CN101970493A - 单克隆抗体及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源化IgG1同种型抗-CD6抗体(T1h)，其与存在于胸腺上皮细胞、单核细胞、激活的T细胞和多种其他细胞类型的表面上的CD6的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域1(D1)结合。

Description

单克隆抗体及其方法
发明领域
本发明涉及人源化IgG1同种型抗-CD6抗体(T1h)，其与存在于胸腺上皮细胞、单核细胞、激活的T细胞和各种其他细胞类型表面上的CD6的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域1(D1)结合。本发明进一步涉及抑制T细胞增殖但不阻断CD6和原初CD6配体样激活白细胞粘附分子(ALCAM)相互作用的方法。本发明还涉及使用与CD6的SRCR结构域1(D1)结合的抗-CD6抗体治疗各种疾病适应症的方法。
发明背景
CD6是主要由人T细胞和B细胞亚群以及由一些B细胞慢性淋巴细胞性白血病和神经元表达的重要细胞表面蛋白[Aruffo等，J.Exp.Med.1991，174：949；Kamoun等，J.Immunol.1981，127：987；Mayer等，J.Neuroimmunol.1990.29：193]。CD6是特征在于具有至少一个与I型巨噬细胞的清道夫受体富含半胱氨酸结构域(SRCR)同源的蛋白质大家族的成员[Matsumoto等，J.Exp.Med.1991，173：55和Resnick等，Trends Biochem.Sci.1994，19-5]。这个家族的其他成员包括CD5[Jones等，Nature.1986，323：346]；亲环素C[Friedman 等，1993，PNAS 90：6815]；补体因子I，其结合激活的补体蛋白C3b和C4b[Goldberger等，J.Biol.Chem.1987，262：10065]；由.τ./.δ.T细胞表达的牛WC-1[Wijingaard等，J.Immunol.1992，149：3273]和M130[Law等，Eur J.Immunol.1993，23：2320]，一种巨噬细胞激活标记。
使用抗-CD6单克隆抗体(mAb)的阻断研究表明CD6通过调节T细胞与胸腺上皮(TE)细胞的粘附相互作用在T细胞发育中起着重要作用[Patel等，J.Exp.Med.1995 181：1563-1568]。其他研究已经表明CD6在T细胞激活中可以作为重要的辅助分子来起作用。例如，某些抗-CD6 mAb对于T细胞是直接致有丝***的[Gangemi等，J.Immunol.1989，143：2439和Bott等，1993 Int.Immunol，7：783]，而其他能够和抗-CD3、抗-CD2或佛波醇12肉豆蔻酸酯13醋酸酯(PMA)一道共同刺激T细胞增殖[Gangemi等，J.Immunol.1989，143：2439；Morimoto等，J.Immunol.1988，140；2165-2170；和Osorio等，Cell.Immunol.1994，154：23]。CD6在T细胞激活中的作用的其他证据来自表明在T细胞激活后CD6对Ser和Thr残基变得超磷酸化[Swack等，Mol Immunol 1989 26：1037-1049和J.Biol.Chem.1991，266：7137；Cardenas等，J.Immunol.1990，145：1450-1455]和对Tyr残基变得磷酸化[Wee等，J.Exp.Med.1993，177：219-223]的研究。这些和其他研究暗示CD6是体内未成熟和成熟T细胞功能的重要调节剂，影响T细胞激活和信号转导。
成熟CD6蛋白的胞外结构域由三个SRCR结构域(下文中称为D1、D2和D3)组成。D3对应于膜近端SRCR结构域，其后为短的33-氨基酸的茎区。这些胞外结构域通过后面为可变长度的胞质结构域的短跨膜结构域锚定于细胞膜上[Aruffo等，J.Exp.Med.1991，174：949]。
使用CD6-免疫球蛋白融合蛋白(含有与人IgG1恒定区融合的选定的CD6胞外结构域(CD6-Rgs)的研究，导致CD6配体的鉴定和克隆，该配体被称为“激活的白细胞粘附分子”(ALCAM)[Wee等，Cell Immunol1994，158：353-364；Patel等，J.Exp.Med.1995.181：1563-1568；Bowen等，J.Exp.Med.1995，181：2213-2220]。ALCAM与对应于膜近端SRCR结构域的CD6的结构域3结合[Whitney等，J.Biol.Chem.1995，270：18187-18190]。
CD6/ALCAM相互作用在T细胞调节中的作用的研究已经表明该受体-配体对能够介导CD6表达细胞粘附到胸腺上皮细胞上[Bowen等，J.Exp.Med.1995，181：2213]。这个和其他证据表明CD6/ALCAM相互作用对于调节T细胞发育和激活是重要的。
尽管CD6的功能性表征仍然不完善，但抗-CD6mAb已经成功地应用于临床环境下，用于清除骨髓的T细胞和T细胞前体。接受抗-CD6-处理的异源骨髓的患者与高水平移植联合的移植物抗宿主疾病的发病率低的发现[Soiffer RJ，1993，Bone Marrow Transplant.；12Suppl3.S7-10]导致CD6阴性的小的外周血T细胞亚群(5-6％)的发现(Rasmussen.J Immunol 1994.152：527-536)。CD6阴性T细胞的亚群与正常的CD6T细胞相比在MLR中呈现较低的同种异体反应性。这些CD6-阴性T细胞的功能性表征还表明了它们对异源刺激是无应答的，但用植物凝集素(PHA)刺激时能够增殖。这些发现进一步支持CD6在体内调节T细胞功能中起着重要作用的假设。还报道了CD6是介导早期和晚期T细胞-APC相互作用的免疫学突触的一部分。(Gimferrer I. J Immunol 2004.173：2262-2270)。
CD6分子是由蛋白酶敏感位点N糖基化的，并具有链内二硫键。之前的报道表明CD6以两种分子形式存在，静息T细胞中的105kDa的磷酸化形式和由肿瘤促进剂佛波醇12肉豆蔻酸酯13醋酸酯(PMA)激活蛋白激酶C后细胞中的130kDa的超磷酸化形式(Osorio M，Cellular Immunology，1994154：123-133)。
US 6,372,215公开了与CD6(hCD6)的SRCR结构域3(D3)或人CD6茎结构域特异性结合(CD6S)并抑制激活的白细胞粘附分子(ALCAM)与CD6结合的抗体和其他结合剂，在此将其内容引入作为参考。
2006年12月26日提交的发明名称为“用于诊断和治疗类风湿性关节炎的包含抗CD6单克隆抗体的药物组合物”的古巴专利申请CU250/2006公开了T1h与CD6结合，但没有抑制CD6与ALCAM配体的结合，在此将其内容引入作为参考。
该发明的CD6抗体通过抑制由与结构域结合引起的T细胞增殖来防止T细胞的激活，该结构域独立于与CD6的已知配体(即ALCAM)相互作用的结构域。
早期的出版物和专利公开了鼠抗CD6(IOR-T1)单克隆抗体的序列和为了将IOR-T1人源化成T1h(人源化IOR-T1)而进行的氨基酸修饰。US 5712120及其同族EP 0699755公开了将鼠单克隆抗体人源化的特定方法以及IOR-T1和T1h的序列。US 6572857及其同族EP0807125公开了IOR-T1和T1h(人源化IOR-T1)的序列。出版物[Roque-Navarro，L.等，Hybridoma and Hybridomics 2003.22：245-257]讨论了将鼠单克隆抗体人源化的特定方法以及IOR-T1和T1h的序列。
本发明的各个方面涉及T1h重链和轻链的可变区的氨基酸序列。这确立了T1h核苷酸和氨基酸序列，如通过用于制造T1h的细胞系所表达的。本发明的单克隆抗体能够与CD6的结构域1(D1)结合并抑制T-细胞增殖，而不干扰ALCAM结合。本发明的单克隆抗体在体外没有诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和凋亡。
发明目的
本发明的主要目的是获得能够与CD6的结构域1(D1)结合并抑制T细胞增殖而不干扰ALCAM结合的单克隆抗体。
本发明的另一个主要目的是获得使用该单克隆抗体来调节炎性病症的方法。
本发明的再另一个主要目的是获得使用该单克隆抗体与免疫抑制剂相结合来调节炎性病症的方法。
本发明的再另一个主要目的是获得使用单克隆抗体与能够引发抗炎免疫应答的抗原(如胰岛素、GAD、MOG、MBP和HSP60)相结合来调节炎性病症的方法。
发明概述
因此，本发明涉及能够与CD6的结构域1(D1)结合并抑制T细胞增殖而不干扰ALCAM结合的单克隆抗体；使用该单克隆抗体来调节炎性病症的方法，该炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病；使用该单克隆抗体与免疫抑制剂相结合来调节炎性病症的方法，该炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病；使用单克隆抗体与能够引发抗炎免疫应答的抗原(如胰岛素、GAD、MOG、MBP和HSP60)相结合来调节炎性病症的方法，该炎性病症如多发性硬化或移植排斥，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病。
附图简述
图1：
图1a：源自质粒和基因组DNA的T1h的VH和Vk的核苷酸序列。
图1b：VH和Vk的氨基酸序列。
图1c：之前出版物中公开的Vk氨基酸序列与本专利中公开的序列的比较，高亮显示序列差异。
图2：在单独的T1h和ALCAM或T1h存在下，用CD6-Fc处理的平板的ELISA阅读。
图3：当MEM98(与结构域1结合的抗体(Castro AA M等，J of Immunol，178(2007)4351-4361))与T1h竞争时，存在所观察到的剂量依赖性竞争，表明两者都与相同的结构域，即结构域1结合。
图4：用T1h抗体(5ug/ml)、hR3抗体(5ug/ml)和雷帕霉素(1.2ug/ml)或没用抗体(作为对照)处理HUT 78细胞，并在CO2培养箱中在37℃下培养过夜。然后用膜联蛋白V标记溶液处理细胞，接着进行流式细胞术分析。V FITC对数在水平轴上，PI/PE得克萨斯红在垂直轴上。
