在免疫病态病症下)也可视为炎性疾病(急性或慢性)，因而它们通常涉及补体活化和诸如中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞等各种白细胞的募集/浸润。
因此，可利用本发明治疗或预防的人或其他物种的病症包括，但不限于：
i)涉及白细胞迁移和/或白细胞活化的病症，例如缺血/再灌注损伤、再灌注损伤、中风、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、慢性障碍性肺病(COPD)、动脉硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、移植排斥、皮肤或器官的白细胞浸润的癌症、大疱性类天疱疮、抗磷脂综合征(APS)；
ii)急性炎症，例如***炎症反应综合征(SIRS)、败血症休克、内毒素性休克、过敏性休克、过敏性反应、药物过敏、超敏感性反应、急性肺损伤；
iii)慢性炎症，例如牛皮癣、炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、溃疡性结肠炎、慢性障碍性肺病(COPD)
iv)自身免疫疾病，例如***性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、强直性脊柱炎、硬皮病、肾小球性肾炎、自身免疫性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis))、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、牛皮癣关节炎、大疱性类天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、型I/幼年发病/胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性贫血(例如，恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血)(它包括其中存在与i)重叠的实施例)；
v)炎性疾病，包括i)或ii)中没有涵盖的病症，以及间质炎性疾病、强直性脊柱炎，脊椎炎，血管炎(例如，坏死性、皮肤的、超敏感性、过敏性)、皮肌炎、皮炎(例如，过敏性接触，特应性，湿疹)、过敏性鼻炎；
vi)免疫病态病症，包括i)-iii)中未涵盖的病症，例如移植排斥(移植之后，例如同种异体移植、异种移植)、移植物抗宿主疾病(GVHD)；
vii)上面未提及的其他类型的病症，包括年龄相关性黄斑变性、败血症、膜增生性肾小球肾炎、致密物沉积病和阿尔茨海默氏病。
典型地，给予治疗有效量的抗体。短语“治疗有效量”是指足以促进、诱导，和/或增强对象的治疗或其他治疗效果的量。如在实施例部分中描述的，“治疗有效量”的实例是10mg/kg。
在另一个实施例中，本发明的各种抗体可用于检测C5aR或可用于测量受体，例如，在中性粒细胞、单核细胞上和/或在用受体基因转染的细胞上的表达。因此，它们也可用于诊断或研究目的的应用，例如细胞分选(例如，流式细胞术、荧光激活细胞分选术)。
本发明的抗-C5aR抗体对检测C5aR的存在与否有用，特别是对于诊断应用。典型地，诊断性试验需要检测抗体或其片段C5aR结合所形成的复合物的形成。对于诊断目的，将抗体或抗原结合片段标记或未标记。抗体或片段可以被直接标记。可以采用各种标记物，包括但不限于，放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶共因子、酶抑制剂和配体(例如生物素、半抗原)。本领域技术人员知道多种适合的免疫分析(参见，例如，US3,817,827、3,850,752、3,901,654和4,098,876)。组织样品的免疫组化学也可以用于本发明的诊断性方法中。当抗体或片段未被标记时，利用诸如凝集反应分析(agglutination assay)的合适的方法可以检测抗体或片段。未标记的抗体或片段也可以和另一种(即，一种或多种)可用于检测的抗体，例如与第一抗体(例如，抗独特型抗体或其他特异于未标记免疫球蛋白的抗体)发生反应的标记抗体(例如第二抗体)的合适的试剂，或其他合适的试剂(例如，标记的蛋白A)联合使用。
关于显像剂，可使用的任何合适的药剂包括，但不限于，MRI剂、CT显像剂、光学显像剂、超声显像剂、paraCEST显像剂，和其组合。在实施例中，该药剂是基于包含顺磁性金属螯合物的MRI或paraCEST剂的质子(proton)，其中该顺磁性金属选自由下列物质组成的组，即钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、钼、钌、铈、铟、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥，和镱。在进一步的实施例中，该药剂可以是包含碘化的油纳米颗粒(iodinated oil nanoparticles)或包埋的(entrapped)固体金属颗粒的CT显像剂。用于本发明的显像剂的进一步实施例是基于卤代烃的纳米颗粒，例如PFOB。
也可以制备用于检测生物样品中C5aR蛋白存在的试剂盒。此种试剂盒可包括与C5aR结合的本发明抗体，以及一种或多种适合检测抗体或片段与C5aR之间的复合物存在的辅助试剂。可以以冻干的形式提供本发明的抗体组合物，它可以单独地或联合另外的特异于其他抗原表位的抗体一起使用。标记的或未标记的抗体可以和辅助成份(例如缓冲剂，例如Tris、磷酸和碳酸、稳定剂、赋形剂、生物杀灭剂和/或惰性蛋白，例如牛血清白蛋白)一起包含于试剂盒中。例如，可以提供抗体和辅助成份的冻干混合物，或者辅助成份可以被单独提供给用户联合使用。这些辅助材料存在的量以活性抗体量为基准一般小于约5重量％，以及存在的总量以抗体浓度为基准至少是约0.001重量％。采用能够结合到抗体的第二抗体，此种抗体通常提供在试剂盒中，例如单独的小瓶或罐。如果存在第二抗体，它通常是被标记的，并按和在本文中的抗体剂型一样的方式进行配制。
组合物和给药模式
根据给药途径以及所选择组合物的性质(例如，溶液、乳剂、胶囊)，给予的本发明抗体的剂型是不同的。待给予的包含本发明抗体的适当的药物组合物可以制备于生理可接受的药用载体中。也可以使用抗体的混合物。对于溶液或乳剂，合适的载体包括，例如水溶液或乙醇/水溶液，对于乳剂或悬浮液，合适的载体包括盐水和缓冲介质。肠外介质可以包括氯化钠溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer溶液或不挥发油。本领域人员所熟知的各种适当的水溶液载体包括水、缓冲水、缓冲盐、多羟基化合物(例如甘油、丙烯乙二醇、液态的聚乙烯乙二醇)、葡萄糖溶液和甘氨酸。静脉内媒介可包括各种添加剂、防腐剂、或液体、营养物或电解质补充物(参见，一般地，Remington′s Pharmaceutical Science，16thEdition，Mack，Ed.1980)。组合物可以按需任选地包含药物可接受的辅助物质，从而接近于生理状态，例如pH调节和缓冲药剂和毒性调整药剂、例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。
根据已知技术的冻干和重溶技术，在使用之前可将本发明的抗体冻干用于保存以及在合适的载体中再新溶解。根据本领域熟知的步骤可以凭经验确定活性成份(一种或多种)在所选的介质中的最佳浓度，并且这将取决于期望的最终药物剂型。对于吸入，可以将抗体或片段溶解并装入合适的分散器中进行给药(例如，喷雾器、雾化器或加压气雾分散器)。
各种给药途径均是可能的，包括但不必局限于：口服、饮食、局部、肠外(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮下注射)、吸入(经气管、经眼、经鼻或经口吸入、经鼻滴入)，这取决于待治疗的疾病或病况。其他合适的给药方法也可以包括可再填装的或可生物降解的装置和缓释多聚物装置。
也可以将本发明的药物组合物作为与其他药剂的联合治疗的一部分给予。此种其他治疗/药剂对本领域中技术人员是众所周知的。在一个实施例中，该病症是风湿性关节炎，其他的治疗剂选自ATC code M01C类别的抗风湿药和ATC code L04类别的免疫抑制剂，包括，但不限于硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、环孢素(cyclosporine)、D-青霉胺(D--penicilllamine)、金盐(金硫丁二钠(sodium aurothiomalate)，金诺芬(auranofm))、来氟米特(leflunomide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米诺环素(minocycline)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)和糖皮质类固醇(glucocorticosteroids)。在另一个实施例中，该病症是***性红斑狼疮和其他的选自ATC codeM01C类别的抗风湿药和ATC code L04类别的免疫抑制剂，包括，但不限于硫唑嘌呤、氯喹、羟氯喹、环孢素、D-青霉胺、金盐(金硫丁二钠，金诺芬)、来氟米特、甲氨蝶呤、米诺环素、柳氮磺胺吡啶和环磷酰胺和糖皮质类固醇、霉酚酸(mycophenolic acid)或麦考酚酯(mycophenolate)和他克莫司(tacrolimus)。在另一个实施例中，本发明抗体也可与其他抗体(例如，结合趋化因子受体的抗体，该抗体包括，但不限于CCR2和CCR3)联合，或与抗-TNF或其他抗炎症药剂或与已存的血浆制品联合使用，例如可商购获得的γ球蛋白及预防和治疗处理中使用的免疫球蛋白制品。本发明抗体可用作独立给予的组合物，连同抗体和/或抗微生物剂供给。
给予本发明抗体的剂量范围是大到足够产生期望效果的剂量，其中改善了免疫病态疾病的症状或减少了感染的可能性或对免疫***的过度剌激。该剂量不应当大到引起不良副作用，例如高粘滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般地，该剂量随着患者的年龄、病况、性别和疾病的程度而变化，并由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，个人医师可以调整剂量。剂量的变化范围为约0.1mg/kg～约300mg/kg，优选为约0.2mg/kg～约200mg/kg，更优选为约0.5mg/kg～约20mg/kg。每日、每周或每两周或以确定需要的任何其他的频率，以及每日一次或多次给予，在慢性病的情况下，服药可持续许多月(或甚至多年)。
本领域技术人员应当理解，通过给予包含编码抗体的核酸分子可以将本发明的抗体引入到对象中。核酸分子可以是DNA或RNA或包含DNA和RNA的嵌合分子的形式。可以将编码抗体的核苷酸序列(一种或多种)克隆到表达载体中，其中编码药剂的序列与表达调控元件可操纵地连接。表达调控元件在本领域是熟知的并包括例如，启动子、增强子和合适的起始及终止密码子。
多种方法可用于将编码抗体的核酸引入到体内靶细胞中。例如裸核酸可注射在靶点处，可包囊化成脂质体，或可通过病毒载体引入。
单独的核酸分子或，例如在阳离子脂质体中包囊化的核酸分子的直接注射可用于在体内将编码TSP-1的核酸稳定基因转移到非***的或***的细胞中(Ulmer等人，1993)。另外，利用粒子轰击方法可在体内将核酸转移到各种组织中(Williams等人，1991)。
病毒载体可用于在体内将编码抗体的核酸分子基因转移到特定的细胞类型中。病毒是特异的感染药剂，它能感染特定的细胞类型并在其中繁殖。这种对感染特定细胞类型的特异性特别适合于在体内使抗体靶向到所选择的细胞中。对病毒载体的选择部分取决于要靶向的细胞类型。
可靶向特定细胞类型的具体的病毒载体在本领域是众所周知的。此种载体包括，例如，具有通用的或组织特异性启动子的重组腺相关病毒载体(US 5,354,678)。重组腺相关病毒载体具有的其它优点是重组病毒可以稳定地整合到甚至静止的非增殖细胞的染色质中(Lebkowski等人，1988)。
通过将组织特异性启动子或增强子并入到载体中，可以构建病毒载体，从而进一步控制表达编码抗体的细胞类型(Dai等人，1992)。
逆转录病毒载体也适合于在体内递送编码抗体的核酸分子的方法。此种载体可被构建成作为感染粒子或作为只进行单次首轮感染的非感染粒子。
利用组织特异性配体或经桥分子与核酸分子非共价络合的抗体，受体介导的DNA递送方法也可以用于以组织特异性的方式将编码抗体的核酸分子递送到细胞中(Curiel等人，1992；Wu和Wu，1987)。
在对象中获得抗体表达的基因转移，也可通过例如，对自体细胞的回体法中(ex vivo)转染执行。对于此种回体法中转染适合的细胞包括血细胞，因为利用本领域众所周知的方法容易操纵这些细胞并将它们重新导入到对象中。
通过细胞的回体法中转染的基因转移可通过多种方法执行，这些方法包括，例如磷酸钙沉淀、二乙氨乙基葡聚糖、电穿孔、脂质体转染或病毒感染。此种方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSprings Harbour Laboratory Press(1989))。这些细胞被转染后，然后将它们移植或迁移回所治疗的对象中，一旦这些引入体内的细胞可以产生抗体，这些抗体可以进入循环并在疾病或病况部位抑制血小板的聚集。
实施例
实施例1-人源化方法
限定CDR和框架残基
通常根据多种编号方案，例如Kabat、Chothia或IMGT(免疫遗传学信息***http://imgt.cines.fr)，定义抗体的CDR和框架区。Kabat定义基于序列变异性，它是最常用的。然而，对于给定的抗体，Kabat定义的CDR不必与其他编号***定义的完全相同。两个编号***定义的CDR可交叠，或可以在另一方的任一侧延伸(extend)几个残基。
本发明人结合使用了Kabat和IMGT编号***，从而在可变(V)结构域中定义CDR和框架区。本发明人希望尽量增大移植到人框架中的小鼠CDR序列的范围，以便维持抗原结合口袋的结构。因此，C5aR抗体CDR包括Kabat和IMGT编号***归类为CDR的所有残基。其余序列包含V结构域框架。
挑选合适的人抗体框架序列
为了挑选合适的小鼠CDR移植在其上的人抗体框架序列，本发明人采用了一些策略：
i)Blast检索序列数据库，鉴定与小鼠C5aR抗体同源性最高的人IgV区轻链和重链序列。比对同源性最高的序列，并产生轻链和重链的共有框架序列。
ii)鉴定与小鼠C5aR抗体重链或轻链具有高同源性的已知人抗体，并使用V区框架(或修饰形式)移植小鼠C5aR抗体CDR。
iii)利用与小鼠C5aR抗体相似的框架序列，鉴定其他成功的人源化的抗体，将小鼠CDR移植到这些框架上。
从序列数据库挑选同源抗体
在Blastp检索SWISSPROT和Genbank数据库中的人免疫球蛋白序列时，小鼠C5aR抗体、7F3可变区氨基酸序列(重链和轻链，见SEQ ID NO 1和2)单独用作查询序列。
在Blast检索人免疫球蛋白基因的IMGT数据库时，小鼠7F3可变区DNA序列(编码重链和轻链，见SEQ ID NO 3和4)单独用作查询序列。
从每次检索中，产生了与查询序列同源性最高的序列列表(表2和3)。
表2：与小鼠C5aR mAb可变轻链同源的人序列
查询 数据库 序列ID 描述 得分
共有框架序列-轻链7F3
通过比对来自表2的下列序列：KV2F_人、KV2D_人、KV2E_人、KV2B_人、KV2A_人，和DNA序列X12691、U41645、U41644、M31952的氨基酸翻译，使用ClustalW，产生了用于移植7F3轻链CDR的轻链人框架共有序列。该比对和共有序列示出在图1中。人共有框架与小鼠C5aR抗体7F3轻链框架序列有86％相同。
表3：与小鼠C5aR mAb可变重链同源的人序列
共有框架序列—重链7F3
产生的用于移植7F3重链CDR的共有人框架序列如下：
a)使用CLUSTALW，比对V区氨基酸序列HV1C_人、HV1B_人、HVIG_人和HV1A_人和V基因序列X92343、X62109、M99641、M99642和Z12305的氨基酸翻译，从而产生共有V区框架序列。
b)使用CLUSTALW，比对J区氨基酸序列HV3K_人、HV2I_人、HV1C_人、HV3H_人和HV3T_人，从而产生共有J区框架序列。
这些比对和共有序列示出在图2中。
挑选同源的人源化抗体
通过检索与鼠科动物抗体序列匹配最紧密的成功人源化的抗体的文献，挑选其他合适的框架序列。
鉴定出用于移植7F3轻链CDR的两条轻链框架序列：
基于KV2F的序列，描述在Caldas等人(2003)中。
基于HuVL-19的序列，描述在Nisihara等人(2001)中。
鉴定出用于移植7F3重链CDR的重链框架序列：
