JPH07508711A - Ｃｄ２８経路免疫調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ２８経路免疫調節 関連出願 本願は、丁ｈａ■ｐｓｏｎらにより１９９２年４月７日付けで出願された、ｒｃ Ｄ２１経路免疫＃ｉ＋Ｊという名称の米国特許出願第□７７８６４、８０５号、 「ＴやＣＤ２８１Ｊンホカイン産生の刺激を含む免疫療法」という名称の米国特 許出願第０７７８６４．８０７号、およびｒＣＤ２ｇ関連免疫応答の増大」とい う名称の米国特許出願第０７７１１６４．８６６号の継続出願である。これらの 出願は、ＴｈｏＩｐｓｏｎらにより１９８８年１１月２３日付けで出願され、現 在放棄されているｒｃＤ２ｇ刺激を含む免疫療法」という名称の米国特許出願第 ０７７２７５．４３３号の一部継続出願である。これらはすべて、本明細書中で 参考のために援用されている。 後援関係 本発明の研究は、Ｎａｖａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｍ＠ａｎｄ、　Ｒｅ５ｅｓｒｃｈ　Ｔａ５ｋ　Ｊｉ ｏ、　Ｍ２Ｏ２Ｓ、００Ｑ３−１００７により一部支援された。政府は、本発明 に関して特定の権利を有する。 生物学的寄託 ネズミのハイブリドーマ細胞系９．３は、ブダペスト条約の条項に従って、Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシＷ　７　 （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄 託され、ＡＴＣＣ指定番号の１１８１０２７１号が与えられた。 発明の分野 本発明は、一般に、免疫療法に関する。特に、本発明は、ＣＤ２８Ｔ細胞表面分 子の調節を含む免疫療法に関する。 発明の背景 Ｔ細胞と呼ばれる胸腺由来のリンパ球は、インビボの免疫応答の重要な調節因子 である。Ｔ細胞は、細胞毒性および遅延型過敏症（ＤＴＩ＋）に関与し、Ｂリン パ球抗体産生のヘルパー機能を果たす。さらに、Ｔ細胞は、例えば、Ｔ細胞の細 胞周期の進行を容易にし得るインターロイキン−２（ＩＬ−２）　；腫瘍壊死因 子−α（ＴＮＦ−α）およびリンホトキシン（ＬＴ）、すなわち、腫瘍細胞の溶 解に関与することが示されているサイトカイン；広範な種類の抗ウィルスおよび 抗Ｉｌ瘍効果を示すインターフェロン−７（ＩＦＮ−ｙ）　；および多系統造血 因子として作用するＩＬ−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ ＧＭ−ＣＳＦ）、などの免疫調節分子として作用する種々のリンホカインを産生 ずる。 癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびそれに伴う感染症などの疾患に対 して現在行われている免疫療法的治療は、免疫応答を増大させるために、ＩＬ− ２およびＩＦＮ−γなどのリンホカインの全身投与を含む。しかし、このような 治療は、Ｔ細胞介在性免疫応答の非特異的な増大を生じる。なぜなら、投与され たリンホカインは、感染部位または腫瘍部位に近接した活性化Ｔ細胞に対して特 異的でないためである。さらに、これらの分子の薬理学的用量を全身投与すると 、重篤な毒性を生じる。免疫不全患者または免疫抑制患者に対して現在行われて いる治療はまた、濃縮γ−グロブリン製剤を用いた免疫システムの非特異的な増 大を含む。このような治療の効果および／または機構、およびそれに伴う利益を 認識していなかったため、現在まで、免疫調節因子のインビボにおける分節の刺 激は、実行可能な代替法であると考えられていた。 従って、Ｔ細胞介在性免疫応答を増大させ、標的細胞によって産生される抗原に よって活性化されたＴ細胞に対して特異的である免疫療法を提供することが望ま しい。さらに、患者の自然免疫特異性を利用し得る免疫療法を提供することが望 ましい。さらに、免疫抑制患者に用いられる得る免疫療法を提供することも望ま しい。さらに、重篤な毒性効果を有する量の免疫調節分子を投与することにあま り依存しない免疫療法を提供することが望ましい。 所望ならば、Ｔ細胞群の除去および再導入をせずに直接投与され得る免疫療法を 提供することも望ましい。さらに、そのような免疫抑制が、例えば、移植患者、 ショック症候群を示す患者、および特定の形態の自己免疫疾患において有益であ るＴ細胞介在性免疫応答を増大させるためだけでなく、抑制するためにも用いら れ得る免疫療法を提供することが望ましい。 発明の要旨 本発明は、Ｔ細胞介在性免疫応答がＣＤ２Ｂ経路によって調節される免疫療法を 含む。ＣＤ２ｇレセプターを抗ＣＤ２ｇ抗体または他の刺激作用性結合等価物に 結合させると、活性化Ｔ細胞介在性リンホカイン産生を誘導する。免疫抑制また は負の調節は、刺激作用性リガンドへのＣＤ２ｇレセプターの結合を妨げるか、 またはＣＤ２８シグナル伝達経路を不活性化することによって、達成される。 本発明の免疫療法は、活性化Ｔ細胞のＣＤ２８表面レセプター分子を刺激する驚 くべきかつこれまで認識されていなかった効果を利用する。活性化Ｔ細胞とは、 免疫応答が、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）　／ＣＤ３　Ｔ細胞表面複合体と、外 来抗原またはその等価物との相互作用によって、必然的ではないが一般的に開始 または「活性化」された細胞のことをさす。このような活性化は、Ｔ細胞の増殖 を起こすが、リンホカイン産生などのＴ細胞エフェクター機能を限定的に誘導す るだけである。 抗ＣＤ２ｇ抗体でＣＤ２ｇ細胞表面分子を刺激すると、Ｔ細胞リンホカイン産生 が顕著に増大する。驚いたことに、抗ＣＤ２ｇで共刺激してＴＣＲ／ＣＤ３複合 体の刺激が最大となるときでさえ、抗ＴＣＲ／ＣＤ３単独で誘導されるときより もＴ細胞増殖はあまり増大しないが、ＩＬ−２リノホカインのレベルは実質的に 増加する。 さらに驚いたことに、ＩＬ−２のレベルが著しく増加するだけでなく、ＣＤ２Ｂ の刺激にこれまで関連していない全セットのリンホカイン類（以下、Ｔ＋＋ＣＤ ２ｇリンホカインと呼ぶ）のレベルも増加する。注目すべきことに、ＣＤ２Ｂ刺 激に起因するＴ細胞増殖およびリンホカインの産生増大は両方とも、シクロスポ リンおよびグルココルチコイドによる免疫抑制に対する耐性を示す。 従って、本発明の免疫療法は、ＣＤ２！ＩＴ細胞表面分子を刺激して、人体が人 体自身から感染または癌を取り除くのを助けることによって、Ｔ細胞介在性免疫 応答が調節され得る方法を提供する。本発明の方法また、Ｔ細胞増殖を増大させ るためだけでなく、所望ならばＣＤ２Ｂ刺激によって調節されることが現在知ら れている全セットのＴ細胞リンホカイン類のレベルおよび産生を増大させること によって免疫応答を増大または上昇させる（ｂｏｏｓｔ）ためにも用いられ辱る 。 さらに、Ｔ細胞免疫応答を増大させる際のＣＤ２Ｂ刺激の効果は、Ｔ細胞活性化 またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体のある種の形態の刺激を必要としているように思わ れるので、本発明の免疫療法は、疾患によって、または特定の感染もしくは癌か ら人体を保護するための治療によって予め活性化されたＴ細胞を選択的に刺激し 、それによって免疫機能を増加させるために現在用いられている方法の非特異的 な毒性を回避するために用いられ得る。さらに、本発明の免疫療法は、免疫抑制 条件下でもＴ細胞介在性免疫機能を増大させるため、ＡＩＤＳなどの免疫不全症 にかかっている個体に特定の利益を与える。 さらに、以下に説明する本発明の原理は、本発明を人体の治療という観点から例 示しているが、本明細書中で説明する方法は、家畜の病気の治療への適用にも同 様に有用であるということが認識される。 本発明およびその利点は、図面および以下に示す実施例に関連した好ましい実施 態様の詳細な説明を読むことによってより十分に理解され得る。 図面の簡単な説明 図１は、ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞によるチミジンの取り込みの増大がないこ とを示す棒グラフである。 図２は、抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞をＣＤ２ｇ刺激することによるウリジン取 り込みの増加を示す棒グラフである。 図３は、ＣＤ２ｇ刺激により誘導されたＴ細胞増殖のシクロスポリン耐性の増大 を示すグラフである。 図４は、抗ＣＤ２ｇにより誘導された、ＰＭＡ−または抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞リ ンホカイン発現に対する／クロスポリンの効果の７−ザンブロノト分析である。 図５は、ＣＤ２Ｂ刺激によるサルにおけるＴ細胞のインビボ活性化を示すグラフ である。 図６Ａおよび図６Ｂは、抗ＣＤ２８■Ａｂの注入後のリンパ球レベルの変化を表 すグラフである。 図７Ａおよび７Ｂは、種々の条件下での、ＰＢＬによるＴＮＦおよびＩＬ−６の インビトロ産生を表すグラフである。 図８Ａおよび８Ｂは、抗ＣＤ２８　ｍＡｂの単回投与および多回投与後のＩＬ− １βの血清濃度を表すグラフである。 図９Ａおよび９Ｂは、抗ＣＤ２ａ−＾ｂの単回投与および多回投与後のＩＬ−６ の血清濃度を表すグラフである。 図１ＯＡおよびＩＯＢは、抗ＣＤ２１　ｍＡｂの、単回ポーラス注射または多回 注射で処置されたサルから単離されたインビトロ刺激されたＰＢＬのＩＬ−６産 生を表すグラフである。 図１１は、一方向（ｏｎｅ−ｍａｙ）混合されたリンパ球培養物中の″Ｈチミジ ン取り込みに対するＣＴＬ＾４１ｇの阻害効果を表すグラフである。 図１２Ａおよび１２Ｂは、組織病理を示す心臓同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ ）の写真である。 図１３は、ＣＴＬＡ４１ｇＧ処置後の心臓同種移植片の生存のＫａｐｌａｎ−Ｍ ｅｉｅｒ　１ｉｆｅ分析である。 図１４は、協同的免疫抑制剤としてのＣＴＬＡ４１ｇおよびシクロスポリンを示 す棒グラフである。 図１５は、ＣＤ２Ｍで刺激された！Ｌ−２産生に対するハルビマイ／ン（ハルビ マインンＡ）の効果を示す棒グラフである。 図１６は、ＨＬＡ−ＤＲに対して、ブロック性ｍＡｂの存在下および非存在下で 、精製された休止Ｔ細胞に関するＳＥＢおよび抗ＣＤ２８による活性化を示す棒 グラフである。 図１７は、末梢血単核細胞中で、ＨＬＡ−ＤＨに対して、ＳＥＢ単独、または、 ＳＥＢおよびブロック性ｓＡｂによる活性化を示す棒グラフである。 図１８は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇで増殖したＣＤ４ゝ末梢血Ｔ細胞のインビ トロでの長期間の成長を示すグラフである。 図１９は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇで共刺激した後、ＩＬ−２およびＩＮＦ− αに対する、−ＲＮＡの増大のノーザンプロット分析である。 図２０は、ＣＴＬＡ−４■ＲＮＡ発現を誘導するマイトジェンの能力のノーザン プロット分析である。 図２１は、抗ＣＤＳ■Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８　ｍＡｂで共刺激することに よるＣＴＬＡ−４冒ＲＮ＾発現の誘導のノーザンプロット分析である。 好適な実施態様の詳細な説明 本発明の免疫療法の好適な実施態様において、ｃｏｚｇ分子が刺激されて、抗原 の、さもなければ活性化されたＴ細胞のＴ細胞介在性免疫応答を増大させる。Ｃ Ｄ２ｇは、約８０％の成熟Ｔ細胞の表面上で発現される４４キロダルトンのタン パク質であり、免疫グロブリン遺伝子に対して実質的に相同性を示す。Ｐｏｇｇ ｉ、　Ａ、ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍ＊ｕｎｏ１．．１フ：１０６５−１０６８ 　（１９８７＞およびＡｒｕｆｆＯ９＾、ら、ＰＮＡＳ　（ｔｌｓＡ）、８４： ８５７３−０７７　（１９１１７）をｔ尺のこと。両者は、本明細書中に参考と して援用されている。本発明の方法による、ＣＤ２８分子の細胞外ドメインの抗 ＣＤ２Ｂ抗体との結合は、Ｔ細胞増殖の増大とゾンホカインのレベルの増加をも たらす。 実施例ＩＩＩ〜＋Ｖおよびｖ１〜Ｖｌｌ＋において、Ｔ細胞活性化は、Ｔ　ｍ１ ｔａＴｃｔ＋／ｃｏ３複合体（これは、Ｔ細胞免疫応答の特異性を介在する）を 、■Ａｂ　Ｇ１９−４などの固定化抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて刺激す ることにより、またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ｉｏｎｏ■ｙｅｉｎ）を用 いて化学的に刺激することにより達成された。しかし、その代わりに、Ｔ細胞の 活性化が、ＣＤ２表面タンパク質の刺激などの、ＣＤ３刺激を直接合まない経路 により達成され得ることもまた認識されるべきである。 しかし、実際に、活性化されたＴ細胞群は、患者自身の免疫系により提供され得 、それは、全体の免疫抑制を妨げ、任意の外来抗原、または、疾患、感染、接種 または自己免疫により存在する実質的にレベルの増加した抗原に対する応答で活 性化されたＴ細胞を有し得る。「外来抗原Ｊという用語は、本明細書では広義に 使用し、生体によっても通常に産生されない抗原を意味し、または、癌腫におけ るように、それを産生じている細胞により通常に産生されない抗原を意味する。 この用語はまた、通常には、「自己（ｓｅｌｆ月として見られるべきであるが、 自己免疫疾患状態中で起こり、外来抗原であるかのように免疫応答を誘発する抗 原を含むという意味である。「実質的に増大した」抗原レベルとは、正常範囲を 超え、そのような上昇により生体に潜在的に存寄な効果を有する抗原レベルを意 味する。 本発明の方法によれば、ＣＤ２８分子自身の刺激は、ＣＤ２Ｂに対して結合特異 性および刺激効果を有するリガンド（モノクローナル抗体またはその部分（例え ば、Ｆ（ａｂ’　）＊）のような）の投与により達成される。適切な抗体は、ｍ Ａｂ９．３、Ｄｒ、　Ｊｅｆｆｒｅｙ＾。 Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ　ｏｒ　Ｏｎｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　５ｅ ａｔｔｌｅ、　ＷＡからの要求により頒布および入手可能（非商業的な目的で） であるＡＴＣＣに寄託されたＩｇＧ２ａ抗体、または■＾ｂ　ｒＯＬＴ−２を含 む。これらの両モノクローナル抗体は、「白血球分類＋１Ｊ　Ｃｈ、１２．１４ ７−１５６頁、Ｒｅ１ｎｈｅｒｔｚ、　Ｅ、　Ｌ、ら編（１９８６）に記載され るように、ＣＤ２８の細胞外ドメインに対する結合特異性を有することが示され ている。モノクローナル抗体９．３Ｆ（ａｂ’　Ｌはまた、ＣＤ２ｇレセプター を刺激し得る満足すべきリガンドであることがまた示されている。本発明の方法 は、ＣＤ２８表面分子を結合する、キメラ（ｃｈｉ■１ｅｒｉｃ）抗体、非免疫 グロブリンの天然および組換えリガンドの使用を予想していることもまた理解さ れるべきである。つい最近、ＣＤ２Ｂに対する天然りガント、すなわちＢ７／Ｂ ＢＩがまた同定され、そして本発明の原理に従って使用され得る。 Ｌｉｎ５ｌｅｙ、　ｐ、　ｓ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７４：５８Ｈ１９ ９１）を参照のこと。 さらに、天然リガンどの結合性相同体はまた、天然であるか、あるいは、生化学 的技術、免疫学的技術、組換え技術または他の技術により合成されたかを問わず 、本発明の原理に従って使用され得る。本明細書中で示されるリガンドは、それ らの適用に依存して、それらの可溶形態または細胞結合形管として利用され得る 。モノクローナル抗体９３およびＢ７は、一般に好適な刺激性リガンドである。 