图5：FITC通道的Sphero校准图。
图6：不同健康个体的T和B淋巴细胞上的CD6受体密度。T细胞显示出对CD6阳性的CD6受体比B细胞高10倍。
图7：使用B细胞单克隆抗体作为阳性对照对Daudi细胞分析了ADCC试验。用CFSE标记Daudi细胞并用或不用B细胞单克隆抗体(2.5，5&10ug/ml)培养，hR3(10ug/ml)用作非特异性对照，PBMC用作效应细胞，比例为1∶25、1∶50、1∶100。将细胞培养6小时。使用7AAD来检测细胞毒性细胞。在CYAN ADP流式细胞计中分析细胞。
图8：在2D点图中通过B细胞单克隆抗体的对Daudi细胞的ADCC试验。
图9：在2D点图中用5μg/ml T1h的对HUT78的ADCC试验。
图10：T1h在ADCC试验中的作用。用CFSE标记HUT78，并用或不用T1h抗体培养，hR3用作非特异性对照，PBMC用作效应细胞，比例为1∶1、1∶25、1∶50。将目标：效应细胞培养过夜。使用7AAD来检测细胞毒性细胞。通过流式细胞术来分析细胞。
图11：T1h在ADCC试验中的作用。用CFSE标记HUT 78并用和不用T1h抗体(5&10ug/ml)培养，hR3(10ug/ml)用作非特异性对照，PBMC用作效应细胞，比例为1∶1、1∶25、1∶50。将目标：效应细胞培养过夜。使用7AAD来检测细胞毒性细胞。通过流式细胞术来分析细胞。
图12：a，b和c，d各自表示分别为5μg/ml和10μg/ml的T1h和hR3(非特异性抗体)的两个独立试验。图表示在不同目标：效应比例下死细胞的百分比。
图13：使用Alamar蓝的CDC试验中B细胞单克隆抗体和T1h之间的细胞毒性倍数差异。
图14：CFSE的直方图，显示了未刺激的和植物凝集素(PHA-M)刺激的细胞的荧光强度。FITC对数在水平轴上，细胞数在垂直轴上。在峰上方的区域(R14)用于计数增殖事件。
图15：作为条线图的T1h对淋巴细胞的剂量依赖性限制。该图表示在不同浓度(50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml)下T1h对PHA活化淋巴细胞的抑制％。使用相同浓度的hR3(非特异性抗体)。
图16：作为独立实验的之前实验的重复。T1h对淋巴细胞的剂量依赖性抑制。该图表示在不同浓度(50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml)下T1h对PHA活化淋巴细胞的抑制％。使用相同浓度的hR3(非特异性抗体)。
图17：在基于ALAMAR蓝试验的96孔平板中，10μg/ml浓度的可溶性T1h的存在明显抑制了PHA介导的淋巴细胞增殖。
图18：用于抗CD3、抗CD3+T1h和抗CD3+ALCAM-Fc的栓系实验的平板设立。
图19：在栓系抗CD3、抗CD3+T1h和抗CD3+ALCAM-Fc的存在下，sT1h和shR3(10μg/ml)各自对淋巴细胞增殖的作用之间的比较。如实验方案中所提及的，使用了不同量的栓系抗CD3和固定浓度的T1h或ALCAM。
图20：在BLISS中之前数据的分析，其中较低的线是各自使用不同浓度的抗CD3抗体和ALCAM-Fc或抗CD6抗体获得的实验曲线。虚线是预测曲线，如果该组合是加性的。上面的线是实验获得的曲线，并且在两种情况下，都在理论预测的曲线上方，表明该组合是协同的。
图21：在不同的浓度下由IL2诱导的原初T细胞的增殖。可溶性T1h和可溶性hR3没有显示任何作用。PHA作为阳性对照加入。
图22：栓系CD3和CD3+ALCAM-Fc引起了淋巴细胞增殖，这受到可溶性T1h的抑制。IL2和可溶性T1h一起显示了在这两种情况下该抑制的部分恢复。
图23：在抗CD3和抗CD3+ALCAM栓系孔中，与对照(可溶性hR3非特异性抗体)相比较，可溶性T1h降低了IL10、INFγ、IL6和TNFα表达。所加入的外源性IL2和可溶性T1h一起显示了该抑制的部分恢复，表明可溶性T1h的抑制受到IL2下调的介导。实验显示了来自两个独立实验的数据的平均值。
图24：在可溶性T1h(sT1h)的存在下，存在表达CD4和CD25的绝对细胞计数的部分降低，在加入sT1h和外源性IL2时，其得到恢复。然而，在可能与绝对受体计数相关的平均荧光强度中，在CD4计数中存在明显的MFI降低，而在CD25计数中更为明显。可以通过加入外源性IL2(1.2ng/ml)分别将这两种降低全部或部分恢复。在栓系抗CD3以及栓系抗CD3和ALCAM-Fc孔中都观察到了这种现象。
图25：可溶性T1h对增殖的抑制没有受到增加的凋亡的介导。PI阳性细胞是坏死细胞，而膜联蛋白V FITC阳性细胞是凋亡细胞，两者都是阳性的是晚期凋亡细胞。从数据清楚地看出与对照相比较，不同组合的每一个死亡参数不存在明显的增加或减少。
图26：用T1h抗体(10ug/ml)、hR3(同种型对照)或不用抗体(作为对照)处理PBMC，并在CO2培养箱中在37℃下培养5天。在培养前，用破伤风类毒素刺激细胞。用Alamar蓝色染料测量增殖。在T1h的存在下，观察到没有增殖的抑制。
图27：在此按照之前提及的(程序II)通过免疫荧光来显示Raji细胞，是真实的B细胞并且也表达MHC II抗原。
图28：在丝裂霉素处理过的Raji细胞存在下的PBMC增殖。阳性对照表明PBMC在PHA的存在下生长。与没有抗体或hR3对照相比较，sT1h抑制T细胞增殖(t检验显著地)。每个实验是获自六个不同孔的平均值和标准偏差。
图29：异源树突细胞混合的淋巴细胞反应-平板设置。
图30：异源树突细胞混合的淋巴细胞反应。T1h显示PBMC增殖的剂量依赖性抑制。阳性对照吡美莫司(其是已知的IL2抑制剂)在所有测试的浓度下抑制。阴性对照hR3与实验对照相似。Y轴是相对荧光单位(RFU)。
图31：异源树突细胞混合的淋巴细胞反应。细胞因子水平的评价。IL6和INFγ以剂量依赖性的方式受到T1h以及吡美莫司(已知的IL2抑制剂)的抑制。
所附序列表的简述：
SEQ ID NO：1：VH序列的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：VK序列的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：VH序列的核苷酸(DNA)序列
SEQ ID NO：4：VK序列的核苷酸(DNA)序列
发明详述
本发明涉及能够与CD6的结构域1(D1)结合并抑制T细胞增殖而不干扰ALCAM结合的单克隆抗体。
在本发明的另一个实施方案中，单克隆抗体包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
在本发明的再另一个实施方案中，单克隆抗体包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体在体外不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体在体外不诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体在体外不诱导凋亡。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体抑制由栓系抗-CD3、栓系抗-CD3和抗-CD6的组合或栓系抗CD3和ALCAM的组合诱导的原初PBMC的增殖。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体特异性地抑制单向MLR，其中Raji细胞是抗原呈递细胞，并且PBMC增殖。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体特异性地抑制由PBMC介导的单向自体MLR。
在本发明的再另一个实施方案中，通过实质性地降低促炎细胞因子，抗体引起原初T细胞增殖的抑制。
在本发明的再另一个实施方案中，通过CD25和CD4计数的减少，抗体引起原初T细胞增殖的抑制。
在本发明的再另一个实施方案中，通过介导IL2的抑制，抗体抑制了T细胞增殖。
在本发明的再另一个实施方案中，随着外源性IL2的添加，抗体显示出功能的增强。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体涉及促炎细胞因子IL6和INFγ的下调。
在本发明的再另一个实施方案中，抗体没有抑制记忆-T-细胞群体。
本发明涉及使用根据在前一个或多个权利要求的单克隆抗体来调节炎性病症的方法，该炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病。
本发明涉及使用单克隆抗体与免疫抑制剂相结合来调节炎性病症的方法，该炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病。
本发明涉及使用单克隆抗体与能够引发抗炎免疫应答的抗原(如胰岛素，GAD，MOG，MBP和HSP60)相结合来调节炎性病征的方法，该炎性病症如多发性硬化或移植排斥，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括将治疗或药物学上有效量的与人CD6SRCR结构域1(D1)特异性结合并且不抑制ALCAM结合hCD6的抗-CD6结合抗体施予患者。
在本发明的再另一个实施方案中，药物学上的有效剂量为0.1-25mg/kg/周。
在本发明的再另一个实施方案中，通过与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列来表示单克隆抗体。
在本发明的再另一个实施方案中，通过与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列至少80％同源的核苷酸序列来表示单克隆抗体。
现在将详细地参考本发明目前优选的实施方案，这些实施方案与以下实施例一起，将用于解释本发明的原理。
列出以下实施例来帮助理解本发明，但目的不是并且不应当解释为以任何方式来限制本发明的范围。该实施例不包括试验程序中所用常规方法的详细描述。这样的方法是本领域技术人员公知的，并且在许多出版物中有描述，包括作为实施例来描述。
除非在此另外限定，结合本发明所用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意义。此外，除非上下文另外要求，单数项应当包括复数，并且复数项应当包括单数。