基于HG3的序列，描述在Caldas等人(2003)中。
基于SGI-VH的序列，描述在Nisihara等人(2001)中。
将CDR移植到框架序列中并创建人源化的轻链和重链序列
人源化7F3轻链
创建了三种形式的人源化7F3轻链可变区。
第一种是通过下面设计的，即从图1中取共有的人框架序列，将这个序列与小鼠7F3框架序列进行比较，将在人框架中选取的氨基酸换成小鼠残基并然后移植于小鼠7F3轻链CDR上(图3)。选作换成小鼠序列的人框架中的残基为：#2 Ile～Val、#15 Pro～Leu和#92Tyr～Phe。作出前两个变换的原因是因为在小鼠中发现的残基和与小鼠7F3最同源的人序列，即KV2F_人中的氨基酸匹配。作出第三个变换的原因是因为它与CDR3的接近性，且需要最小化对抗体结合区的结构的变换。小鼠7F3轻链CDR被移植到修饰的共有框架序列中，从而创建序列h7Vk(图3)(SEQ ID NO：31)。
第二种人源化的7F3轻链可变区是通过将小鼠7F3轻链CDR移植到上述人源化HuVL-19框架序列-RNOK203VL上(图4)创建的。这产生了序列h7aVk(图4)(SEQ ID NO：32)。
第三种人源化的7F3轻链可变区是通过将小鼠7F3轻链CDR移植到上述KV2F源的框架序列VLCD18-Q上创建的(图5)。与KV2F_人框架序列相比(见图1和SEQ ID NO：5)，2个氨基酸换成小鼠7F3序列：#51 Arg～Leu，从而除去第二个带电荷的残基，其中在小鼠中仅有一个，和#109 Val～Leu。一个进一步的差异是在残基#105 Gln～Gly处的变换，从而除去庞大的侧链。这产生了序列h7bVk(图5)(SEQ ID NO：33)。
图6示出所创建的这3个人源化7F3Vk序列的比较。这些序列与框架区中2～5位置上的共有序列h7F3VkCons是不同的，意味着所有序列彼此之间都超过93％相同。下面示出的数据表明含有某些轻链的人源化7F3抗体优于其他抗体。特别地，CDR环L1和L2之间的残基是关键的(critical)，在这个区中某些变换具有有害影响(例如，在残基#41处引入Cys)。其他变换，例如引入另外的带电荷的残基的影响相对较小。对人源化7F3Vk序列作出的其他变换可能对含有这些变换的抗体性质是无害的。
人源化7F3重链
创建了3种形式的人源化7F3重链。
第一种是通过下面设计的，即，从图2中取共有的人框架序列，将这个序列与小鼠7F3框架序列进行比较，变换在人框架中选取的氨基酸并然后移植于小鼠7F3重链CDR上(图7)。被改变的人共有框架中的残基为：#20变成Ile、#43变成Lys(从而保留带电荷的残基)、#72变成Ala(从而除去带电荷的残基)、#91变成Ser，和#95变成Phe。这些残基与小鼠框架相同，但也可在至少一种人Ig序列中找到。另外，通过在这时挑选HVIAv序列，解决F3中的相对灰区(ambiguous region)，从而并入在残基#70处的Ile和在#74处的Glu。将小鼠7F3重链CDR移植到修饰的共有框架序列中，创建序列h7Vh(图7)(SEQ ID NO：34)。
第二种人源化7F3重链可变区是通过将小鼠7F3重链CDR移植到上述SGI-VH源的框架序列上创建的(图8)。将位于六个位置处的SGI-VH框架中的人残基变换成小鼠7F3残基。这些变换是在残基#38(Arg～Lys)、#48(Val～Ile)、#67(Arg～Lys)、#68(Val～Ala)、#72(Leu～Ala)和#77(Asn～Ser)上作出的。作出这些变换是因为该残基与CDR H1或H2靠得很近，并认为对结合口袋的形成重要。例如，创建序列RNOK203VH的SGI-VH中这些位置处的回复突变，已显示可改进人源化的抗-FasL抗体的中和活性(Nisihara等人，2001)。这产生了序列h7aVh(图8)(SEQ ID NO：35)。
第三种人源化的7F3重链可变区是通过将小鼠7F3轻链CDR移植到上述HG3源的框架序列上创建的(图9)。HG3框架上的一个位置，残基#71(Arg)回复突变成小鼠7F3残基(Ala)，从而除去带正电荷的残基。这产生了序列h7bVh(图9)(SEQ ID NO：36)。
图10示出所创建的这3个人源化7F3Vk序列的比较。这些序列与框架区中位于1～8位置上的共有序列h7F3VkCons是不同的，意味着所有序列彼此之间都超过90％相同。序列之间的一些显著差异包括在残基43处的Lys与Gln和在#74处的Glu与Thr。然而，下面示出的数据表明含有3条重链中任一条的人源化7F3抗体可有效阻断C5a与人C5aR的结合。因此，Vh序列之间的差异似乎不是关键的，对人源化7F3 Vh序列作出的其他变换可能对含有此种经修饰的序列的抗体性质是无害的。但是，对人源化7F3 Vh序列作出的某些置换有可能改进了抗体性质，而其他的置换可能是有害的。
分子建模
背景
抗体结合位点的建模是蛋白质同源建模和从头(ab initio)建模的组合，其中蛋白质同源建模中大量抗体结构可用作已知数据库，而从头建模必须用于太易变而不能运用同源方法的抗体的那些部分。在不同的抗体之间，大部分可变片段(Fv)框架区(FW)的结构都是很保守的。在考虑了特定β-链中确实发生了的这些变化形式之后，可通过选择序列中与待建模的Fv最接近的已知结构，给框架建模。
抗体中大多序列和结构可变性限制于结合抗原的高变区(CDR)。这六个环(LI、L2、L3、HI、H2和H3)位于抗体表面上，且这是对CDR的建模的最大挑战。除了H3，所有CDR通常落入2和6结构(标准)类之间的一个(Chothia和Lesk，1987；Chothia等人，1989)。标准类的成员都具有近乎相同的骨架构象。因此，为了给未知CDR建模，检查序列，分配适当的标准类，并使用序列同源性最高的已知CDR。H3环更难建模，因为它的构象在多种结构之间显著变化。
抗体建模的当前方法通常采取同源方法(见，例如，Pulito等人，1996；Eigenbrot等人，1993；Barry等人，1994)。WAM(WebAntibody Modelling，见http://antibody.bath.ac.uk)采用的算法使用了序列同源性最高的框架和待构建序列的标准CDR环，该序列选自已知抗体结构的数据库。
对于非标准环，使用不同方法。这是Martin等人(1989)的CAMAL(Combined Antibody Modelling Algorithm)，并由结合的数据库/构象检索组成。
模型产生
WAM用于产生小鼠7F3 Fv区的模型(带有重链和轻链)和人源化7F3 Fv区的模型。
产生许多人源化Fv区模型(各自含有一个V区轻链和一个V区重链)，因为本发明人已为人源化7F3重链和轻链中的每个生产数个序列变体，将每个人源化Fv模型与小鼠7F3 Fv结构进行比较，其中使用DeepView/SWISS-PdbViewer详细比较CDR结构。例如，当将h7Vk-h7Vh结构与7F3 Fv结构比较时，h7Vk轻链可以非常好的配合7F3 Vk，几乎是完全相同的，但重链CDR H2和H3没有紧密比对。相反，在另一个模型中，包含h7aVk-h7aVh序列，重链与7F3 Vh的比对比与h7Vh好，但是轻链比对在CDR中大大不同。从这个分析，可以推测h7Vk和h7aVh的结合可产生与7F3最相似的抗体。包含显露CDR LI、HI、H2和H3的h7bVk-h7bVh序列的抗体分析与等价的7F3 CDR之间的不同比与其他的h7F3重链和轻链之间的不同要大，揭示含有h7bVk或h7bVh序列的抗体没有7F3或未含有这些序列的人源化7F3抗体。鉴于此，令人吃惊的和出乎意料的，含有h7bVh序列的一个抗体显示出比F3较高的活性(见实施例15，图17)。
接下来的步骤是将上述人源化的7F3重链和轻链序列转换成用于体外和体内测试的抗体。
实施例2—人源化抗体的表达和生产
将抗体可变区基因克隆到含有恒定区基因的载体中
按如上所述设计重链和轻链可变氨基酸序列。为了生产含有这些结构域的抗体，合成了编码每个可变区的DNA序列(Genescript公司)。EcoR1和Hindlll位点添加在5’或3’端，从而促进到载体PUC18中的克隆。另外，轻链可变基因在每个端点均具有仅有的BsmB1限制位点。重链基因具有位于5’的BsmB1位点和位于3’端的Nhel位点。
为了构建全长抗体基因，可变区基因被亚克隆到编码分泌信号和恒定结构域的载体中。对于轻链，这个载体含有被两个独特BsmB1位点分开的分泌信号序列和人恒定kappa(Cγ)区基因。重链载体含有被BsmB1和Nhel位点分开的分泌信号和人恒定γ(Cγ)区基因。重链载体含有γ1(Cγ1)、γ2(Cγ2)、γ3(Cγ3)、γ4(Cγ4)、γ4PE突变(Cγ4PE)或γ4p突变(Cy4P)基因。
该克隆过程涉及通过标准方法制备质粒DNA，按制造商(新英格兰Biolabs和Promega)推荐的，用BsmB1(轻链载体和Vk区基因)或BsmB1和Nhel(重链载体和Vh区基因)消化质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，使用凝胶提取试剂盒(JetQuick、Genomed)从凝胶中回收DNA片段，将可变基因片段连接到载体片段(T4 DNA连接酶，Promega)，将DNA转化成感受态E.coli细胞(前10名，Invitrogen)。通过限制性内切酶消化以分析来自转化细胞的质粒DNA，对质粒中的抗体基因测序，从而证实已在正确的阅读框中克隆可变区。
将抗体基因亚克隆到表达载体中
在证实全长抗体基因具有正确的序列之后，将其亚克隆到表达载体中。可使用的表达载体的实例包括pcDNA-、pLENTI-、pT-REX-、pAd-、pREP-或pCEP-哺乳动物表达载体(Invitrogen)、pTriExl或pBac载体(Novagen)、ZAP和pCMV表达载体(Stratagene)、GS表达***载体，例如pEE12.4和pEE6.4(Lonza)、pCMV5 cumate表达***载体(Qbiogene)、UCOE表达***质粒(ML实验室)或MARtech表达质粒(Selexis)。在这种情况下，重链基因(含有位于5’端的Hindlll位点和位于3’端的EcoR1位点)被亚克隆到pcDNA3源的载体(Invitrogen)中CMV启动子的Hindlll-EcoR1位点下游，和/或GS表达载体(Lonza)中，其中该pcDNA3源的载体含有小鼠DHFR基因。轻链基因(含有位于5’端的Spel位点和位于3’端的EcoR1位点)(Invitrogen)被亚克隆到pTracer-CMV/BSD(Invitrogen)的Nhel-EcoR1位点中。含有位于5’端的Hindlll位点和位于3’端的EcoR1位点的轻链基因也被亚克隆到GC表达载体(Lonza)的Hindlll-EcoR1位点中。在一些情况下，重链表达盒(启动子、轻链编码序列和多聚腺嘌呤信号)被亚克隆到轻链载体中，从而创建表达重链和轻链的单个载体。
在哺乳动物细胞中表达人源化抗体
为了表达人源化抗体，使用脂质体(Invitrogen)将重链和轻链载体共转染到CHO细胞中，或者，可通过电穿孔、磷酸钙沉淀、直接注射、基因枪或本领域技术人员已知的其他方法转染载体DNA。或者可将载体DNA转染到任何数目的哺乳动物细胞系中，例如CHOK1SV、HEK293、PerC6或NS0。在一些情况下，编码重链和轻链的单个载体可通过电穿孔或使用脂质体转染到细胞中。
在转染的前一天，将15ml非选择性培养基(含有核苷(Invitrogen)的α-MEM，2mM L-谷氨酰胺，10％FBS)中4×105CHOdhfr-细胞(ATCC)接种到T175烧瓶中，并在37℃下在5％ CO2中孵育。在转染之前将800μl生长培养基中的质粒DNA(15μg)加入到800μl生长培养基中的100μl脂质体(Invitrogen)中，并在室温下孵育20分钟。用PBS漂洗该细胞单层，并将DNA/脂质体混合物添加到含有5ml生长培养基的烧瓶中。在37℃下在5％CO2中孵育16小时之后，加入另一个10ml生长培养基。一天之后，用PBS清洗该细胞，并添加15ml选择性培养基(α-MEM不加核苷和5％的透析FBS)。2天之后，以每孔2～5个细胞的平均密度将粘附性细胞再植入(replate)到96孔的组织培养板中。在接下来的2-3周之后，使用人IgG-特异性ELISA测量生长抗体生产。细胞表达抗体扩增到T-烧瓶中，用以生产。收获培养基并按如下方法纯化抗体。将GS***表达载体转染到CHOK1SV细胞和分离的分泌细胞系的抗体中，并按制造商(Lonza)的推荐扩增该载体用于生产。
人源化抗体的纯化
转染细胞将抗体分泌到生长培养基中。通过蛋白质A或蛋白质G亲和色谱纯化抗体。收集通过SDS-PAGE或通过人IgG-特异性ELISA鉴定的含有抗体的组分。人IgG-特异性ELISA用于确定回收的抗体量及其浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗体纯化。
生产和分析的人源化抗体列表
表4列出了生产的不同抗体，示出抗体中出现的重链和轻链序列。
表4：生产的人源化抗体
实施例3-人源化抗-C5aR抗体的结合研究
为了表征人源化抗-C5aR抗体与人C5a受体(hC5aR)的结合动力学，在这个实施例中描述了两种类型的结合研究。第一种在竞争性配体结合试验中比较了抗体和C5a与人C5aR的结合。第二种涉及表达人C5aR的细胞中的饱和结合。
A.人源化抗-C5aR取代C5a与C5aR结合，竞争性配体结合试验
按下面描述的，测试了人源化Ab抑制125I-标记的C5a与用hC5aR基因转染的L1.2细胞或人中性粒细胞结合的能力。重组人C5aR从Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得。125I-Bolton-Hunter-标记的补体C5a从NEN-Dupont(Boston，MA)处购买，其中比活性(specific activity)为2200Ci/mM。简言之，在实验之前，让L1.2/hC5aR稳定转染子生长数天，然后在结合试验之前用5mM丁酸处理过夜，从而刺激hC5aR表达。从采集于健康志愿者的静脉血液中纯化出人中性粒细胞。通过Percoll密度离心，和随后的红血细胞裂解步骤，从白细胞分离出中性粒细胞。两种细胞类型都用PBS清洗一次，并使其重悬于浓度为1×107/ml的结合缓冲剂(50mMHepes，pH 7.5，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％BSA)中。将等份的40μl(4×105细胞)分配(diapense)到96孔微孔板中，接着添加冷的竞争剂(抗体或人C5a)。在将放射性标记的C5a添加到最后浓度为0.4nM中之前，在室温下孵育细胞和冷的竞争剂15分钟。最终的反应体积是120μl。在室温下孵育60分钟之后，用150μl含有0.15M NaCl的结合缓冲剂清洗细胞三次。然后在TopCount闪烁计数器(Packard)上对细胞颗粒进行计数。样品分为一式三份进行分析，每个为6～8浓度。在至少3个独立的试验中测试每个抗体。每个样品中计算数目(number of counts)表示最大125I-C5a结合百分比，该最大125I-C5a结合百分数是在扣除背景之后没有添加冷竞争剂的情况下在孔中观测的。
通过与人中性粒细胞中的小鼠抗体7F3和L1.2/hC5aR转染子比较，对人源化抗体中每个抗体的这个分析的结果(取代曲线)分别在图11和12中给出。表5示出每个抗体的EC50值。可使用Graphpad Prism软件，以数据拟合对于一个结合位点的非线性方程，获得这些值。数据显示不是所有人源化抗体都等同有效地从受体中取代放射性标记的C5a。人源化抗体O和N与人中性粒细胞中的小鼠7F3同样有效，而抗体C、J、M、N、O和Q与L1.2/hC5aR转染子中的7F3没有显著差异。
表5：图11和12中示出的每个抗体的EC50值。
  nM   染子)nM
  人C5a   0.5   0.37-0.88
  m7F3   0.54   0.39-0.75   0.51   0.35-0.75
  A   nd   2.78   1.81-4.27
  C   2.48   1.49-4.12   0.90   0.56-1.47
  F   2.55   1.51-4.31   1.26   0.88-1.80
  G   3.52   1.95-6.35   1.53   0.92-2.52
  J   4.11   2.14-7.91   0.93   0.63-1.31
  M   4.05   2.53-6.49   0.95   0.60-1.48
  N   0.65   0.45-0.94   1.03   0.56-1.90
  O   0.48   0.32-0.70   0.68   0.39-1.17
  Q   3.50   2.42-5.05   0.86   0.52-1.46
  S   2.69   1.46-4.96   nd