ＣＤ２８の細胞外ドメインは、＾ｒｕｆｒｏ、　Ａ、ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、 ８４：８５７３−１１５７７（１９８７）により配列決定され、一般に以下のア ミノ酸配列を含む： ＭｅｔＬｅｕＡｒｇ　ＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡＩａＬｅｕＡｓｎＬｅｕＰｈｅＰｒ ｏＳｅｒｌｌｅＧｌｎＶａｌＴｈｒＧＩｙＡｓｎ　Ｌｙｓ　ｌｌｅＬｅｕＶａｌ ＬｙｓＧＩｎＳｅｒＰｒｏＭｅｔＬｅｕＶａｌＡｌａＴｙｒＡｓｐＡｓｎＡｌａ ＶａｌＡｓｎＬｅｕＳｅｒＣｙｓＬｙｓＴｙｒＳｓｒＴｙｒＡｓｎＬｅｕＰｈｅ ｓｅｒＡｒｇＧｌｕＰｈｅＡｒｇＡＩａＳｅｒＬｅｕｌ−１ｉｓＬｙｓＧｌｙＬ ｅｕＡｓｐＳｅｒＡｌａＶａｌＧｌｕＶａｌＣｙｓＶａｌＶａｌＴｙｒＧｌｙＡ ｓｎＴｙｒｓｅｒＧＩｎＧｌｎＬｅｕ　Ｇ　ＩｎＶａ　ｌＴｙ　ｒＳ　ｅ　ｒＬ ｙｓＴｈｒＧＩｙＰｈ　ｅＡｓｎ　ＣｙｓＡｓｐＧｌｙＬｙｓ　ＬｅｕＧＩｙＡ ｓｎＧｌｕＳｅｒＶａｌＴｈｒＰｈｅＴｙｒＬｅｕＧＩｎＡｓｎＬｅｕＴｙｒＶ ａｌＡｓｎＧｌｎＴｈｒＡｓｐＨｅＴｙｒＰｈｅｃｙｓＬｙｓＩＩｅＧＩｕＶａ １ＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒ。 ＰｒｏＴｙｒＬｅｕＡｓｐＡｓｎＧＩｕ　ＬｙｓＳｅｒＡｓｎＧ　ＩｙＴｈｒｌ ｌｅｌｌｅＨｉｓＶａｌＬｙｓＧＩｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＣｙｓＰｒｏＳｅｒＰ ｒｏＬｅｕＰｈｅＰｒ６ＧＩｙＰｒｏＳｅｒＬｙｓＰｒ。 本明細書および請求項において以後使用される、「細胞外ドメイン」という用語 は、上記の提示されたアミノ酸配列、任意のその実質的部分、またはそれに実質 的な相同性を有する任意の配列を意味する。 実施例１１１−Ｖのデータにより示されるように、ＣＤ２Ｂ刺激にょるＴ細胞介 在性免疫応答の実質的増大は、活性化Ｔ細胞に特異的であるようである。そのよ うな特異性は、特に臨床的に重要であり、そして本発明の免疫療法の重要な利点 の一つである。抗ＣＤ２８抗体または他のＣＤ２ｇリガンドの投与は、既に活性 化され免疫応答に関わるＴ細胞または活性化のプロセス中にあるＴ細胞の応答を 特異的に増大する。しかし、ＣＤ２１ルセブターへの本発明のＣＤ２ｇ特異的リ ガンドの結合後、Ｔ細胞が活性化される場合でさえ、ＣＤ２８刺激が有効であり 得ることもまた認識されるべきである。従って、腫瘍部位または感染部位でまた は近辺で、Ｔ細胞は、これら部位で産生されたまたは存在する抗原により活性化 されており、ＣＤ２８刺激により選択的に［上昇する（ｂｏｏｓｔｅｄ）　Ｊ。 免疫応答を上昇させることもまた、例えば、ワクチン中に存在する抗原に対する 応答を増大させることにおいて、健康な個体に対して有益であり得る（実施例Ｉ Ｘを参照のこと）。 本発明に従って、抗原の投与上共にＣＤ２ｇで刺激すると、従来のワクチンを用 いるだけでなく、例えばヒトレトロウィルス（例えば、ＨＩＶおよびある種のヘ ルペスウィルス）で適切な免疫応答を誘起するのが困難な状況において、さらに 効果的に免疫化され得る。本発明のＣＤ２８による刺激が用いられ得る例として は、麻疹、インフルエンザ、ポリオ、ヘルペス（すなわち、ＩＩｃＭＶ、エプス タイン・バーウィルス、タイプ１および１１）に対するウィルス性ワクチン；百 日咳（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　、破傷風（Ｃｌｏｓｔｒ ｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｕｓ）　、肺炎（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｅｃｕｓ　ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅ）　、髄膜炎および淋病（Ｎ６１ｇ５ｅｒｉａ）、ならびに腸疾 惣性細菌（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＳＥ、　ｃｏｌｉ、およびＳｈ＋ｇｅ ｌｌａ）に対する細菌性ワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。本発 明の原理はまた、寄生虫感染症（原生動物寄生虫により引き起こされる感染症（ 例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーンコマニア症、アメーバ症、トキソ プラズマ症、二二一モシスチス・カリニ、およヒハヘシア症）、条虫（例えば、 サナダムン）により引き起こされる感染症、および他の寄生生物により引き起こ される感染症を包含する）ニ対スル接種ニモ適用され得る。Ｎａｔｕｒｅ　３５ ６：１５２（１９９２）に記載のように、抗ＣＤ２ｇと共に刺激される細胞内抗 原産生物のｃＤＮＡを注入することによる体液性応答の免疫化もまた、本発明の 範囲内にあるとして意図されることが理解される。 ＴＣＲ／ＣＤ３の刺激が最大のとき、Ｔ細胞の増殖は著しく増大しないが、ある 種のリンホカインのレベルがＣＤ２Ｂの活性化によって実質的に増加し、これら のリンホカインの細胞産生が増加することを示している。従って、疾患または感 染症のために、本来の最大のＴＣＲ／ＣＤ３刺激またはインビボでそれと等量の Ｔ細胞の活性化を受けている患者では、本発明の方法に従って、抗ＣＤ２ｇ抗体 またはＣＤ２８を刺激する他のＣＤ２８ソガンドを投与することにより、リンホ カインの産生が実質的に増大する。 驚くべきことに、本発明の方法に従ってＣＤ２１１刺激因子を投与して達成され るリンホカイン産生の増大により、特に実施例１！１で示すように、完全なセッ トのリンホカインの産生が増大し、このことから、これらのリンホカインはＣＤ ２１１を調節するある形態下にあることが示される。このセＩトの一部のリンホ カイン（？！ｋに決定するように、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、　ＩＦＮ−γ 、およびＩＬ−３を包含する）は、Ｍｏｓｍａｎｎ、　Ｔ、Ｒ，ら、夏ｍ５ｕｎ ｏｌ。 Ｔｏｄａｙ、　８：２２３〜２２７（１９８７）に記載されている、マウスに存 在するＴイｌ細胞リンホカインにいくらか類似している。ヒトＩＬ−４産生は、 ＣＤ２８の刺激では増大しないと元来は考えられていたが、実施例ＩＩ＋に示す ようなより最近のアッセイにより、他のリンホカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−５ を包含する）の産生が増大することも現在明らかにされている。そして、ＩＬ− ６およびＩＬ−１の産生が増大することもまた実施例ＩＸで示された。しかしな カラ、ｒＴＮ１リンホカイン」という用語は、元来は表記を簡単にするために用 いられ、上記のリンホカインに明確には限定されておらず、そしてＣＤ２＋１　 Ｔ細胞表面分子の結合または刺激により、産生が影響されるかまたは調節される 全てのリンホカインを含むことを意味したことが理解される。従って、ＣＤ２８ によす影響されるリンホカインのグループを、以下よりＴイＣＤ２ｇリンホカイ ンと表記し、また、「ＴやＣＤ２ｇリンホカイン」という用語は、本明細書中で 挙げる特定のリンホカインに限定されることを意図しないことが理解される。さ らに、本発明の原理が獣医学の適用に用いられることにより、動物のＴ細胞介在 性免疫応答およびリンホカインの産生が増大し得る。 従って、本明細書中で用いるｒＴ、ＣＤ２．８リンホカイン」という用語はまた 、類似した動物のリンホカインを含むことを意味する。このように、本発明の方 法に従って、抗ＣＤ２Ｂ抗体または他のＣＤ２８リガンドを投与することにより 、完全なセットのリンホカインの産生およびレベルが著しく増大し得る。 本発明の免疫療法はまた、免疫抑制された患者（例えば、ＡＩＤＳ患者）におい て、Ｔ細胞介在性免疫応答を促進するのに用いられ得る。実施例ｖ１〜ｖ１１１ に示すように、Ｔ細胞の増殖およびＣＤ２ｇで調節されたリンホカインのレベル または産生の増大は、ンクロスボリンまたはデキサメタシンにより引き起こされ るような免疫抑制の存在下でさえも機能し続ける。従って、ＣＤ２ｇ刺激因子（ 例えば、■＾ｂ９．３または他のＣＤ２ｇリガンド）の投与は、インビボでリン ホカインのレベルを増大させるため、免疫抑制された患者を治療するのに用いら れ得る。 さらに、敗血性シッソクおよび腫瘍銹発性悪液質を含む種々の症候群は、ＣＤ２ ８経路の活性化およびリンホカインの潜在的毒性レベルの産生の増大を包含し得 る。免疫応答はまた、器官移植の受容者または自己免疫疾患におけるような別の 状況では有害であり得る。従って、ＣＤ２ｇ経路の負の調節または不活性化はま た、以下におよび実施例ＸおよびＸＩで十分に議論するように、上記および他の 臨床的病状の免疫療法を提供し得る。 抗ＣＤ２８抗゛体の投与が、以前は、活性化Ｔ細胞部位におけるリンホカインレ ベルの実質的な増大に対する可能な免疫療法として重大には熟考されていなかっ たことが理解されるべきである。例えば、ｗＡｂ９．３の添加は、Ｔ細胞の増殖 をいくらか増大するとだけ考えられ、Ｔ、ＣＤ２ｇリンホカイン産生の実質的な 増大を誘発するとは考えられていなかった。 ＣＤ２８の結合がＴ細胞介在性免疫応答を調節することによる任意の特定のメカ ニズムで規定されることは、本明細書の趣旨ではないが、刺激メカニズムのモデ ルは、実験データ（そのうちのあるものは実施例Ｖｌｌ＋に示されている）より 仮定されそして支持されている。多くのリンホカイン遺伝子が、構成約に発現し たハウスキーピング遺伝子由来のｍＲＮＡよりも細胞質内で迅速に分解すること が以前から示されており、このことから、これらの誘導性＋＊ＲＮＡの不安定性 が選択されて、遺伝子発現が迅速に調節されるという仮説が導かれる。本明細書 中に記載されそして請求の範囲で請求されるＣＤ２８１１節のメカニズムは、上 記のＴ、ＣＤ２ｇリンホカインのセットのための迅速分解性ｍＲＮＡの安定化に 関係すると考えられている。現在までのところ、いかなる真核細胞系においても 、細胞表面の活性化経路が、ｍＲＮＡの分解で特定の変化を誘導することにより 遺伝子発現を変化させ得ることを示す他のメカニズムは記載されていないようで ある。　（ＣＤ２Ｂ活性化の可能なモデルのさらに詳細な分析が本明細書中で以 下に示される。）実施例＋Ｖに示すように、ＣＤ２ＢおよびＴＣＲ／ＣＤ３が共 に刺激されると、ＴＭＣＤ２８リン十カインのｍＲＮＡが増加し、これは、Ｔ細 胞の活性化に関係する全ての遺伝子の定常状態でのｍＲＮＡの発現の増大が一般 化した結果ではなかった。この増加は不均衡であり、従って、培地中の細胞の増 殖割合の増加によって説明され得なかった。本明細書中で詳細には説明しないさ らなる研究に加えて、これらのデータより、活性化Ｔ細胞のＣＤ２８表面分子の 活性化が、リンホカインｍＲＮＡを特に安定化するために機能することが示され る。−ＲＮＡの安定性が増大すると（すなわち、その分解が遅くなると）、５Ｒ ＮＡの翻訳が増大し、次に細胞あたりのリンホカインの産生が増大する。Ｔ細胞 あたりのリンホカインの産生が増大すると、Ｔ細胞は他の炎症細胞および造血細 胞の応答に影響し、これはバラタリン産生と称される。対照的に、単に細胞増殖 が増大することによるリンホカインレベルの増大（例えば、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ 、Ｊ、ら、Ｊ、　ｌｌ１ｕｎｏ１．１３６：３２８２〜３２ｇ？（１９８６）に 示される）は、オートクライン産生と一般に称される。表記を簡単にするため、 バラクリン産生はまた、本明細書中では「細胞の」リンホカイン産生と表記され る。 このように、本発明の原理に従って、ＣＤ２１１に対して特異的に結合するリガ ンドは、ＣＤ２ｇ経路を刺激するインビボでの投与に適した生物学的に適合する 形態で投与される。ｒｃｏｚｇ経路の刺激」とは、ＣＤ２８分子の刺激を意味し 、これによって、Ｔ細胞のＴ、ＣＤ２８リンホカイン産生が増大する。「インビ ボでの投与に適した生物学的に適合する形態」とは、リガンドの毒性効果がたと えあるとしても、その治療効果のほうが重要である場合における投与されるべき すがンドの形態を意味する。ＣＤ２８リガンドの投与は、任意の適切な薬理学的 形態であり得、これは溶液でのリガンドの静脈内注射を包含するが、これに限定 されない。 リンホカイン産生のＣＤ２８Ｈ節のモデルは、リンホカインレベルの刺激および 増強に関して上記のように説明されるが、ＣＤ２８経路の負の調節または阻害も また本発明の原理に従うことが理解されるべきである。免疫応答の負の調節また は抑制は、種々の病状（敗血性ショック、腫瘍誘発性悪液質、自己免疫疾患、お よび、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、および他の器官移植を受けた患者の病状を 包含するンに対して臨床上特に重要である。負の調節に対する一つの好ましいア プローチは、ＣＤ２ｇレセプターの天然のリガンド上への刺激的結合部位の遮断 である。例えば、ＣＴＬＡ−４（以下でさらに詳細に議論する）（これはＣＤ２ ｇと３２％のアミノ酸相同性を有しており、そしてＣＤ２ｇよりもＢ７に対して 強い結合親和性を有すると考えられる）は、Ｂ７と結合して、ＣＤ２ｇの結合お よびそれによる活性化を防ぐように用いられ得る。Ｌｉｎ５ｌｅｙ、　Ｐ、Ｓ、 ら、Ｊ、　Ｅｘｐ。 Ｍｅｄ、、　１７４：５６１（１９９１）を参照のこと。このような調節は、実 施例Ｘに記載するように、インビボで行われている。この実施例では、完全なＭ ＢＣ不適正対合心臓同種移植の急性拒絶は、Ｂ７依存性Ｔ細胞活性化を遮断する ことにより（すなわち、ＣＤ２８と、可溶性組み換え融合タンパク質ＣＴＬＡ４ １ｇとの結合により）防止された。ＣＴＬＡ４１ｇで観察された免疫抑制は、Ｔ 細胞のサブセットを循環させるのに著しく変化しなかった。他の８７結合性リガ ンド（例えば、Ｂ７に対するモノクロナール抗体）も同様に用いられ得ることが 理解される。 負の調節はまた、刺激性リガンドを擬態し得るがＣＤ２８経路を活性化しない非 刺激性リガンド（例えば、レセプターを架橋しないかそうでなければ活性化しな い、Ｆ（ａｌ＋’）、改変した天然の、合成の、組換えの、または他のリガンド ）でＣＤ２Ｂ結合部位を占有することによって、Ｂ７へのＣＤ２８レセプターの 結合を遮断することにより達成され得ることが理解される。 証拠を累積することにより、Ｔ細胞レセプターの占有に加え、池の共刺激シグナ ルが、完全なＴ細胞介在性免疫応答を誘導するのに必要とされることが示唆され る。Ｔ細胞テ発現するＣＤ２８レセプターは、細胞のリンホカイン産生のバラク リンレベルを誘導し得る、新規なシグナル伝達経路の表面成分として機能する。 ＣＤ２１１とその天然のリガンドＢ７（これは活性化したＢ細胞マクロファージ または樹状細胞の表面で発現する）とのインビトロでの相互作用は、抗原レセプ ター−活性化Ｔ細胞での高レベルのリンホカイン産生を誘導する共刺激因子とし て作用し得る。従って、負の調節への別のアプローチは、以下に記載するように 、ＣＤ２ｇシグナル伝達経路の活性化を阻害することである。 ＣＤ２８シグナル伝達経路は完全には理解されていないが、実施例ｘ１は、ＣＤ ２ｇの結合により、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）誘導性のチロシンリン酸化とは 異なる、タンパク質のチロシンリン酸化が誘導されることを示している。例えば 、ＴＣＲ誘導性のチロシンリン酸化は、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の両方で 生じるが、ＣＤ２１１Ｎ導性のチロシンリン酸化は、既に活性化したＴ細胞にお いて最初に生じる。最も著しい点は、ＣＤ２Ｂレセプターが、細胞に結合したＢ ７と連結した後の結果であり、ここでリン酸化は一貫して単一の基質のみで検出 し得た。Ｊｕｒｋａｔ　Ｅ６−Ｉ　Ｔ細胞系を用いた実験により、ＣＤ２８誘導 性のチロシンリン酸化をＩＩＩ察するには、ＰＭＡの予備処理が必ず必要である ことが示された。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ　Ｊ３２系においては細胞の予備活性 化は必要ではなく、他方、上記のように、ＣＤ２８の応答性を誘導するためには 、正常Ｔ細胞のＰＭＡまたはＴＣＲの予備的刺激が比較的必要であった。Ｊｕｒ ｋａｔ変異体に関する研究は、さらに、ＣＤ２８誘導性のチロンノリン酸化およ びその生物学的機能はＴＣＲが存在しないときに生じ得ることを示した。この点 に関し、Ｔ細胞の活性化に含まれる他の補助分子（例えば、ＣＤ２、Ｌｙ−６、 Ｔｈｙ−ｔ、およびＣＤ５）がＴＣＲの存在を必要とすると考えられるという点 で、ＣＤ２ｇは独特であると考えられる。