在描述和主张本发明中，将根据在此列出的定义来使用以下的术语。
“抗-CD6抗体”是与人CD6(hCD6)的SRCR结构域1(D1)特异性结合的抗体。在本发明的优选方面中，提供了与人CD6的SRCR结构域1特异性结合并且不干扰激活淋巴细胞粘附分子(ALCAM)结合CD6的抗体和其他免疫球蛋白，包括原初的和人工修饰的抗体和抗体片段。
本发明的T1h单克隆抗体还包括含有如下重链和/或轻链的抗体，该重链和/或轻链具有通过缺失、置换或添加一个或几个氨基酸源自构成抗体的重链或轻链的氨基酸序列的氨基酸序列。可以通过部分地改变编码氨基酸序列的核苷酸序列将上述部分氨基酸改变(缺失、取代、***或添加)给予本发明的抗体的氨基酸序列。可以通过标准方法使用已知形式的定点突变来给予这种核苷酸序列的部分改变(Proc Natl Acad Sci U.S.A.，1984 Vol 81：5662)。
本发明的一个优选实施方案表示了与CD6的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域1(D1)特异性结合的单克隆抗体，其包含如下的重链和轻链可变区，该重链和轻链可变区包含与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
本发明的另一个优选实施方案表示了与CD6的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域1(D1)特异性结合的单克隆抗体，其包含如下的重链和轻链可变区，该重链和轻链可变区包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列或其补体；和(b)包含SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列或其补体的核酸分子。
根据一个实施方案，本发明的与CD6的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域1(D1)特异性结合的抗-CD6抗体变体T1h在对应于SEQ ID NO：1&2所示氨基酸残基的位置具有至少约65％氨基酸序列同一性或同源性，至少约70％氨基酸序列同一性或同源性，至少约75％氨基酸序列同一性或同源性，至少约80％氨基酸序列同一性或同源性，至少约80％氨基酸序列同一性或同源性，至少约85％氨基酸序列同一性或同源性，至少约90％氨基酸序列同一性或同源性，至少约95％氨基酸序列同一性或同源性，至少约98％氨基酸序列同一性或同源性或至少约99％氨基酸序列同一性或同源性。
本发明的抗体在体外不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本发明的抗体在体外不诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本发明的抗体在体外不诱导凋亡。
在另一个方面中，本发明进一步提供用于不同疾病(包括自体免疫失调)的预防剂、治疗剂或诊断剂，其含有本发明的主题抗体或其功能性片段作为活性成分。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)指的是由巨噬细胞、NK细胞、嗜中性细胞等的激活而诱导的一种细胞毒性，通过抗体恒定区结合这些细胞表面上表达的Fc受体而得到识别。相反，补体依赖性细胞毒性(CDC)指的是由补体***的激活而诱导的一种细胞毒性，通过抗体与抗原的结合而产生。已知这些活性的强度根据抗体亚类而不同。还已知这样的差异是由于抗体恒定区之间的结构差异引起的(Charles A.Janeway等，Immunobiology，1997，Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.)。
在本发明的其他实施方案中，公开了T1h的重链和轻链的可变区的核苷酸和氨基酸序列。这确定了T1h核苷酸和氨基酸序列如用于制造T1h的细胞系所表达的。
提供了筛选方法用于鉴定与hCD6特异性结合的其他结合剂。这些方法需要接触与人CD6SRCR结构域1(D1)特异性结合并且不抑制ALCAM结合hCD6的参照抗-hCD6单克隆抗体。
将不同浓度的ALCAM-Fc与固定浓度的T1h在CD6-Fc覆盖的ELISA平板中一起培养时，在所有ALCAM-Fc浓度下检测到T1h。该实验表明T1h与来自ALCAM结合结构域的不同结构域(D 3)结合。
将MEM98(与结构域1结合的抗体[Castro AA M等，J of Immunol，178(2007)4351-4361])与T1h竞争时，观察到存在剂量依赖性竞争，表明两者都与相同的结构域，即结构域1结合。
在本发明的其他方面中，提供了用于调节炎性病症的方法，该炎性病症如多发性硬化、移植排斥、移植物抗宿主疾病(GvHD)和1-型糖尿病。T1h单克隆抗体能够抑制原初T细胞增殖，如在混合淋巴细胞反应、PHA介导的PBMC增殖试验以及最终在栓系抗CD3抗体和抗CD3抗体+ALCAM-Fc存在下的PBMC增殖中所观察到的。其减少了促炎细胞因子并降低了细胞上IL2受体(CD25)和CD4的表达。
1型糖尿病是胰岛素依赖性的并且认为是由T细胞介导的自体免疫疾病。这表明了T1h抗体具有通过干扰自体反应性T细胞的增殖来防止胰岛β细胞耗尽的功能。如果这些细胞的团块是完整的，那么将导致对胰岛素降低的依赖。因此，与T1h抗体的作用特征一致是可能的，其通过结合胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)和热休克蛋白60(HSP60)来促进抗炎应答，因此在1型糖尿病中是有效的。通过延伸相同的逻辑，假定分子与胰高血糖素样肽-1(GLP1)或其相关模拟物Exendin-4可以以附加乃至协同的方式来更有效地工作是合理的。GLP-1和Exendin-4通过抑制这些细胞的凋亡和促进这些细胞的再生增强了葡萄糖介导的胰岛素释放、降低了胰高血糖素的水平和增加了β细胞。
T1h结合髓磷脂碱性蛋白(MBP)或髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)在多发性硬化中是有效的。
此外，T1h结合起着抗炎和免疫抑制作用的其他小分子(如西罗莫司，他克莫司和霉酚酸酯)在自体免疫失调、移植排斥和GvHD中可以具有特定的治疗益处。
这些方法包括将治疗或药物学上有效量的与人CD6SRCR结构域1(D1)特异性结合并且不抑制ALCAM结合hCD6的抗-CD6结合剂给药于患者。用于这些方法中的优选抗-CD6结合剂是单克隆抗体，包括人源化的和人单克隆抗体，以及修饰的免疫球蛋白，如抗体片段和原初抗体的突变形式，这些抗体与对应的原初抗体具有实质性的氨基酸序列同一性，并且基本上享有与其相同的结合特异性。
在本发明的其他方面中，提供了诊断组合物和方法，用于在体外和体内试验中检测CD6、CD6+细胞和/或CD6-介导的活性，例如，与T细胞激活相关的CD6活性。这些方法同样使用与人CD6SRCR结构域1(D1)特异性结合并且不抑制ALCAM结合hCD6的抗-CD6结合剂。
可以使用各种方法来筛选本发明主题抗体的各种功能性特征，这些方法包括但不限于，用于体外试验、体内和基于细胞的试验中的那些以及选择技术。可以同时或单独筛选多种特性。蛋白质可以是纯化或是未纯化的，这取决于试验的需求。在一个实施方案中，筛选是针对抗-CD6抗体与已知的或被认为结合抗-CD6抗体的蛋白质分子的结合的定性或定量结合试验。这样的试验通常涉及监控细胞与抗-CD6抗体的应答，例如，细胞存活、细胞死亡、细胞的吞噬作用、细胞裂解、细胞形态的改变或转录激活，如原初基因或报告基因的细胞表达。例如，这样的试验可以测量抗-CD6抗体引发ADCC或CDC的能力。对于一些试验，除了靶细胞以外，需要加入其他细胞或成分，例如，血清补体或效应细胞，如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。
本领域技术人员可以容易地确定最佳的剂量和剂量给药方案，并且这将随着特定药剂的药物动力学特征、给药时间和方式、制剂强度和病症发展情况(包括疾病症状的性质和程度)而改变。此外，与待治疗的特定患者相关的因素，包括患者的性别、年龄、体重、膳食、身体活动和并发症，将导致调节剂量和/或给药方案的需要。药物学上有效的剂量为0.1-25mg/kg/周。
可以在细胞、组织和整个生物体实验中表征本发明的抗-CD6抗体的生物特性。如本领域已知的，通常在动物(包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子)中测试药物，以测量药物治疗疾病或疾病模型的功效，或测量药物的药物动力学、毒性和其他特性。
本发明之前的描述说明和描述了本发明。此外，公开内容显示和描述了本发明的代表性优选实施方案，但如上所述，应当理解本发明能够在各种其他组合、改变和环境中使用，并且能够在在此所表达的本发明构思的范围内进行改变和改进，与以上的教导和/或相关领域的技术或知识相称。以下所述的实施方案进一步用来解释实施本发明的最佳已知方式并且使得本领域的其他技术人员能够以这样的或其他实施方案利用本发明，并且根据本发明的特定应用或使用的需要进行各种改变。因此，该描述不是打算用来将本发明限制到在此所公开的形式。此外，所附权利要求旨在解释为包括备选的实施方案。
1.T1h的核苷酸(基因组和质粒)和氨基酸序列
使用基因组和质粒DNA作为模板的多重PCR反应用于测定T1h的核苷酸序列。从表达T1h的NSO细胞制备基因组DNA。使用ESI-TOF和MALDI-TOF测定氨基酸序列。使用不同酶(包括胰蛋白酶、Lys-C和Glu-C)的肽图谱用于产生最终的氨基酸序列。图1中公开的序列与US571220及其同族EP 0699755、US6572857及其同族EP0807125中已经公开的T1h序列略有不同。已经确定了本专利中公开的序列对其目标CD6具有完全的功能活性，如以下提及的各种实施例中所述的。
2.T1h与CD6受体的结构域1(D1)结合
ELISA实验清楚地显示了不同浓度的ALCAM的存在没有阻止T1h结合CD6-Fc。ALCAM与T1h之间不存在竞争表明对于两者的结合结构域是不同的。
将MEM98(与结构域1(D1)结合的抗体[Castro AA M等，J of Immunol，178(2007)4351-4361])与T1h竞争时，观察到存在剂量依赖性竞争，表明两者都与相同的结构域，即结构域1结合。