B.抗-C5aR抗体与纯化的人中性粒细胞的饱和结合
将按如上所述分离的人中性粒细胞重悬在dPBS中，并将1×105细胞(在25μl)分配到96孔板中。在每个孔中添加等体积(25μl)的2×抗体(稀释在PBS中)。使用2倍连续稀释，将最终的抗体浓度稀释到40～0μg/ml(使用未标记的hAb-Q、hAb-J和7F3)。在4℃下孵育细胞和抗体20分钟。孵育之后，在每孔中加入100μl PBS+1％BCS中并在2,000rpm下离心该板3分钟。在PBS+1％BCS中清洗细胞3次，并将其重悬于在PBS中稀释1/300的抗人IgG-FITC(Sigma F1641)或抗小鼠IgG-FITC(Jackson 195-115-003)中，并在冰上孵育20分钟。按上面清洗细胞一次，并将其重悬于PBS+1％FCS中，以通过流式细胞仪分析。FSC与SSC分散剂(scatter)用于鉴定中性粒细胞，确定每个样品的中位荧光强度(MFI)。通过使用GraphPad Prism(v4.0)软件以数据(MFI-背景与log10[抗体浓度])拟合S形剂量反应曲线(sigmoidal dose-response)(可变斜率)，即，4-参数logistic方程，确定EC50值。通过以数据拟合一位点结合(one-site binding)双曲线方程可确定Bmax和KD。
图13示出两个饱和结合图表，其中x-轴为log10(从而计算EC50)和线性(从而计算Bmax和KD)标度。该数据显示与人中性粒细胞在4℃下结合的人源化抗-C5aR抗体N和Q的KD和EC50约为7F3的2-3倍。人源化抗体的KD和EC50是相似的，每个大约为20～25nM(～3μg/ml)，而在这个试验的条件下7F3的KD和EC50范围为～8-10nM。
实施例4-人源化抗-C5aR抗体在人C5aR的第二细胞外环中结合抗 原表位EEYFPP(SEQ ID NO：38)的方法
结合到嵌合受体的抗体
包含小鼠和人C5aR节段的系列嵌合受体被构建，从而鉴定抗体结合的C5a受体区。使用标准分子技术(Lee等人，2006)制得这些抗体。使用脂质体2000(Invitrogen)，将编码不同嵌合受体的每个重组载体(在DMEM中稀释的5μg)转染到5×105小鼠L1.2细胞中。细胞在DMEM或RPMI(Invitrogen)和10％的胎儿牛血清(Hyclone)中生长。24小时或48小时之后，通过在1,500rpm下离心5分钟收获细胞，并将其重悬于FACS缓冲剂中(磷酸盐缓冲盐水加2％牛血清白蛋白)。为了用hAb-Q染色，0.5x105转染的细胞与每孔体积为50μl的5或10μg/ml抗体在4℃下孵育20分钟。在添加稀释1∶200或1∶300的50μl FITC-结合的抗人IgG(Sigma，F1641)之前，按如上使细胞成颗粒状并用150μl FACS缓冲剂漂洗细胞3次。在使细胞成颗粒之前，在4℃下孵育这个混合物20分钟，用FACS缓冲剂清洗3次，最后将其重悬于150-200μl FACS缓冲剂中。在FACS Calibur(BD Bioscience)上分析样品。
结合到来自第二细胞外环的肽的抗体
合成了22个重叠肽(12mer)组，每个被1个下一个残基偏移(offset)，并跨越人C5aR的第二细胞外环(第三个细胞外结构域)(Mimotopes，Melbourne)。每个肽都是由生物素组和位于N-末端的4-氨基酸接头(SGSG)制成。合成的一个肽，no.23，为33mer，该33mer表示hC5aR的第二个细胞外环(来自SEQ ID NO：37的残基173-205)的全长，该肽也在N-末端具有生物素-SGSG。在这个实验中使用的肽描述在lee等人(2006)中。
该实验是这样进行的，即，通过使肽结合到384-孔链霉亲和素包被的板，然后孵育抗体和该肽并用结合到如下辣根过氧化物酶(HRP)的抗人IgG检测结合肽。在200μl 60％的DMSO中溶解每个肽，使其到浓度为10mg/ml。进一步用PBS/Tween 20/叠氮化物溶液(PBS/0.05％ Tween 20中的0.1％ w/v的叠氮化钠)，1∶1000稀释肽，使其工作浓度为10μg/ml。
每孔用20μl阻断缓冲剂(PBS中的1％w/v BSA)，阻断384-孔链霉亲和素包被的板(Nunc)。用PBS/Tween 20(PBS中的0.1％v/v Tween 20)清洗该板4次。将20μl稀释的肽溶液转移到孔中，并在室温下孵育该板1小时。在清洗该板4次(如上)之后，向孔中加入20μl抗体(0.5、1、1.25、2.5或5μg/ml)，并在20℃下孵育1小时。如上清洗该板4次，然后向每孔中添加20μl HRP-结合的抗小鼠IgG(在PBS/Tween 20中1∶5000稀释)。在室温下孵育1小时之后，清洗该板3次(如上)，然后用PBS清洗两次，从而除去痕量Tween。通过向每孔中添加20μl新近制备的TMB底物试剂(BD Opt EIA)和在室温下孵育20分钟，检测过氧化物酶的出现。最后在650nm/450nm处读板。
第二个细胞外环内的关键氨基酸的鉴定：丙氨酸扫描突变肽
为进一步限定抗原表位EEYFPP(来自SEQ ID NO：37的残基179-184)(SEQ ID NO：38)中的关键结合残基，如上合成了系列多肽(12mers)，该多肽包含人C5aR第二个细胞外环序列VREEYFPPKVLC(来自SEQ ID NO：37的残基177-178)(SEQ IDNO：38)，在结合基序(binding motif)中的不同位置被丙氨酸置换，且在N-末端有生物素基团和4氨基酸接头(SGSG)(Lee等人，2006)。肽A1没有Ala置换，肽A14是肽A1的杂乱形式。肽A2-A13分别含有位于从12-1的氨基酸位置上的单个丙氨酸置换。按如上所述，进行抗体与包被在ELISA板上的肽的结合。
N-末端肽(PEP1)ELISA
用在PBS/0.01％Tween-20中浓度为1-15μg/ml，对应于人C5aR的残基9-29的多肽(PEP1)在37℃下包被384-孔Maxisorp板(Nunc)，持续1.5小时，然后清洗3次。用每孔20μl阻断缓冲剂(PBS中的1％ w/v BSA)在4℃下阻断该板过夜。用PBS/Tween缓冲剂(PBS中的0.05％ v/v Tween-20)清洗该板3次。向每孔添加20μl抗体(最终浓度为5μg/ml)，并在37℃下孵育该板2小时。如上清洗该板3次，然后向每孔中添加20μl HRP结合的抗人IgG kappa(在PBS/Tween中1∶8000稀释)或HRP结合的抗小鼠IgG(1∶7500稀释)。在室温下孵育2小时之后，清洗该板4次(如上)。通过向每孔中添加20μl新近制备的TMB底物试剂(BD Opt EIA)和在室温下孵育20分钟，可检测过氧化物酶的出现。最终，在用每孔20μl 1MH2SO4终止反应之后，在酶标仪(plate Reader)中在450nm(参考620nm)处阅读该板。
结果
为了证实人源化抗-C5aR抗体，在人C5aR中与在亲本抗体7F3中识别的结合位点相同，进行了四个试验。首先，使用hAb-Q给表达各种嵌合的人/小鼠C5aR的细胞染色。其次，hAb-J和Q与系列重叠肽(12mers)一起孵育，该重叠肽包含hC5aR的第二个细胞外环。第三，hAb-J和Q与系列突变肽一起孵育，该突变肽包含位于每个位置的Ala取代、来自人C5aR的第二个细胞外环的12个氨基酸基序。第四，hAb-J和Q与肽一起孵育，该肽包含来自人C5aR的N-末端细胞外结构域的9-29个残基。
人源化抗-C5aR抗体结合到含有人C5aR第二个细胞外环的嵌合受体
系列嵌合受体，包含细胞外结构域的每个中的人或小鼠C5aR序列，该结构域为：N-末端结构域，且按如上所述的构建第一个、第二个和第三个细胞外环(ECL)。每个细胞外结构域的的起源、以及跨膜和膜内节段的详述在表6中。在每个构建体中，细胞外结构域的起源由4-字母编码限定，例如mHHH定义了含有小鼠C5aR N-末端和人C5aR第一个、第二个和第三个ECL的嵌合受体。
表6：嵌合受体构建体：通过hAb-Q染色
*嵌合受体由它们的细胞外(EC)结构域命名：HHHH是人C5aR，Hmmm表示嵌合体，该嵌合体含有人C5aR的N末端和小鼠C5aR的第一、第二和第三细胞外环等。
a：人C5aR：SEQ ID NO：37
b：小鼠C5aR：GenPept编号NP_031603
亲本抗-C5aR mAb 7F3显示出表达嵌合C5aR的染色细胞的模式，该模式暗示它识别出人C5aR的第二个细胞外环(3rd细胞外结构域)中的抗原表位。为了证实人源化抗体hAb-Q与7F3具有相同的染色模式，用hAb-Q给表达不同嵌合的人/小鼠C5aR的暂时转染的细胞染色，并通过流式细胞仪分析，其中人源化抗体hAb-Q通过CDR移植来源于小鼠mAb 7F3，并因此应当含有相同的抗原结合位点。染色阳性的嵌合受体在表6中给出。通过hAb-Q染色的模式与用7F3观测到的模式完全相同。没有通过单独的第二抗体(secondaryantibody)(抗-hIgG-FITC)染色。用hAb-Q给嵌合受体1、2、3、6、8和11染色，表示这个抗体可识别人C5aR第二个细胞外环中的抗原表位。
结合来自第二细胞外环的肽的抗体
为了进一步限定人源化抗-C5aR抗体结合的第二个细胞外环中的抗原表位，合成了一组22个重叠多肽(12mers)，每个重叠肽被下一个重叠肽的1个残基偏移，并跨越人C5aR的第二细胞外环。通过肽ELISA分析抗体与这些肽的结合。
通过7F3的肽结合模式与通过人源化7F3抗体hAb-Q和hAb-J的结合模式相似。人源化抗体最强烈地结合到肽4和5和肽23(图14A和14B)。肽23是人C5aR全整的第二个细胞外环(来自SEQ IDNO：37的残基173-205)。与肽1-3和6-7的结合较弱。相比之下，7F3强烈地结合到肽1-7。肽1-7含有公共元素：6个氨基酸基序：EEYFPP。抗体没有结合到缺少这个基序的肽13-22，或含有截断(truncated)形式的基序的肽8-12。抗C5aR抗体识别并结合到人C5a受体的第二个细胞外环上的线性抗原表位(EEYFPP；来自SEQID NO：37的残基179-184)。人源化抗体没有结合到含有接近一个或另一个端点的EEYFPP的肽，而是结合到其中基序位于中央的肽。
在第二个细胞外环的EEYFPP基序内的关键结合残基
为了进一步限定人源化抗-C5aR抗体结合的抗原表位EEYFPP中的关键结合残基，合成了系列短肽(12mers)，该短肽包含人C5aR第二个细胞外环序列VREEYFPPKVLC(来自SEQ ID NO：37的残基177-188)，其中结合基序中的不同位置上取代有丙氨酸。通过肽ELISA分析了抗体与这些肽的结合。
在这个实验中，发现了用于结合鼠科动物抗-C5aR mAb 7F3的关键氨基酸是Y3，和抗原表位E1E2Y3F4P5P6(Lee等人，2006)中的F4。如同7F3，人源化抗体hAb-J和Q(分别为Figure 14C和D)没能结合在位置Y3或F4上有Ala取代的肽。另外，在E1、E2和P5上的取代也减少了通过hAb-J和Q的结合。
主导抗体(lead antibody)hAb-Q未结合N-末端9-29肽(PEP1)
本实施例示出了人源化抗-C5aR抗体结合C5aR的第二个细胞外环中的抗原表位。而且，它们没有结合包含人N-末端结构域和小鼠第二个细胞外环的嵌合的小鼠/人C5aR构建体#7和#9(见表6)。
为了证实抗-C5aR抗体没有结合来自人C5aR的N-末端结构域的线性多肽，合成了具有序列PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT(来自SEQ ID NO：37的残基9-29)(SEQ ID NO：59)的肽PEP1，并通过ELISA分析了抗体与肽的结合。
早期研究表明抗-C5aR抗体mAbs 7F3、12D4和6C12没有与PEPI竞争结合转染子上的人C5aR，这些mAbs也没有结合包被在ELISA板上的PEP1(WO 03/062278)。图15显示人源化抗-C5aR抗体hAb-J和Q(在5μg/ml)没有结合PEP1，该PEP1以3种不同浓度(1/100、1/500和1/1000，即分别为10μg/ml、2μg/ml和1μg/ml)结合在ELISA板上。然而，针对人C5aR N-末端肽1-31的抗-C5aR(CD88)mAb S5/1(AbD Serotec，Cat No.MCA1283)，确实如期望地在5μg/ml下结合PEP1。
实施例5-阻断表达人C5aR的细胞的迁移
A.人源化抗体阻断人中性粒细胞的迁移
从外周血液中分离出人中性粒细胞，首先通过在室温下40分钟的葡聚糖沉积步骤，获得白细胞部分。然后将细胞分层加入到Ficoll-Paque(GE Healthcare)中，在室温下在2500rpm下密度梯度离心15分钟。在低渗(hypotonic)裂解剩余的红血细胞之后，将中性粒细胞重悬在趋化缓冲剂(49％RPMI 1640(Invitrogen)、49％的介质(Invitrogen)、2％透析的FBS(Invitrogen))中。将浓度为5μg/ml的抗-C5aR抗体添加到中性粒细胞(1x107/ml)中。包括了阴性对照(没有添加Ab，但是添加了1×PBS)。
然后将该细胞放入到带有3.0μm孔径的聚碳酸酯膜的24孔组织培养板(Corning公司)的***物(insert)的上室，并在室温下孵育10分钟。然后将***物放置到含有浓度为0.1～100nM的人中性粒细胞化学引诱物重组人C5a(sigma)的下室中。中性粒细胞的最大迁移发生在当下室中C5a为1-10nM时。然后在37℃下孵育中性粒细胞30分钟。用流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences)量化通过膜迁移到下室的中性粒细胞数目。通过获取长30秒的结果，获得相对细胞数目。发现这个方法有着极高的可重复性，并可对活细胞选择并排除碎片。
图16中示出的结果显示，相比阴性(无抗体)对照，人源化抗体抑制了人中性粒细胞朝向C5a的迁移。浓度为5μg/ml的小鼠抗体7F3，阻断了97％人中性粒细胞的迁移。浓度为5μg/ml的人源化抗体G和J，分别阻断84％和82％的迁移，而抗体C和K效果较小，仅分别抑制75％和55％的中性粒细胞迁移。
B.人源化抗-C5aR抗体在体外以药剂依赖的方式阻止C5a-诱导的 表达人C5aR的细胞迁移
方法
人中性粒细胞迁移
将健康志愿者人静脉血液采集到含有作为抗凝结剂的EDTA(anti-coagulent)(BD Vacutainer #366457)的管子中。通过percoll密度离心，接着红血细胞裂解步骤，从血液中纯化出中性粒细胞(Lee等人，2006)。在1,200rpm下离心纯化的中性粒细胞5分钟，并将其重悬在浓度为2x107细胞/ml趋化缓冲剂的趋化缓冲剂(49％RPMI 1640、49％介质199、2％透析的FBS、GIBCO)中。于37℃下在5％CO2中孵育总体积为200μl的抗体(在趋化缓冲剂中稀释，最终浓度为0.003-10μg/ml)和细胞(2x106细胞/孔)20分钟。然后将这分成2×100μl样品，并将其添加到24-孔transwell板上室中的2孔中(HTS Transwell，3.0微米孔径；Corning)。将含有C5a的趋化缓冲剂(总共600μl)(最终浓度为0-100nM)置入下室中。于37℃下在5％CO2中孵育该板～1小时，从而允许细胞迁移。对照孔含有不带抗体的细胞，或不带C5a的缓冲剂。这个试验的标准曲线建立在带有如下所述的CyQUANT染料的96孔板上。
L1.2/hC5aR转染子细胞迁移
将生长在RPMI 1640、10％FBS、0.5mg/ml G418(Invitrogen)中，并用5mM丁酸刺激过夜的L1.2/hC5aR细胞在1,200rpm下离心5分钟并在趋化缓冲剂(49％RPMI 1640、49％介质199、2％透析的FBS、Gibco)中清洗，然后再次离心，最后将其重悬于2×106细胞/ml趋化缓冲剂中。将总体积为200μl的，与细胞(1×105细胞/孔)混合的抗体(稀释在趋化缓冲剂中，最终浓度为0.005-5μg/ml)添加到96孔板中并于37℃下在5％CO2中孵育到20分钟。将这分成2×100μl样品，并将其添加到96-孔transwell板(HTS Transwell-96***、5.0微米孔径、Corning)的上室中的2孔中。将含有重组人C5a(Sigma)、最终浓度为0.1-100nM的趋化缓冲剂(总共150μl)置入下室。于37℃下在5％CO2中孵育该板1小时，从而允许细胞迁移。对照孔含有不带抗体的细胞，或不带C5a的缓冲剂。配制hC5aR/L1.2细胞在趋化缓冲剂中的连续稀释，从而创建用于CyQUANT检测试验的标准曲线。在1hr孵育步骤之前，将含有固定数目的细胞(每孔0、150、450、1350、4050、12150)的缓冲剂(150μl)直接添加到下室中的两孔中的每个孔中。
使用CyQUANT染色量化