従って、特定のチロシンリン酸化は、 ＣＤ２ｇリガンドの結合の結果として直接中じると考えられ、Ｂ７／ＢＢＩレセ プターを発現する補助細胞によって、ＣＤ２ｇを通じて送達されるシグナルを伝 達することに包含される。 チロシンキナーゼ、ハルビマインンＡのＳｒｅ系列のインヒビターに関する、お よびチロシンホスファターゼに関する研究は、実施％Ｉ　Ｘ　ｌに記載のように 、リンホカイン遺伝子の発現に対するＣＤ２ｇ刺激の機能的効果には、上記のタ ンパク質のチロシンリン酸化が必要であることをさらに示している。このように 、チロノンのリン酸化インヒビターに関するデータは、ＣＤ２ｇ介在性のシグナ ル伝達の不活性化が、本発明の原理に従って、リンホカイン産生を負に調節する のにも用いられ得ることを示している。 本発明に従ったＣＤ２＋１刺激を通じた免疫療法はまた、骨髄移植受容者の治療 における臨床的適用性を有する。自家および同種間の骨髄移植（ＢＭＴ）の成功 は、一般に、再発性悪性疾患、対宿主性移植片病（Ｇｖ）ＩＤ）、およびＢＭＴ 後に生じる生命を脅がす免疫不全により制限されている。これらの問題を克服す るための一つのアプローチは、リンホカイン注入と組み合わせたリンパ球の養子 移入であり、これによって、免疫の再構成を促進するか、または悪性細胞に関す る細胞毒性を仲介する。 しかしながら、このようなリンホカイン注入による移入に伴う副作用は非常に著 しい。 従って、外部から加えられるＩＬ−２の非存在下で、ＣＤ３およびＣＤ２１１の 共刺激に応答したＴ細胞の増殖およびリンホカインの合成は、実施例ＸＩ目に記 載のように、外因性のリンホカインを注入せずに、インビボでＴ細胞の欠陥を修 復する活性化Ｔ細胞の養子移入の臨床的使用のための唯一の機会を提供する。 実施例Ｘ　Ｉ　Ｖ　ニ示される研究は、抗ＣＤ３　（ＯＫＴ３まタハＧ１９−４ ）　ｌｉ：対するインビトロでの欠陥増殖性応答が培養物中に■Ａｂ９．３を加 えることにより修復され得ることを示している。Ｊｏｓｈｉ、１．ら、旧ｏｏｄ 　５ｕｐｐ１．　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）（１９９１）を参照のこと。Ｔ細胞と０ ＫＴ３／９３との共刺激は、サイトカイン／リンポヵイン（例えば、ＩＬ−２、 ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦα）のｍＲＮ＾発現レベルが増大した結果として増 殖性応答を修復した。前出のＪｏｓｈｉの文献；　Ｐｅｒｒｉｎ、Ｐ、Ｊ、ら、 Ｂｒｏｏｄ　５ｕｐｐｌ　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）＜１９９１）を参照のこと。従 って、精製した正常ＣＤ４“細胞は、０ＫＴ３７９．３で共刺激されて、長期間 リンホカインを増強し、そして分泌し得る。■Ａｂ９．３の刺激を用いた予備臨 床研究は、サルにおいて不適切な効果を示さなかった。ＣＤ３で刺激した細胞（ ＣＴＣ）は、正常Ｂ細胞にヘルパー因子を提供するが、ＣＤ３−ＣＤ２ｇで共刺 激した細胞は、ＣＤ３で刺激したＴ細胞よりもヘルパー因子を産生ずることにお いてさらに効果的であると考えられる。従って、共刺激はまた、ＢＭＴ後の養子 免疫療法のために、ヘルパー細胞および細胞毒性Ｔ細胞の増殖を増強し得る。イ ンビトロで拡張したＴ細胞のインビボでの投与は、骨髄移植において二つの卓越 した有用性を提供する。造血について強い正の効果を有する多くのリンホカイン （例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、　ＩＬ−３、およびＩＬ−６）を産生ずる、ＣＤ２８ 処理細胞の能力は、骨髄移植後の移植成長（ｅｎｇｒａｆｔ■ｅｎｔ）を促進す るべきである。さらに、細胞毒性の原因となりそしてリンホカイン（例えば、Ｔ ＮＦ）の産生を引き起こす抗ＣＤ２８の能力は、骨髄移植の抗新生物形成効果を 増大させるべき養子免疫療法の新規な形態である。 アネルギーにおけるＣＤ２ｇの可能な役割もまた試験された。 一般に、休止Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞抗原レセプターの刺激により開始される 。この活性化は、自己コードされるＭＨＣ分子の抗原結合溝に存在する抗原ペプ チドの咬合（ｅｎｇａｇｅ謹ｅｎｔ）を介して、または外来ＭＨＣ分子の咬合に よって生じ得る。しかしながら、このレセプター介在性活性化事象は、休止細胞 でのＴ細胞応答の開始を必要とするが、最近の研究では、抗原レセプターのみに よって伝達されたシグナルが、効果的なＴ細胞介在性免疫応答へ導くには十分で ないことを示している。 実際、いくつかのインビトロモデルは、休止Ｔ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ ）　／ＣＤ３活性化のみによって、Ｔ細胞が抗原特異的レセプターによるさらな る刺激でアネルギーになる状態へ誘導されることを示唆している。この状態は比 較的永続し、少なくとも数週間であり、これによって、その細胞は抗原の刺激に 対してさらに応答し得なくなる。付加的なＴ細胞共刺激性分子の非存在下での、 ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のみによるこの孤立した活性化が、Ｔ細胞が末梢で自己抗 原に応答するのを防止することによって、末梢免疫応答を調節するのに重要な役 割を演じることが仮定される。 従って、増殖性応答を与えそして細胞介在性免疫応答を開始させるＴ細胞に対し て、休止Ｔ細胞は、通常、その抗原特異的Ｔ細胞レセプターを介する刺激だけで なく、付加的な共刺激／グナルを細胞に提供する第二のレセプターを介する刺激 も必要とする。本明細書中に示すデータＵｌえば、実施例Ｘｌ＋）は、ＣＤ２ｇ が、インビトロおよびインビボでのＴ細胞の応答に対して必須の共刺激シグナル を提供することを示している。従って、Ｔ細胞のリンホカイン産生を増大させる ＣＤ２δレセプターの能力により、細胞介在性免疫応答が開始されるだけでなく 、体止Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導も防止される。 プログラムされた細胞死の防止におけるＣＤ２８の役割もまた試験された。細胞 死の誘導は、胸腺における自己反応性または非反応性Ｔ細胞の排出において主要 な役割を有する。胸腺において、Ｔ細胞レセプターのシグナルは、自己抗原に特 異的なＴ細胞レセプターを発現する細胞を含む選択的かつ特異的な様式で、プロ グラムされた細胞死を誘導し得ると考えられる。Ｔｕｒｋａ、Ｌ、＾　ら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４４：１６４６〜５３（１９９０）Ｉこ記載のように、Ｃ Ｄ２８は胸腺におけるＴ細胞の発生中に発現し、そして、ｍＡｂ９．３の結合は 胸腺細胞の細胞死を防止する。プログラムされた細胞死はまた、末梢リンパ系器 官の成熟Ｔ細胞で生じると考えられる。Ｔ細胞レセプターを通じて送達されるシ グナルは、細胞死を誘導し得る（Ｎｅｖｅｌｌ、　Ｍ、に、ら、Ｎａｔｕｒｅ、 　３４７：２８６〜ｇ（１９９０）を参照のこと）。細胞死は、免疫病理学のあ る形態において役割を有するということもまた提案されている。例えば、ＨＩＶ −１の感染において、進行性免疫不全が、ウィルス誘導性の細胞障害効果の直接 的な結果ではなく、免疫学的に仲介した細胞死の結果であり得ることが提案され ている。Ａｍｅｉｓｅｎ、　Ｊ、Ｃ，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、　４ ：１０２＜１９９１）を参照のことＨＧｒｏｕｘ　Ｈら、Ｊ、　ＥＸＩｌ、　Ｍ ｅｄ、　１７５：３３１〜３４０（１９９２）もまた参照のこと。実施例Ｘｌｌ ＋の結果は、ＣＤ２ｇが成熟Ｔｉ１ｌ胞の細胞死を防止し得ることを示している 。従って、ＣＤ２ｇの異常な発現または活性化は、いくつかの自己免疫疾患（例 えば、全身性エリテマトーデス、胸腺で排出されなかったかまたは末梢りンバ系 でアネルギー状態から抜は出せなかった異常な自己反応性Ｔ細胞を特徴とする疾 患）の免疫病理学において役割を有し得る。同様に、ＣＤ２１１の活性化を誘導 する能力は、進行性のＴ細胞枯渇（例えば、ＨＩＶ−１の感染）を特徴とする疾 患において有用であり得る。 超抗原ＳＥ＾およびＳＥＢ　（ＭＢＣに結合するための従来のプロセシングを必 要としない）は、Ｇ、からＧ、への移行および！Ｌ−２レセプターの発現の誘導 により決定されるように、補助細胞の非存在下における精製Ｔ細胞を直接活性化 し得ることもまた、実施例Ｘｌ＋で示された。しかしながら、ＳＥＡもＳＥＢも 、単独では十分にＴ細胞を増殖しなかった。ＳＥＢまたはＳＥＡによるＴ細胞増 殖の誘導には、第二の共刺激シグナルの添加が必要であった。これは、ＣＤ２ｇ を補助細胞またはモノクロナール抗体のいずれかで刺激することにより提供され 得た。前に報告したように、補助細胞の存在下でエンテロトキシンにより誘導さ れるＴ細胞の増殖は、クラスＩＩのＭＢＣに対する遮断抗体（ＨＬＡ−ＯＲ）に より一部阻害された。対照的に、共刺激がＣＤ２８を介して提供される精製Ｔ細 胞においては、増殖はクラスＩＩの抗体で阻害されず、モしてＨＬＡ−ＤＲの発 現は検出されなかった。さらに、ＣＤ２ｇを介する共刺激は、シクロスポリンの 効果に一部抵抗した。これらの結果より、ＣＤ２Ｂの共刺激が、リンホカインの 産生およびそれに続くエンテロト牛ンン活性化Ｔ細胞の増殖を誘導するのに十分 であり、そしてこの効果がクラス１１のＭＭＣの発現に依存しないことが示され る。超抗原で活性化した細胞（例えば、トキシノクシッ１り症候群、および、リ ウマチ様関節炎またはライム関節炎で生じる細胞）のＣＤ２ｇのインビボでの活 性化の防止は、疾患の罹患率を実質的に減少し得る。 既に記載のように、本発明は、活性化の特定のメカニズムに制限されることを意 図していないが、ＣＤ２８活性化経路におけるＣＴＬＡ−４の役割が調べられて おり、そして本明細書中に記載されるデータと一致するモデルが仮定されている （例えば、実施例ｘｖを参照のこと）。発明者らの研究室における最近の研究に より、ＣＴＬＡ’−４遺伝子が、染色体２上のＣＤ２８のすぐ隣に位置し、類似 のゲノムの構築を伴い、そして３２％のアミノ酸相同性を有することが示された 。これらの染色体の位置および配列、ならびに構築の類似性に基づくと、ＣＤ２ ８およびＣＴＬＡ−４は、おそらく進化的な遺伝子の重複を表している。従って 、本明細書中では、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４という用語が採用されているが 、ａｌｌ的な命名法によると、ＣＤ２８αおよびＣＤ２８βと称されるのがより 適し得る。 ＣＴＬＡ−４は休止リンパ系細胞では発現しないが、ＲＮ＾レベルでのその発現 は、Ｔ細胞の活性化により迅速に誘導され得る。 ＣＴＬＡ−４が機能し得る二つの可能なメカニズムが以下に仮定される。第一に 、ＣＤ２ｇおよびＣＴＬＡ−４は、それらの細胞外ドメイン中で対合していない 一つのシスティンを含むので、このシスティン残基は、表面上に架橋したダイマ ーレセプターを形成するのに用いられ得る。これが事実ならば、ＣＴＬＡ−４が 、通常、ＣＤ２ｇと共にヘテロダイマーとして表面上に発現することが示唆され 得る。このような状況下で、天然のリガンドＢ７に対するＣＴＬＡ−４の親和性 が高いほど、ダイマーの状態において、シグナル化性能の増強と共にレセプター の親和性がより高くなり得る。これによって、抗原活性化細胞でＣＤ２８−ＣＴ ＬＡ−４へテロダイマーを介したシグナル伝達能力が増強し得る。さらに、ＣＤ ２８およびＣＴＬＡ−４が、ヘテロダイマーの状態で活性化細胞中に最初に見い だされるならば、このことは、ＣＤ２１１含有レセプターが活性化細胞中で増強 した／グナル化能力を有するという観察結果を説明し得る。 他方、本明細書中に記載されるデータはまた、ＣＴＬＡ−４が、ＣＤ２ｇの競合 的インヒビターとしてＴ細胞の活性化により誘導され、そして、Ｂ７とＣＤ２ｇ との間の相互作用を表面でさらに阻害することにより、進行中の免疫応答を負に 調節するのに用いられるというモデルに適合する。さらに、表面で発現するＣＴ ＬＡ−４がまた、分離型（ｓｈｅｄ　ｆｏ＋ｖ）で発現することがまったく可能 であり、この分離型のレセプターが、Ｂ７−ＣＤ２１１の進行中の相互作用の可 溶性競合的インヒビターとして作用し、これにより、その環境下で抗原供与細胞 が付加的Ｔ細胞を活性化するのを防止する。従って、ＣＤ２ｇの付加的イソ型（ すなわち、ＣＴＬＡ−４）を産生ずるＴ細胞の能力は、ＣＤ２ｇおよびＣＴＬＡ −４の発現の相互作用が、ＣＤ２８含有レセプターを介して活性化されるＴ細胞 の能力に対して強い効果を有することを示唆する。 ＣＤ２ｇ経路の活性化および阻害に関する研究は、Ｔ細胞を活性化してリンホカ イン産生を増大させるＣＤ２ｇの天然のリガンドＢ７の能力が、ＣＤ２Ｂホモダ イマーまたはＣＤ２８−ＣＴＬＡ−４へテロダイマーのいずれかであるＣＤ２ｇ 含有レセプターを通じて完全に媒介されることを示している。従って、ＣＴＬＡ −４ホモダイマーは、Ｔ細胞の活性化に重要ではないが、Ｔ細胞リンホカイン産 生の負の調節において重要な役割を演じ得、一方、ＣＤ２ｇ−ＣＴＬＡ−４ヘテ ロダイマーは、Ｔ細胞の活性化によるＣＤ２ｇ含有レセブターの増強したシグナ ル化特性の原因であり得ることが、データより示唆される。 ＣＤ２ｇ介在性シグナル伝達事象におけるＣＴＬＡ−４の役割は、本明細書中に 取り上げそして記載される正常Ｔ細胞の活性化に対するＣＤ２Ｂの新規で強力な 効果が、ヒトＴ細胞系で今までに観察されなかった理由を説明し得る。ＣＤ２ｇ 経路に関する初期の研究は、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞のような細胞系について行 われた。これらの細胞を刺激してＣＴＬＡ−４を発現させる幅広い試みは、完全 に陰性であった（図２０を参照のこと）。対照的に、正常Ｔ細胞の細胞周期進行 へ導＜＃ｊＡ準的な活性化事象は、化学的***促進剤（例えば、ファイトへマグ ルチニン（ＰＨＡ）およびホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ））を介 したとしても、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が架橋されるように、ＣＴＬＡ−４の発現 の迅速な誘導を導く。従って、先の研究書違が、細胞のリンホカイン産生を増強 するＣＤ２ｇ活性化経路を理解または利用するのが不可能であったのは、おそら く、これらの細胞系におけるＣＤ２８のＣＴＬＡ−４イソ型が発現しなかったこ とによるものであった。 興味深いことに、休止Ｔ細胞と抗ＣＤ２Ｂモノクロナール抗体との共刺激は、Ｃ ＴＬＡ−４遺伝子の発現を増強する（図２１を参照のこと）。従って、実際、正 常細胞におけるＣＤ２ｇ活性化経路は、ＣＤ２８ホモダイマーを介する初期のＣ Ｄ２ｇの刺激がＣＴＬＡ−４の発現を増強させることにより、ヘテロダイマーの 発現およびシグナル伝達を増強させ、正のフィードバックループを含み得る。 あるいは、増強したＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８シグナル伝達と競合してリンホカ イン産生の最終的な終結を導き、そして、負のフィードパ、クループとして作用 することによりＣＤ２ｇ介在性の進行中のリンホカイン産生を負に調節する、レ セプターの産生へと導き得る。 実施例夏 ＣＤ２ｇ刺激因子モノクローナル抗体９．３の調製。 モノクローナル抗体（ｍＡｂ）９．３　（ＣＤ２８分子の細胞外ドメインに結合 するＩｇ０２ａモノクローナル抗体）を、ｌ１ａｎｓｅｎら、Ｉ＋ｎｕｎｏｇｅ ｎ。、１０　：　２４７−２６’０（１９８０）で記載されるようにして独自に 誘導した雑種細胞系により産生じた。高力価のモノクローナル抗体９．３を含む 腹水を、Ｂａ１ｂ／ＣＫ　Ｃ５７ＢＬ／６　ｐ、ｖ　’）　ｘ　ニ５〜１０！１ ０’個の雑種細胞を腹腔内接種して、調製した。マウスは、予め腹腔内への０． ５ｍｌのＰｒ１ｓｔａｎｅ（ＡＩｄｒｉｃ、ｈ　Ｃｈｅｓｊｅａｌ　Ｃｏ、、Ｍ Ｈｖａｕｋｅｅ、　ｆｌ）で感作させていた。モノクローナル抗体９．３を、Ｈ ａｒｄｙ、Ｒ，、ｒＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒ　ＥｘｐｅｒＩｍｅｎｔａｌｌｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙＪ、ｃｈ。 １３（１９８６）に記載のブドウ球菌プロティンＡセファロースカラムで、腹水 から精製した。 機能的アッセイに用いる前に、精製■Ａｂ９．３をリン酸緩衝生理食塩水（ＫＣ Ｉ　Ｏ，２グ５ム／’）　ノトルｄＨｓｏ；Ｋ［ｌｓＰＯｇ　０．２グラム／リ ツトルｄｌｌ＊ｏ　；　ＮａＣ１８，０グラム／リツトルｄＨＪ　；　Ｎａ＊Ｈ ＰＯ，・７＋１．０２．１６グラム／す・ノトルｄＨｘｏ）に対して充分に透析 し、次いで、０．２２立方ミクロンの無菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｅ。 Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、＾ｎｎ　Ａｒｂｏｒｓ　Ｍｌ）を介して濾過 した。ｍＡｂ９゜４３ｊ１製物から、２０″Ｃで４５分間、１００．　ＯＯＯｘ ｇでの遠心分Ｈにより凝集物を取り除いた。生じる精製■Ａｂ９．３を、リン酸 緩衝生理食塩水中で再懸濁させ、０Ｄ２８０分析により決定される最終濃度を２ ００μｇ／ｍｌとし、そして使用の前に４℃で保存した。 実施例１１ ＣＤ２Ｂ”　Ｔ細胞の単離 パフイーフートを、２１歳〜３１歳の健康なドナーの白血球搬出（Ｉｅｕｋｏｐ ｈｅｒｅｓｉｓ）により得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）　（約２゜５ｘｌＯ” ）を、リンパ球分画培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅ ｄｌｕｓ）　（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、　Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ、 　ＭＤ）密度勾配遠心分離法によりバフィーコートから単離した。次いで、Ｔ細 胞のＣＤ２８１サブセツトを、Ｙａｍａｄａら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、１５　：　１１６４−１６８８（１９８５）に記載のＣＤＩＩおよびＣＤ２８ 表面抗原の相互的および非重複の分布を利用して、免疫吸着を用いる負の選択（ ｎｅｇａｔｉｖｅ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）によりＰＢＬから単離した。　ＰＢＬ を、約２０ｘｌＯ’／１にて、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４）（Ｇ ＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｑ　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）、 ５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、　Ｌｏｕｉ ｓ、　ＭＯ）、および５％熱活性化ヒトＡＢ血清（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、　Ｂｒ ｏｗｎＤｅｅｒ、　Ｈ）を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯＬａｂ ｏｒａｔａｒｌｅｓｓ　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中で懸濁させた。 細胞を、４°Ｃにて、以下のモノクローナル抗体の飽和量を有する回転振とう器 上で２０分間、インキユベートした：モノクローナル抗体６０．１（抗ＣＤ１１ ａ）　（ＢｅｒｎｓｔｅＩｎ、１．Ｄ　ら、　ｒＬｅｕｋｏｅｙｔｅ　Ｔｙｐｉ ｎｇ　Ｉｌｌ、第３巻、１−２５頁、Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ、　Ｅ、Ｌ、ら扁、（１ ９ａｌｉ）を＃照せよ）；ＩＦ５（抗ＣＤ２０）　（Ｃ１ａｒｋ、Ｅ、Ａ、ら、 ＰＩＩＡＳ（ＵＳＡ）、８２　：　１７６６−１７７０（１９８５）を参照せよ ）；ＦＣ−２（抗ＣＤ１６）　（Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ，ら、Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７７　：　１２２４−１２３２（１９８６）を参照 せよ）；および抗ＣＤ１４゜抗体のこの混合物は、全てのＢ細胞、単核細胞、大 顆粒リンパ球（ｌａｒｇｅ　ｇｒａｎｕｌａｒ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、およ びＣＤ２Ｂ−Ｔ細胞をマウスイムノグロブリンでコートした。細胞をＰＢＳで３ 回洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、１個の細胞あたり３個の磁気粒子の 比で、ヒツジ抗マウスイムノグロブリンでコードンた磁気粒子（Ｄｙｎａｌ、Ｉ ｎｃ、、Ｆｏｒｔ　Ｌｅｅ、　ＮＪ）と共に、４℃で１時間、インキユベートし た。次いで、磁気粒子に結合した抗体コート細胞を、Ｌｅａ、　Ｔ、ら、５ｃａ ｎ、　Ｊ、ｌｍ５ｕｒ＋ｏ１．．２２　：　２０７−２１６（１９８５）に記載 の磁気分離により除去した。典型的には、約７００ｘｌＯ°個のＣＤ２ｇ＋Ｔ細 胞を回収した。細胞精製はフローサイトメトリー、および組織化学的手法により 定期的にモニターした。フローサイトメトリーは、Ｌａｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、 Ａ、ら、ｒ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｕｒ４ａｅｅ　ＡｎｔｉｇｅｎｓＪ、１ １９−１２９頁（Ｈｅｌｓｅ、　Ｅ、１ｓｓ１９８４）で記載のように行った。 簡単には、ＣＤ２ｇ”　Ｔ細胞を、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ、Ｗ、、ｒＭｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉ ｃｅＪ、２３０頁（Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、Ｌ＠、１９１１３）に記載のように、 フルオレセインイソチオ／アネート（ＦＩＴＣ）−共役抗ＣＤ２　ｖｒ＾ｂ。 ＫＴｌｌ（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、　ＦＬ八およびＦＩＴＣ−共役抗 ＣＤ２８　ｍＡｂ９６３で染色した。ＣＤ２ｇ”　Ｔ細胞は、非結合イソタイプ 適合のＦＩＴＣラベルしたコントロール抗体（ＣｏｕＨｅｒ、　ｌｌｊａｌｅａ ｈ％ＦＬ）と比較して、ＦＩＴＣ−共役モノクローナル抗体０ＫＴＩＩで９９％ を上回って陽性であり、モしてＦＩＴＣ−共役モノクローナル抗体９．３で９８ ％を上回って陽性であった。残りの単核細胞は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｗｉｅａｌ 　Ｃｏ、、ＳＬ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯから得た市販のキットを用いて、非特異 的エステラーゼの染色により定量し、そしてそれは本研究で用いた全ての細胞群 において０．１％未満であった。生存度は、Ｍｉｓｈｅｌｌ、Ｂ、Ｂ、ら、　ｒ ｓｅｌｅｅｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１１．　ｌａｗｕｎｏｌｏｇｙ Ｊ、１！−１７頁（１９８０）に記載のトリバンブルー排除により測定して、約 ９８％であった。 実施例ＩＩ＋ モノクローナル抗体９．３でのＣＤ２Ｂ刺激によるヒトＴ＠ＣＤ２ｇリンホカイ ンの細胞産生の増加。 Ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−７、およびＧＭ−ＣＳＦの産生増加。 ＣＤ２Ｂ”　Ｔ細胞を、種々の組み合わせの刺激因子の存在下で約１ｘｌＯ’細 胞／ウエルで培養した。刺激因子には、以下のものが含まれた：ホルボールミリ ステートアセテート（ＰＭＡ）（ＬＣ５ｅｒｖｉｅｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ、　ＷＯｂＬＩｒｎｓ　ＭＡ）が３ｎｇ／ｍｌ　；　抗ＣＤ２８　ｍＡｂ　９ ゜３が１１００ｎ／ｍｌ　；　Ｇｅｐｐｅｒｔら、Ｊ、ｌ５ｎｕｎｏ１．、Ｈ８ ：　１６６０−１６６６（１９８７）；また、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ、１ｍ ｍｕｎｏ１．．１３５　：　２３３１−２３３６（１９８５）で先に記載のプラ スチック組織培養プレートの表面への吸養上澄み液を２４時間目に集め、そして 系列希釈してＴ、ＣＤ２８リンホカインの存在をアッセイした。 具体的には、ＩＬ−２は、Ｇ１１ｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　２６８　二１５４ −１５６（１９７７）で先に記載のパイオアフセイを用いてアッセイした。１ユ ニツト（Ｕ）を、２４時間の培養で７ｘｌＯ”個のＣＴＬＬ−２（ヒト細胞障害 性Ｔ細胞系）の最大増殖量の半分を誘導するのに必要なＩＬ−２の量として定義 した。個々の実験において、上記の各培養条件のためのＩＬ−２の相対的なレベ ルを、市販のＥＬＩＳ＾アフセイ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｒｐ、、ＢＯ８ＬＯｎ ｓ　ＭＡ）を用いて別個に確認した。ＴＮＦ−ａ　／ＬＴレベルは、Ｋｕｎｋｅ ｌら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、２６３　：　５３８０−５３８４（１９８ｇ） で先に記載の半自動化し９２９線維芽細胞溶解アブセイを用いて測定した。ＴＮ Ｆ−α／ＬＴのユニットを、ＴＮＰ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｒｐ、、Ｂｏｓ ｔｏｎ　ＭＡ）の内部標準を用いて定義したａ　ＴＮＦ−ｃｒおよびＬＴの両方 が独立して存在することを、各サイトカインに特異的であるモノクローナル抗体 が、固定化抗ＣＤ３■Ａｂ　Ｇ１９−４および抗ＣＤ−２８■Ａｂ９．３で共刺 激された細胞の上澄み液によって媒介される細胞溶解を部分的に阻害する能力に よって確認した。ＩＦＮ−７は、市販のキット（Ｃｅｎｔｏｅｏｒ、　Ｍａｌｖ ｅｒｎ、　Ｐ＾）を用いてラジオイムノアッセイにより測定した。ＩＦＮ−γの ユニットを、テストキットに提供されるＩＩＪラベルしたヒトＩＦＮ−γを用い て標準曲線から決定した。ＧＭ−ＣＳＦは、ＴＮＦ−αおよびＬＴに対する中和 モノクローナル抗体の存在下で、Ｌａｎｇｅら、Ｂｌｏｏｄ、　７０　：　１ｌ ９２−１９９（１９？）に記載のように、ヒトＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系＾ＭＬ− １９３の増殖の刺激により検出した。精製ＧＭ−ＣＳＦ　（Ｇｅｎｅｔｉｅｓ　 Ｉｎｓ目Ｌｕｔｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）の１０ｎｇ／−１により誘 導されたＪ−チミジン取り込みを１００Ｕとして定義した。細胞の個々のアリコ ートを、刺激後４８時間で回収し、そして、Ｔｈｏｓｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ 、　３１４　：　３６３−３６６（１９８５）で先に記載のように、ヨウ化プロ ビジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｔｖ　１ｏｄｉｄｅ）で細胞を染色し、７ｏ−サイト メトリーにより分析することにより、細胞周期の後期（ＳＡＧ、十Ｍ）にある細 胞の百分率をアッセイした。 表１に示すように、ＣＤ３刺激Ｔ細胞のＣＤ２８刺激は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α 、ＩＦＮ−７、およびＧＭ−ＣＳＦの細胞産生の著しい増加を生じた。 良１ １＝頭β克 ＮＴ＝客尤Ｖセ丁 Ｂ、Ｔ細胞ＩＬ−４、夏Ｌ−５、および！Ｌ−３分泌への抗ｃｏｚｇ刺激の効果 ■１２タイプのリンホカインのＴ細胞産生への抗ＣＤ２８■＾ｂ刺激の効果に関 する先の研究は、刺激の最初の数日に限定されていた。それらの研究において、 ＩＬ−４は抗ＣＤ２ｇ刺激後に検出され得なかった（　Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐ ＮＡＳ　８６　：　１３３３（１９１１９）に記載）。 この問題の再検討で、抗ＣＤ２ｇは、ＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を増加させ 得、従って、先に記載された７、１タイプのリンホカインだけでな（Ｔ６２タイ プのリンホカインの産生を増加させることが見いだされた。表２に示したように 、少量のＩＬ−４およびルー５の両方が、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８での刺激の２４ 時間後に検出され得る。しかし、細胞が培養中で８日後に再刺激された際には、 大量のＩＬ−４およびＩＬ−５の両方が分泌される。表３に示すように、同様の 結果が、Ｔ細胞のＣＤ２ｇサブセットがホルボールミリステートアセテート（Ｐ ＭＡ）と抗ＣＤ２１１　ｍＡｂとを組み合わせて刺激した際に、見いだされた。 これらの結果は、少量のＩＬ−４およびＩＬ−５が、休止Ｔ細胞の抗ＣＤ２１１ による初めの刺激の後に検出され得ることを示した。しかし、刺激を継続すると 分化が生じ、そして多量のＩＬ−４および、特に大量のＩＬ−５が産生され、一 方でより少量のＩＬ−２およびγ−ＩＦＮもまた産生される。 （以下余白） 表２ 上記の表２のデータは、次のプロトコルを用いて得た：ｃＤ２８゛Ｔ細胞を、実 施例１１に記載のように、モノクローナル抗体および磁気イムノビーズを用いて 負の選択により単離した。 細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地（培地）、あるいはプラスチックに吸 着した抗ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９−４、または、プラスチックに吸着し た抗ＣＤ３に加えて０．５μ／１で溶液に添加した抗ＣＤ２８　ｍＡｂ　９．３ を含む培養ウェルで、１ｘｌＯ’個／ｍｌで培養した。細胞培養物からの上澄み 液を、市販のＥＬＩＳＡキｙ）を用いてリンホカイン濃度について分析し、そし て値を、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびγ−ＩＦＮについてはｐｇｌｍｌとして、ま たはＩＬ−２については１１あたりのユニットとして表した。上澄み液を２４時 間の培養後、分析しく初期）、あるいは、細胞を上記の刺激の形で８日間培養し 、細胞を回収し、洗浄し、次いで、当初の処理で再刺激し、そして上澄み液をさ らに２４時間の刺激の後、分析した（再刺激）。その値は、２回の培養の平均を 示す。 上記の表３のデータは、以下のプロトコルを用いて得た：ＣＤ２ｇ”　Ｔ細胞を 、実施例Ｉ＋に記載のように、モノクローナル抗体および磁気イムノビーズを用 いて負の選択により単離した。細胞を、１０％ＦＳＣを含むＲＰＭＩ培地（培地 ）中にて、あるいは培地とＰＭ＾３　ｎｇ／ｍｌ中にて、またはＰＩｉｌＡと抗 ＣＤＺａ　ｍＡｂ　９．３を０．５μｇ／ｍｌ中にて、ｌＸｌ０＠個／ｍｌで培 養した。細胞培養物の上澄み液を、市販のＥＬＩＳＡキ・ノドを用いてリンホカ イン濃度について分析し、そして値を、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびγ−ＩＦＮに ついてｐｇｌ−１として表した。上澄み液を２４時間の培養の後、分析しく初期 ）、あるいは、細胞を上記の刺激の形で８日間培養し、次いで、再刺激し、そし て上澄み液をさらに２４時間の刺激の後、分析した（再刺激）。その値は、２回 の培養の平均を示す。 抗ＣＤ２ｇ処理後のＴ細胞におけるルー３発現の誘導。