3.T1h没有诱导HUT 78细胞凋亡
凋亡的特点之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜内部迁移至外部[JBiol Chem 1990.265：4923-4928]。通过使用用于区分凋亡和坏死细胞的膜联蛋白-V-荧光素和碘化丙啶(PI)来进行凋亡细胞膜外部小叶上的磷脂酰丝氨酸的分析。膜联蛋白V是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸具有高亲和性[J Immunol Methods 1995.184：39-51]。尽管PI结合不同的坏死细胞，膜联蛋白-V-荧光素结合凋亡的细胞。这种方法帮助区分凋亡的和坏死的细胞群体。早期凋亡群仅是膜联蛋白V阳性的，而后期凋亡是膜联蛋白V和PI阳性的。
在该实验中，我们观察到T1h在HUT78细胞中具有有限的凋亡潜能，HUT78细胞是表达CD6的T淋巴瘤细胞系。用T1h处理HUT78细胞，显示出40％的凋亡，这差不多等于膜联蛋白V FITC通道中的未处理对照。未处理和非特异性同种型对照，hR3(与EGFR结合的单克隆抗体)处理的细胞各自显示出35.3％和36.5％的凋亡，而阳性对照雷帕霉素显示出54.3％的凋亡。该数据表明T1h没有在HUT78细胞系中介导凋亡。
4.CD6阳性的T和B细胞，在CD6受体的表达中显示出差异
胸腺细胞、成熟的T细胞、称为B-1亚型的B细胞亚群和一些大脑细胞表达CD6[J Exp Med 1991.174：949-952；J Immunol 1997.158：1149-1156]。该实验的目的是定量各自在T和B细胞中的受体密度和CD6表达。
该实验表明与B细胞相比，T细胞上的CD6受体密度高10倍。该方法没有主张定量绝对受体密度，因为没有使用抗体的饱和量。然而，T和B细胞中表达模式的倍数差异是明确可区分的。
5.T1h诱导温和的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)
抗体结合目标或受感染细胞时，抗体的Fc部分结合存在于细胞(特别时原初杀伤(NK)细胞)表面上的Fc受体。然后，这引起这些细胞的激活。这些激活的细胞释放细胞因子和细胞毒素颗粒，并通过引发凋亡来促进细胞死亡。将这称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在本发明中，用细胞追踪染料CFSE(羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯)标记靶细胞群体(HUT 78/Daudi)。基于荧光素的染料CFSE具有使其特别适用于活细胞标记的生化特性[J Immunol Methods 2000.243：147-154]。CFSE由含有两个醋酸酯部分的荧光素分子和琥珀酰亚胺酯官能团组成。以这种形式，它是膜渗透性的，并且没有荧光。扩散至胞内环境中后，内源性酯酶除去醋酸酯基团，产生高度荧光的分子，并且对细胞膜是非渗透性的[J Immunol Methods 2000.243：147-154]。在抗体T1h的存在或不存在下，培养靶细胞，HUT78细胞。以不同比例(目标：效应：1∶1、1∶25、1∶50、1∶100)加入效应细胞(通过Ficoll paque方法收集的PBMC)，并在37℃下培养最佳的时间。使用7AAD来测量细胞死亡。7氨基放线菌素D(7AAD)进入死细胞中，并结合DNA。集合CFSE标记的细胞，用来评价靶细胞的抗体介导的细胞毒性。Daudi细胞用来证明该试验是否合格，使用公知的具有有效ADCC活性的B细胞单克隆抗体。B细胞单克隆抗体在6小时内显示出超过50％的细胞毒性。在相似的条件下，四个独立实验表明T1h在HUT78细胞中诱导了温和的ADCC，在效应细胞存在下过夜培养。
6.T1h没有介导补体依赖性细胞毒性(CDC)
使用基于Alamar蓝(刃青天)的试验来测量抗体促进细胞杀灭的能方。通过抗体与细胞表面抗原的结合来诱导这，由此固定和激活导致靶细胞裂解的补体。刃青天是氧化还原-活性染料，其得到还原时，颜色从蓝色变成粉色。最近的数据表明刃青天进入细胞的细胞质中，它在其中还原成荧光素产品，然后再次分泌返回至培养基中[Eur J Biochem 2000.267：5421-5426]。
来自这些试验的结果决定性地证明了抗体在表达CD6的细胞系中(即HUT78)没有诱导CDC。
7.T1h抑制PHA介导的淋巴细胞增殖
植物血球凝集素(PHA-M)用于刺激淋巴细胞培养物中的细胞***。PHA，来自红芸豆(Phaseolus vulgaris)的凝集素提取物，含有有效的、细胞凝聚和促有丝***的活性[Proc Natl Acad Sci USA 1982.79：1611-1615]。PHA含有五个异凝集素家族(L4E0、L3E1、L2E2、L1E3、L0E4)，各自通过非共价力把四聚物结合在一起。亚基是两个不同类型的，称为淋巴细胞反应性(L)和红血球反应性(E)。L对淋巴细胞表面受体具有高亲和性，但对红细胞的那些亲和性很低，并且负责异凝集素的促有丝***特性。E负责红血球凝集特性。PHA-P是蛋白质形式，而PHA-M是这些异凝集素的粘蛋白形式[J Biol Chem 1977.252：9018-9023]。
用细胞追踪染料CFSE(羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯)标记PBMC。然后用或不用不同浓度的抗体来培养细胞。通过植物血球凝集素(PHA)来刺激细胞，以在37℃下增殖三天。随着细胞增殖，CFSE相等地分布至子细胞中，每次连续传代将具有一半的细胞荧光强度[J Immunol Methods 1994.171：131-137]。认为增殖抑制的百分比是抗体的作用。通过以下公式来估算增殖抑制的％：[{PHA-(T1h+PHA)}/PHA]*100，其中，PHA是由PHA诱发的增殖，T1h+PHA是在T1h和PHA存在下诱导的增殖。
这些数据表明T1h以剂量依赖性方式介导了PHA刺激的淋巴细胞的增殖抑制。由于正常个体之间的固有差异，抑制百分比在个体间可能是不同的。然而，总体而言，使用T1h观察到PHA刺激的淋巴细胞的剂量依赖性抑制，但使用非特异性IgG1同种型抗体hR3未观察到。
8.即使在基于96孔平板的Alamar蓝试验中T1h也能抑制PHA介导的淋巴细胞增殖
将之前的实验改变成基于高通量平板的试验，其中在用或不用T1h或非特异性IgG1同种型抗体hR3的96孔培养皿中培养新鲜收集的PBMC。随后，加入PHA来刺激淋巴细胞增殖三天。通过使用Alamar蓝来测量增殖。通过T检验进行显著性测试。
该试验重申了如下事实：在可溶性T1h的存在下，PHA介导的淋巴细胞增殖得到了明显抑制，但在非特异性IgG1同种型抗体hR3存在下没有得到抑制。这与之前的试验一起表明了T1h在抑制原初T细胞增殖中的作用。
9.T1h降低由栓系抗CD3、抗CD3+T1h和抗CD3+ALCAM Fc诱导的淋巴细胞增殖
已知通过T细胞受体(TCR)和共刺激受体的刺激引发了T细胞分化从静息(静止)状态转换成激活状态，激活状态的特征在于快速生长和增殖并且获得效应物功能[Immunity 2007.27：173-178]。人CD6受体是在未成熟胸腺细胞、成熟T和称为B1a亚群的B淋巴细胞亚群、慢性B细胞淋巴细胞性白血病和大脑的各种区域上表达的105-130kDa的1型糖蛋白[J Immunol 2006.177：1152-1159]。CD6是基于家族特征性的三个100至110aa长的富含半胱氨酸结构域的胞外区域的存在的蛋白质受体的清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)超家族的B组成员[J Exp Med 1991.174：949-952]。可获得的证据表明CD6是涉及淋巴细胞激活和分化过程的辅助分子[J Immunol 2006.177：1152-1159]。在胸腺细胞和静止的成熟T细胞上，CD6与TCR/CD3复合物[J Immunol 2004.173：2262-2270]和CD5(SRCR超家族的一个亲密成员)[J Biol Chem 2003.278：8564-8571]部分相关。此外，CD6在成熟免疫突触(IS)的中心部分累积，它在那与TCR/CD3和CD5共同定位。还已经表明CD6在早期T细胞-APC接触中影响IS成熟，以及T细胞增殖性应答[J Immunol 2006.177：1152-1159，Eur J Immunol 2004.34：930-940]。
非常确定的是导致细胞增殖的最佳T细胞激活需要至少两个刺激信号。一个涉及TCR-CD3复合物，其识别与抗原呈递细胞(APC)上的I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽片段，第二个信号不是抗原特异性的，已经称为共刺激或辅助信号，因为尽管是必需的，但其没有通过自身引起T细胞增殖[Immunology 1998.93：358-365]。已经鉴定了几个潜在的共刺激信号受体及其配体，并且这些包括CD4与II类MHC、CD8与I类MHC、CD2与淋巴细胞功能相关的抗原-3、CD5与CD72、CD28与B7-1/B7-2以及CD6与CD6配体(D166或ALCAM)之间的相互作用[Immunology 1998.93：358-365；Curr OPin Immunol 1995.7：389-395]。
之前存在关于用或不用抗共刺激分子抗体的栓系抗CD3抗体导致淋巴细胞增殖作用的文献。在CD3刺激时，单独或通过与CD2或CD4的共同交联，CD6在两个最C-端的酪氨酸残基(Y629和Y662)上暂时变成磷酸化的[J Exp Med 1993.177：219-223]。因此，已经表明CD6-介导的对T细胞增殖的作用涉及酪氨酸激酶活性，这依赖于PKC激活[Cell Immunol 1995.166：44-52]。尽管CD6的信号途径与CD28(另一种共刺激分子)的相比没有得到很好的表征，但这两种细胞表面抗原的作用之间存在一些相似性。例如，通过TCR复合体与信号协同作用的两个受体任一的连接促进T-细胞增殖[J Immunol 1989.143：2439-2447]。它们还能够在组织血纤维蛋白溶酶原激活子(TPA)的存在下引发T-细胞增殖，导致IL-2受体(IL-2R)和IL-2mRNA的上调[Cell Immunol 1995.166：44-52，Proc Natl Acad Sci USA 1989.86：1333-1337]。还显示了栓系抗CD6和抗CD28抗体引起了与抗CD3抗体刺激无关的静止淋巴细胞的增殖[Immunology 1998.93：358-365]。