孵育之后，将transwell下室中的缓冲剂和迁移的细胞转移到96孔平底板(Nunc)中并在200×g(～1,500rpm)下离心5分钟。用150μl PBS清洗细胞颗粒，从而除去微量酚红，酚红可干扰CyQUANT荧光。在第二离心步骤之后，小心地除去上清液并在-80℃下过夜冷冻该板，从而裂解细胞。在室温下使该板解冻，并将在裂解缓冲剂中稀释的200μl CyQUANTGR染料(CyQUANT细胞增殖试验试剂盒，Invitrogen)添加到每孔中。
对于使用L1.2/hC5aR细胞的试验，如上面描述的首先在transwell板上确立标准曲线，并将该细胞转移到96-孔板中，以用CyQUANT染料标记。对于使用中性粒细胞的试验，在带有CyQUANT染料的96-孔板中如下直接建立标准曲线：将含有1×106中性粒细胞的颗粒在-80℃冷冻过夜，然后使其解冻，并将其重悬于1ml CyQUANT染料中，然后将200μl中的2×105细胞添加到含有200μl CyQUANT染料的96-孔中两孔中的每孔中，并将1份连续稀释在2份中，从而确立标准曲线(一式两份)，范围为100,000～48.8细胞/孔。
将包裹在铝箔中(从而保护不受光的影响)的该板在室温下孵育2-5分钟，然后置入荧光剂(FLUOstar Galaxy，BMGLabtechnologies)中，并在最大激发(Al)设置在485nm的情况下和将最大发射(B1)设置在520nm的情况下读板。使用FLUOstar控制软件记录荧光强度和处理数据。使用标准曲线将荧光强度转换成细胞数目，使用线性回归或非线性4-参数log方程(GraphPadPrism v4.0)分析数据。
结果
研究了浓度范围内的人源化7F3抗体阻断C5a诱导的人中性粒细胞和hC5aR/L1.2细胞转染子迁移的能力。
在transwell试验中，在暴露到10nM C5a之前，将来自4个健康的不同志愿者供体的中性粒细胞和各种浓度的抗-C5a抗体hAb-Q或7F3或同种型对照抗体一起预孵育。将样品分为一式两份进行。使用回归分析从标准曲线扣除背景荧光强度之后计算迁移细胞的数目。对于每个实验，标准曲线拟合方程r2值都＞0.99。
抗-C5a抗体表现出剂量反应关系。浓度为10μg/ml的hAb-Q和7F3彻底阻断了10nM C5a诱导的人中性粒细胞迁移。迁移细胞的数目随着抗体浓度的减少而增大。中性粒细胞与hAb-Q或7F3在浓度低于0.1μg/ml下的预孵育不能有效阻止迁移。同工型对照抗体没有阻断C5a诱导的中性粒细胞的化学趋化作用。图17示出来自用hAb-Q和7F3所示的最佳拟合的非线性回归线作图的4个实验的平均数据。人源化抗-C5a抗体比7F3更有效地阻断C5a诱导的人中性粒细胞的迁移，且IC50低至少6-8倍。
在与各种浓度的抗-C5aR抗体hAb-Q、hAb-J或7F3或同种型对照抗体预孵育之后，也对表达人C5aR的转染细胞进行了迁移试验。图18示出在5μg/ml下，hC5aR/L1.2转染子迁移被人源化抗-C5aR抗体J和Q，及7F3彻底抑制。使用非线性回归与S形剂量反应方程(GraphPad Prsim software)进行数据分析，得出7F3、J和Q的IC50值分别为0.5、0.6和0.7μg/ml，暗示着该抗体每个都非常有效地阻止中和的C5a诱导的hC5aR/L1.2细胞的迁移。
C.在受体占位率(receptor occupancy)的低水平下，人源化抗-C5aR 抗体高效阻断人中性粒细胞的体外迁移
上面显示人源化抗-C5aR抗体抑制了C5a诱导的表达人C5aR的细胞的迁移(化学趋化作用)。为了进一步表征这个抑制，按如下确定了抑制人中性粒细胞体外迁移所需的通过人源化抗-C5aR抗体的C5a受体占位率的水平。
方法
hAb-Q的FITC标记
异硫氰酸荧光素(FITC)共价结合到上。简言之，将～2.2mghAb-Q加入到“反应缓冲剂”(160mM Na2CO3、340mM NaHCO3，pH 9.5)中，并将回收的1.8mg添加到溶解在DMSO中的144μgFITC(分子探针，Cat.No.F1906)中。于室温下(～21℃)在黑暗中反应1小时。使用PD-10柱除去未结合的FITC，用“储存的缓冲剂”(10mM Tris，150mM NaCl，pH8.2)预平衡和洗脱未结合的FITC。使用微量离心浓缩器YM-30旋转过滤器(Amicon，Cat.No.4208)，浓缩结合的hAb-Q-FITC，从而达到5.7mg/ml的最终浓度，并于4℃下在黑暗中储存。
使hAb-Q结合到人中性粒细胞上的C5aR上
将按上述制备但无红血细胞裂解步骤的人中性粒细胞在1,200rpm下离心5分钟，并将其重悬在趋化缓冲剂(49％ RPMI1640，49％介质199，2％透析的FBS；Gibco)的2×107细胞/ml中。在趋化缓冲剂中将抗体hAb-Q稀释到2×所需的最终浓度。配制了0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6、20、60、200和600μg/ml的浓度。混合等体积的细胞(125μl)和抗体(125μl)并在37℃下孵育10分钟，从而允许hAb-Q结合到C5aR。
人中性粒细胞化学趋化试验
简言之，在孵育中性粒细胞和hAb-Q之后，将每个含有2×106细胞和0～100μg/ml hAb-Q的混合物的100μl等份置入(一式两份)24孔transwell板(6.5mm***物，3.0微米聚碳酸酯膜；CorningCostar，Cat.No.3415)中。将含有重组人C5a的趋化缓冲剂(总共600μl)(最终浓度为0、0.1、1、10或100nM)置入下室中。于37℃下在5％CO2中孵育板30分钟，从而允许细胞迁移。对照孔含有不带抗体的细胞或不带C5a的缓冲剂。孵育之后，通过在FACSCalibur(BD Biscience)上的流式细胞仪，给下室中的细胞计数。
结合hAb-Q的测量
人中性粒细胞上结合的hAb-Q的量在2个样品中进行计算：化学趋化作用之前的细胞和抗体的混合物样品(样品A)和来自化学趋化作用之后transwell板的下室中的细胞样品(样品BL)。这是为了确定迁移的细胞的受体占位率是否不同，或受体占位率在化学趋化作用开始和结束之间是否改变。通过孵育细胞和抗-hIgG-FITC，检测结合的hAb-Q。在一些试验中，结合抗体量在第三样品进行测量-来自化学趋化作用之后的transwell板上室的细胞和抗体的混合物样品(BU)。
将样品A(趋化之前的10μl细胞和抗体)添加到96孔U-圆底板的孔中(一式两份)，并于室温下在台式离心机(Beckmann CoulterAllegra X-15R)中在1,200rpm下离心2分钟。在将其重悬在50μl的抗-hIgG-FITC(1/300，在dPBS中稀释)中之前，用200μl PBS清洗细胞颗粒2次，并在室温下孵育30分钟。在2,000rpm下离心样品2分钟，除去上清液并将细胞颗粒重悬在150μl FACS缓冲剂(PBS，1％BCS)中，用以通过流式细胞仪(FACSCalibur，BDBiosciences)分析。
将样品BL(来自化学趋化作用之后的transwell板下室的200μl细胞)和BU(来自化学趋化作用之后的transwell板上室的50μl细胞+抗体混合物)置于96孔U-圆底板的孔中(一式两份)并按为样品A描述的方法处理。
‘游离的’C5a受体的测量
人中性粒细胞上的游离受体量在2个样品中进行计算：化学趋化作用之前的细胞和抗体的混合物样品(样品C)和来自化学趋化作用之后transwell板的下室中的细胞样品(样品D)。通过孵育细胞和FITC-标记的hAb-Q(hAb-Q-FITC)检测了游离受体。
将样品C(趋化之前的10μl细胞和抗体)添加到96孔U-圆底板的孔中(一式两份)，并于室温下在2,000rpm下离心2分钟。在将其重悬在50μl的hAb-Q-FITC(100μg/ml，在dPBS中稀释)中之前，用200μl PBS清洗细胞颗粒2次，并在室温下孵育30分钟。在2,000rpm下离心样品2分钟，除去上清液并将细胞颗粒重悬在FACS缓冲剂(PBS，1％BCS)中，用以通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences)分析。
将样品D(来自化学趋化作用之后的transwell板下室的200μl细胞)置于96孔U-圆底板的孔中(一式两份)并按为样品C描述的方法处理。
中性粒细胞C5a受体占位率的流式细胞分析
FACSCalibur流式细胞仪设有为通道FL-1确立的补偿参数。获得的样品要排除死细胞和碎片。基于FSC和SSC鉴定中性粒细胞。通过确定样品中中性粒细胞的FITC(FL-1)的平均荧光强度(MFI)，确定结合的hAb-Q(抗-hIgG-FITC)或游离C5aR(hAb-Q-FITC)的水平。
根据下面方程，通过确定每个样品A和B的MFI占与300μg/mlhAb-Q一起孵育的样品的MFI的百分比(在扣除非特异性背景(NSB)之后，非特异性背景(NSB)是无hAb-Q的样品的MFI)，量化结合的hAb-Q百分数：
％占位的受体＝[MFI(样品)-MFI(NSB)]/[最大MFI(300μg/ml hAb-Q样品)-MFI(NSB)]×100
根据下面方程，通过确定每个样品C和D的MFI占未与hAb-Q一起孵育的样品的最大MFI的百分比(扣除非特异性背景(NSB)之后，非特异性背景是与300μg/ml未标记的hAb-Q一起孵育的样品的MFI)，量化游离的C5a受体百分数：
％游离受体＝[MFI(样品)-MFI(NSB)]/[最大MFI(无未标记的hAb-Q样品)-MFI(NSB)]×100
结果
进行了4个实验。简言之，从健康志愿者的静脉血液中分离的纯化的中性粒细胞与浓度范围为0.001～100ug/ml的hAb-Q预孵育10分钟。选取小等份的这种混合物，从而确定结合受体的抗体量(％受体占位率)，并将剩余物置入transwell板的上室中。将C5a(10nM)置入下室中。孵育30分钟之后，使用FACS确定已迁移到下室中的细胞数目。使用FITC-标记的抗-hIgG和流式细胞仪，也确定了在迁移终点下室和上室中的中性粒细胞上结合的抗体量。通过在迁移之前和迁移之后将FITC-标记的hAb-Q和中性粒细胞一起孵育，在一个实验中确定游离受体(没有结合的抗体)的水平。
中性粒细胞的迁移被hAb-Q阻断
图19示出hAb-Q浓度与这四个实验的组合数据产生的迁移细胞总数目的图表。hAb-Q浓度与迁移之间存在剂量反应关系。浓度≥0.1μg/ml的hAb-Q彻底阻断10nM C5a诱导的人中性粒细胞的迁移。迁移细胞数目随着抗体浓度的减少而增大。这个结果与上面描述的相似(图17)。
受体占位率随着抗体浓度的增大而增大
组合这四个实验的受体占位率数据。在化学趋化作用前和化学趋化作用后的transwell下室样品中，在每个浓度的hAb-Q下，中性粒细胞上结合的抗体(占位的受体)平均量通过图表示出在图20中。来自transwell下室的化学趋化作用前样品和迁移后样品之间存在占位的受体的水平差异(EC50值分别为0.3和1.1μg/ml)。在任何给定浓度的hAb-Q，结合到化学趋化作用后的细胞比结合到化学趋化作用前的细胞的抗体少。这种差异可能是因为优选迁移的细胞比不迁移的细胞平均具有更少的阻断受体的hAb-Q。对于该差异，另一个解释可以是当置于下室中含有600μl缓冲剂的transwell板中时，预混合的细胞和抗体溶液(100μl)实质上被稀释～7倍。因为抗体可自由跨过transwell 3μm膜，被稀释，结合反应的平衡将会改变。
在未标记的hAb-Q结合之后，在一个实验中测量了游离受体量。这个数据也通过图表在图20中示出。观测到在化学趋化作用前和化学趋化作用后的样品中结合和游离受体之间存在反比关系。
受体占位率和化学趋化作用的抑制之间的关系
通过表达迁移细胞数目占迁移到不含抗体的样品中的10nMC5a的细胞的平均数目的百分比，转化图19中示出的中性粒细胞迁移数据。这个百分比然后扣除100％，从而获得迁移抑制的百分比。因而在无抗体样品中迁移细胞数目变成0％抑制，0迁移细胞变成100％抑制。然后使用GraphPad Prism，采用非线性回归(S形剂量反应(可变斜率)方程)分析这个数据。然后用图20的受体占位率数据对这个分析之后获得的曲线作图表，从而产生图21。
图21示出与中性粒细胞迁移抑制增加相关的增大的受体占位率。对于抑制迁移的EC50值是0.03μg/ml，而对于受体占位率，对于化学趋化作用前的样品，它是0.3μg/ml，而对于来自transwell下室的化学趋化作用后的样品，它是1.1μg/ml。该数据暗示非常低的受体占位率与迁移的显著抑制相关。在0.03μg/ml hAb-Q时，仅10％受体结合了抗体，但这个剂量导致迁移下降50％。当受体占位率为～15-45％时，在浓度为0.3μg/ml时彻底阻断迁移。总之，在低水平的受体占位率时，hAb-Q非常有效地阻断C5a介导的人中性粒细胞体外迁移。
实施例6-人源化抗体阻断C5a诱导的钙离子从人中性粒细胞释放
钙动员(calcium mobilization)是在C5a结合到它的受体之后发生的第一事件之一。C5a结合导致从内部储存释放的细胞浆游离Ca2+的立即增加(几秒内)，接着通过因细胞外介质流量造成的更持久的影响(过几分钟)。游离Ca2+的暂时增大，作为在C5a结合到C5aR之后在中性粒细胞中观测到的各种生物反应的第二信使。
为了确定人源化7F3抗体是否有效阻断C5a诱导的Ca2+释放，如下进行了“钙流量”试验。简言之，从健康对象分离的人中性粒细胞并按如上描述纯化。对于每个样品，需要1×106中性粒细胞。离心中性粒细胞并在PBS中清洗，然后将其重悬在细胞染料(完全MGB[5mM KCl，140mM NaCl，300μM MgSO4，1mM MgCl2，220μM K2HPO4，1.1mM NaHPO4，10mM HEPES，5.5mM葡萄糖])中的1×107细胞/ml中，该染料带有250μM磺吡酮(sulfinpyrazone)和1.7μM氟3-AM(Calbiochem，Cat.No.343242)或氟4-AM(Invitrogen)，并在室温下在黑暗中孵育40分钟。离心细胞并用完全MGB+250μM磺吡酮清洗，从而除去过多的染料，再次离心并将其再悬在带有完全MGB+250μM磺吡酮的2×106细胞/ml中。将细胞(0.5ml)等分放入到未经灭菌的玻璃FACS管中—用于此种样品的一个管子—并在1小时内使用。制备10×在不完全MGB中的最终浓度的各种试剂(C5a，离子霉素，抗体)。设立FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)，并使用x-轴正向散射，y-轴侧向散射设门(gating)。y-轴FL-1(FITC)通道用于检查中性粒细胞反应。连续测量样品荧光并在CellQuest文件中保持数据。各种对照测试在其他样品之前进行-未经处理的细胞用于确立基线荧光。向细胞(50μl的10nM重组人C5a(Sigma)中加入C5a：最终浓度为1nM)，从而测试反应。没有抗体预处理，如果有功能则该细胞立即对hC5a作出反应；如果没有获得反应，则细胞不合适。离子霉素(在管中最终浓度为0.1-1μg/ml)用于确定细胞是否装有染料。
为了确定人源化7F3抗体是否有效阻断C5a诱导的Ca2+释放，将载有染料的中性粒细胞与抗C5aR抗体(在管子中最终浓度0.1-50μg/ml)一起孵育，持续10-25分钟。然后细胞和抗体运行通过流式细胞仪，从而获得基线读数，接着加入1nM hC5a(最终浓度)。如果hC5a在荧光中没有产生峰值，则加入离子霉素(Sigma，0.1-1μg/ml最终浓度)，从而检查能够反应的细胞(可存活)。
研究了原始小鼠抗人hC5a mAb 7F3阻断C5a诱导的Ca2+释放的能力。浓度为10μg/ml 7F3彻底阻断C5a诱导的Ca2+流量，1μg/ml是部分有效的，而较低浓度(0.01和0.1μg/ml)没有阻断Ca2+释放。当加入C5a之后～30秒加入1μg/ml离子霉素时(数据未显示)中位荧光强度(MFI)的增大，表明与10μg/ml 7F3一起孵育的细胞液能释放Ca2+。
测试了当在加入1nM C5a之前与中性粒细胞一起孵育约10分钟时，人源化7F3抗体(F、G、J、M、N和O)中和浓度为10μg/ml的人中性粒细胞中C5a诱导的钙释放的能力。与没有与抗体预孵育的对照细胞比较，如观测的较低的平均荧光值所暗示的抗体N和O彻底阻断Ca2+流量，而抗体F、G、J和M部分阻断了Ca2+释放。当离子霉素加入到与抗体N或O一起预孵育的细胞中时，MFI立即增大表明中性粒细胞仍然可以在阻断抗体的情况下释放Ca2+(数据未显示)。