ＩＬ−３は、Ｔ細胞によ り主としてに産生され、そして一般にＴ＊１細胞により産生されると考えられて いる多重結合（−ｕ１目ｌｉｎｅａｇｅ）造血増殖因子である。本明細書中に記 載の実験的プロトコルおよび結果は、Ｇｕｂａ、　Ｓ、Ｃ，ら、Ｊ　Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、　＋１４（６）　：　１７０１−１７０６（１９ｊ１９）に詳細 に記載され、本明細書中で参考として援用されている。 ＰＢＬを上記のように単離した。Ｔ細胞のＣＤ２ｇ＋サブセットをＪｕｎｅ、　 Ｃ，Ｈ，ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：　４４７２−４４８１（ １９δ７）に記載の負の選択により単離した。いくつかの実験においては、Ｔ細 胞のＣＤ２ｇ＋サブセットを、ＰＢＬを■Ａｂ９Ｊとインキュベートし、次いで 、ヒツジ抗マウスコート磁気ビーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｊｅｓ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）でＣＤ２８”細胞を取り 出すことにより単離した。ノーザン（ＲＮＡ）プロット分析を、Ｊｕｎｅ、　Ｃ ，Ｈ。 ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：　４４７２−４４１１１（１９ｇ ？）に記載のように行った。ＩＬ−３プローブは、１．０ｋｂＸｂｏ　Ｉ　ｃＤ ＮＡフラグメントであった。 Ｔ細胞の活性化のＴＣＲ／ＣＤ３経路の刺激が、ＩＬ−３遺伝子発現を誘導した かどうかを決定するために、ＣＤ２８″″Ｔ細胞を、最大量のプラスチック固定 化抗ＣＤ３　ｓＡｂで、１ｇｇ／ｓｌの９．３ｍＡｂの存在下または非存在下で 、１〜３６時間刺激した。表４に示すように、抗ＣＤ２８は、ＣＤ３単独による 誘導に比べて、ＩＬ−３ａＲＮＡ発現の３〜５倍の増強を生じた。ＣＤ２ｇは、 ＩＬ−３遺伝子発現の速度論を変化させず、抗ＣＤ３処理後、または抗ＣＤ３＋ 抗ＣＤ２８処理後、６時間でピークレベルに達した。さらなる実験は、ノーザン 分析（表４）により決定されたように、ＩＬ−３遺伝子の発現がＴ細胞のＣＤ２ ｇ＋サブセ・ットに限定されることを示した。 ＩＬ−３議１１Ｎ＾の安定度もまた決定された。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、または抗 ＣＤ３と抗ＣＤ２δｍＡｂで３時間処理し、ＩＬ−３■ＲＮ＾発現を誘導させた 。３時間口に、アクチノマイシンＤを培養物に添加し、さらなるＲＮＡ合成を阻 害させた。全細胞のＲＮＡを単離し、そして残存するルー３■ＲＮＡをノーザン 分析により決定した。抗ＣＤ３と抗ＣＤ２ｇで処理した細胞のＩＬ−３ｓＲＮ＾ の半減期は、抗ＣＤ３処理した細胞のＩＬ−３ｍＲＮ＾よりも少なくとも８倍よ り長かった（表４）。従って、他のリンホカインについての抗ＣＤ２１１の上記 の結果から予期されるように、Ｉし一３遺伝子誘導における抗ＣＤ２８の効果は 、ＣＤ２ｇがルー３メツセンジヤーＲ）ｌ＾を安定化させる能力により、大部分 が説明され得ることを結論付は得る。 （以下余白） 表ヰ 実施例ｔＶ ＣＤ２Ｂ刺激と他のＴ細胞表面分子の刺激との比較。 ＣＤ２８″″Ｔ細胞を、約１ｘｌＯ”細胞／ウェルで、５％熱不活性化ウシ胎児 血清（ＦＣＳ）、ｐＨ＾Ｌｏμｇ／ｍｌ、　ＰＭＡ　３　ｎｇ／ｍｌ、　１１０ ０ｎ／ｍｌのイオノマイシン、１１００ｎ／ｍｌの抗ＣＤ２８　ｍＡｂ　９．３ 、あるいは１ｇｇ／ｍｌ（ＤＣ０４５１ｍ特異的なｍＡｂ９．４または１　ｕ　 ｇ／５ｌ（１）ｃｏ２ニ特異的なｍＡｂ９．６、あるいは２００ｎｇ／ウェルの ＣＤ３に特異的な固定化■Ａｂ　Ｇ１９−４を含有するＲＰＭＩ培地で培養した 。 ＣＤ２８９Ｔ細胞を、５％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ中、平底 の９６−ウェルマイクロタイタープレート中で４組のサンプルについて培養した 。細胞の等しいアリフートを１８時間培養し、次いで、１μＣ１／ウエルの１ト ウリジンで６時間パルスを与え、または７２時間培養し、次いで、１μＣ１／ウ エルの３トチミジンで６時間パルスを与えた。細胞をグラスファイバーフィルタ ー上に集めた後、平均および標準偏差を（ｅｐ議で）、液体シンチレーシッンカ ウンターにより決定した。 抗ＣＤ３モノクローナル抗体によりプラスチックに固定された細胞を含む全ての 培養物を、目視により検査し、完全に細胞を集めたことを確認した。これらの培 養物における細胞がＰＨＡに応答して増殖できない原因は、上記実施例１１に記 載の負の免疫吸着による、補助細胞、インビボで活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、 およびＣＤＩＩ“（ＣＤ２ｇ−）　Ｔ細胞の激しい減少のためである。各実験に おいて、細胞をフルオレセイン共役抗ＣＤ２■＾ｂＯＫＴＩＩおよびフルオレセ イン共役抗ＣＤ２８　ｗＡｂ　９．ｆｆで染色した。 そしてそれぞれ９９にを上回る表面、および９８％を上回る表面が陽性であった 。 典型的な実験を図１および図２に示す。図１および図２に示すように、抗ＣＤ２ ｇは、それ自体、ウリジンまたはチミジン取り込みに対して顕著な効果を有さず 、固定化抗ＣＤ１−＾ｂＧ１９−４により誘導される増殖、またはホルボールミ リステートアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）を含む化学 的に誘導されるＴ細胞増殖のいずれかを増大するように作用することもない。し かし、図２に示すように、抗ＣＤ２１１は、両方のセットの細胞のウリジンの取 り込みを顕著に増加させた。これに対して、抗ＣＤ２■Ａｂ　０ＫＴＩＩおよび 抗ＣＤ４Ｓ■Ａｂ９．４を含む他のモノクローナル抗体は、抗ＣＤ！刺激細胞の ウリジン取り込みに顕著な効果を有さなかった。これは、細胞におけるこれらの 抗体の効果がないためではない。なぜなら、抗ＣＤ２モ／クローナル抗体は抗Ｃ Ｄ３刺激細胞の増殖を顕著に増大させたからである。別の実験において、インタ イブ適合■＾ｂと他のＴ細胞表面抗原（ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ？、またはＣＤ８ ）との結合は、抗ＣＤ２１１で認められたものと類似の効果を生じなかった。 これらのデータから、ＣＤ２＋１による活性化Ｔ細胞の刺激が特異な表現塁を有 することを確認できる。その表現型は、Ｔ細胞の増殖を直接増強することなく、 Ｔ細胞の定常状態ＲＮＡへの放射性マーカーの取り込み速度を直接増強するよう である。 実施例Ｖ Ｅｘ　ｖｉｖｏでのＣＤ２ｇ刺激によるヒトＴｍＣ０２ｇリンホカインの細胞産 生の増加。 インビトロシステムでの証拠に基づくと、抗原による活性化またはそれと同等な ものを経た後でなければ、ＣＤ２Ｂはリンホカインの細胞産生に顕著な効果を有 さないようであった。 しかし、９．３ｍＡｂによるＣＤ２Ｂ結合は、抗ＴＣＲ／ＣＤ３活性化Ｔ細胞が ヒ）Ｔ工ｌタイプのリンホカインの産生を持続する能力を顕著に増大させた。生 理学的なセツティングにおけるこの効果をテストするために、ｅｘ　ｖｉｖｏの 全血液モデルでのＴリンノく球の活性化を調べた。 ５０から１００１の静脈血を、承諾を得た後に正常なボランティアから標準的な 無菌手順により得た。血液を２５Ｕ／ｍｌの防腐剤無添加のヘパリン（Ｓｐｅｃ ｔｒｕｍ、ＧａｒｄｅｎｉａＳＣＡ）でヘパリン化し、凝固を防止した。次いで 、各々１０ｍ１のアリコートを、１５ｓ＋１のポリプロピレンチューブ内に、ロ ッキングプラットホーム（ｒｏｃｋｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍ）上に置き、サンプ ルの流動および通気を保持した。 リンホカイン遺伝子発現の誘導におけるＣＤ２ｇの刺激の効果をアブセイするた めに、ＴＮＦ−α分子の産生をモデルとして選択した。その理由は、このタンパ ク質が全血液中で極端に短い半減期（約１５分）を有するためである。上記のよ うに単離した全血液の１０■ｌを、可溶性抗ＣＤ３　ｍＡｂ　Ｇ１９−４の１ｇ ｇ／腸ｌの濃度と、または抗ＣＤ２８　ｇ＋Ａｂ　９．３のｌμｇ／謹１の濃度 と、あるいはその２つの抗体を組み合わせたものと、インキユベートした。 血漿を、１時間および４時間で実施例Ｉ１１に記載のようにＴＮＦ−αについて アッセイした。そのような実験の１つの例を表５に示し、最大のＣＤ３の刺激お よびＣＤ２ｇの共刺激により、ＴＮＦ−αの持続した産生が顕著に増加したこと を示す。 （以下余白） 表ｙ 実施例ＶＩ ＣＤ２ｇ誘導Ｔ細胞の増殖のシクロスポリンへの耐性。 本明細書中に記載の用いたプロトコルおよび結果は、Ｊｕｎｅ。 Ｃ，Ｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ！、、７　：　４４７２−４４８１（ １９ｇ？）で詳細に記載されており、本明細書中に参考として援用されている。 Ｊｕｌｌｕｓら、Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　１１１ｕｎｏ１．．３　：　６４５−６４ ９（１９７３）に記載のようにナイロンウール濾過により濃厚にしたＴ細胞を、 以下の組み合わせの刺激因子の存在下で約５ｘｌＯ’個／ウェルで培養した：抗 ＣＤ２８　ｍＡｂ　９．３（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（ｌｎｇ／ｍｌ） 　；あるいは固定化抗ＣＤ３　ｍＡｂ　Ｇ１９−４　（２００ｎｇ／ウェル）； またはＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）。上記の組み合わせはまた、Ｗｉｅｓｉｎｇ ｅｒら、１ｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、１５Ｇ　：　４５４−４６３（１９７９）に記 載のようにエタノール−Ｔｗｅｅｎ　８０に溶解した、４倍の力装置（ｔｉｔｒ ａｔｉｏｎ）　（２５ｎｇ／ｍｌ〜１．６μｇ／ｍｌ）のシクロスポリン（ＣＳ Ｐ）（Ｓａｎｄｏｚ、　Ｈａｎｏｖｅｒ、　ＮＪ）を含んでいた。 １Ｈ−チミジン取り込みを、培養の３日目に測定し、そして８つの独立した実験 のうちの典型的な結果を図３に示す。ＣＤ２ｇ誘導Ｔ誘導場細胞増殖平均（、９ １，１１５０±１３００　（平均上標準偏差））は、ＰＭＡの投与を伴う場合、 はとんど完全なシクロスポリン耐性を示す。以下の表６は、次の条件下、平底９ ６−ウェルマイクロタイタープレー）　（ＣｏＳｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ％Ｍ＾）中、約５！１Ｇ’細胞／ウエルで培養されたＣＤ２ｇ”　Ｔ細胞のＣＤ ３誘導増殖へのシクロスポリンの効果を示す：固定化■＾ｂ　Ｇ１９−４　；ま たは固定化冒Ａｂ　Ｇ１９−４および■＾ｂ　９．３０１１００ｎ／ｍｌ　；ま たは固定化ｍＡｂ　Ｇ１９−４およびＰＭＡｌｎｇ／ｍｌ　；またはｍＡｂ　９ ．３１１００ｎ／ｍｌおよびＰＭ＾ｌｎｇ／■１０　シクロスポリンを上記のよ うに調製し、そして０，０．２．０．４．０．８．１．２μｇ／−１で培養物中 に含有させた。 １Ｈ−チミジン取り込みを上記のように３日目の培養物で決定した。増殖の阻害 の百分率を、培地のみで、またはシクロスポリン１．２μｇ／會ｌで、培養した ＣＤ２ｇ”　Ｔ細胞間について計算した。シクロスポリンの非存在下で培養した ＣＤ２１１＋Ｔ細胞に、シクロスポリン希釈液を与丸た。培地、またはＰＭＡ、 またはモノクローナル抗体９．３単独で培養した細胞の８Ｈ−チミジン取り込み は、ｌ５Ｏｃｐｓ未満であった。表６に示すように、ＣＤ３およびＣＤ２８の共 刺激は、Ｔ細胞増殖のシクロスポリンへの耐性の著しい増加を生じ、そしてＰＭ Ａの存在下でのＣＤ２ｇの刺激では、Ｔ細胞増殖のシクロスポリン抑制の完全な 欠如を生じた。表７に示すように、ＣＤ２８と固定化抗ＣＤ３との刺激はまた、 免疫抑制剤であるデキサメタシンによるＴ細胞増殖の抑制に対する耐性を生じた 。 表７ 丁ｈＲ乙５１４ｔｒ−ろ・ワうデキサメタン“シ町１本＊ｈｔｒｒＱＤ！止り！ ａこの効１しく以下余白） 実施例Ｖ、Ｉ　Ｉ シクロスポリンの存在下での ヒトＴ、Ｃ０２ｇリンホカイン分泌 実施例Ｉ１１に記載したように、ＣＤ２１１”Ｔ細胞を種々の刺激因子の存在下 で培養した。培養上清を２４時間で採取し、上記のようにＩＬ−２、ＴＮＦ−α 几Ｔ、　ＩＮＦ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦについて系列希釈物をアブセイした。 細胞の別個のアリコートを刺激後４８時間で回収し、細胞周期の後期（Ｓ＋Ｇ１ ＋Ｍ）にある細胞の比率についてアッセイした。 表８（実施例ＩＩ＋のデータも比較のために引用する）に示されるように、０． ６μｇ／ｗ＋１でシクロスポリンを試験プロトコールに含む場合、ＣＤ２ｇ”Ｔ 細胞は、ｍＡｂ９．３およびＰＭＡ、または固定化した璽Ａｂ　Ｇ１９−４およ び謙Ａｂ９にまたはＰＭＡおよびイオノマイシンおよび■Ａｂ９．３で刺激した 培養物中で、シクロスポリンの存在下、ＴＮＣＤ２ｇリンホカインを分泌するこ とが判明した。しかし、固相ｍＡｂ　Ｇ１９−４；またはイオノマイシンおよび ＰＭＡにより誘導される７ｗＣＤ２１１リンホカイン産生は、シクロスポリンの 存在下で完全に抑制された。 （以下余白） 表８ 実施例マＩＩＩ シクロスポリンの存在下における ヒトＴＭＣ０２８リンホ力インｍＲＮＡ発現ＣＤ２１１の刺激がシクロスポリン 耐性Ｔ、ＣＤ２ｇリンホカイン遺伝子の発現および分泌を導くかどうかをさらに 試験するために、種々の刺激物質による刺激の後で、！Ｌ−２、ＴＮＦ−α、Ｌ Ｔ、　ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの誘導を抑制するシクロスポリンの能力 を試験した。詳細には、５％ＦＣＳ　（ＭＥＤ）を含む完全ＲＰＭＩ培地（ＧＩ ＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）中で、ＣＤ２ｇ”Ｔ細胞を２×１０ “／ｍｌで培養した。ＣＤ２８”Ｔ細胞の個々のアリコートを、ＰＭＡ３ｎｇ／ ｍｌおよび抗ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３（１ｌｇ／■１）；または固定化抗ＣＤ３ 冒＾ｂ　Ｇ１９−４（１ｇｇ／ウェル）；または固定化−Ａｂ　Ｇ１９−４（１ ｇｇ／ウェル）および謁Ａｂ　９゜３（１ｎｇ／■１）を含む１．０ｇｇ／■ｌ シクロスポリンの存在下または非存在下で６時間インキュベートした。ＣＤ２Ｂ ”Ｔ細胞を採取し、以前にＴｂｏｓｐｓｏｎらによるＮａｔｕｒｅ、　３１４： ３６３−３６６（１’９８５）に記載のように、全細胞ＲＮＡを単離し、リポソ ームＲＮＡについて均等に分配した（ｅｑｕａｌｉｚｅｄ）。 ノーザンプロットを調製し、そしてＪｕｎｅ、　（：、　Ｈ，らによるＭｏｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　７：４４７２−４４８１（１９８７）に記載のように 、ｓｓＰでラベルされ、ｎ１ｃｋ翻訳された遺伝子の特異的プローブで連続して ハイブリダイズした。ＩＬ−２プローブは、Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ，らによるＭｏ １．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、７：４４７２−４４８１（１９８７）に記載の１． 　Ｏｋｂのｐｓｔ　Ｉ　ｃＤＮＡフラグメントであり：ＩＦトγプローブは、Ｙ ｏｕｎｇらによるＪ、　Ｉ＋＋ｍｕｎｏ１．　、１３６：４７００−４７０３（ １９８６）に記載の１．０ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　ｃＤＮ＾フラグメントであった。 ＧＭ−ＣＳＦプローブは、ｌｏｎｇらによる５ｃｉｅｎｃｅ、２２８：８１０− ８１５（１９８５）に記載の７００塩基対のＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｌＩＩ　ｅＤＮ Ａフラグメントであり；４Ｆ２プローブは、ＬｌｎｄｓｔｅｎらによるＭｏ１． Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、８：３ｇ２０−３８２６（１９８ｇ）に記載の１．