在本发明中，我们显示了T1h抗体抑制由栓系抗CD3、抗CD3+T1h和抗CD3+ALCAM Fc介导的T细胞增殖。事实上，我们观察到抗CD3+T1h和抗CD3+ALCAM的结合实际上是超过单独的CD3的协同作用，如在数据的Bliss分析中所观察到的。我们进一步显示了外源IL2(1.25ng/ml)的加入导致可溶性T1h介导的T细胞增殖抑制部分恢复。通过细胞因子分析，我们显示了T1h主要抑制IFNγ、IL10和TNF，并且IL2的外源添加诱导了这些促炎细胞因子的部分恢复。增殖淋巴细胞中CD25和CD4的受体密度的估算表明可溶性T1h导致新两种标记的下调，而外源IL2部分地恢复了这些标记表达。将该数据联系在一起，表明了T1h通过抑制促炎细胞因子(如IFNγ)和IL2受体表达的降低来抑制T细胞增殖。因为外源IL2的加入显示了部分“功能获得”，我们的结果看来表明了T1h可以抑制由栓系抗CD3、抗CD3+栓系T1h和抗CD3+栓系ALCAM Fc介导的IL2合成。
9a.原初PBMC(外周血单核细胞)中IL2的滴定
IL2是T细胞激活必需和充分的细胞因子。它通过上调的IL2受体发出信号。它在T细胞发育、T细胞免疫记忆和T调控细胞的发育中具有关键作用[J Immunol 1995.155：1151-1164]。从该实验看，在进一步的实验中使用了1.25ng/ml的IL2最佳浓度。
9b.T1h导致促炎细胞因子、CD4和CD25受体表达的降低，而不诱导凋亡，但在外源IL2的存在下部分地除去了这种抑制
流式细胞术是可以基于大小和颜色可以区分不同颗粒的分析工具。BDTMCBA使用一系列具有离散荧光强度的颗粒来同时检测多种可溶性分析物。将BDATMCBA结合流式细胞术来形成强有力的复合试验。使用BDA CBA人Th1/Th2细胞因子II来定量测量单个样品中的白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-10、TNF和干扰素γ水平[J Immunol Methods 2001.254：109-118]。
用IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ蛋白特异性的捕获抗体覆盖具有不同荧光强度的六个珠粒制剂。将六个珠粒制剂混合在一起，形成BDTMCBA，将其分解在DAKO Cyan ADP条带流式细胞计数器的FL3通道中。将细胞因子捕获珠粒与PE-缀合的检测抗体混合在一起，然后用重组标准品或测试样品培养，以形成夹层复合物。使用流式细胞计数器获得样品数据后，以图表形式产生样品结果。
从这些试验可以清楚T1h导致原初T细胞增殖的抑制，并且通过促炎细胞因子的实质性降低以及CD25和CD4数量的减少介导了这。外源IL2的添加能够恢复抑制以及提高促炎细胞因子的表达，并且还提高了CD4和CD25的绝对受体数量。这些结果表明了由T1h引起的T细胞增殖抑制是通过抑制IL2和引起“功能获得”的外源IL2的添加介导的。我们还观察到通过诱导凋亡没有介导T细胞增殖的降低。
10.T1h没有抑制记忆T细胞增殖
识别抗原呈递细胞上的外源抗原后，T细胞增殖并且引起免疫应答。这些T细胞中的一些转化成记忆T细胞，其在***中循环，并且用相同的抗原再次激发时，这些细胞增殖并引起免疫应答。大部分人对破伤风类毒素进行了免疫，并且用相同的抗原激发来自这些人的T细胞时，群体中的记忆T细胞增殖。该实验结果表明破伤风类毒素以剂量依赖性的方式刺激了T细胞的增殖，但是sT1h没有显示出这些细胞增殖的任何抑制。这强烈地表明了T1h没有抑制记忆T细胞增殖。这对于T1h疗法是有利的，因为循环记忆T细胞增殖没有受到影响，并且进行T1h疗法的患者不会变得易受感染。
11.T1h在PBMC和Raji细胞介导的混合淋巴细胞反应中抑制T细胞增殖
将来自遗传上全异个体的淋巴样细胞的混合物在体外培养时，它们经历了特征性的应答，将其称为混合淋巴细胞反应(MLR)[Proc Natl Acad Sci USA 1973.70：2707-2710]。通过早期增殖阶段接着效应淋巴细胞的出现来代表这种反应，效应淋巴细胞对带有用于刺激最初反应的抗原的靶细胞呈现出特异性细胞毒性。
同种异体T淋巴细胞的两个群在MLR中都增殖，除非通过用丝裂霉素C或致死的X-照射使得一个群成为无反应的。在称为单向MLR的后一种***中，无反应的群提供了刺激细胞，该刺激细胞表达刺激细胞的同种异体抗原。在单向MLR受体中，TH细胞识别刺激细胞上的同种异体II类MHC分子，并应答这些差异而增殖。从含有抗CD4加补体的应答群种除去CD4+TH细胞消除了MLR，并且阻止了CTL的产生。辅助细胞(如巨噬细胞)也已经显示出对MLR是重要的。现在认识到巨噬细胞的作用是激活II类-MHC限制的TH细胞，在MLR中测量了其的增殖。
在本发明中，使用用丝裂霉素处理过的Raji细胞来进行单向MLR，因此它们是抗原呈递细胞，同时在PBMC上测量增殖。之前的文献表明Raji细胞表达ALCAM[J Immunol 2004.173：2262-2270]。
从该实验可以推断出T1h特异性地抑制单向MLR，其中Raji细胞是抗原呈递细胞，而PBMC增殖。
12.T1h在由PBMC和成熟树突细胞介导的混合淋巴细胞反应中抑制T细胞增殖
在同种异体(抗原呈递细胞取自一个个体，PBMC取自另一个个体)混合淋巴细胞反应中，其中成熟树突细胞(抗原呈递细胞)引起原初PBMC的增殖，T1h以剂量依赖性的方式抑制这种增殖。数据表明作用方式涉及至少两种主要的促炎细胞因子(即，IL6和IFNγ)的下调。
材料和方法
细胞系和细胞培养物：
将HUT 78(来自ATCC的T细胞淋巴瘤人细胞系)用作靶细胞。在补充的Iscove’s DMEM中培养细胞，该培养基含有2mg/ml NaHCO3、20mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺和20％FBS(Invitrogen)。
Daudi细胞(B细胞淋巴瘤，ATCC)，将细胞在RPMI 1640中培养；该培养基含有2mg/ml NaHCO3、20mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺和10％FBS(Invitrogen)。
WIL2S细胞(B细胞淋巴瘤)：将细胞在DMEM中培养；该培养基含有2mg/ml NaHCO3、20mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺和10％FBS(Invitrogen)。
将PBMC(外周血单核细胞)用作效应细胞：通过Ficoll-Paque(Amersham目录号：17-14403-03)介导的密度离心来分离PBMC。白细胞层获自健康捐献者，并且通常是新鲜收集的。将细胞在RPMI 1640(Invitrogen)中培养，该培养基含有2mg/ml NaHCO3、20mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺和5％FBS(Invitrogen)。
抗体：
在体外使用以下的抗-CD6MAb：B细胞单克隆抗体(Genentech)、hR3抗体(CIM，Havana，古巴)。
1XPBS(Invitrogen目录号：10010)。覆盖缓冲液(NaHCO3-8.4g、Na2CO3-3.56g，在1000ml水中，pH9.5)。
PBS/吐温(1000ml PBS中0.5ml吐温-20，SIGMA)
阻断溶液(PBS中1％BSA)
RPMI 1640(目录号：11875Invitrogen)
Iscove’s DMEM(Invitrogen目录号：12200-036)
Alamar蓝(Invitrogen DAL-1100)
Biotek平板阅读器(SynergyTM HT)
集合的人血清
在EDTA vacutainers(BD vacutainers目录号：368457)中收集的来自健康个体的外周血
补充1％FBS(胎牛血清)的Iscove’s DMEM培养基(Invitrogen)
凋亡试剂盒-目录号1988549(Roche)
流式细胞计数器：Dako Cyan ADP
Ficoll-Paque(Amersham目录号：17-14403-03)，RPMI 1640目录号：11875(Invitrogen)
FBS.(胎牛血清)Gibco目录号：10082-147
抗CD6-PE、抗CD6-FITC、抗D19-PECy5、抗CD3-FITC和抗CD4-Alexa AbD Serotec，UK
SPHEROTM Rainbow校准颗粒(目录号：RCP-30-5A)
CFSE(Sigma目录号：21888)，7AAD(Invitrogen目录号：V 35124)
RPMI 1640(Invitrogen)，其含有2mg/ml NaHCO3、20mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺和5％FBS(Invitrogen)。
96孔Fluotrac 600平板-目录号655077(Greiner Bio)
作为说明而非限制，提供了以下实施例。
实施例1a
通过ELISA，T1h和ALCAM不与相同的结构域结合
在覆盖缓冲液中稀释rhCD6FC/嵌合体(R&D systems)(100μg/ml)，并将100μl加入到96孔Nunc-Maxisorp平板的每个孔中。然后将平板在4℃下培养过夜。用PBS吐温20将平板洗涤三次。随后，加200μl阻断溶液(1XPBS中2％BSA+0.1％吐温20)并在37℃下培养1小时。培养后，再次用PBS吐温将平板洗涤三次，接着加入不同浓度的T1h单克隆抗体(0.2mg/ml)和rhALCAMFc(R&D systems)。然后将这在37℃下培养一小时。随后用PBS吐温将平板洗涤3次。向孔中，加入200μl稀释于阻断缓冲液中的抗人IgG(Fab)2ALP(1∶20000)，并在37℃下培养一小时。用PBS吐温将平板洗涤三次，将200μl对硝基苯基磷酸盐(PNPP)底物加入到每个孔中，并在37℃下培养，直至颜色产生约15分钟。使用BIOTEK Micro平板读数器在405nm下进行阅读。实验表明不同浓度的ALCAM的存在没有阻止T1h与CD6受体结合。ALCAM与T1h之间的竞争的不存在表明对于两者的结合结构域是不同的(图2)。