通过在加入C5a和测量Ca2+释放之前，将人中性粒细胞与各种浓度的抗体一起预孵育，检验抗体G、J、M、N和Q的剂量-反应关系。浓度为30μg/ml的抗体G彻底阻断C5a诱导的Ca2+释放，而低浓度(0.1、1、10μg/ml)是无效的。对于抗体M，结果是相同的。在两种情况下，当在C5a之后90秒加入约1μg/ml的离子霉素时，用30μg/ml的抗体处理的细胞仍可以释放Ca2+，如同所示的。示出的抗体J在浓度为30μg/ml和10μg/ml时彻底阻断Ca2+流量，尽管在之前的实验中，10μg/ml的抗体J仅部分有效地阻断Ca2+流量。抗体N是最有效的抗体，在10μg/ml和1μg/ml时在2个单独的实验中彻底阻断C5a诱导的Ca2+流量。在所有情况下，当C5a未能引起Ca2+流量时，加入1μg/ml的离子霉素，产生MFI大幅增加，表示该细胞仍可以作出反应。对于抗体Q，当该细胞与5或50μg/ml的抗体Q一起预孵育时，C5a诱导的人中性粒细胞的Ca2+释放被阻止，如加入1nM C5a之后荧光中缺少峰值所表明的。向这些样品中加入离子霉素的短时间之后，荧光中产生常见的增大，表示该中性粒细胞仍可以作出反应。与0.5μg/ml的抗体Q一起预孵育是无效的，且在将1nM C5a添加到样品中之后观测到荧光的大幅增大，类似于当仅用1nM C5a(未添加抗体)处理细胞时观察到的效果一样。这些结果概括在表7中。
表7：钙流量试验结果，该结果示出有效阻断C5a诱导的Ca2+释放的每个抗体浓度
#这个浓度在一个实验中是部分中和的，但在另一个实验中是彻底中和的。
^表示仅测试了单一的Ab浓度。
图7示出对抑制人源化7F3抗体最有效的是抗体N和Q。感兴趣地是，抗体N是同种型IgG1，且由于结合到中性粒细胞上的Fcγ受体(FcγR)，比带有同种型IgG4的抗体更有效。人IgG1对FcγR的亲和力比hIgG4高。为了确定通过抗体N或O结合的FcγR是否有助于C5a介导的Ca2+释放，将预载有氟3-AM的人中性粒细胞与单独的抗体O或抗体N，或抗体N加50μl Fc阻断[从与分离中性粒细胞相同的血液样品制备人血清]，或抗体O加Fc阻断，或单独的Fc阻断一起预孵育10分钟。在流式细胞仪上测量应答C5a(必要时和离子霉素)的细胞内Ca2+水平的改变。抗体N或O中和C5a诱导的Ca2+释放的能力在存在或不存在Fc阻断的情况下没有差异。这些细胞仍能够释放Ca2+，如同通过添加离子霉素所示出的。将中性粒细胞与单独的Fc阻断一起预孵育没有阻止C5a诱导的Ca2+释放。这些数据暗示抗体N和O通过结合到C5aR和阻断C5a信号发挥它们的保护效果，没有通过与FcγR相互作用。
实施例7—人源化抗-C5aR抗体对中性粒细胞活化的影响
A.人源化抗-C5aR抗体阻止C5a诱导的人中性粒细胞的体外活化
C5a是人中性粒细胞的潜在活化剂，诱导表面抗原CD11b(MAC-1整联蛋白的α链，介导化学趋化作用和与内皮的相互作用)的上调，和粘附分子CD62L(L-选择蛋白)的衰减。在全血活化试验中研究了人源化抗-C5aR抗体阻止C5a介导的中性粒细胞活化的能力。
方法
将健康的人志愿者(2个供体)的血液采集到含有抗凝结剂酸式柠檬酸盐葡聚糖(ACD)的管子中，并在室温下(23℃)，用10分钟将其添加到含有H2DCFDA(最终50μM)的孔中，接着添加0.3-300μg/ml hAb-Q、0.3-300μg/ml IgG4同种型对照组，或单独的dPBS。将样品在室温(23℃)下孵育20分钟。将C5a(最终为100nM)、PMA(0.2-400ng/ml)或dPBS添加到每个样品中并在室温(23℃)下再孵育20分钟。用15分钟将抗-CD11b和抗-CD62L抗体(最终为1/400)添加到所有样品中。使用RBC裂解缓冲剂除去红细胞，并将白细胞重悬在dPBS+1％FCS中。
CD11b和CD62L在中性粒细胞上的表达水平的测量如下。FACSCalibur流式细胞仪(BD Bioscience)设有为通道FL-2和FL-4确立的补偿参数。获得的样品要排除死细胞和碎片。中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC，并测量了这些细胞的PE(FL-2)和APC(FL-4)的中位荧光强度(median fluorescence intensity)(MFI)。
使用下式，将CD11b和CD62L表达水平(MFI)表示为最大表达的百分比：
％最大表达＝[(样品-最小表达)/(最大表达-最小表达)]×100
注意.最大表达是无抗体(单独的dPBS)+CD11b的100nM C5a样品，和无抗体(dPBS)+CD62L的0nM C5a(dPBS)样品(CD62L在活化的中性粒细胞上减少)。
使用GraphPad Prism(v4.0)软件，计算C5a介导的CD11b和CD62L表达的变化的hAb-Q中和的IC50值。为每个实验和该两个实验的平均值，使用非线性回归，以数据拟合S形剂量反应(可变斜率)方程。
结果
利用2个供体，在全血试验中评估了hAb-Q对C5a诱导的中性粒细胞活化的阻断效果。在用C5a活化的样品中，在不存在hAb-Q时CD11b表达水平增大。但如果存在hAb-Q，则CD11b表达水平的这种增大将以剂量反应方式被阻止，其中IC50值为～10.7μg/ml(图22)。同种型对照抗体，甚至在＞100μg/ml(数据未示出)时都没有阻止C5a诱导的CD11b表达的上调。
人源化抗-C5aR抗体hAb-Q以剂量依赖方式也阻止了C5a诱导的CD62L的衰减，其中IC50值为～5.4μg/ml(图23)。同种型对照抗体，甚至在＞100μg/ml时都没有阻止C5a诱导的CD62L的衰减(数据未示出)。
B.人源化抗-C5aR抗体在溶液中体外不活化人中性粒细胞
上面描述了人源化抗-C5aR抗体中和C5a诱导的中性粒细胞的活化能力。在下面的实验中，在不存在C5a时将人源化抗-C5aR抗体与纯化的人中性粒细胞一起孵育，该C5a没有改变细胞表面标记物，CD11b和CD62L的表达。这些实验表明抗-C5aR抗体本质上没有在溶液中活化细胞。
方法
人中性粒细胞活化试验和CD11b和CD62L表达的测量
在系列实验中，将人外周静脉全血和人源化抗-hC5aR抗体hAb-Q、hAb-J或bAb-G在回体法中孵育。通过如下面所述的确定CD11b和CD62L表达水平，测量中性粒细胞活化。CD62L水平的降低或CD11b水平的增大是中性粒细胞活化的标记物。
实验1
简言之，将健康供体的肝素化(heparinised)全血添加到1、10或100μg/ml hAb-J或hAb-Q、10μM fMLP(甲酰Met-Leu-Phe肽)，或单独的dPBS中。在最终1/100稀释中添加抗-CD 11b-PE和抗-CD62L-APC抗体之前，于37℃下在5％CO2中孵育样品1小时。使用RBC裂解缓冲剂除去红细胞，并将白细胞重悬在dPBS+1％FCS中。
FACSCalibur(BD)流式细胞仪设有为通道FL-2和FL-4确立的补偿参数。获得的样品要排除死细胞和碎片。中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC。计算了这些细胞在FL-2(CD11b-PE)和FL-4(CD62L-APC)通道中的中位荧光强度(MFI)。每个样品的CD11b(PE)和CD62L(APC)被确定并表示为相对于dPBS对照的表达倍数。
实验2
将4个健康供体的肝素化血液添加到含有0.1、1、10或100μg/ml的hAb-G、hAb-J、10nM或100nM人C5a或单独的dPBS的管子中。于37℃下将6％葡聚糖(最终conc.1％)添加到每个管子中并允许放置30分钟，从而沉积红细胞。将上面富含白细胞的血浆层转移到96孔板中，在冷的dPBS中清洗细胞。离心之后，除去上清液并将细胞重悬在含有抗-CD11b-PE(1/50)和抗-CD62L-APC(1/50)的dPBS中，然后在冰上孵育30分钟。再次清洗细胞并将其重悬在dPBS+1％FCS中。CD11b和CD62L在中性粒细胞上的表达水平按如下描述的测量。
实验3
将健康人志愿者(2个供体)的血液采集到含有抗-凝结剂酸式柠檬酸盐葡聚糖(ACD)的管子中，并按实施例7A中描述的处理，除了没有向样品中添加C5a。CD11b和CD62L在中性粒细胞上的水平通过FACS按实施例7A中描述的测量。
结果
在用人源化抗-C5aR抗体的全血试验中，CD11b和CD62L在人中性在细胞上的表达没有被改变。
在第一个实验中，于37℃下将人全血与1、10或100μg/mlhAb-Q或hAb-J、10μM fMLP或dPBS一起孵育1小时，并通过流式细胞仪测量CD11b和CD62L的表达。在含有1-100μg/ml的任何浓度的hAb-Q或hAb-J的样品中，CD11b表达没有增大或CD62L表达没有减小(图24A和24B)。相比，已知可活化粒细胞的肽fMLP，使CD11b表达的大幅增大，CD62L的减少。
在第二个实验中，于37℃下将4个供体的人全血与0.1-100μg/ml人源化抗-C5aR抗体hAb-G或hAb-J，10-100nM人C5a，或dPBS孵育20分钟。处理之后，CD11b和CD62L在中性粒细胞上的表达相对dPBS对照组上的表达分别在图25A和25B中示出。在测试的样品中的任何一个中，hAb-G或hAb-J都没有诱导中性粒细胞CD11b的上调或CD62L表达的减少。相比之下，10nM和100nM C5a分别致使CD11b表达相对dPBS增大2.5和3.0倍，而在dPBS对照组中CD62L表达分别降到0.33和0.14的水平。如同fMLP，已知C5a可活化粒细胞。
在第三个实验中，将2个供体的人全血添加到0.3-300μg/mlhAb-Q或同种型对照抗体中，然后将100nM C5a或dPBS添加到每个样品中。中性粒细胞CD11b和CD62L表达通过流式细胞仪测量，且结果示出在图26a和26b中。在含有hAb-Q或PBS的同种型对照抗体的样品中，CD11b表达水平没有改变(增大)，表示在任何抗体浓度高达300μg/ml时没有活化(图26)。然而，当将100nM C5a添加到含有同种型对照抗体的样品中时，CD11b表达增大到最大水平，如在含有100nM C5a和无抗体的样品中测得的。在没有C5a的样品中CD62L表达最多(没有活化)。HAb-Q的添加或同种型对照抗体在浓度高达300μg/ml时没有降低CD62L表达水平，即没有活化中性粒细胞(图26b)。相比之下，含有同种型对照抗体和100nMC5a的样品失去了CD62L表达并被最大活化。
总之，该结果表示人源化抗-C5aR抗体没有活化人中性粒细胞，如在回体法中用人全血孵育之后，CD62L和CD11b表达水平所表示的。
C.当结合到固体载体上时hAb-Q没有在体外活化人中性粒细胞
超氧化物是其中一种反应性氧种类，它活化中性粒细胞生产从而与病原体作斗争。然而，超氧化物也可以对正常组织具有不利影响。抗-C5aR抗体本身可以通过中性粒细胞刺激超氧化物生产的可能性已研究。下述实验示出人源化抗-C5aR抗体hAb-Q没有刺激人中性粒细胞去产生超氧化物，但是当人中性粒细胞被C5a刺激时可以阻碍它的的产生。
方法
测量通过分离的人中性粒细胞在体外产生的超氧化物
超氧化物(O2 -)是当中性粒细胞被炎性中介，例如C5a活化时NADPH氧化酶产生的第一种含氧的物质。有些“O2 -”被细胞外分泌。不可渗透膜的细胞色素C(Fe3+)被超氧化物还原成细胞色素C(Fe2+)，细胞色素C(Fe2+)可通过分光光度法在550nm处检出。在本研究中，利用Wallac Victor2(Mayo and Curnutte，1990)，使用96孔板分光光度法测定细胞色素C的还原。
人中性粒细胞的制备
人中性粒细胞按上面实施例5B描述的纯化。用人血纤蛋白原(1mg/ml)包被96孔微量滴定板过夜。向每孔中添加100μl细胞色素C(150μM)和在50μl RM(含有HBSS的反应混合物(Cat#14175 Gibco))及0.4mM MgSO4、0.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2和20mM HEPES中的200,000中性粒细胞，pH设定在7.4。于37℃将该板***在Wallac Victor2(Perkin-Elmer)中，并在4分钟期间每分钟测量未被刺激的O2 -。接下来将抗体添加到15μl RM中，并每2分钟测量孔，持续10分钟。最后添加C5a并每2分钟测量该板，持续30分钟，接着每10分钟测量一次，持续60分钟。1.5小时之后测得的值用作结果。每组使用四孔。
结果
这个研究中使用了2-6个健康供体的中性粒细胞。图27示出在37℃下孵育1.5小时之后超氧化物的生产。反应混合物(RM)用作对照(6个供体)。炎性中介C5a诱导加强的O2 -生产(6个供体)，该生产被抗-C5aR抗体hAb-Q抑制(5个供体)。在这个研究中，高浓度的抗体用于确保任何刺激效应不被忽视。明显地，hAb-Q在1000μg/ml(4个供体)、250μg/ml(3个供体)和100μg/ml(2个供体)时，及对照的不相关的IgG4抗体HzATNP(2个供体)没有刺激效应，其中该IgG4抗体HzATNP是鼠科动物抗体A-TNP的人源化形式。
总之，上述结果表明人源化抗-C5aR抗体hAb-Q没有刺激人中性粒细胞从而生产自由基O2 -。相反，它可以阻碍C5a引发的生产。
实施例8—在回体法中人全血试验中人源化抗-C5aR抗体没有消耗 血液白细胞
为了确定hAb-Q是否可以杀伤或消耗表达C5aR的其他人细胞，特别是血液中的中性粒细胞和单核细胞，进行了数个回体法中全血消耗试验。全血消耗研究使用了抗-凝结剂，来匹卢定(lepirudin)(Refludan)，来匹卢定没有灭活补体或抗体介导的杀伤机制(CDC、ADCC)。来匹卢定是高特异性的直接凝血酶抑制剂。它是从水蛭提取的抗凝结剂水蛭素的重组类似物。
方法
血液采集
将健康志愿者的外周静脉血液采集到无菌的15ml聚丙烯管子中，该管子中含有最终浓度为50或500μg/ml的来匹卢定(Refludan，Pharmion有限公司，墨尔本，澳大利亚)。
与抗体一起孵育
将等份(50μl)的抗凝结血液分配到96孔板中，并一式两份与在dPBS中稀释的最终浓度为100μg/ml的25μl抗体一起在37℃下在5％CO2中孵育3.5小时。对照样品包含50μl血液及25μl dPBS。将包含抗-hCD66b-FITC(最终为1/100)、抗-hCD19-APC(最终为1/300)和抗-hCD14-PE(最终为1/300)的染色混合液(25μl)添加到每个样品中，并于37℃下在5％CO2中继续孵育30分钟。然后将校准珠(calibration bead)(50ul，980珠/μl；Flow-CountFluorosphere；Beckman Coulter，USA；Cat.No.7547053)添加到每个样品中。通过添加100μl 1×FACS裂解溶液(10xFACS裂解溶液；BD Bioscience；Cat.No.349202)裂解红细胞。将整个样品转移到1.5ml管子中，并再添加500μl 1×FACS裂解溶液。在4,000rpm下离心管子3分钟并除去上清液。将细胞和珠重悬在150μl FACS缓冲剂(dPBS+1％ BCS)中。
FACS分析
在FACSalibur(Becton Dickinson)流式细胞仪上分析细胞。使用正向和侧向散射，从而包括所有细胞，但排除碎片。设门控以计数CD66b-FITC(FL-1)阳性细胞(中性粒细胞)、CD19-APC(FL-4)阳性细胞(B淋巴细胞)或CD14-PE(FL-2)阳性细胞(单核细胞)。测定了每5000珠的细胞数目。
每毫升血液中每种细胞类型的总数目计算如下：
#细胞数/ml＝#5000珠中的细胞数x(50x 980)/5000x 1000/50
消耗百分数计算如下：
％消耗＝100x(1-(#细胞数/ml Ab处理的样品/#细胞数/mlPBS处理的样品))
结果
使用采集到含有来匹卢定的无菌管子中的3个不同健康志愿者的全外周静脉血进行三个单独的实验。该血液与人源化抗-C5aR抗体hAb-Q、利妥昔(rituximab)(阳性对照抗-CD20抗体)、hIgG4(阴性同种型对照抗体)或PBS(缓冲对照、基线从而测量细胞消耗程度)一起孵育。在孵育的终点，使用标记了针对CD66b、CD14和CD19的抗体的混合液将细胞染色，从而鉴定粒细胞(中性粒细胞：CD66b+ve)、单核细胞(CD66b-ve、CD14+ve)和B细胞(CD19+ve)。为了测定每种细胞类型的绝对数目，将已知浓度的固体体积的校准珠添加到每个样品中。因此，可以测定每个样品(如细胞/ml)中的中性粒细胞(粒细胞)、单核细胞和B细胞的绝对数目，以及用抗体处理之后每种细胞类型的相对消耗，该相对消耗表示为与PBS一起孵育的样品中细胞总数目的百分比。
3个实验数据进行平均，结果示出在图28和29中。图28示出从3组数据计算的平均细胞数目(±标准偏差)。图29示出相对于PBS处理的样品中细胞数目，每种细胞类型消耗的平均百分比(±sd)。该数据示出在与hAb-Q一起孵育4小时之后中性粒细胞或单核细胞没有被消耗。相比之下，利妥昔导致B细胞(表达CD20，利妥昔的靶)的～70％消耗，但是没有降低不表达CD20的细胞类型，单核细胞或中性粒细胞的数目。