８Ｓ ｋｂのＥｅｏＲＩ　ｅＤＮ＾フラグメントであり；ＩＬ４プローブは、Ｙｏｋｏ ｔａらによるＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８３：５８９４−５１１９８（１９８Ｇ＞に 記載の０．９ｋｂのＸｈｏ　Ｉ　ｅＤＮＡフラグメントであり；そしてヒト白血 球抗原（■ＬＡ）プローブは、ＬｉｎｄｓｔｅｎらによるＭｏ１．　Ｃｅ１１． 旧ｏ１．．Ｉｆ：３１１２Ｇ−３８２６（１９８ｇ＞に記載のＦＩＬ＾−８７遺 伝子由来の１．４ｋｂのＰｓｔ　Ｉフラグメントであった。ＴＮＦ−αおよびＬ Ｔの特異的プローブは、　５ｔａｆｆｅｎらにょるＪ。 Ｉｓｗｕｎｏｌ、　、　１４０　：　２６２１−２６２４　（１９８８）および ｌｌａｎｇらによる５ｃｉｅｎｃｅ。 ２２８＋１４９−１５４（１９８５）に記載の遺伝子特異的な３０個のヌクレオ チドオリゴマーとして合成した。ハイブリダイゼーションの後で、プロットを洗 浄し、そして−７０℃で、オートラジオグラフィーにさらした。Ｌｉｎｄｓｔｅ ｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　８　：　３８２０−３１１２６ （１９８８＞に記載のデンシトメトリーによって、バンドの濃度の定量を行った 。 図４のノーザンプロットによって例示されるように、ＰＭＡを含む＋＋Ａｂ９． ３による刺激、および、ｍＡｂ　Ｇ１９−４を含むｍＡｂ９．３による刺激は、 シクロスポリンに対して耐性を示すヒトＴ工ＣＤ２８リンホカイン遺伝子発現を 導いた。対照的に、ＴＣＲ／ＣＤ３■＾ｂＧＩ９−４のみによる刺激は、シクロ スポリンの存在下で完全に抑制された。 実施例１ｘ ＣＤ２８刺激によるＴ細胞のインビボでの活性化Ａ、モノクローナル抗体Ｌ！　 Ｆ（ａｂ’）ｍＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、　Ａ、らによるＪ、　１ｍ５ｕｎｏ １．　、１３５　：　２３３１−２３３６　（１９１１５）に記載のように、　 ｓＡｂ　９．３のＦ　（ａｂ’　）　＊フラグメントを調製した。精製され、そ してエンドトキシン非含有のＦ（ａｂ’）＊フラグメントを、３０分間にわたっ て、健康なマカブク類（Ｍ、　ｎｅｗ＋ｅｓｔｒｉｎａ）のサルに、１ｉ＋ｇ／ ｋｇ体重で静脈内注射した。注射の２日および７日後、５霞１の血液を抜き取り 、そして試験した。 サルの血液由来の末梢血リンパ球を、実施例■に記載のように、濃度グラジェン ト遠心分離によって単離した。ＰＶＡ（Ｉｎｇ／ｍｌ）に応答する末梢血単核細 胞の増殖を、実施例＋Ｖに記載のように、処理されたサルおよびコントロール動 物（Ｆ（ａｂ’）、フラグメント未処理）３匹ずつで試験した。３日間の実験の 最後の６時間における′Ｈ−チミジンの摂取によって増殖を測定し、そしてその 結果を図５に示した。３つの培養物の平均が示され、そしてその平均の標準偏差 は各時点において２０％未満であった。図５に示すように、Ｆ（ａｂ’）、　ｍ Ａｂ　９．３フラグメントによるインビボでのＣＤ２１１の刺激は、少なくとも ７日間、Ｔ細胞の増殖を増加させた。 Ｂ、モノクローナル抗体９．３ 霊長類のＭａｅａｃａ　厘ｕｌａｔｔａに、２種類の投与量（１０ｍｇおよび０ 、１ｍｇ）の峰ｂ　９．３を静脈内投与した。３匹の動物を、各投与量について 、以下に記載のように評価した。 細胞群の変化、　多量の投与量について、即時性の効果をはじめの１２０分間に わたってモニターした。図６Ａおよび６Ｂに描かれた代表的な結果は、リンパ球 の数の経時的な変化を示す。＾ＬＣ，および、ＣＤ２８ＪＢ胞の分布を、図６Ａ に示す。一方、図６Ｂは、ＣＤ４”ｋよびＣＤ８”＄１胞の分布を例示している 。 絶対的リンパ球数（ＡＬＣ）は、はじめの６０分間にわたって減少し、次いで、 ２４時間で増加した（図６Ａを参照のこと）。この場合には、Ｃ０２ｇ陽性リン パ球の数は本質的に同一のままであるが、はじめの３０分の後、抗体でコートさ れた（ヤギ抗マウスフィコエリスリンを加えることによって測定された）。この 同じ動物において、ＣＤ４およびＣＤ８陽性群が測定され、そして２４時間での 増加は、ＣＤ８”ＣＤ２８−細胞によるものであった（図６Ｂを参照のこと）。 ８日後に再評価した動物は、抗体でコートされた３５％と６０％との間のＣＤ２ ｇ”ｌＢ胞を有していた。０．１６で処理された霊長類の循環するリンパ球数に は、著しい変化はなかった。 インビトロでの刺激の後に放出されるサイトヵイン、破傷風トキソイドで予め免 疫化され、そして１０ｍｇのｍＡｂ９．３で処理された霊長類から特定の時点で 単離されたＰＢＬを、インビトロで培養して、サイトカイン生産における抗原性 の刺激の効果を測定した。図７Ａは、インビトロでのＴＮＦの生産を表し、一方 、ｒＸＪ７Ｂは、インビトロでのＩＬ−８の生産を表す。コンカナバリン−ａ　 （Ｃａｎ−ａ）で刺激されたＰＢＬは、△で表される。破傷風トキソイド（１丁 ）で刺激されたＰＢＬは、・で表される。刺激されていないＰＢＬは、Ｏで表さ れる。図７Ａおよび７Ｂにおいて示されるように、ベースライン細胞の培養物は 、Ｃａｎ−ａ刺激およびＴＴ刺激のいずれにも応答しなかった。しかし、図７Ａ において示されるように、抗体の注入６時間後の動物から単離されたＰＢＬは、 ＴＮＦ生産の増加を示した。図７Ｂにおいて示されるように、２４時間後、刺激 されていない培養物は、ＴＮＦは生産したが、ＩＬ−６は生産しなかった。ＴＴ 刺激されたＰＢＬでは、ミトゲンで刺激された培養物と同様量のＴＮＦおよび！ Ｌ−６を生産した。 この応答は、７２時間に至るまで一定であつた。 モノクローナル抗体９．３を、ポーラスとして（１０ｍｇ（ｎＩＩ３）で１日の み）、または複数日注入物として（５日間連続して１０■ｇ７日（ｎ１１３）で ）のいずれかで霊長類に投与し、そしてその動物を同時に追跡した。抹消血細胞 群の変化は、劇的ではなかった。前に見られたように、ＡＬＣは、最初の注射に より減少したが、さらに注入物を投与しない場合にはベースラインを越えて回復 した。しかし、複数回の注射により処理された動物については、ＡＬＣは、ｍＡ ｂ投与の期間中、通常の約２５％未満を維持した。複数回処理された動物のＡＬ Ｃは、２１日間の実験期間にわたって通常のレベルを越えるレベルには回復しな かった。 絶対的好中球数は、５日間処理されたグループでは、約３０％減少した。 血清中のサイトカイン、血清をＩＬ−６、ＴＩＩＦ、および］Ｌ−１βについて 分析した。血清調製物からのＴＮＦの検出は、首尾良くはいかなかった。従って 、今回、結果は得られていない。図８Ａおよび８Ｂは、５Ａｂ９．３の注入後の ルー６の血清濃度を示す。 図８Ａおよび８Ｂにおいて示されるように、ｍＡｂ注入の２４時間後、ＩＬ−６ レベルの上昇が検出された。１回注射した動物においては、ルー６レベルは、４ 日目にピークまで上昇したが、８日目に再び測定されたとき、低下が見られた（ ｌｌ１７８Ａを参照のこと）。対照的に、５日間処理された動物（多数回投与量 ）は、８日間にわたってルー６において継続的な上昇を示した（図８Ｂを参照の こと）。 ｒＸＪ９　Ａオヨび９Ｂｊｉ、ＩＩＡｂ９．３（Ｄ注入の後（ＤＩＬ−１〕血清 濃度を示す。図９Ａおよび９Ｂにおいて示されるように、血清中のＩＬ−１βの 測定によると、１回注射された動物（図９Ａを参照のこと）および複数回注射さ れた動物（図９Ｂを参照のこと）の両者において８日後まではいずれのルー１も 検出されなかった。しかし、２１１日目は、複数回注射された動物ではレベルが 上昇していたのに対し、１回注射された動物ではレベルは低下した。 インビトロでの刺激後のサイトカインの放出、ｎ、−６生１Ｍは、インビトロで のＴＴによる刺激の３日後では、動物ノｐＢｔ、＋：おいて検出されなかった（ 図１０）。このことは、上記のインビトロでの結果と対照的であった。しかし、 ＩＬ−６の生産の増加が７日目に検出され、そしてさらに著しい増加が、５日間 処理された霊長類から単離されたＰＢＬから見られた。１４４日目単離されたＰ ＢＬの培養物において、生産の増加がさらに見られた。 ＰＢＬのＩＬ−＠生産および増殖、　図１ＯＡおよびＩＯＢは、サルから単離さ れた、インビトロで刺激されたＰＢＬのＩＬ−６生産を示している。図ＬＯＡお よびＩＯＢにおいて、１白目、３白目、および１４日日目、コントロールを表す △および刺激されたＰＢＬ応答を表すＯで示される。図１ＯＡは、１回注射され た動物の応答を示し、そして図１０Ｂは、複数回注射された動物の応答を示す。 （ＰＢから採取された細胞量は、実施されるアッセイの数を制限し、その結果、 θ８目のポイントおよび０８目のデータがないことに注意すること。）　ＰＢＬ を、異なる処理されたグループから単離し、そしてＣｏｎ−１、ＴＴ、および刺 激されていないものに対するそれらの増殖応答について評価した。歴史的には、 ＴＴ応答は、約Ｓ、　０ＯＯｃｐ■であり、モしてＣ。 ｎ−ａ応答は、約３５．’０００ｅｐ−であった。従って、この結果により、Ｃ ａｎ−ａに対するＰＢＬ増殖応答は、減少し、そして徐々に回復したことが示さ れる。ＴＴで刺激した場合には、増殖応答は見られなかった。このことは、イン ビトロでの培養において見られるリンホカイン生産と対照的である。 実施例Ｘ ＣＴＬＡ４１ｇによる免疫調節 Ａ、インビトロ アロ抗原に対する一次免疫応答におけるＣＴＬＡ４１ｇの効果を、まず、Ｌｅｗ ｉｓラット（ＩＩＴ１’、応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））とＢｒｏｗｎ−Ｎｏ ｒｗａｙラット（ＲＴＩ”、刺激体（ｓｔｔｍｕｌａｔｏｒ））との間で、一方 向混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において試験した。リンパ球を、気管前および類 リンパ節から単離したａ　Ｔｕｒｋａ、Ｌ、Ａ、ら、丁ｒｘｎｓｐｌａｎｔ、　 。 ４７：３ｇｇ−３９０（１９８９）に記載されたように、９６ウエルの丸底のプ レート中の４つづつで、培養を行った。４日後に培養物を採取し、そしてｌ■Ｃ １／ウェルの１トチミジンを、培養の最後の６時間に加えた。このアッセイにお いて、Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙ刺激体の細胞を、３００Ｆで照射してその細胞 の増殖を抑制し、次いで、Ｌｅｖ１ｇ応答体のリンパ球の培養物に加えた。増殖 応答は、Ｍａｒｒａｅｋ、　Ｐ、ら、１ｍｍｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ、　９：３ ０８−３１５（１９８ｇ）に論じられているように、同種異系のＭＩＩＣに対す る応答としての、細胞表面のＴＣＲを介する活性化の結果として、通常、約１− ５ｚの細胞において生じる。ＣＴＬ＾４１ｇ、または、Ｆｅ１１．Ｉｌ、Ｐ、ら 、Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｗ、　（印刷中）に記載のインタイブ適合の（ｉｇｏ ｔｙｐｅ−ｍ＠ｔｃｈｅｄ）コントロールモノクローナル抗体Ｌ６を、種々の濃 度で加えた。 図１１は、一方向混合リンパ球培養におけるＣＴＬ４１ｇの効果を表す。図１１ に示されるように、ＣＴＬ４１ｇは、用量依存様式において増殖をブロックし得 、ｌ■ｇ／ｍｌの濃度では実質的に完全な阻害が見られた。（結果は、′Ｈ−チ ミジンの取り込み士標準偏差の１分間当たりの数として表される）。自発的な増 殖は、Ｂｒｏｗｎ−ＮｏｒｖａＦ刺激体の非存在下で、Ｌｅｖｉｓ細胞によるチ ミジンの取り込みである。このことは、図１１において黒塗りの四角で示されて いる。これらの結果と一致して、同種異系反応性のτ細胞応答はまた、＾ｚｕｍ ａ、　Ｍ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７５：＄５３−３６０（１９９２）に 示されるように、抗ＣＤ−２８モノクローナル抗体の非刺激Ｆ（ａｂ’）フラグ メントによって阻害され得る。これらのデータは、組み合わせると、インビトロ での増殖応答を開始するために、同種異系反応性のＴ細胞は、ＴＣＲのＭ８Ｃエ ンゲージメントにより刺激されるだけでなく、ＣＤ２ｇレセプターのＢフ咬合に よる共刺激を要求しなければならないことを示唆する。 Ｂ、インビボ：心臓同種移植。 次にＣＴＬＡ４１ｇをラットの臓器移植のモデルに用い、そのインビボでのアロ 抗原応答を遮断する能力を確認した。レシピエンド動物は異所性心臓移植を受け 、それはＢｏｉｌｉｎｇ、　Ｓ、Ｆ、ら、シ」１す１μｍ１．５３：２８３−２ ０（１９９２）に記載のように首の血管に吻合する。移植片を触診により機構的 機能を、そして心電計により電気生理学機能をモニターした。移植片拒絶は、触 診可能な収縮機能の最終日に起こるといわれた。最初の試験として、動物を毎日 ＣＴＬＡ４１ｇまたはアイソタイプ適合のコントロールモノクローナル抗体Ｌ６ の注射で７日間処置した。ＣＴＬＡ４１ｇをｏ、ｏｔｓｓｇ／日（５匹）、０． ０５冒ｇ／日（５匹）、および０．５日ｇ７日（８匹）の用量で投与した。Ｌ６ は０．５■ｇ／日で与えた。未処置ルイス（Ｌｅｖｉｓ）ラットは６．８±０． ３日（ｎ−１０）で異所性Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙ同種移植片を拒絶した。Ｃ ＴＬＡ４１に処置動物中の移植片は薬物投与の完了後も機能を維持した。一方、 未処置動物、またはＬ６コントロール抗体で処置した動物は、表９に示すように 一様１こ８日（ｐ＜０．０００１）までにその移植片を拒絶した（ｐ値はカイ二 乗分析により算出した）。 表９ ＣＴＬＡ４１ｇ処置ラットでは、観察できる急性または慢性の副作用は上記タン パク質の投与からは示されなかった。剖検によればＣＴＬＡ４１ｇ処置動物に大 きな解剖学上の異常は観察されなかった。 未処置動物およびＣＴＬ＾４１ｇ処置動物を組織学検査のために屠殺した。心臓 同種移植片を、未処置動物（図１２Ａに示す）およびＣＴＬ＾４１ｇ処置動物（ ０，５５ｇ７日）（図１２Ｂに示す）から、移植後４日で取り除いた。同種移植 片はホルマリンで固定し、組織切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。　 （オリジナル写真は２００ｘ倍）。未処置動物から取り出したドナーの心臓は、 重篤な急性細胞性拒絶の組織学的な所見を示した。それは間隙性単核細胞の水腫 形成を伴う著しい浸潤、筋細胞の破壊、および細動脈壁の浸潤を含む。それに対 して、ＣＴＬＡ４１ｇ処置動物由来の移植心臓は単に弱いリンパ球浸潤を示した 。明白な単核細胞壊死および細動脈障害の証拠は存在しなかった。各動物由来の 本来の心臓は組織学的な異常を示さなかった。 ＣＴＬＡ４１ｇ治療が薬物処置後に持続する移植寛容の状態を確立したかどうか を決定するために、毎日ＣＴＬＡ４１ｇ注射で７日間処置した動物を移植片機能 の停止まで追加の治療をせずに観察した。動物は未処置、ＣＴＬＡ４１ｇ（０， ５ｍｇ／日！７日間）またはイソタイプ適合のコントロールモノクローナル抗体 Ｌ６（０，５■ｇ／日！７日間）のいずれかを受けた。全ての場合において、処 置は移植時に開始した。図１３は処置う・７トおよびコントロールラットにおけ る同種移植片の生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を示すグラフである。移植片の生存は 、Ｏ，ａＳ謹ｇ／日のＣＴＬＡ４１ｇで処置した動物で１ｌｌ−４０日であった 。移植片の生存は毎日評価した。永続性移植が誘導されないのは不十分な用量の ＣＴＬＡ４１ｇのためであるようではなかった。なぜなら、１０倍高い用量（ｏ 、５■ｇ／日）で処置した動物が、長期（５０日より長い）の移植片機能を維持 した１匹を含めて、図１３に記載のような類似の移植片の生存曲線を示したから である。図１３では、移植片の生存は移植片機能の最終日として記載する。０． ０１５ｍｇ／日ｘ７日間（ｎ＝５）の用量で処置した動物は、平均１２．６±２ ．１日間（ｎ＝５）生存した。さらに、定量ＥＬＩＳＡアッセイでの測定によれ ば、この群での血清ＣＴＬＡ４１ｇの谷のレベルは１０μｇ／■ｌより多く、そ の濃度はインビトロでは最大抑制である（図１１参照）。１ｇ−４３日後に機能 を停止したＣＴＬＡ４１ｇ処置動物由来の同種移植片の組織学的検査で、急性細 胞性拒絶の典型的な兆候を示した。その兆候は、７日後にそれらの心臓を拒絶し たコントロール動物において見られるのと同程度の重症度であった。移植片機能 を維持した動物を５７日目に屠殺した。