实施例1b
T1h与CD6的结构域1(D1)结合
当MEM98(与结构域1结合的抗体)(Castro AA M等，J of Immunol，178(2007)4351-4361)与T1h竞争时，观察到剂量依赖性竞争，表明两者都与相同的结构域，即结构域1结合(图3)。
实施例2
T1h在HUT78细胞中不诱导凋亡
收集细胞，并将1.5ml的3.3×105细胞/ml(终细胞：5×105细胞)接种于每个35mm培养皿中。将所需含量的抗体加入各个培养皿中，以制得(5μg/ml)的终浓度。在对照培养皿中，没有加入抗体。作为阳性对照，用1.2μg/ml浓度的雷帕霉素培养细胞。将细胞在5％CO2培养箱中在37℃下培养过夜。然后将细胞转移至FACS试管BD Falcon目录号：352054，并且在室温下(RT)在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，并重悬浮于2ml的PBS中，在RT下在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，加入100μl膜联蛋白-V-荧光素标记溶液，并在RT下培养10-15分钟。用2ml PBS将细胞洗涤并在1200RPM下离心5分钟。然后丢弃上清液。将细胞重悬浮于0.5ml PBS中，并通过流式细胞计数器获取(集合了3000个细胞)，使用488nm激发。对于膜联蛋白V，在FITC通道中阅读样品，对于PI，在PE Texas红通道中阅读。运行雷帕霉素处理臂中的膜联蛋白V单独和PI单独的样品，使得能够补偿。
用T1h处理的HUT 78细胞显示出40％的凋亡，其几乎等于膜联蛋白V FITC通道中未处理的对照。未处理的和非特异性抗体(hR3抗体)处理的细胞各自显示出35.3％和36.5％的凋亡，而阳性细胞雷帕霉素显示出54.3％的凋亡。该数据表明T1h在HUT 78细胞中没有介导凋亡(图4)。
实施例3
来自正常个体的T和B淋巴细胞上的CD6受体的表达差异
通过Ficoll-Paque(Amersham目录号：17-14403-03)介导的密度离心来分离PBMC。白细胞层获自健康捐献者并且通常是新鲜收集的。然后将PBMC在PBS中洗涤。然后将PBMC以1.5x106细胞/ml的细胞密度重悬浮于5ml的1XPBS中，并将100ul加入到每个falcon试管中。将10μL缀合抗体(1∶10稀释度)加入到各自的试管中并涡旋，然后在4℃下培养30分钟。培养后，将2ml的1XPBS加入到每个试管中，然后在RT下在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，将细胞重悬浮于0.5mL 1XPBS中，以在流式细胞计数器中获取细胞。为了FSC和SSC中所需的群(3000个细胞)，将细胞(淋巴细胞)集合。和以上的试管一起，在相同的电压设定下，还获取了SPHEROTM(目录号：RCP-30-5A)Rainbow校准颗粒。记录了每个峰的荧光平均通道数(即，相对亮度)。使用以下公式将平均通道数转化成相对通道数：
i.相对通道#＝(R/4)log(平均通道#x10)
ii.其中R＝分辨率(即，256)
在Excel表上使用对每个峰指定的MEF值与相对通道数进行作图，以获得如图5中所示的校准图。获得T和B细胞上的CD6抗体的RCN，将其在Sphero校准图上作图，以定量各种淋巴细胞亚群的单个细胞上的CD6受体密度。
源自该图的用于计算淋巴细胞上的受体数目的公式为：
a.FITC通道：y＝134.95e 0.0366x
b.PE通道：y＝23.6e 0.03736x
与B细胞相比，T细胞上的CD6受体密度高10倍。发现T和B细胞表达模式的差异是可区分的(图6)。
实施例4
T1h导致温和的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)
收集靶细胞系(HUT 78/Daudi)，并在PBS中洗涤两次。将细胞(2x105)重悬浮于1ml 0.25μM浓度的CFSE中(每种细胞类型需要CFSE的滴定，以挑选不会泄漏至PE Cy5通道中的CFSE浓度)。将细胞在37℃下精确地培养10分钟。加入2ml RPMI，5％FBS，以停止反应。用2ml RPMI 5％FBS将细胞洗涤两次，以除去CFSE。然后将靶细胞群体以1x105细胞/ml的细胞密度重悬浮于RPMI培养基中，然后将100ul(104个细胞)加入到每个falcon试管中。将50ul抗体(5ug/ml，10ug/ml)加入各自的试管中，并在RT下培养30分钟。然后以1∶1、1∶25、1∶50和1∶100的T/E比例将PBMC(效应细胞)加入到各自的试管中。用培养基使每个试管中的最终体积为250ul。将每个试管在1200rpm下离心2分钟，以促进细胞与细胞间的相互作用，并在37℃下培养，使得产生ADCC。用B细胞单克隆抗体将Daudi细胞培养6小时，作为阳性对照与样品一起运行。然后用1XPBS洗涤细胞。加入100ul7AAD(6.25ug/ml)，并在4℃下培养15分钟。用1XPBS洗涤细胞，在4℃下在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，并将细胞悬浮于500ul的1XPBS中。在约200事件/秒下获取细胞，并在流式细胞计数器的FITC和PE Cy5通道中观察。CFSE阳性细胞在对数级别的第二和第三十进位之间发出荧光，没有溅入PE Cy5通道中。在该群体中总共集合了3000个FITC阳性细胞，评价了显示出7AAD细胞(PE Cy5阳性)的百分比(图7和图8)。除了非特异性抗体对照外，该试验中还包括单独的效应/靶细胞，比例为1∶1、1∶25、1∶50和1∶100。凋亡的％采用FITC/PEcy5点图分散中右上象限的细胞％(图9)。
实施例5
T1h对HUT78产生的ADCC
基于实施例4，以相同的试验程序进行ADCC试验，以检测T1h对HUT 78的作用。将细胞培养4小时至过夜。使用过夜培养获得最佳的和一致的结果。
来自四个不同的单独实验的体外结果表明在效应细胞存在下过夜培养，T1h在HUT78细胞中诱导了温和的ADCC(图10、11和12)。
实施例6
T1h不介导补体依赖性细胞毒性(CDC)
将来自全血的集合人血清(最小三)收集于无菌试管中，并使血液在室温下凝固至少4小时，在900g下离心20分钟。收集血清，等分并储存在-80℃下。将靶细胞(Wil-2S/HUT-78)在稀释缓冲液中洗涤，并重悬浮至2x105细胞/mL。将抗体以4x最终所需的浓度稀释于稀释缓冲液中。以4x所需的终浓度来稀释补体(即，对于1∶10的终浓度，1∶2.5稀释)。将50μL稀释的抗体、稀释的补体和50μL细胞悬浮液(10,000细胞/孔)加入到96-孔平底平板的每个孔中。包括以下的对照孔：靶细胞+Ab单独(自发的细胞死亡)、靶细胞+血清单独(背景裂解)和靶细胞+10％SDS(用于最大细胞死亡)。阳性对照是用不同浓度的B细胞单克隆抗体处理的Wil-2S细胞。将96-孔平板在37℃下培养2小时。将50uL/孔的Alamar蓝加入到每个孔中，并将平板在37℃下培养过夜。在分光光度计Biotek SynergyTM HT上测量荧光，使用530nm激发，590nm发射和灵敏度＝35。结果表明与Rituxan相比，T1h没有诱导CDC(图13)。
实施例7
T1h抑制PHA介导的淋巴细胞增殖
细胞系和细胞培养物：
在同意后，按照标准放血程序从正常个体采取全血。通过Ficoll-Paque(Amersham目录号：17-14403-03)介导的密度离心来分离PBMC。白细胞层获自健康捐献者，并且通常是新鲜收集的。将细胞在RPMI 1640(Invitrogen)中培养，该培养基含有2mg/ml NaHCO3，20mM Hepes，2mM L-谷氨酰胺和10％FBS(Invitrogen)。
通过流式细胞计数器使用CFSE的淋巴细胞增殖抑制
收集PBMC并在PBS中洗涤。将细胞(7.5x106)重悬浮于1ml 2μM CFSE浓度的PBS中。将细胞在37℃下精确培养10分钟。加入10ml的RPMI，10％FBS来停止反应。用10ml PBS将细胞洗涤两次。然后将细胞制剂以1.5x106细胞/ml的密度重悬浮于5ml的PBS中，并将200ul加入到每个BD FACS试管中。加入200ul所需的并且是不同浓度的(各自为50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml和6.25ug/ml)非特异性抗体并在37℃下培养30分钟。将2ml PBS加入到每个试管中，在RT下在1200RPM下离心5分钟，以洗掉未结合的抗体。将1ml RPMI，10％FBS加入到每个试管的沉淀中。将1ml RPMI 10％FBS中的20μg/ml FHA加入到各自的试管中，以刺激增殖。试管中的总体积是2ml，并且PHA的终浓度为10μg/ml。将试管涡旋，并在CO2培养箱中，在37℃下培养3天。用PBS洗涤细胞，并在4℃下，在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，并重悬浮于500μl 1XPBS中。在约200事件/秒下总共获得20000事件，并在FITC通道中观察。
％抑制＝{[PHA-(T1h+PHA)]/PHA}*100
(其中PHA＝PHA-细胞单独，PHA+T1h＝(PHA+T1h)-细胞单独，PHA+hR3＝(PHA+hR3)-细胞单独)
细胞单独是CFSE+细胞。
这些数据表明T1h抗体以剂量依赖性方式介导淋巴细胞刺激的PHA增殖的抑制。由于正常个体间内在的差异，个体间的抑制百分比可能是不同的。然而，总体而言，使用T1h观察到PHA刺激的淋巴细胞的剂量依赖性抑制，但使用非特异性抗体hR3没有(图14、图15和图16)。
实施例8
即使在基于96孔平板的Alamar蓝试验中T1h也能抑制PHA介导的淋巴细胞增殖
PBMC是新鲜收集的，并且以4x105细胞/ml的浓度重悬浮于RPMI5％FBS中。将50μl细胞加入到每个孔中。将100μl 2X浓度(20μg/ml)的抗体(T1h或hR3)加入到各自的孔中。将100μl单独的培养基加入到非抗体孔中。然后将平板在37℃下培养半小时。将50μl 4X浓度(20μg/ml)的PHA加入到各自的孔中，以刺激淋巴细胞的增殖。在剩余的孔中，加入50μl培养基，使得所有孔中的终体积为200μl/孔。将平板在CO2培养箱中，在37℃下培养三天。将65μl Alamar蓝加入每个孔中，并在CO2培养箱中，在37℃下培养过夜。在分光光度计Biotek SynergyTMHT上测量荧光，使用530nm激发，590nm发射和灵敏度＝35。