实施例9—人源化抗-C5aR抗体hAb-Q没有经过补体介导的裂解杀 伤C5aR-表达细胞
开发不杀伤C5aR-表达细胞(中性粒细胞、单核细胞等)的人源化抗-C5aR抗体是理想的。抗体可以通过一些机制启动对表达靶抗原的细胞的杀伤。hAb-Q作为IgG4同种型被生产，从而避免/降低补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。当抗原-抗体复合物通过抗体的Fc结构域结合补体蛋白Clq，从而启动蛋白水解事件(proteolytic event)的级联活化时，补体介导的杀伤被诱导，其中该蛋白水解导致C5a的释放和裂解靶向细胞的膜攻击复合物(membrane attack complex)的形成。
为了证明hAb-Q没有诱导CDC活性，进行了下面实验。
方法
表达高水平C5aR的Ramos E2克隆的产生
根据制造商的方案，利用脂质体TM LEX试剂(Invitrogen)，用人C5aR表达质粒(pcDNA3.1-C5aR；4μg DNA/3x106细胞)稳定转染表达CD20的人B淋巴细胞细胞系(伯基特氏肿瘤源(Burkitt′slymphoma-derived))，Ramos。转染40小时后，将2mg/ml遗传霉素(G418硫酸盐，Gibco)添加到生长培养基中。细胞(非克隆系)在选择性培养基中生长近3周，此段时间中，使用抗-C5aR抗体通过流式细胞仪证实了C5aR表达和转染的百分数。将细胞以生产～30-40阳性克隆/板的密度转移到384孔板中。挑选单个克隆系集落并将其转移到96孔板中用于扩增。充分生长之后，每个克隆中C5aR的表达可使用抗-C5aR抗体通过流式细胞仪测定。挑选并扩增表达最高的克隆，E2。将Ramos E2细胞维持在RPMI，10％FCS，2mg/mlG418中。
用兔补体进行的CDC试验
将靶细胞(Ramos E2细胞)与抗体或单独的介质(RPMI+10％热灭活的BCS)在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。孵育之后，将稀释在RPMI中的兔补体(Cedarlane)添加到样品中，使其最终浓度为1％v/v。在37℃下在5％CO2中进一步孵育样品2小时。
向每个样品中添加荧光活性染料(fluorescent viability dye)，To-Pro-3(分子探针)，之后通过流式细胞仪测量定义为To-Pro-3阳性的不可存活的(non-viable)靶细胞，并以全体靶细胞的百分比表示。
通过从相应‘靶和补体’(B)样品中减去不可存活的‘仅有靶’(A)的平均％，计算每个样品的特异性CDC。然后从每个样品中减去‘靶和补体’(C)‘仅有介质’的样品的，从而得出特异性CDC的最终值：
特异性CDC(％裂解)＝(B-A)-C
上面公式也可表示如下：
特异性CDC(％裂解)＝(T+CS-T+CMO)-(TOS-TOMO)。
其中：T+CS是靶+带有抗体的补体样品中不可存活的细胞的平均％
T+CMO是靶+仅有补体介质(无Ab)中不可存活的细胞的平均％
TOS是带有抗体的仅有靶的样品中不可存活的细胞的平均％
TOMO是仅有靶仅有介质(无Ab)中不可存活的细胞的平均％
用人血清进行的CDC试验
按下面实施例10中描述的，使用人血清进行ADCC试验。通过从含有人血清的‘仅有靶+抗体’的样品(B)中减去‘仅有靶/仅有介质’的样品(A)的不可存活细胞的平均％，确定抗体的CDC活性。然后减去‘仅有靶+抗体’样品(C)与热灭活的牛血清反应中的‘仅有靶/仅有介质’的样品(D)的不可存活的％之差，从而得出特异性CDC的最终值：
特异性CDC(％裂解)＝(B-A)-(C-D)
结果
使用Ramos E2靶细胞进行CDC试验
通过在兔补体存在时将人中性粒细胞与抗体一起孵育，初步研究了hAb-Q诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)的可能性。在这个试验(数据未示出)中，本质上没有中性粒细胞的特异性杀伤(＜0.5％细胞死亡)。
开发了表达高水平的人C5aR及CD20的Ramos E2细胞系之后，再次面临hAb-Q是否可以诱导CDC的问题。使用Ramos E2细胞系作为靶，进行了两个系列的实验。第一系列使用1％兔补体，其中利妥昔用作阳性对照。第二系列比较了与10％人血清一起孵育的样品中的细胞死亡和与热灭活的牛血清一起孵育的样品中的细胞死亡。
在存在1％兔血清时抗体hAb-Q没有诱导Ramos E2细胞的CDC。
进行了三个试验。第一个涉及将最终浓度为10μg/ml的抗体hAb-Q、利妥昔(Roche)和hIgG4同种型对照(Sigma)与Ramo E2细胞和1％兔补体一起孵育。第二个和第三个试验使用浓度为100μg/ml的抗体进行的并包括另外的阳性对照-兔多克隆的抗-C5aR(US Biological)。
在第一个实验中，与10μg/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4一起孵育的样品中特异性CDC的水平分别为0％、96％和0％。在第二个和第三个实验中，与100μg/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4一起孵育之后平均特异性CDC分别为1.5％、98％和1％。将Ramo E2与20μg/ml多克隆和1％兔补体一起孵育产生了82％特异性CDC(图30)。据报道，利妥昔可通过CDC杀伤表达CD20的细胞。多克隆抗体也是补体活化和CDC的有效诱导物。这些阳性对照示出CDC试验是可行的并表明人源化抗-C5aR抗体hAb-Q没有通过CDC杀伤细胞。
在存在10％人血清时抗体hAb-Q没有诱导Ramos E2细胞的CDC
使用从人血液中分离的效应细胞(PBMC)，靶向与人源化抗-C5aR或对照抗体一起孵育的Ramos E2细胞，进行一系列ADCC试验(见下面的实施例10)。以平行方式进行了一组对照反应，该反应涉及在存在热灭活的牛血清或10％人血清的情况下孵育RamosE2细胞(‘仅有靶’)及抗体，该10％人血清与提供的PBMC来自相同的供体。
含有人血清的对照反应被认为代表CDC试验，因为它们模拟了上述CDC试验，除了是人血清，而不是兔血清之外。然而，一个差异是没有靶+未与人血清一起孵育的抗体样品。因此，在使用人血清的试验中，通过从靶+与人血清一起孵育的抗体样品中“靶细胞不可存活％”减去靶+与热灭活的牛血清一起孵育的抗体中“靶细胞的不可存活％”，计算特异性CDC。
使用人血清进行了七个试验。在存在10％热灭活的牛血清或10％人血清时，1、10或100μg/ml的Ramos E2细胞与hAb-Q、利妥昔或hIgG4同种型对照抗体一起孵育。Ramos E2细胞在孵育之前载有染料PKH-26，并在孵育之后载有活性染料ToPrO3，从而使得不可存活和可存活细胞得以区分。按如上描述的，用从试验中每个样品减去背景的仅有介质计算特异性CDC。对于用在热灭活的牛血清样品中观测到较少的非特异性死亡的人血清的每个处理，不可存活的靶(Ramos E2)细胞的平均％与特异性CDC相等，结果示出在图31中。
图31表明在含有hAb-Q的样品中，多种剂量之间无差异的特异性CDC的水平非常低(～1-2％)。Ramos E2裂解水平对于热灭活的牛血清和含有hAb-Q的人血清样品是相似的。在与同种型对照抗体一起孵育的样品中观测到相似水平的特异性CDC(～0-4％)。重要地，与hAb-Q一起孵育和与hIgG4同种型抗体一起孵育的样品中观测到的裂解平均量在统计学上没有显著差异(p＞0.05)。这个数据暗示hAb-Q没有特异性介导CDC。相比之下，特异性CDC，在含有利妥昔的样品中，特异性CDC是剂量依赖性的，且其范围为带有1μg/ml利妥昔的72％到带有100μg/ml利妥昔的91％。在存在人血清的情况下，对利妥昔观测到的高水平杀伤表明该试验是可行的，并因此推论出hAb-Q没有特异性介导CDC。若hAb-Q特异性介导CDC，考虑与Ramos E2克隆表达相似的高水平的CD20和hC5aR，可以预期利妥昔相似水平的杀伤。
实施例10—人源化抗-C5aR抗体诱导的抗体依赖的细胞毒性依赖 于重链同种型
开发不杀伤表达C5aR的细胞(中性粒细胞、单核细胞等)的人源化抗-C5aR抗体是理想的。抗体可以通过一些机制启动表达靶抗原的细胞的杀伤。用IgG4同种型生产了一些人源化抗-C5aR抗体(例如，hAb-Q、hAb-J、hAb-G)，从而避免/降低补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。用IgG1同种型生产了其他人源化抗-C5aR抗体(例如，hAb-N、hAb-O)，已知IgG1同种型可以结合C1q和FcγR并因而更可能诱导CDC和ADCC。当结合到抗原的抗体的Fc结构域-例如“靶细胞上的受体”-与带有细胞毒可能性的细胞(“效应细胞”)上Fc受体交联时，ADCC被介导，带有细胞毒可能性的细胞包括自然杀伤(BK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
为了测定人源化抗-C5aR抗体体外诱导的ADCC活性水平，进行了下面实验。
方法
ADCC试验方案
简言之，通过使用聚蔗糖或Percoll(Healthcare)密度梯度分离，从健康供体分离的外周血单核细胞(PBMC)制备效应细胞组分。然后通过附着于烧瓶(1hr，37℃，5％ CO2)耗竭了PBMC群体的单核细胞，剩余的非粘附性细胞(含有NK细胞)在含有100ng/ml重组人IL-2(Peprotech)的介质中在37℃下在5％ CO2中孵育过夜。第二天，用荧光细胞膜染料，PKH26(Sigma)给靶细胞(表达hC5aR的Ramos E2细胞—见上面)染色，并将5×104细胞/样品与抗体或单独的介质一起在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。孵育之后，将效应细胞按50∶1的比例，或仅有介质添加到靶细胞中并在37℃在5％ CO2中进一步孵育3小时。将荧光活性染料，To-Pro-3(分子探针)添加到每个样品中，之后通过流式细胞仪测量定义为To-Pro-3阳性的不可存活的靶细胞，并表示为全体靶细胞(PHK-26阳性细胞)的百分比。该介质含有10％人血清，或10％热灭活的牛血清，其中该10％人血清与分离出的PDMC“效应”细胞来自相同的供体。
通过从相应样品的‘靶和效应子’(B)中减去平均％不可存活的‘仅有靶’(A)，计算每个样品的特异性ADCC。然后从每个样品中减去‘靶和效应子’(C)的‘仅有介质’的样品，从而得出特异性ADCC的最终值：
特异性ADCC(％裂解)＝(B-A)-C
上面公式也可表示如下：
特异性ADCC(％裂解)＝(T+CS-T+EMO)-(TOS-TOMO)。
其中：T+ES是靶+带有抗体的效应子样品中不可存活的细胞的平均％
T+EMO是靶+仅有效应子介质(无Ab)中不可存活的细胞的平均％
TOS是带有抗体的仅有靶的样品中不可存活的细胞的平均％
TOMO是仅有靶仅有介质(无Ab)中不可存活的细胞的平均％
结果
在系列试验中使用Ramos E2细胞作为靶，检查了人源化抗-C5aR抗体hAb-Q通过ADCC机制诱导细胞杀伤的可能性。RamosE2可表达CD20和C5aR，允许靶向CD20和被ADCC杀伤的利妥昔用作阳性对照。C5aR在Ramos E2上的表达比在人中性粒细胞上的表达高～7倍。已报道在细胞表面上被表达的靶受体水平可影响抗体诱导的ADCC和CDC的程度(Preithener等人，2006；van Meerten等人，2006；Lowenstein等人，2006)。
效应细胞是从健康志愿者的静脉血中纯化出的人PBMC，然后耗竭单核细胞，并与IL-2孵育过夜，从而刺激(“激活(prime)”)NK细胞。发现这个步骤是最大化效应子细胞毒性所必需的。
用染料PKH-26标记靶细胞，因此在流式细胞术期间它们可以不同于效应细胞。对于每个靶+抗体样品，设立2个管子(每个一式两份)。一个含有靶细胞和介质，另一个含有比例为50∶1的效应子和靶。在试验开展期间，已显示效应子∶靶的最佳比例为50∶1可产生最大杀伤。在所有孵育步骤之后通过向样品中添加染料To-Pro-3(TP3)测量活力(viability)，并通过流式细胞仪分析。靶细胞消耗是在扣除背景之后(无抗体样品)，不可存活的靶细胞数目(TP3+ve/PKH+ve)占全体靶细胞(PKH+ve)百分比。
使用Ramos E2作为靶细胞，比较hAb-Q和hAb-N诱导的ADCC活性
在第一系列的实验中，比较了人源化抗-C5aR抗体hAb-Q(重链同种型hIgG4)和hAb-N(hIgG1)诱导Ramos E2细胞ADCC的可能性与利妥昔(hIgG1)和同种型对照抗体(hIgG4)诱导的ADCC。人IgG1比hIgG4对FcγR的亲和力高，并预期可更高效地诱导ADCC。
在存在10％热灭活的胎牛血清(FCS)的情况下，将靶细胞与100μg/ml的hAb-Q、hAb-N、利妥昔(Roche)、hIgG4抗体(Sigma)或单独介质(RPMI)一起孵育。30分钟之后，IL-2刺激PBMC(比例为50∶1(E∶T))，或者将单独介质添加到靶细胞中并继续孵育3小时。通过流失细胞仪测得的不可存活的细胞数目表示ADCC活性。从每个样品中扣除仅有介质的背景和仅有靶的背景，从而测定特异性ADCC活性。进行了3个完全相同的实验。结果(三个实验的组合数据±sd)示出在图32中。
IgG1抗体、利妥昔和抗-C5aR hAb-N有效介导Ramos E2细胞的高水平杀伤(＞65％)。相比之下，hAb-Q(IgG4)和同种型对照hIgG4介导的特异性ADCC的水平明显降低，在与PBMC和hAb-Q一起孵育之后，仅23％的Ramos E2细胞不可存活。与同种型对照抗体一起孵育的Ramos E2细胞没有死亡。这些结果暗示抗体同种型是ADCC活性的重要决定因素，并暗示如果不需要抗体依赖的细胞杀伤，则hIgG4同种型的人源化抗-C5aR抗体优选用于体内处理。
用Ramos E2细胞作为靶，比较血清对hAb-Q介导的ADCC活性的影响
其它系列的ADCC试验按如上进行，其中一组在介质中孵育的样品含有从PBMC效应细胞的供体中分离的10％人血清，备份组样品中含有10％热灭活的牛血清。血清的热灭活被认为破坏补体活性。因此预期CDC活性可在与人血清一起孵育的样品中观测到。从‘仅有靶’的样品中测定CDC水平。确实，在含有利妥昔的‘仅有靶’的样品中，不可存活的(TP3+ve)细胞的数目通常＞90％。因此，不能在含有人血清的样品中检测利妥昔诱导的特异性ADCC活性。然而，在含有10％热灭活的牛血清和100μg/ml利妥昔的平行样品中，平均60％的靶(Ramos E2)细胞被效应细胞特异性杀伤。这与图32中示出的结果相似，并表示效应细胞和ADCC试验是可行的。
而且，如上面图31中所示，人源化抗-C5aR(hAb-Q)和hIgG4同种型对照抗体在本实验中没有诱导CDC活性。因此对于含有人血清的样品，因hAb-Q和同种型对照抗体引起的特异性ADCC可按如上所述计算。该结果示出在图33中。hAb-Q和同种型对照在浓度为1-100μg/ml时都没有通过ADCC显著地引起细胞死亡。对于hAb-Q，这个结果与在含有热灭活牛血清的样品中观测到的ADCC活性形成对比(图32)。
实施例11—小鼠研究
KRN转基因小鼠系含有T细胞受体，该细胞受体可识别C57BL/6背景上的自身抗原6-磷酸葡萄糖异构酶(GPI)。当这些小鼠与NOD小鼠交配(cross)时，转基因阳性F1子代(K/BxN)自发患上对抗GPI的循环抗体介导的自身免疫样(autoimmune-like)疾病(Kouskoff等人，1996)。可将关节炎K/BxN小鼠的血清转移到其中自身抗原免疫复合物可活化可替换的补体途径的其他品系(strain)中，接着活化C5aR和FcγRIII介导的细胞和生产炎性细胞因子(Ji等人，2002)。中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞在这种模型病症的形成中发挥着重要作用(Wipke和Allen，2001；Lee等人，2002；Solomon等人，2005)。观测到的炎性表型以包括关节破裂的慢性进行性疾病在内的人风湿性关节炎的许多标志为特征(Kyburz和Corr，2003)。
A.在炎性关节炎的小鼠模型中，C5aR逆转炎症的人源化抗体
方法
动物
在C57BL/6背景上(Lee等人，2006)～6-12周龄的敲入人C5aR的转基因小鼠，来源于悉尼的Garvan Institute的繁殖种群。实验中优选雄性小鼠，但也可使用雌性小鼠。
制备K/BxN血清
为了生产用于实验的血清，让KRN雄性与NOD雌***配。处死携带发展成发炎关节的KRN转基因的F1子代，并通过心脏穿刺采集血液。在37℃下孵育2小时之后分离血清，并在4000rpm下离心10分钟。对多个小鼠的血清进行集合、再等分并储存在80℃。
实验关节炎的诱导和测量