この動物由来の同種移植片にはいかなる 組織学的な異常も認められなかった。 屠殺時に、５７日「寛容」動物および３３日目に心臓を拒絶したＣＴＬＡ４１ｇ 処置動物由来のリンパ球を、それらの機能性応答について試験した。これらの応 答をコントロール（移植しなかった）ルイスラット由来のリンパ球の応答と比較 し、その結果をコントロール応答の比率として標準化した。コントロール動物に 比較して、「寛容」および拒絶の両方の動物由来のリンパ球は、Ｃａｎ−ａ　（ 寛容、６２．５％；拒絶、５１．１％；ｐ−０，６３，２側Ｔ検定）、および第 三群のＡＣ＋ラブ）　（ＲＴＩ”’）由来の細胞（寛容、１６０％；拒絶、２１ ３％；　ｐ−ｏ、　ｓｇ）に対して同程度に増殖する応答をした。しかし、宵意 な差異がＢｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙ細胞に対する応答において見られ（寛容、３ ４．２％；拒絶、２３８％；　ｐ＜０．００５）、機能性移植片を有する動物由 来のＴ細胞はドナーのＭＨＣ抗原に対して特に低応答性であることを示唆した。 ５７日「寛容」動物由来の胸腺および肺臓は、大きさおよび細胞数が移植してい ないコントロールラットと同様であった。そして、胸腺、リンパ節、および肺臓 のフローサイトメトリー分析で、各動物におけるＣＤ４＋およびＣＤ８”Ｔ細胞 の両方の比率が同様であることが判明した。５７日「寛容」動物から本来のルイ スレシピエンドへ養子移植した肺細胞は、その動物がＢｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙ 心臓同種移植片を拒絶する速さに影響しなかった。従って、寛容はこの動物中の サプレッサー細胞により維持されるようではなかった。 高濃度ＣＴＬＡ４１ｇ（０，５ｗｇ／日ｘ７日間）で処置した５匹の同種移植レ シピエンドのうち４匹が研究期間内に移植片を拒絶した事実は、共同刺激分子Ｂ ７の遮断が永続性移植片寛容を一貫して誘導しなかったことを示す。１つの可能 性のある説明では、ＣＴＬ＾４１ｇが一時的な非応答状態を誘導し、回復下でレ シピエンドＴ細胞が移植片拒絶に影響し得る。あるいは、ＣＴＬＡ４１ｇ処置の 結果、Ｂ７−依存性共同刺激なしで標的抗原の認識をし得ることにより、循環し ているＴ細胞において永続的に非応答状態になり得る。ＣＴＬＡ４１ｇ処置の中 止後に胸腺から現れる新たに成熟したＴ細胞はこの機構により寛容になり得ず、 Ｂ７−共同刺激されたＴ細胞のアロ活性の結果として移植片拒絶を媒介し得る。 これらの２つの可能性を識別するために、ラットを心臓移植の３日前に胸腺切除 し、移植後毎日ＣＴＬＡ４１ｇの注射（０，５膳ｇ／日ｘ７日間）で処置した。 これらの動物は移植片を２８日から３３日の間に拒絶し、このことは同種移植し ７ピエントは新たなＴ細胞の流入によらず、同種免疫応答を開始したことを示し た。従って、ＣＴＬＡ４１ｇ処置時に存在するＴ細胞は、結局移植片拒絶を誘導 し得るようである。このことは、一時的な非応答状態からのＴ細胞の回復を示し 得るか、またはＣＴＬＡ４１ｇ処置期間中のＴ細胞の流通のキネティ・７クスを 反映し得る。 Ｃ，シクロスポリンの相乗効果 可溶性ｃＤ２１ルセプターポモログ（ＣＴＬＡ４１ｇ）がインビトロおよびイン ビボで細胞媒介応答を抑制し得ることを示す能力に基づいて実験を行って、この 免疫抑制剤がシクロスポリンと付加的なまたは相乗的な効果を有するか否かを決 定した。刺激体としてＢｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラブドリンパ節細胞、そして応 答体としてルイス系統ラットリンパ節細胞を用いる混合リンパ球反応（ＭＬＲ） を、共培養後７２時間のトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより 測定した。０．１ｇｇ／■１濃度でのＣＴＬ＾４１ｇおよび３０ｎｇ／■ｌでの シクロスポリンのみ、またはその組み合わせた能力を測定した。図１４は種々の 条件下での１トチミジン取り込みを示す。図１４において理解できるように、い ずれの免疫抑制剤も混合リンパ球の増殖する応答について部分的な減少のみ引き 起こしたが（ＭＬＲ＋ＣＴＬＡ４１ｇおよびＭＬＲ＋Ｃ５Ｐ）、２ツ（１）　１ １１１　ｈ　合ｈ　セ（ＭＬＲ＋ＣＳＰ＋ＣＴＬＡ４１ｇ＞　ｉ！　コれら１７ ）　ＭＨＣ−非適合系統間の混合リンパ球の反応を完全に遮断した。この効果は 、付加効果を有する２つの免疫抑制試薬から予測したより太き（、ＣＴＬＡ４１ ｇおよびシクロスポリンが独立した機構によりＴ細胞活性化を遮断し、アロ抗原 への応答におけるＴ細胞の活性化に対して相乗効果を有することを示唆する。 実施例ＸＩ 第２メツセンジヤーによるリンパ球産生の制御。 リンパ球産生における種々の第２メツセンジヤーを調べた。 特に、２つの主要な細胞第２メツセンジヤー系に対する役割、プロティンキナー ゼＣの活性化および細胞内カルシウムの上昇が、リンパ球遺伝子の転写の中心的 な調節剤として特徴付けられた。さらに、特異的なチロシンリン酸化反応が、翻 訳および／または■ＲＮＡ安定性における改変の発生に相関し得ることが確認さ れた。セリンおよびトレオニンキナーゼへのさらなる調査は、それらがまたリン ホカイン産生に含まれるシグナル伝達事象において役割を有し得ることを示す。 対照的に、ｅＧＭＰによる調節への実験は、この薬剤が、リンパ球産生に比較的 非特異的な作用を有することを示した。 ＣＤ２Ｂに関係するチロシンリン酸化反応は、さらに以下に記載のように調べら れた。 プロトコール モノクローナル抗体：抗ＣＤ２　ｍＡｂ　Ｇ１９−Ｇ１９−４（Ｉ、抗ＣＤ２ｇ ■＾ｂ　９．３（ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ５　ｗＡｂ　１０．２（１ｇ０２ａ）、 および抗ＣＤ４５　ｍＡｂ９、４　（１ｇ０２ａ）を産生じ、精製しそしである 場合には、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、Ａ、ら、Ｊ、　１ｍ５ｕｎｏ１．．１３ ５：２３３１（１９８５）およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ。 ＪＡ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３７：３２９９（１９８６）に記載のよ うにビオチン化した。抗８７　ｓＡｂ　Ｂ３（ＩｇＭ）、および、Ｆｒｅｅｄｍ ａｎ、　Ａ、　Ｓ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３９：３２６０（１９ｇ？ ）に記載されたような腹水の希釈液を用いた。抗ＣＤ３肩Ａｂ　ＯＫＴ３（Ｉｇ Ｇ２ａ）を、マイクロスフェア（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ＞に 共有結合的に結合したヤギ抗マウスＩｇＧに、プールした腹水の１７１０’希釈 液をＨＢＳＳ中で１０７ビーズ／ｓｌと、室温でインキュベーションし、引き続 いて充分に洗浄することにより吸収させた。 細胞：Ｔ細胞のＣＤ２８”サブセットを、末梢血Ｔリンパ球から、以前にＪｕｎ ｅ、　Ｃ，Ｈ，ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．旧ｏ１．．７：４４７２（１９１１７） に記載されたように、ヤギ抗マウス１ｇでコートされた磁性粒子を用いた免疫吸 収を用いる負の選択により、単離した。これにより、〉９９駕ＣＤ３”でありし かもＮＫ細胞のようなＣＤ２”／ＣＤ３−を含まない休止Ｔ細胞の集団を得た。 Ｊｕｒｋａｔ　Ｔ白血病細胞系Ｅ６−１はＤｒ。 Ａ、　ｆｅｉｓｓからの供与品であり、完全培地、例えば、２＋＋ＭＬ−グルタ ミン、５０μｇ／璽ｌゲンタマイシン、および１０％ＦＣＳ（ＢｙＣＩ。 ｎｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｌｏｇｉｎ、　ＵＴ）を含むＲＰＭＩ　１ ６４０で維持した。 ある場合には、Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞を、完全培地中、または、５ｎｇ ／ｍｌ　ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｅｉｃｉｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｌ ｓ、　ＭＯ）または０ＫＴ３ビーズ（±５ビーズ／細胞）を含む完全培地中で、 実験前に培養した。Ｊｕｒｋａｔ　Ｇ３２細胞系（ＣＤ２”、ＣＣＤ３−１ＣＤ ２”）は、Ｍａｋｎｉ、Ｈ，ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１４６：２５２ ２（１９９１）中に記載されている。 Ｊ３２変異体（ＣＤ２”、ＣＤ３−１ＣＤ２８勺は、γ線照射で誘導される変異 および免疫選択（上述のＭａｋｎＬ　（１９９１）参照）に由来した。そのよう な一つのクローン化された変異体Ｊ３２−７２．４は、培養中で安定である。こ れら細胞の表面レセプター発現は、間接免疫蛍光法により定量化しそしてフロー サイトメトリーにより分析した。各試料の平均対数蛍光強度を測定し、そして式 △Ｆ　Ｌ　＝１０　［Ｉ　＠　−Ｃｌ　／　Ｄ　Ｉにより線形相対蛍光単位（△ ＦＬ）に変換した；ここでＥは実験抗体試料の平均対数蛍光強度であり、Ｃは対 照抗体試料の平均対数蛍光強度であり、Ｄは１０個あたり５０チヤンネル（５０ ｃｈａｎｎｅｌｓ／ｄｅｃａｄｅ）である、　ＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２ｇレ セプターに対して、Ｇ３２細胞のΔＦＬは、２７．０および５７．０であり、モ してＧ３２−７４．２細胞に対して１，１および４０．７であった。Ｇ３２−７ ２゜４のノーザンプロット分析は、検出可能なＴＣＲ−β　■ＲＮＡを示さなか ったが、ＴＣＲ−α、ＣＤ３−γ、δ、およびε、およびＴＣＲζｍＲＮ＾の発 現は、親のＧ３２細胞のそれと似ていた（未公開データ）。 ＣＨＯｍ胞の８７）ランスフェクシ習ン：ＣＨＯ細Ｆｌを、Ｂ７ｅＤＮ＾で、以 前に、ＧＩｍｍｉ、Ｃ，Ｄ、ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、ｇｌｌ：６５７５（１９ ９１）中に記載されたように、トランスフェクトした。これら細胞は、以前に、 ＣＤ２８■＾ｂで誘導されたＴ細胞活性化を模した方法でリンパ球増殖およびリ ンホカイン分泌を刺激することが示されているｔｓ　Ｌｉｎ５ｌｅｙ、Ｐ、Ｓ、 ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７３ニア２１（１９９１）およびＧＩｌ鶏１１上 述（１９９１）参照。Ｂ７を発現しないトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、 リフローン化しそしてＣＨＯ−８７と称した。ＣＨＯ細胞を、ＧＩｍｍｉ、上述 （１９９１）中で記載されたように、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中３０ 分間のインキコベーンコンにより組織培養プレートから剥し、そして０４％パラ ホルムアルデヒド中で固定した。固定されたＣＨＯ−８７細胞を対照細胞として 使用した。 タンパク質チロシンリン酸化の免疫ブロフト分析：抗ホスホチロノン抗体を用い た免疫プロットアッセイの詳細は、Ｈｓｉ、　Ｅ、　Ｄら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　、　２６４＋１０８３６（１９８９）およびＪｕｎｅ、　Ｃ，Ｈら 、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、＋４４＋１５９１（１９９０）中に記載されている。 細胞を、Ｓ−１０ＸＩＯ’細胞／１で、反応培地、即ち、０８％ＦＣＳおよび２ ０　ｍ１ｌｌ　Ｈｅｐｅｓを含むｌｌＢ５５中、３７℃で、時間３分で懸濁し、 そして時間０分で刺激した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、１０μｇ／冒１ 最終濃度で使用した。架橋のために、ビオチン化した■Ａｂを、室温で５−８分 間、細胞とインキニペートし、細胞を時間３分で予熱し、そして時間０で最終濃 度４０μｇ／ｍｌのアビジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）で刺激 した。刺激は、水冷した１０ｘ溶解緩衝液の添加により終了させ、０．５％Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００の最終濃度とした。Ｊｕｎｅ、　Ｊ、Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌｓ 上述（１９９０）を参照。４℃で溶解後、核をベレット化し、そして核を除いた 上澄液を７．５ｚゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ポリビニリデンジフルオラ イド微細多孔膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）にトランスファ ージ、そしてこの膜を１″Ｉ■スタフイロコツカスプロテインＡ　（ＩｃＮ、　 Ｉｒｖｉｎｅ、　Ｃ＾）でラベルされたアフィニティ精製された抗ホスホチロシ ン抗体を用いてプローブし、Ｘ線フィルムに曝した。 結果 ハルピマイシンＡはＣＤ２ｇ刺激ＩＬ２産生を阻害する：以前の研究により、ホ ルボールエステル、カルシウムイオノフオア、およびＣＤ２８レセプターの■Ａ ｂとのライゲーションにより提供される３つの明瞭な生化学シグナルが、最適Ｉ Ｌ−２分泌を起こすのに必要であることが示されている（Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ， ら、Ｊ、ｌ■■ｕｎ。 １、．１４３：１５３（１９８９）参照）。ＰＭＡ、イオノマイシンの存在下、 またはＣＤ２８■Ａｂ単独下で培養された細胞は、検出可能なＩＬ−２を産生ぜ ず、そして、Ｊｕｎｅ、　Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．　、　（１９１１９）上述、 およびＦｒａｓｅｒ、　Ｊ、　Ｄ、ら、５ｅｌｅｎｅｅ（ｌｌｉｓｈ、　、　Ｄ 、　Ｃ，）２５１　：　０３　（１９９１）中で以前に報告されたように、ＣＤ ２ｇレセプターの刺激は、固定化された抗ＣＤ２霞Ａｂ％ＰＭ＾、またはＰＭＡ ＋イオノマイシンで刺激されたＴ細胞のルー２産生を強力に高める方向に制御し た（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。ＣＤ２Ｂが引き金となるシグナル化において チロシンキナーゼの可能な役割を調べるため、Ｉｒｅファミリータンパク質チロ シンキナーゼのインヒビターであるハルビマイシンＡ（Ｕｅｈａｒａ。 Ｙ、ら、ＢＩｏｅｂｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗ＋ｓｕｎ、　 、　１０　：８０３　（１９８９）参照）の、ＩＬ−２産生のＣＤ２８が引き金 となる増強に対する作用を調査した。 Ｔ細胞をハルビマイシンＡ（ｌμＭ）の不存在下（図１５の０棒で示す）または 存在下（図１５の黒枠で示す）で−晩培養した。次いマ細胞をさらに２４時間、 培地に固定化された抗ＣＤ３　ｍＡｂ（Ｇ１９−４）、ｐＭＡ（３Ｂｇ／ｍ１） （Ｐ）、またはＰＭＡ＋イオノマイシン（１５０ｎｇ／ｍｌ）　（Ｐ＋■）の存 在下、可溶性抗ＣＤ２８　ａＡｂ　９．３（Ｉμｇ／ｍｌ）の存在下または不在 下で培養した。細胞フリーの上澄液を集め透析してノールビマイシン＾を取り除 き、そして連続希釈液を、Ｊｕｎｅ、　Ｊ、　１ｍ＋＊ｕｎ０１．上述（１９８ ９）中に記載されたようなパイオア・７セイによりＩＬ−２含有量について分析 した。図１５は、ＣＤ２ｇで刺激されたＩＬ−２産生に対するハルビマイシンＡ の作用を示す。固定化された抗ＣＤ３、またはＰＭＡを用いた刺激に応答する、 ＣＤ２８■Ａｂで介在されたルー２産生の増強は、／％ルビマイシンＡの存在下 でほぼ完全に阻害された。これに対し、ＰＭＡ、イオノマイシンまたは９゜３　 ｍＡｂのみで培養された細胞は、＜ＩＯＵ／ｍｌのＩＬ−２を産生じた。 ＣＤ３により引き起こされる基部シグナリング経路の***により、抗ＣＤ！