该试验重申了以下的事实：在可溶性T1h的存在下，PHA介导的淋巴细胞增殖得到明显的抑制，但在非特异性抗体hR 3的存在下，没有得到明显抑制。这与之前的实验一起表明了T1h在抑制原初T细胞增殖中的作用。该实验还显示了与之前基于流式细胞计数器的实验相比(图17)，PHA介导的T细胞增殖的抑制可以转化成方便的基于平板的试验形式。
实施例9
T1h降低了由栓系抗CD3、抗CD3+栓系T1h和抗CD3+栓系ALCAM Fc诱导的淋巴细胞增殖
将50μl覆盖缓冲液加入到96孔平板中，将50ul 2x浓度(1ug/ml)的抗CD3抗体加入到A行中，如图18中所示。从第一个A行中取出50μl抗体稀释液，使用12个通道电子移液管从平板往下连续稀释直至E行。将50μl覆盖缓冲液加入A-E行的1-4列，将50μl 2X(2μg/ml)浓度的抗体(T1h(5-8)或ALCAM Fc(9-12))加入到各自的孔中，使得孔的终浓度具有恒定的1μg/ml抗体和不同浓度的抗CD3抗体(A-E行具有1、0.5、0.25、0.625μg/ml)(图18)。将100μl 1μg/ml的T1h或hR3或ALCAM作为对照加入到各自的孔中(如模板中所示的)。对于培养基对照、sT1h和shR3，在三个平板中进行以上的设定。为了抗体结合平板，将平板在4℃下培养过夜。
阻断平板
使平板达到室温，并使用vaccusafe(IBS Integra BioScience)吸出覆盖缓冲液，通过将200μl的阻断溶液加入每个孔中来阻断非特异性结合位点。将平板在37℃下培养1小时，并用PBS/吐温洗涤两次。用RPMI培养基进行第三次洗涤。小心地除去剩余体积的培养基。
添加细胞悬浮液：
将100μl PBMC(30,000个细胞)加入每个孔中。将100μl 2X浓度的所需抗体(T1h或hR3)加入到各自的平板中。将100μl培养基加入到培养基平板中。将96孔平板在5％CO2培养箱中，在37℃下培养72小时。将65μl Alamar蓝溶液加入到每个孔中，并在5％CO2培养箱中，在37℃下培养过夜。使用96孔荧光计(Synergy HT，使用Gen 5软件)阅读荧光，使用530nm激发和590nm发射(灵敏度＝35)(图19)。
对于Bliss分析，栓系抗-CD3+T1h和抗CD3+ALCAM的组合是超过单独的栓系抗-CD3协同作用的(图20)。
实施例9a
原初PBMC中IL2的滴定
将100μl培养基加入到所有孔中。将100μl 2x浓度的IL2(20ng/ml)加入到第一行A2至A10。从第一行取100μl向下进行连续稀释，直至H行。将50μl PBMC悬浮液(6x105细胞/ml)加入到所有孔中。在各自孔中加入50ul培养基或抗体(T1h或hR3 10μg/ml)或PHA 10μg/ml，使得终体积为200μl。将平板在5％CO2培养箱中，在37℃下培养5天。将65μl Alamar蓝溶液加入到每个孔中，并在5％CO2培养箱中，在37℃下培养过夜。使用96孔荧光计(Synergy HT，使用Gen 5软件)阅读荧光，使用530nm激发和590nm发射(灵敏度＝35)。基于该实验，确定选择1.25ng/ml的IL2用于随后的实验中(图21)。
实施例9b
T1h导致促炎细胞因子的减少，并且在外源IL2的存在下部分地除去了这种抑制
细胞因子分析
人Th1/Th2细胞因子标准品的制备
用0.2ml试验稀释液重建1小瓶冷冻干燥的人Th1/Th2细胞因子标准品，以制备10x大量标准品，并在进行稀释之前使其平衡至少15分钟。将12×75mm试管(BD Falcon目录号352008)做上标记，并以以下次序排列：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256。
将900μl试验稀释液吸移至顶部的标准试管中。将300μl试验稀释液吸移至剩余的每个试管中。通过从顶部标准品中转移300μl至1∶2稀释试管中并彻底混合来进行连续稀释。通过从1∶2试管中转移300μl至1∶4试管中进行进一步的连续稀释，以此类推至1∶256试管，并彻底混合。制备一个含有试验稀释液的试管，用作0pg/ml负对照。
混合的人Th1/Th2细胞因子珠粒的制备
将捕获珠粒单独装瓶，就在将其与PE检测试剂、标准品和样品混合之前，需要合并珠粒试剂(A1-A6)。确定实验需要的试管的数量(包括标准品和对照)。在混合前将每个捕获珠粒悬浮液涡旋几秒钟。对于每个待分子的试管，将每个捕获珠粒的10μl等份加入到标记为“混合捕获珠粒”的单个试管中(例如，10μl IL-2捕获珠粒x18试管＝180μl所需的IL-2捕获珠粒)。
样品的制备：
使用合适体积的试验稀释液通过所需的稀释倍数(即，1∶2、1∶10或1∶100)来稀释测试样品。将样品转移至含有混合的捕获珠粒和PE检测试剂的适当试管之前，将样品稀释液彻底混合。
培养物上清液试验程序
将50μl混合的捕获珠粒(使用混合的人Th1/Th2细胞因子捕获珠粒制备中所述的程序制备)加入到合适的试管中。在加入试管之前，将混合的捕获珠粒涡旋。将50μl人Th1/Th2-II PE检测试剂加入试管中。将50μl人Th1/Th2细胞因子标准品稀释液加入到对照试管中。将50μl的每种测试样品加入到测试试管中。将试管在RT下培养3小时，并防止其直接暴露于光。将1ml洗涤缓冲液加入到每个试管中，并在200xg离心5分钟。从每个试管小心吸取上清液，并丢弃。将300μl洗涤缓冲液加入到每个试管中，以重悬浮珠粒沉淀。在流式细胞计数器上分析样品(图22和图23)。
可溶性T1h抑制增殖T细胞上的CD4和CD25受体表达
按照栓系试验程序中所述的设定试验，即，图18中提及的平板的覆盖和PBMC的培养。然后从96孔平板中取出细胞，放入BD falcon试管中。将2ml的1XPBS加入到每个试管中，并在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，将100ul 1XPBS加入细胞沉淀中。每个试管中取100μl细胞，并加入10μl Flourchrome、缀合的抗CD4 Alexa或抗CD25PE，并在4℃下培养30分钟。培养后，将2ml 1XPBS加入每个试管中，然后在RT下在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液。将细胞重悬浮于0.5mL 1XPBS中，然后在流式细胞计数器中获取细胞。为了FSC和SSC中所需的群(3000个细胞)，将细胞(淋巴细胞)集合。估算了两者的细胞百分比和平均荧光强度。将该实验进行三次，并且显示了一个代表图。结果在独立的实验中是可重复的(图24)。
上述试验中的凋亡没有增加
在试验中，按照试验程序实施例9中所述设定，从96孔平板中取出细胞，放入BD falcon试管中，并做上标记，用于凋亡试验。每个试管中加入2ml 1XPBS，并在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液，将100ul 1XPBS加入到细胞沉淀中。加入100ul PI/膜联蛋白V标记溶液并在4℃下培养30分钟。培养后，将2ml 1XPBS加入到每个试管中，然后在室温下在1200RPM下离心5分钟。丢弃上清液。将细胞重悬浮于0.5mL 1XPBS中，并在流式细胞计数器中获取细胞。为了FSC和SSC中所需的群(3000个细胞)，将细胞(淋巴细胞)集合(图25)。
从这些实验，清楚了T1h导致原初T细胞增殖的抑制并且由促炎细胞因子的实质性增加以及CD25和CD4数量减少来介导。外源IL2的加入能够恢复抑制以及提高促炎细胞因子的表达，以及提高CD4和CD25的绝对受体数。这些结果表明由T1h引起的T细胞增殖的抑制是通过IL2的抑制来介导的，并且外源IL2的加入导致“功能的获得”。我们还观察到T细胞增殖的降低不是由凋亡的诱导来介导的。
实施例10
在破伤风类毒素介导的T细胞增殖试验中T1h不抑制记忆T细胞
通过Ficoll-Paque(Amersham目录号：17-14403-03)(密度梯度离心)分离PBMC。白细胞层获自健康的捐献者并且通常是新鲜收集的。然后将PBMC在PBS(Invitrogen)中洗涤。然后将PBMC以0.3x106细胞/ml的细胞密度重悬浮于2ml的补充5％FBS的RPMI培养基中。然后将细胞在无菌BD FACS 5ml试管中培养30分钟，用或不用T1h10ug/ml和hR3，其用作非特异性对照。培养后，将细胞涡旋并将100μl细胞悬浮液加入到各自的孔中。将100ul破伤风类毒素(Cat#582231，CALBIOCHEM)(10ug/ml)工作溶液(含有5％FBS的RPMI培养基)加入到各自的孔中，以刺激记忆T细胞增殖。将平板在CO2培养箱中在37℃下培养五天。将65μl Alamar蓝加入到每个孔中，并在在CO2培养箱中在37℃下培养过夜。在分光光度计Biotek SynergyTM HT上测量荧光，使用530nm激发，590nm发射和灵敏度＝35(图26)。
实验结果显示破伤风类毒素以剂量依赖性方式刺激了T细胞的增殖，但sT1h没有显示出这些细胞增殖的任何抑制。这强烈地表明了T1h没有抑制记忆T细胞增殖。这对于T1h疗法是有利的，因为循环记忆T细胞增殖没有受到影响，并且T1h治疗中的患者将不会易受感染。
实施例11
T1h在PBMC和Raji细胞介导的混合淋巴细胞反应中抑制T细胞增殖
收集Raji/PBMC细胞，并悬浮于1XPBS中。将8x105细胞/ml Raji细胞/PBMC重悬浮于1ml丝裂霉素(25ug/ml)中。将细胞在CO2培养箱中在37℃下培养30分钟。培养后，将2ml的含有5％FBS的RPMI加入每个试管中，并在RT下在1200RPM下离心5分钟以除去丝裂霉素。丢弃上清液，并再加入2ml的含有5％FBS的RPMI并离心。丢弃上清液，并将细胞重悬浮于RPMI培养基中。