通过在腹腔给药第0天和2天注射100-150μl血清，在受者小鼠中诱导实验关节炎。通过使用卡尺测量踝最小厚度的变化和临床得分，每日监控疾病进展。通过平均后爪(rear paw)的每个读数，确定每日踝最小厚度。通过总计四只爪的得分，计算每只小鼠的临床得分：0，正常关节；1，踝的轻微/中等肿胀和/或一个趾(digit)肿胀；2，踝肿胀或者两个或多个趾肿胀；3，爪的所有方向都严重肿胀或5个趾都肿胀。监控小鼠的研究人员对每只小鼠已接受的处理是不知道的。
处理
在腹腔给药第5天(治疗处理方式)注射纯化的抗C5aR或同种型对照抗体(PBS中1-10mg/kg)。在一些实验中，对照组接受PBS，而不是同种型对照抗体。
统计分析
使用曼肯德尔检验(Mann-Kendall test)或使用克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)和用邓恩的多重比较检验(Dunn′sMultiple Comparison Test)完成的事后分析(post hoc analysis)，确定独立对照和K/BxN模型中处理组之间差异的统计显著性。
结果
研究了在K/BxN模型中人源化7F3抗体逆转确认的炎症的能力，结果描述在下面。表8列出在这个模型中测试的抗体和给予的剂量。通过在K/BxN血清注射诱导关节炎之后在腹腔注射“治疗”的第5天，给予所有抗体。
表8：测试的抗体和给予的剂量
抗体 测试剂量 组尺寸 结果数据
  G   10mg/kg   6   34
  M   10mg/kg   6   34
  N   10mg/kg   6   34
  J   1mg/kg   4   35
  J   3mg/kg   5   35
  J   10mg/kg   5   35
  C   3mg/kg   5   35
  C   10mg/kg   4   35
图34和35中示出的结果表明当在诱导炎性关节炎之后在腹腔给药第5天给予10mg/kg时，人源化抗体有效逆转了炎症的临床迹象。抗体J和G的较少剂量比10mg/kg剂量效果小，但在大部分情况下都可以阻止炎症的任何进一步进展，如在对照组中观察到的(给予PBS的小鼠，或人IgG4-针对不相关的人抗原的同种型对照抗体)。
B.人源化抗-C5aR抗体减轻风湿性关节炎的小鼠模型中关节炎症 的迹象和症状：抗体剂量、抗体血清浓度、受体占位率和功效之间 的关系。
在治疗给予人源化抗-C5aR抗体之前，在小鼠中诱导实验关节炎。研究了抗体剂量、血清中抗体浓度、通过抗体的C5aR占位率水平和对小鼠中关节炎症功效之间的关系。
方法
动物
在C57BL/6背景上(Lee等人，2006)～8-16周龄(平均～12)的雄性和雌性敲入人C5aR的转基因小鼠，来源于繁殖种群，该繁殖种群在悉尼的Garvan Institute，或Perth的Animal ResourceCentre。
制备K/BxN血清
本研究中所有小鼠都注射了同一批的按上面描述制备的K/BxN血清。
hAb-Q的FITC标记
异硫氰酸荧光素(FITC)如下共价结合到hAb-Q抗体。简言之，将～1.5mg hAb-Q放入“反应缓冲剂”((160mM Na2CO3，340mMNaHCO3，pH 9.5))中，并将其添加到溶解在DMSO中的120μg FITC(分子探针)中，每mg抗体。于室温(23℃)下在黑暗中进行该反应1小时。使用PD-10柱除去未结合的FITC，用“储存的缓冲剂”(10mM Tris，150mM NaCl，pH8.2)预平衡和洗脱未结合的FITC。使用微量离心浓缩器(YM-30)旋转过滤器浓缩结合的hAb-Q-FITC，从而达到1.036mg/ml的最终浓度，并于4℃下在黑暗中储存。
实验关节炎的诱导和测量
如上所述，通过在第0天和2天腹腔注射150μl K/BxN，在受者小鼠中诱导实验关节炎。在第5天，通过将临床得分乘以从0天起爪尺寸的变化(mm)，计算每只小鼠的“RA得分”。只有RA得分＞0.5的小鼠才进入该研究的治疗阶段。～90％的雄性小鼠和50％的雌性小鼠患上炎性关节炎。
研究设计—概述和组尺寸
该研究设计用于测量在用抗-C5aR开始处理之前和之后不同时期的炎症，体内受体占位率和K/BxN疾病模型中血清抗体浓度。通常在～3周内解决这个模型中的病程。炎症迹象和症状在用K/BxN小鼠血清免疫的一天或两天内是明显的。在10-14天附近，炎症达到峰值，并在之后慢慢衰退。
考虑到这些情况，采取下面时间表进行分析：
炎症：在第0天(第一血清注射之前)、d2(第二血清注射之前)、5(开始处理之前)，然后d6、d7、d8、d9、d10、d11、d12、d14和d16测量爪尺寸和临床得分。在每组至少10只小鼠中测定炎症。
血清抗体浓度：在第5天(处理之后30分钟和12小时)、d6(处理之后24小时)、d7(48小时)、d8(72小时)、d9(96小时)，10 d10(120小时)、d11(144小时)、d12(168小时)、d14(192小时)和d16(264小时)抽取血样样品。从通过心脏穿刺在第5.5天(处理之后12小时)、6、8、10、12和16天抽取的血液制备血清，和从第5天(处理之后30分钟)和第7、9、11和14天的尾静脉血制备血清。2-4组小鼠在每个时间为每个处理提供血液，但是每个小鼠的抽血不能超过3次。将约100μl血液采集到1.5ml管子(无抗凝结剂)中，并在37℃下孵育30分钟，从而促进凝血，接着在13,000rpm下离心10分钟。将该血清分配到新管(fresh tube)子中(每个小鼠样品2个)并储存在-80℃，之后使用ELISA测定抗体浓度。
受体饱和：在第5.5(处理之后12小时，)6、8、10、12和16天处死小鼠＝(每组n＝4)，并通过心脏穿刺抽取血液。用FITC标记的hAb-Q给白细胞染色，从而测定游离C5a受体量，或用FITC标记的抗人IgG给白细胞染色，从而测定与PBS对照组比较的结合hAb-Q的量。用CD11b和Ly6G共同给细胞染色，从而区分中性粒细胞和单核细胞。见下面的进一步详述。
处理
将挑选用于进入该研究的小鼠随机分为5组，从而在第5天接受5个处理中的一个。
1.PBS腹腔给药
2.huIgG对照抗体腹腔给药8mg/kg
3.hAb-Q腹腔给药1mg/kg
4.hAb-Q腹腔给药3mg/kg
5.hAb-Q腹腔给药10mg/kg
将抗体溶解在PBS中，以便注射的总体积为每只小鼠～100μl。监测小鼠的研究人员对每只小鼠接受的处理是不知道的。直到数据收集和分析之后才揭示处理组，除了鉴定用于受体占位率研究的药PBS的动物。
未用抗体处理的组1(PBS对照)用于确立受体饱和、活化和PK分析的基线。组2是用不相关的人IgG抗体处理的阴性对照组。组3-5接受抗-C5aR处理。
统计分析
按上面描述的测定独立对照组和处理组之间差异的统计显著性。
测量结合的hAb-Q
为每个测试样品设立含有hAb-Q(200μg/ml，[最终])或dPBS的板。将来自每只小鼠的25μl肝素化血液添加到含有hAb-Q和dPBS孔中，并在37℃下孵育1.5小时。用dPBS清洗细胞3次，从而除去未结合的hAb-Q，并在室温下将其重悬在含有抗-hlgG-FITC(1/50)、抗-Ly-6G-PE和抗-CD11b-PerCP/Cy5.5抗体(1/400)的dPBS中，持续45分钟。通过添加BD FACS裂解溶液(BD，349202)除去红细胞。在2,000rpm下离心样品板3分钟，除去上清液并再次将细胞重悬在BD FACS裂解溶液中，用以通过流式细胞术(BD FACSanto)分析。
测量‘游离’C5a受体
设立含有hAb-Q(200μg/ml，[最终]，对于最少的游离C5aR)或dPBS(对于最多的游离C5aR和所有测试样品)的板。将来自每只小鼠的25μl肝素化血液添加到相应孔中(即，将用仅有的dPBS注射的小鼠，添加到含有hAb-Q和dPBS的孔中(对于最少和最多的游离C5aR)。将所有其他的测试血液样品添加到含有仅有的dPBS的孔中，并在37℃下孵育1.5小时。用dPBS清洗细胞3次，从而除去过多的hAb-Q，并于37℃下将细胞重悬在含有25μg/mlhAb-Q-FITC、抗-Ly-6G-PE和抗-CD11b-PerCP/Cy5.5抗体(1/400)的dPBS中，持续45分钟。通过添加BD FACS裂解溶液(BD，349202)除去红细胞。在2,000rpm下离心样品板3分钟，除去上清液并再次将细胞重悬在BD FACS裂解溶液中，用以通过流式细胞术(BD FACSanto)分析。
流式细胞术分析中性粒细胞C5a受体饱和
BD FACSCalibur流式细胞仪设有为通道FL-1、FL-2和FL-3确立的补偿参数。获得的样品要排除死细胞和碎片。中性粒细胞被鉴定为Ly-6G-PE高、CD11b-PerCP/C5.5低-高。单核细胞被鉴定为Ly-6G-PE阴性、CD11b-PerCP/C5.5高。通过测量每个样品的FITC(FI-1)的中位荧光强度(MFI)，测定结合的hAb-Q(a-IgG-FITC)和游离的C5aR(hAb-Q-FITC)。
根据下面方程，通过测定在dPBS中孵育的每个样品的MFI，占与200μg/ml hAb-Q一起孵育的相同样品MFI的百分比，量化结合的hAb-Q的百分数(在扣除背景之后，该背景是从经PBS处理的小鼠样品计算的，该小鼠样品与PBS一起孵育，然后与FITC-抗-hIgG孵育的)：
[[MFI(样品+dPBS)-MFI(背景，即，PBS对照小鼠+dPBS)]/[Max_MFI(样品+冷hAb-Q)-MFI(背景)]]×100
通过测定在dPBS中孵育的每个样品的MFI，占最多的游离受体样品，即给予仅有dPBS的小鼠的百分比，量化游离的C5aR受体的百分数。最多游离的C5aR，即在回体法中与过量的hAb-Q一起孵育的样品，未用在这个计算中，而用于比较目的。
测量抗体血清浓度
用证实可检测小鼠血清中hAb-Q的ELISA方法，按照GLP，分析hAb-Q的血清浓度。最低量化限(lowest limit of quantification)(LLOQ)是4ng/ml。对于体外失踪研究，量化小鼠试验，用于检测人EDTA血浆中的hAb-Q。当该试验应用在血浆中时，LLOQ是10ng/ml。
结果
免疫一些200hC5aR KO/KI小鼠两次，用来自K/BxN小鼠的血清分2天(第0天和第2天)进行，以便诱导炎性关节炎，该炎性关节炎自身表现为受者小鼠的爪中关节和趾肿胀。在5天的时候，约70％小鼠(～85雄性和～60雌性)的一些爪和关节已肿胀和变红。将“RA得分”＞0.5的小鼠随机分成5个处理组，每组11-12只小鼠。给每组给予5个处理中的一个—PBS中的hAb-Q，剂量为1、3和10mg/kg，PBS中的对照抗体(无关抗原的人IgG)，剂量为8mg/kg和仅有的PBS。接下来的11天，定期监测小鼠，给定临床得分并测量爪尺寸(踝最小厚度)。血液样品采集于尾静脉或通过心脏穿刺在第5.5、6、7、8、9、10、12、14和16天采集，用于测定受体占位率和抗体血清浓度。
人源化抗-C5aR抗体以剂量依赖方式逆转炎性关节炎的K/BxN模型中的炎症
图36中示出从0天之后每个处理组的平均临床得分和爪尺寸的变化。该数据表示hAb-Q在体内有效减轻了炎症的迹象和症状。10mg/kg剂量明显比3mg/kg和1mg/kg更有效，观测得剂量反应关系。与2个对照组相比，10mg/kg hAb-Q减轻并控制了炎症和给药一周之后的临床得分，3mg/kg hAb-Q阻止了炎症的任何进一步进展约5天，但是不能减轻已存在的炎症，而1mg/kg hAb-Q无效。在最后的3-5天，10mg/kg和3mg/kg组的炎症得分都呈现上升的趋势。在第5天，只给予单次剂量的hAb-Q。如下所示，炎症的减轻或平稳(没有进一步增加)与高的受体饱和和血清抗体浓度相关。当这些下降时，炎症复发。
通过人源化抗-C5aR抗体的C5a受体占位率的水平和程度是剂量依赖的
用两种不同的方式测量受体占位率。用hAb-Q-FITC给白细胞染色，从而测定“游离的”受体量，或用抗hIgG-FITC给白细胞染色，从而测定体内结合的hAb-Q(“占位的”受体)量，和用CD11b和Ly6G共同给白细胞染色，从而区分中性粒细胞和单核细胞。结合到中性粒细胞上C5aR的抗体量和游离的(空的)受体量之间应当存在反比关系。当计算结合的抗体时，校正了受体数目中小鼠与小鼠的变异。测定游离受体时没有进行该校正。结果示出在图37和38中。
图37示出给予的抗体剂量和中性粒细胞中结合的抗-C5aR抗体之间的关系。在最高剂量10mg/kg时，结合的抗体仍然处于饱和水平，直至给予～120小时之后(10天)，然后经过264小时(16天)下降到～20％的占位率。在3mg/kg时，结合的抗体持续24小时处于饱和水平，然后经过72小时下降到50％，经过120小时下降到15％。1mg/kg剂量不足以产生抗体的饱和结合，给药24小时后受体占位率仅为75％。到72小时时，实际上已没有结合到中性粒细胞的hAb-Q。在单核细胞中观测到了相似的结果(未示出)。
图38表明“游离的”受体水平与“占位的”受体(图37中示出的结合抗体)百分数呈现反比关系。在用10mg/kg hAb-Q处理的小鼠中，中性粒细胞上的游离受体非常少，直至给药一周后。在3mg/kg组中，游离受体少，直至72小时之后，在1mg/kg组中，在给药24小时之后游离受体显著增多。对于单核细胞观测到了相似的结果(未示出)。
血清中人源化抗-C5aR抗体浓度的水平和程度是剂量依赖的
给药之后，每隔30分钟到11天的时间间隔，测定动物血清中人源化抗-C5aR抗体的浓度。结果示出在图39中。给药之后，血清中hAb-Q浓度迅速增大。给药之后，测得的最大浓度在30分钟和12小时之间达到，且该最大浓度是剂量依赖的。给予1mg/kg之后，血清中抗体浓度在30分钟之后达到峰值1.9μg/ml，持续12小时仍然超过1.5μg/ml，然后在第7天(给予48小时之后)下降到＜0.1μg/ml。在3mg/kg组中，血清抗体峰值浓度是给予12小时之后的13.3μg/ml。在10mg/kg组中，血清抗体浓度在给予12小时之后到达峰值69.5μg/ml，接下来的7天逐渐下降到5.5μg/ml，然后到14天时下降到0.1μg/ml。
炎症的减轻或稳定与高的受体占位率和高的血清抗体浓度相关
上面图36a(临床得分)、37(hAb-Q占位的hC5aR％)和39(血清中hAb-Q浓度)的数据已组合在图40、41和42中，从而证明抗体剂量、受体占位率和血清抗体浓度之间的关系。
当通过在小鼠中注射K/BxN血清诱发实验关节炎时，关节和爪肿胀和变红均增加，按上面描述的使用“关节炎指数”量化该增加(表示为临床得分)。当治疗给予人源化抗-C5aR抗体hAb-Q时，即在炎症已在小鼠中形成之后的第5天，其中在第0和2天给予该小鼠K/BxN血清，接受最高剂量(10mg/kg)的小鼠组中炎症大幅度持续降低。图40表明在受体占位率高(＞40％)的同时，在第5和12天之间，该组中炎症水平(临床得分)下降，该hAb-Q的高水平(＞5μg/ml)是在血清中测得的。炎症中记录的给予3mg/kghAb-Q的小鼠在接下来三天内稍微有所减少，接下去的4天将开始呈现上升趋势。图41表明在给予3mg/kg hAb-Q的小鼠中，血清抗体浓度＞5μg/ml的同时受体占位率≥50％。8天之后，血清抗体浓度和受体占位率都迅速下降，这对应于炎症开始再次呈现上升趋势的时期。当给小鼠给予最低剂量1mg/kg hAb-Q时，炎症稳定进展水平中有约1天的暂停，如临床得分所表明的(图42)。同时，在注射之后血清中抗体水平从1.8μg/ml的峰值迅速下降，并在12小时时到达1.5μg/ml。仅在迅速下降的1天前，C5aR占位率仍然＞50％。
支持高的受体占位率依赖于血清中高的Ab浓度，和如在组织切片中观测的和通过抓尺寸减小测得的关节中白细胞减少，和临床得分依赖于受体占位率的高水平(低“游离的”受体)的提议的这些数据。在没有游离受体的情况下，C5a不能结合C5aR从而引起活化和白细胞从血液到炎症部位的迁移及组织中补体活化。
C.在K/BxN小鼠模型中hAb-Q的PK/PD关系
在这个实施例中，我们提供了似乎真实的药物动力学/药效学(PK/PD)模型，该模型描述了抗-C5aR mAb的药物动力学、靶受体占位率，和炎性关节炎的K/BxN小鼠模型中效果之间的量化关系。建模数据产生于两个研究：药理研究(描述在上面实施例11B中)和毒理研究。这个模型构成了解释数据的方法，从而探测浓度反应关系，并可用于帮助选择人的安全启动剂量。
方法
药理研究
上面实施例11B中给出了药理研究方法的充分详述。简言之，本研究的目的是为了确定，首先用人源化抗-C5aR抗体、hAb-Q的治疗处理是否有效逆转K/BxN模型中炎性关节炎的迹象和病症；和其次，为了将剂量和抗炎性效果、受体占位率水平(以游离hC5aR和结合的hAb-Q测量)、中性粒细胞活化状态和循环血清抗体浓度关联。在每组至少10只小鼠中测定炎症。用每组4只小鼠，除了给予PBS的对照组包括2只小鼠，完成了受体饱和研究。给药组(1、3、10mg/kg，腹腔给药，和对照动物)。