将50ul PBMC(4x105细胞/ml)加入96孔圆底平板的各自的孔中。将100μl抗体稀释液T1h或hR3(10ug/ml)加入各自的孔中，并在CO2培养箱中在37℃下培养30分钟。将50ul丝裂霉素处理过的Raji细胞(4x105细胞/ml)加入到各自的孔中。连同该试验一起，包括的对照是单独的丝裂霉素处理过的Raji细胞、单独的PBMC、丝裂霉素处理过的Raji细胞+PHA、PBMC+PHA、丝裂霉素处理过的Raji和PBMC。将平板在CO2培养箱中在37℃下培养5天。将65μl Alamar蓝加入到每个孔中，并在CO2培养箱中在37℃下培养过夜。在分光光度计Biotek SynergyTMHT上测量荧光，使用530nm激发，590nm发射和灵敏度＝35。
总之，观察到T1h可以特异性地抑制单向MLR，其中Raji细胞是抗原呈递细胞，并且PBMC增殖(图27和图28)。
实施例12：
混合的淋巴细胞反应(树突细胞和外周血淋巴细胞(PBL))：
MLR试验：
按照DC∶PBL＝1∶2比例进行MLR试验。用三个浓度的T1h设计实验模板，吡美莫司用作阳性对照，hR3为阴性对照。显示了模板(图29)。根据横跨平板进行连续稀释。
按照平板的设计加入PBL和DC。将丝裂霉素C处理过的PBL加入平板中相应的孔中。在所有孔中，终体积为200ul。
重复两次进行MLR。一个平板用于增殖试验，而另一个用于细胞因子试验。最终，将两个平板简短离心，并在CO2培养箱中保存6天。
增殖试验：
培养后，在显微镜下检测平板的污染，并将20ul的Alamar蓝(10％总体积/孔)加入到每个孔中。在灵敏度35下，在4小时时开始的不同时间范围下进行读数，直至过夜(图30)。
细胞因子试验：
从每个孔中收集上清液，并且对于每个组，将上清液合并。在流式细胞计数器中使用BD CBA Th1/Th2试剂盒II分析细胞因子(图31)。
在同种异体(抗原呈递细胞取自一个个体，而PBMC取自另一个个体)混合淋巴细胞反应中，其中成熟树突细胞(抗原呈递细胞)导致原初PBMC的增殖，T1h以剂量依赖性方式抑制这种增殖。数据显示了作用模式涉及至少两种主要的促炎细胞因子(即IL6和IFNγ)的下调。
实施例13
I型糖尿病动物模型
已知NOD(非肥胖糖尿病)雌性小鼠产生自发性的自体免疫T细胞介导的糖尿病，如通过随着时间增加的葡萄糖所测量的。这种胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)模型是用于研究药物的治疗和预防效果的极好模型。将该小鼠用于研究CD6替代抗体(以T1h结合人CD6相似方式结合鼠CD6的大鼠单克隆抗体)的治疗和预防益处。
在中间实验中，来自Harlan的动物在8-10周中已经显示出产生了疾病。这些小鼠在实验开始时的年龄为6-7周。2.46-19.68mg/kg/周的剂量范围明显降低了葡萄糖水平，并且事实上在最高剂量下，将葡萄糖水平降至正常。
在治疗情况下，十只小鼠中的相似实验以剂量依赖性方式延迟了疾病的发作。在最高剂量下延迟可以长达三周。
实施例14：
胶原蛋白诱发的关节炎模型
胶原蛋白诱发关节炎(CIA)的小鼠模型对研究动物模型中的类风湿性关节炎特别有利。该模型在历史上还用于研究抗类风湿性关节炎分子(包括抗体)的作用。
在该研究中使用C57BL/6雄性小鼠。简而言之，将来自Sigma的鸡胶原蛋白(CII)溶解于10mM醋酸中，并使用0.2μm滤器进行无菌过滤。在该研究中使用50μl注射体积。将CII以4mg/ml溶解，用于100μl体积。所有程序在2-8℃下进行。
将热灭活的结核分枝杆菌与不完全弗氏佐剂(IFA)混合用研钵和杵棒精细研磨。然后通过将两者混合将CII乳化到此溶液中。所有程序在2-8℃下进行。
在尾巴的基部给予第一次剂量两周后，注射加强剂量。然后监控关节炎的产生。
在产生疾病的十只小鼠中，使用特异性地检测与T1h相似结构域中的小鼠CD6的替代抗CD6抗体。与未处理的对照相比，2.46-19.68mg/kg/周的剂量范围以剂量依赖性方式明显地降低了这些小鼠中的类风湿性关节炎。这些实验确定了如下的事实：T1h的替代抗体可以控制类风湿性关节炎。
实施例15：
自体免疫脑脊髓炎(EAE)
实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)是脑炎的动物模型。其是中枢神经***(CNS)的炎性脱髓鞘疾病，并且作为人CNS脱髓鞘疾病(包括多发性硬化的疾病)的模型进行研究。
已知注射大鼠髓鞘碱性蛋白时，C57BL/6小鼠易受这种疾病的影响，并且使用了加强实验方案，其中在第0天和17天用200μgCFA中的大鼠MBP使小鼠免疫，接着注射标准的百日咳毒素。该实验方案导致单相的中等疾病过程，在第20天时开始，具有发炎和轴突损伤的组织学标记，但没有明显的脱髓鞘。
将处理臂中的10只小鼠暴露于不同浓度的T1h替代抗体下，其结合小鼠CD6的相似结构域，与T1h结合人CD6一样。剂量范围为2.46-19.68mg/kg/周。与安慰剂制剂相比，处理明显地以剂量依赖性方式控制了疾病，尤其是在最高剂量下。
实施例16：
同种异体移植
将来自品系A自交小鼠的皮肤移植至小鼠B时，可能以特定的方式排斥皮肤移植，在第3天至第7天之间皮肤首先变得血管化。然后用淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞和其他炎症细胞渗透血管化的皮肤。在7-10天内移植的组织存在减少的血管化，并且在10天后出现可见的坏死。
对二十只小鼠(BALBc-WT)尝试该实验，这些小鼠接受来自C57BL6/WT小鼠的皮肤移植。使用标准外科手术程序，切下皮肤并移植至不同的BALBc小鼠中。将处理臂中的十只小鼠暴露于不同浓度的T1h替代抗体，其与小鼠CD6的相似结构域结合，与Th1与人CD6结合一样。剂量范围为2.46-19.68mg/kg/周。在BALBc小鼠接受移植之前的一周，给予第一次注射，并在此后持续6周。
看来这些数据表明了与未处理的动物相比，在接受药物的小鼠中更常见能耐受皮肤移植。在所有未处理的动物中，在三周内移植变得坏死。对移植的耐受也是剂量依赖性的，接受最高剂量的动物更能承受移植。
Figure IPA00001213009100021
Figure IPA00001213009100031
Figure IPA00001213009100051

Claims (22)

1.一种单克隆抗体，其能够与CD6的结构域1(D1)结合并抑制T细胞增殖而不干扰ALCAM结合。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为至少80％同源的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为至少80％同源的氨基酸序列。
4.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体在体外没有诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
5.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体在体外没有诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
6.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体在体外没有诱导凋亡。
7.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体抑制由栓系抗-CD3；栓系抗-CD3和抗-CD6的组合或栓系抗CD3和ALCAM的组合诱导的原初PBMC的增殖。
8.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体特异性地抑制单向MLR，其中Raji细胞是抗原呈递细胞，并且PBMC增殖。
9.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体特异性地抑制由PBMC介导的单向自身MLR。
10.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体通过实质性地降低促炎细胞因子引起原初T细胞增殖的抑制。
11.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体通过CD25和CD4计数的下降引起原初T细胞增殖的抑制。
12.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体通过介导IL2的抑制而抑制T细胞增殖。
13.权利要求1的单克隆抗体，其中随着外源IL2的添加，抗体显示出功能的获得。
14.权利要求1的单克隆抗体，其中抗体参与促炎细胞因子IL6和INFγ的下调。
15.根据在前任一项权利要求的单克隆抗体，其中抗体没有抑制记忆T细胞群体。
16.使用根据在前权利要求一项或多项的单克隆抗体来调节炎性病症的方法，所述炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病。
17.使用单克隆抗体与免疫抑制剂相结合来调节炎性病症的方法，所述炎性病症如牛皮癣、类风湿性关节炎或患者体内的自体免疫应答，如与多发性硬化或移植排斥相关的不利应答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癣，皮肤性T细胞淋巴瘤，甲状腺炎和其他T细胞介导的自体免疫疾病。
18.使用单克隆抗体与能够引发抗炎免疫应答的抗原如胰岛素，GAD，MOG，MBP和HSP60相结合来调节炎性病症的方法，所述炎性病症如多发性硬化或移植排斥，移植物抗宿主疾病，1型糖尿病。
19.根据权利要求16、17或18的方法，包括将治疗或药物学上有效量的抗CD6结合抗体给药于患者，该抗体特异性地与人CD6SRCR结构域1(D1)结合而不抑制ALCAM与hCD6结合。
20.根据权利要求18的方法，其中药物学上有效的剂量为0.1-25mg/kg/周。
21.根据权利要求16、17、18或19的调节炎性病症或自体免疫反应的方法，其中通过与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列为至少80％同源的氨基酸序列来表示单克隆抗体。
22.根据权利要求16、17、18或19的调节炎性病症或自体免疫反应的方法，其中通过与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列为至少80％同源的核苷酸序列来表示单克隆抗体。
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