毒理研究
通过向转基因小鼠皮下和静脉内(丸剂)给予hAb-Q进行毒理研究，其中剂量是隔日给予的。毒理动力学数据获得于四个hAb-Q给药组(5、50、500mg/kg，i.v.，和100mg/kg皮下(s.c.))中每组中的18-21雄性和18-21雌性。
药物动力学
按上面描述的，分析hAb-Q的血清浓度。
受体占位率
按如上描述的，测定通过给予的hAb-Q mAb，中性粒细胞和单核细胞上hC5aR的结合。对于药理研究，占位率计算如下，
扣除了预(pre)值，因为这些值被认为提供了背景MFI。
模型建立
带有一级条件预测(first order conditional estimation)(FOCE)的NONMEM VI(非线性混合效果建模软件，non-linear mixed effectsmodelling software)用于建模，S-PLUS8.0(Insigthful)用于制图和数据处理。中间模型之间的评价和判别以目标函数值和标准的图解评价方法为基础。对于目标函数值，该值的变化假定为x2(chi-squared)分布的(对于嵌套模型，nested model)，用于扩张模型的准则被限定并据此使用。
结果
用于占位率的PK/PD关系
结合来自转基因小鼠中药理研究的药理动力学和来自药理研究的PK/PD数据，从而评定药物动力学和占位率之间的关系。用靶介导处理的一区室PK模型完整地显示了这些数据，如图43中所示。对于每个给药组，PK和占位率模型拟合示出在图44中，而参数值在表9中给出。还注意到在毒理研究中，估计500mg/kg组比较低剂量水平的组的清除率(clearance)高。这与其他研究一致，高剂量观测到较高的清除率，这是由FcRN受体的饱和造成的(Hansen和Balthasar，2002)。
表9：在毒理研究和药理研究中，转基因中hAb-Q的药物动力学参数
*来自毒性研究中的KO/KI hC5aR小鼠，在500mg/kg组中发现较高的清除率。V1＝中间体积，CL＝清除率，ka.sc/ka.ip是用于s.c.或i.p.施用的吸收率常数。F.sc/F.ip是用于s.c.或i.p.施用的生物利用率。Kd＝特异性结合的亲和力。koff＝解离速率常数。Bmax.Targ＝用于hAb-Q的最大靶结合能力。回转(turnover)＝更新靶和除去结合的抗体所需时间(koff固定为0.1l/h)。
对炎症产生影响的PK/PD关系
建立了PK/PD模型，从而描述在使用转基因小鼠药理研究(K/BxN模型)中的炎性进攻之后，药物动力学和爪尺寸变化之间的关系。K/BxN模型的自然进程是因实验关节炎诱导造成的爪尺寸逐渐增大，在约12天之后，爪尺寸随后朝向炎症消失(wane off)的正常爪尺寸逐渐恢复(return)。图45中示出的PK/PD模型描述了hAb-Q通过抑制诱导的炎症的效果。最大抑制百分数被设为从占位的PK/PD模型获得的占位率水平。如在图46中所见，测得的和作模型用的爪尺寸之间的合理一致性可通过这个途径获得，该途径示出中性粒细胞C5a-受体和对炎症影响之间的非常紧密的关系。
使KO/KI hC5aR小鼠(n≥10/时间点/组)在第0天经受实验关节炎的诱导，并在第5天用1、3、10或0mg/kg抗-C5aR(hAb-Q)对其注射。在约12天之后，爪尺寸开始减小，因为诱导的炎症消失。同样地，在占位率接近100％的情况下，诱导炎症的进展被抑制，且对于10mg/kg组，可见到爪尺寸的减小。在该模型中，这些过程是相关的，都被描述为朝向正常爪尺寸的自然恢复。
可预测hAb-Q影响的主要部分的模型在某一浓度获得，导致循环中性粒细胞上受体的完全占位。在1mg/kg时，仅对于给药后1-2天占位率高，且此后爪尺寸开始再次增大，见图46。相似地，3mg/kg约导致72小时的高占位率，其中在爪尺寸开始再次增大之后。在10mg/kg时，获得约10天的占位率，导致抑制爪炎症的约相同的时间间隔。
使用示出的似乎真实的模型，我们观测到当占位率超过50％时，爪尺寸的增长被抑制，且当占位率降到50％以下时，例如，在3mg/kg组中在8天之后，爪尺寸重新开始炎症驱使的增大。因为模型使得50％的抑制与50％的占位率之间有联系，良好拟合给出量化证实1)占位率和对炎症的影响是紧密联系的，和2)在50％的峰值占位率预期对炎症的影响最小。
结论
该模型表明在mAb浓度、占位率，和对炎症的影响，及良好一致性之间发现测量和预测值之间的紧密关系。模型描述了该数据中最重要的特征：1)对小鼠爪激发的进一步临床进展的明显有利影响。2)靶介导的处置体现的高饱和消除组分，其中该靶介导的处置可导致用于长期治疗效果所需的高剂量水平，和3)与体内受体的相对强的结合，这可能与二价结合相关，该二价结合可导致低剂量时的高峰值占位率。
这个模型用作构建人刺激模型的一套的一部分。该刺激模型以所有相关前临床数据为基础，从而在人的初次试验中选择安全启动剂量。
实施例12—人类数据更新的PK/PD模型
使用药物动力学和C5aR占位率数据，带有hAb-Q的正在进行的临床试验数据用于证实和更新实施例11中描述的潜伏期PK/PD模型。这个模型的刺激可用于在较高剂量水平时描述PK/PD的当前预测。这个模型构成解释关于在将来研究中作出剂量水平和治疗方案选择(regimen selection)的早期决策的数据的方法。
方法
临床数据
NN8209-1940是随机化的双盲的空白对照的单个静脉给药和分别在8和7剂量水平的平行皮下给药的剂量递增试验。对象被随机分布到抗-C5aR(hAb-Q)的单个静脉给药或皮下给药剂量。对象以3∶1比例随机分布，其中3个对象将被分派到在每个剂量水平和给药路径的活性治疗中，且一个经受空白对照例处理。以计划的剂量水平，给予抗-C5aR(hAb-Q)，剂量比前面剂量水平实际增大了3或3.3倍。包括在PK/PD模型中的当前剂量水平更新为：静脉给药剂量水平：0.003、0.01、0.03、0.1、0.2、0.6mg/kg；皮下给药剂量水平：0.01、0.03、0.1、0.3mg/kg。
没有包括在建模、未结束试验完成中的数据，包括计划的剂量水平：2和7mg/kg静脉给药和1和3mg/kg皮下给药。
取样时间
在0小时(给药之前最多60分钟)和在5分钟(在仅静脉给药之后)，15分钟(在仅静脉给药之后)，和30分钟，和在药物给予后1、2、4、6、8、12、24和48小时和3、7、14、21、28、42、56、和70天，计划用于测量抗-C5aR(hAb-Q)的PK取样。时间点是指在0分钟开始注射或开始输液。对于随机分派到静脉给药的对象，输液时间是15分钟，因此15分钟的时间点是指输液终点。
对于中性粒细胞和单核细胞上的C5aR占位率的取样，在0小时(给药前最多60分钟)和在药物给予后4、24和48小时和3、7、14、21、42和70天进行设计。
占位率计算
使用三种不同方法，测定通过给予的hAb-Q与中性粒细胞和单核细胞上hC5aR的结合。通过FACS分析之后，这些测量中的每个都产生校正的中位荧光强度(MEF)。三种方法是；1)直接方法，使用FITC标记的抗-人IgG4第二抗体，从而评定已体内结合hAbQ的占位的受体(MEF结合)；2)间接方法，测量由体内hAb-Q给药，接着回体法中添加hAb-Q-FITC产生的游离hC5a受体(MEF游离)；和3)测量总受体数目，回体法中与过量的hAb-Q孵育从而填充所有受体，然后添加抗人第二抗体(MEF最大结合)。占位率随后如下所得：
模型建立
带有一级条件预估(first order conditional estimation)(FOCE)的NONMEM VI用于建模，S-PLUS8.0(Insigthful)用于制图和数据处理。中间模型之间的评价和判别以目标函数值和标准的图解评价方法为基础。对于目标函数值，该值的变化假定为x2分布(对于嵌套模型)，用于扩张模型的准则被限定并据此使用。
从数据估计更新模型。然而，当前数据不足以加强所有参数的估计。在这种情况下，将一些参数固定为典型IgG参数的参数值。
结果
用于人PK和占位率的当前更新模型描述在图47中。总的来说，发现模型预测与到目前为止在实验中观测到的药物动力学和占位率具有非常好的一致性。给予抗-C5aR(hAb-Q)之后PK/PD的这些模型预测对于静脉给药在图48中给出，对于皮下给药在图49中给出。注意这些预测可能在数据累积之后改变。
该模型是高度非线性的，这使得比线性药物动力学预测更困难。基于当前数据，只有少的信息有助于在高剂量水平时消除半衰期，暗示应当考虑一些不确定性，尤其对于预测高剂量水平。对于皮下给药，可获得的药物动力学数据也接近最低量化限，这意味着主要占位率数据有助于生物利用率的估计。
结论
总的来说，发现观测到的和预测的PK和占位率之间存在良好的一致性。从临床前数据预测的主要特征也在临床数据中观测到。这些特征包括高饱和消除组分，这可能是因靶和在低浓度时的相对高的占位率造成的。
技术人员应当理解，可在不背离概括描述的本发明精神和范围的情况下，如具体实施例中所示，对本发明作出许多变化和/或修饰。因此，本事实施例的各个方面都应当理解为示例性而非限制性的。
本申请要求于2008年2月提交的US 61/066,539的优先权，该申请完整地合并在本文中，以供参考。
上面讨论的所有出版物都完整地合并在本文中。
包括在本说明书中的文献、文件、材料、设备、文章等所作的任何讨论，其目的仅仅为了提供本发明的背景。不能视为因它在本申请每个权利要求的优先权日期之前已经存在，这等于认可这些内容的部分或全部构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。
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Claims (34)

1.一种纯化的和/或重组的人源化抗体，包括：
i)包括了由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的可变区的免疫球蛋白轻链，和
ii)包括了由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的可变区的免疫球蛋白重链，
其中所述抗体结合人C5aR。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其中：
i)所述免疫球蛋白轻链包括了由与SEQ ID NO:40和SEQID NO:41中的一个或多个至少98％相同的氨基酸序列组成的恒定区，和
ii)所述免疫球蛋白重链包括了由与SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45中的一个或多个至少98％相同的氨基酸序列组成的恒定区。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的人源化抗体，所述人源化抗体为由两条重链和两条轻链组成的四多肽链结构、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，所述人源化抗体为结合人C5aR的抗体片段。
5.根据权利要求4所述的人源化抗体，其中所述片段为Fab片段。
6.一种结合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗体和直接或间接结合到所述抗体的治疗剂。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中所述治疗剂选自由下列物质组成的组：细胞毒素、放射性同位素、免疫调节药剂、抗血管新生药剂、毒素、抗增殖药剂、促凋亡药剂、化疗剂、和治疗核酸。
8.根据权利要求7所述的结合物，其中所述毒素是假单胞杆菌(Pseudomonas)外毒素或其衍生物。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的结合物，其中所述治疗剂通过接头间接结合到所述抗体。
10.根据权利要求9所述的结合物，其中所述接头选自由下列物质组成的组：4-(4'乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基酸性酸(AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(酰胺)、及其衍生物。
11.一种结合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗体和直接或间接结合到所述抗体的可检测标签。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中所述标签选自由下列物质组成的组：放射性标签、荧光标签、酶标签和显像剂。
13.一种分离的和/或外源的多核苷酸，其编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或其链。
14.一种包含权利要求13所述的多核苷酸的载体。
15.一种包含权利要求13所述的多核苷酸和/或权利要求14所述的载体的宿主细胞。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其为细菌、酵母或植物细胞。
17.一种组合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、权利要求6至12中任一项所述的结合物、权利要求13所述的多核苷酸、权利要求14所述的载体和/或权利要求15或16所述的宿主细胞，以及药用载体。
18.一种生产抗体的方法，所述方法包含培养权利要求15或16所述的宿主细胞，以表达所述多核苷酸并生产所述抗体，其中所述宿主细胞包含至少一种权利要求13所述的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链和所述免疫球蛋白重链被一个连续多核苷酸上的两个分开的开放阅读框编码。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，进一步包含从所述宿主细胞培养物中回收所述抗体。
21.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或根据权利要求6至12中任一项所述的结合物在制备用于抑制人C5aR与其配体相互作用的药物中的应用。
22.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或根据权利要求6至12中任一项所述的结合物在制备用于抑制细胞中人C5aR活性的药物中的应用。
23.一种抑制人C5aR与其配体相互作用的体外方法，所述方法包括使人C5aR暴露于根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或根据权利要求6至12中任一项所述的结合物。
24.一种抑制细胞中人C5aR活性的体外方法，所述方法包含使细胞暴露于根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或根据权利要求6至12中任一项所述的结合物。
25.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、根据权利要求6至12中任一项所述的结合物、权利要求13所述的多核苷酸、权利要求14所述的载体、权利要求15或16所述的宿主细胞和/或权利要求17所述的组合物在制备用于治疗或预防对象中的病症的药物中的应用。
26.根据权利要求25所述的应用，其中所述病症是免疫病态病症。
27.根据权利要求26所述的应用，其中所述免疫病态病症是自身免疫疾病。
28.根据权利要求25所述的应用，其中所述病症是炎性疾病。
29.根据权利要求28所述的应用，其中所述炎性疾病是急性炎症或慢性炎症。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的应用，其中所述免疫病态病症或炎性疾病涉及白细胞迁移和/或白细胞活化。
31.一种根据权利要求25至29中任一项所述的应用，其中所述免疫病态病症或炎性疾病涉及补体活化。
32.根据权利要求6至10中任一项所述的结合物、或编码其的多核苷酸在制备用于递送治疗剂到对象的炎症部位的药物中的应用。
33.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、或根据权利要求4至12中任一项所述的结合物在制备用于将遗传物质引入到呈递C5aR的细胞中的药物中的应用，其中所述抗体或结合物结合于遗传物质或与遗传物质联合。
34.一种试剂盒，包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、根据权利要求6至12中任一项所述的结合物、权利要求13所述的多核苷酸、权利要求14所述的载体、权利要求15或16所述的宿主细胞和/或权利要求17所述的组合物。
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