およ び抗ＣＤ２ｇで刺激された細胞に対するハルビマイシンの作用が可能的に説明さ れ得る。これに一致して、ＣＤ３が引き金となる！Ｌ−２産生は、ハルビマイシ ン＾にこのうえな（感受性であることが示されている。Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｉ！、 ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８７：７７２２（１９９Ｇ）を参照。しかし、ＰＭＡ ＋イオノマイシンまたはＰＭＡ＋ＣＤ２ｇの組み合わせの刺激を用いて誘導され たルー２産生は、原則的に、ハルビマイシン＾の作用を試験するＣＤ２８シグナ ルを分離する能力を許容する。ＰＭＡ十抗ＣＤ２ｇで刺激された！Ｌ−２産生は 、ハルビマイシンＡの作用に感受性であり、他方では、前に注記したように、Ｐ ＭＡ＋イオノマイシンで刺激されたルー２分泌は、ハルビマイシンＡの作用に耐 性であった。ＰＭＡ＋イオノマイシン＋抗ＣＤ２ｇの組み合わせによる刺激は、 ＰＭＡ＋イオノマイシンの最適量より多いＩＬ−２分泌を引き起こす結果となり 、このことは、Ｊｕｎｅ、　Ｊ、　１ｍ５ｕｎｏ１．　、上述（１９ｇ９）　、 およびＦｒ１ｓｅｒ、Ｊ、Ｄ。 ら、５ｅｉｅｎｃｅｆｆａｓｈ、　Ｄ、Ｃ，）２５１：３１３（１９９１）の以 前の報告と一致する。しかし、ハルビマイシン＾の存在下で、ＰＭＡ＋イオノマ イシン＋ＣＤ２１１で刺激された細胞は、ハルビマイシンの不在下でＰＭＡ＋イ オノマイシンで刺激された細胞とほぼ等量の！Ｌ−２を産生じた。それとともに 、上記の結果は、ＴＣＲおよびＣＤ２Ｂ両レセプターは、ハルビマイシンに感受 性であることを示唆し、そしてさらにＩＬ−２遺伝子発現に対するこれら３つの 薬剤の独立の作用を示唆する。Ｊｕｎｅ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、上述（１９ ８９）、およびＦｒａｓｅｒｓ上述（１９９１）参照。 ｍＡｂと架橋するＣＤ２８レセプターはＰ輩Ａ処理されたＪｕｒｋａｔ細胞でタ ンパク質チロシンリン酸化を誘導する：上記の機能的結果を得て、ＣＤ２ｇが介 在するシグナル伝達におけるタンパク質チロシンリン酸化の関与の可能性を、Ｔ 細胞白血病系Ｊｕｒｋａｔ　Ｅ６−１の全細胞溶解液の核を除いた上澄の免疫プ ロット分析により調べた。Ｊｕｒｋａｔ　Ｅ−６細胞を、２日間ＰＭＡ（５Ｂｇ ／ｍｌ）の存在下または不在下で培養した。洗浄後、１２０μｌ中の１０？細胞 を、反応培地（対照）、抗ＣＤ３　ｗ＋Ａｂ（０１９−４）、抗ＣＤ２８■Ａｂ （９，３）、または架橋された抗ＣＤ２８■Ａｂ（９，３）　（最終濃度、１０ μｇ／■監）で刺激した。架橋には、ビオチン化した謳Ａｂを時間１０分で、次 いで、時間ゼロでアビジン（４０μｇ／■ｌ）を添加した。 ２分後、反応を水***解緩衝液を用いて終了させ、そして核を除いた上澄液を５ ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、イモピロン（ｉｍｍｏｂｌｌｏｎ）に移 し、そして抗ホスホチロシンを用いて免疫プロットし、次いで１１１１−プロテ ィンＡおよびオートラジオグラフィーを行った。 Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、Ａ、ら、Ｂｌｏｏｄ、７５：１５３１（１９９０） による以前の報告では、増加したチロシンリン酸化が、ＣＤ２ｇレセプターを架 橋後体止Ｔ細胞で検出され得なかった。この報告に一致して、二価性または架橋 されたＣＤ２ａ霞＾ｂの結合後刺激されなかったＪｕｒｋａｔ細胞中において、 チロシンリン酸化に変化は検出されなかった。以前の研究では、ＣＤ２８刺激単 独では、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のリンホカイン産生に至らずまたは主要Ｔ細胞の増 殖を誘導しないことが示されている。Ｗｅｉｓｓ、　Ａ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　、　１３７：８１９（１９８６）　；Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ、　Ｊ、ら、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３６：３２８２（１９８６）；およびＨａｒｍ、　Ｔ 、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１！１：１５１３（１９１１５）を参照。ＣＤ２ ＢのＣＤ２８■＾ｂによる、または、Ｂ７、天然ＣＤ２Ｂリガンドによる固着は 、Ｔ細胞がＰＭＡまたはＴＣＲ／ＣＤ３論＾ｂで刺激されて提供される、共刺激 シグナルを送達する。Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ 、　１１：２１１（１９９０）；［ｏｕｌｏｖａ、Ｌ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、、１７３ニア５９（１９９１）：Ｌｉｎ５ｌｅｙ、　Ｐ、　Ｓ、ら、Ｊ　Ｅｘ ｐ　Ｍａｄ　、１７３７２１（１９９１）、および０１ｍｍ１．Ｃ，Ｄ。 ら、、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１１：８５７５（１９９１）参照。コノヨうに、Ｃ Ｄ２１１？銹導されたタンパク質チロシンリン酸化は、共刺激シグナルの関係で のみ生じ得るようであった。 この仮説を試験するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＰＭＡ中で培養しそして次いで 以前に記載されたように抗ＣＤ２１１■＾ｂで刺激した。 ＰＭＡで刺激された細胞では、２分間のＣＤ２Ｂの架橋は、約４７、約６２、約 ７５、約８２、約１００．約１１０．および約１４５ｋＤノ分子量で移動する基 質上のリン酸化を誘導した。二価性ＣＤ２１１■Ａｂはチロシンリン酸化を誘導 したが、その程度はより小さかった。Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ，ら、Ｊ、ｌｍ５ｕｎ ｏ１．．１４４：１５９１（１９９０）に一致して、Ｊｕｒｋｉｔ細胞のＣＤ３ による引き金は、休止Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＰＭＡ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞にお いて、ホスホプロティン（ｐｐ）　５６．　ｐｐ６ｓ、　ｐｐ７５．　ｐｐｌｏ ｏ、　１１ｐ１１０．およびｐ１１１４５のチロシンリン酸化を誘導した。特に 興味深いのはｐｐ７ｓおよびｐｐｔｏｏであり、試験されたすべての条件下で、 ＣＤ２Ｂ刺激により一致してリン酸化された。 ■Ａｂと架橋するＣＤ２８レセプターは正常Ｔ細胞中でタンパク質チロシンリン 酸化を誘導する： 同様の実験を、ＣＤ２ｇが形質転換されなかった細胞中でチロシンリン酸化を増 大し得るか否かを測定するために、正常ヒトドナーからの高度に精製された末梢 血Ｔ細胞を用いて行った。末梢血ＣＤ２８３Ｔ細胞をＰＭＡ（５ｎｇ／■ｌ）中 で６時間培養した。洗浄後、１０’細胞を、２分間、培地（対照）、抗ＣＤ３　 ｍＡｂ（Ｇ１９．４）、抗ＣＤ２８謹＾ｂ（９，３）、架橋された抗ＣＤ２８■ Ａｂ（９，３）、または架橋された抗ＣＤ５　ｍＡｂ（１０，２）で刺激した。 細胞を溶解し、そしてタンパク質チロシンリン酸化を、以前に記載したように測 定した。ＰＭＡ処理された細胞上のＣＤ２８の架橋は、みかけ上、４５．７５、 および１００ｋＤの位置に移動するチロシンリン酸化された基質を誘導した。再 び、ｐｐ７ｓおよびｐｐｉｏｏが最も優勢にそして一致して再産生された。 ＰＭ＾刺激の２４−４８時間後に観察されたＣＤ２ｇ刺激の作用は、６時間後に 見られたそれより顕著であった。休止Ｔ細胞上でのＣＤ２８の■Ａｂによるライ ゲージ叢ンは、みかけ上、僅かに検出されるチロシンリン酸化を引き起こした。 ＰＭＡによる抗ＣＤ２８ｍＡｂ刺激に対する増大した応答性の誘導は、ＣＤ２Ｂ で誘導されたチロシンリン酸化を普遍的に観察するには４−６時間のＰＭＡ処理 を必要とするほど緩慢である。シクロへ牛ジイミドを用いた実験は、細胞がＣＤ ２Ｂに応答性になるには新規のタンパク質合成が必要であることを示す。ＣＤ２ ８で誘導されたチロシンリン酸化の特異性は、ＣＤ５をインタイブが相一致した ■＾ｂで架橋することにより調べた。７５ｋＤ基質上の増大したチロシンリン酸 化が、ときどきＣＤ５架橋により誘導された。対照的に、ＣＤ５は、＋１１１１ ００上でチロシンリン酸化を誘導しなかった。同様に、ＭＨＣクラス■レセプタ ーの架橋はまた、この基質のチロシンリン酸化を誘導しなかった。 ＣＤ２８レセプター架橋はＣＤ３処理された正常Ｔ細胞でタンパク質チロシンリ ン酸化を誘導する二上記の実験は、ＣＤ２８が、静止細胞中で比較的不活性であ り、そして結果としてプロティンキナーゼＣ活性化に応答性になることを示唆す る。 ＴＣＲ刺激がまた細胞にＣＤ２！ｌシグナルを呼び出す（ｐｒｉｍｅ）か否かを 測定するために、Ｔ細胞を培地中または抗ＣＤ３でコートされたビーズの存在下 で一晩培養した。細胞を回収し、そして８ｘ１０＠細胞を、架橋された抗−ＣＤ ２８　ｓＡｂでｏ−５分間刺激し１、細胞を溶解し、モしてタンパク質チロシン リン酸化を以前に記載されたように測定した。架橋されたＣＤ２８■＾ｂは、休 止Ｔ細胞中で多（の基質について、ＣＤ２８刺激後２−５分でピークとなる低レ ベルのチロシンリン酸化を誘導した。対照的に、ＣＤ２１１■＾ｂは、ＣＤ３で 呼び出された細胞中で１分以内で最大となる顕著なチロシンリン酸化を誘導した 。このように、抗ＣＤ３を用いたＴ細胞の共刺激は、応答の程度の増加および応 答の動力学の加速により示されたように、ＣＤ２ｇで誘導されたチロシンリン酸 化を増大した。ＣＤ２８に対する応答性のこの誘導は、これらの研究に用いられ たＴ芽細胞が、細胞サイクルの後期Ｇ、相中であったことを別の研究が示したよ うに、ＤＮＡ合成を必要としながった。 ＣＤ２８レセプター−８７７ＢＢＩレセプター相互作用がＴ細胞中の特異的チロ シンリン酸化を誘導する二上記の結果は、ＣＤ２８■Ａｂが、前もって活性化さ れたＴ細胞に関する種々の基質中でチロシンリン酸化を増大し得ることを示す。 以前の研究は、ＣＤ２ｇが、架橋の程度に依存して２つの生化学的に別のシグナ ルを送達することを示した。Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊ、＾、ら、Ｂｌｏ。 ｄ、　？Ｓ：ｌ５３１（１９９０）参照。Ｔ細胞の刺激後に観察されたＣＤ２８ 諷Ａｂの独特の機能的性質は、高度に架橋されたＣＤ２８峰すを必要とせず、無 傷のまたはＦ（ａｂ’１ｓｃＤ２８■＾ｂを用いて得られる。■２ｒａ、　Ｔ、 ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６１：１５１３（１９８５）中で論議されたよう に、研究は、ＣＤ２Ｂリガンドを発現するＣＩＯ細胞がＣＤ２８　ｍＡｂの機能 的作用を模倣することを示した。Ｌｌｎｓｌｅｙら、上述（１９９１）、および Ｇｉ■■１１上述（１９９１）参照。これらの細胞は、多分、ＣＤ２ｇレセプタ ーが介在するシグナル伝達を研究するための、より生理学的な手段となる。Ｃｌ ０−Ｂ７＋細胞をＰＭＡで処理されたＴ細胞と、ＣＨＯ／　Ｔ細胞比１：１０で ５−３０分間インキュベートした。細胞表面上（ＣＩＯ−Ｂ７−細胞）でＢ７を 発現しないＢ７でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を対照として用いた。刺激 前、ＣＨＯ細胞をパラホルムアルデヒドで固定しホスホチロシンのバックグラウ ンドを減少させた。以前の研究は、この処理が、無傷の８７−Ｃ０２ｇ相互作用 を残しておき、そして機能的作用を確実にすることを示した。Ｇｆｎｉ、上述（ １９９１）を参照。時間ゼロ点で、まず溶解緩衝液をＴ細胞に添加し、次いで、 直ちに混合液にＣＨＯ細胞を添加した。ＣＨＯ−８７’″細胞は、主に１ｏＯｋ Ｄの位置に移動する基質上で検出される特異的チロシンリン酸化を誘導した。こ のＣＨＯ−８７−で誘導されたチロシンリン酸化は、刺激後５分以内で検出され 、そして少なくとも３０分間プラトーレベルで高められたままであった。ＣＩＴ Ｏ−Ｂ７で誘導されたチロシンリン酸化は種々のＣＨＯ−Ｔ細胞比で明瞭であり 、モして１００ｋＤ基質のみが一致して観察された。ＣＨＯ−８７−細胞は、　 ｐｐｔｏｏのチロシンリン酸化を誘導しなかった。このＢ７で誘導されたチロシ ンリン酸化は、Ｃｌｌ０細胞の抗Ｂ７冒Ａｂとの予備インキュページ豐ンがＣｌ ｌ０−Ｂフで誘導されたｐｐｌｏｏチロシンリン酸化を妨げたように、ＣＤ２ｇ −８７相互作用に依存した。８７−ＣＨＯ細胞は、ある実験では、ｐｐｔｏｏチ ロシンリン酸化で僅かな増加を誘導した；しかじ、これは普遍的には観察されな かった。 他の実験では、同種異系抗原（アロ抗原）で誘導されたＴ芽細胞を、ＣＤ２８で 誘導されたチロシンリン酸化について試験した。 Ｔ細胞を、異質遺伝子型の照射された細胞とともに８日間培養し、そして次いで ＣＤ２８　ｍＡｂで刺激した。７４および１ｏｏｋＤ基質において最も顕著なチ ロシンリン酸化が観察された。このように、同種異系抗原、ＣＤ３　ｍＡｂ、ま たはＰＭＡで予備活性化されたＴ細胞のＣＤ２Ｂ刺激が、開始が早くそして継続 期間の短い、限られた数の基質においてチロ７ンリン酸化を誘導し得る。 ＣＤ４５によりおよびハルビマイシンにより阻害されたＣＤ２８で誘導されるチ ロシンリン酸化：タンパク質チロシンキナーゼインヒビターハルピマイシンＡが 、ＣＤ２ｇで誘導されるＩＬ−２分泌を効果的に阻害し得るということがわかっ たので、このインヒビターをＣＤ２ｇで誘導されるチロシンリン酸化に対する作 用について試験した。Ｔ細胞を、示されたハルビマイシン＾濃度の存在下または 対照培地中、−晩ＰＭ＾（Ｓｎｇ／霞ｌ）で処理した。細胞を集め、洗浄し、そ して８ｘｌＯ６細胞を培地または架橋抗ＣＤ２１１■Ａｂで２分間刺激した。界 面活性剤に可溶性のタンパク質を、以前に記載されたように調製した。抗ＣＤ２ ＋１■Ａｂで誘導されたチロシンリン酸化は、特異的にＣＤ２Ｂで誘導されたＩ Ｌ−２産生を阻害する条件下で、ハルビマイシン処理された細胞中でほぼ完全に 阻害された。 ＣＤ２８　ｍＡｂで誘導されたチロシンリン酸化の短い一時的経過は、ホスファ ターゼによる制御を示唆した。ＣＤ２ａが介在するシグナル伝達に対しホスファ ターゼの作用を向けるために、Ｔ細胞をＰＶＡ（Ｓｒ＋ｇ／■ｌ）を用いて一晩 培養した。１０７細胞を１０分間、培地（対照）、ビオチン化された抗ＣＤ４５ ■＾ｂ（９，４）、抗ＣＤ２８璽＾ｂ（９，３）、または両者を用いてインキュ ベートした。モノクローナル抗体を時間０でアビジンで架橋した。反応を２分後 に終了した。界面活性剤可溶性タンパク質の抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫 プロット分析を以前に記載されたように実施した。ＣＤ２ｇ架橋が誘導したｐｐ ７５およびｐｐｔｏａにおけるチロシンリン酸化は、ＣＤ４５により完全に阻害 された。Ｓａ■ｅｌｓｏｎ。 Ｌ、Ｅ　ら、Ｊ、Ｉｓ＊ｕｎｏ１．．１４５：２４４８（１９９Ｇ）中に記載さ れた以前の結果に一致して、ＣＤ４Ｓのみの架橋は、１２Ｇ−１３５ｋＤ基質の 増大したチロシンリン酸化を引き起こした；この作用はまた、ＣＤ２ｇ　＋ＣＤ ４５処理された細胞中で見られた。このように、上記の研究は、ＣＤ２８で誘導 されたチロシンリン酸化は、ｓｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼのイ ンヒビターに感受性であり、そしてさらに、ＣＤ４５タンパク質チロシンホスフ アターゼがＣＤ２８で誘導されたタンパク質チロシンリン酸化を阻害し得ること を示す。 ＣＴＬＡ−４発現はＣＤ２８経路活性化に続＜ＩＬ−２発現を予言する：精製さ れた休止Ｔ細胞を、固定化された抗ＣＤ２Ａｂ、抗ＣＤ３＋■Ａｂ９．３、ＰＭ Ａ÷イオノマイシン、ＰｉｌＡ＋冒Ａｂ９．３およびＰＭＡ＋イオノマイシン十 −＾ｂ９．３を用いて、タンパク質−チロシンキナーゼインヒビターハルビマイ シンの存在下または不在下で８時間刺激した。２回のノーザンプロットを、ＣＴ ＬＡ−４、ＣＤ２ｇ、ルー２または肛Ａ特異的プローブにハイブリダイズした。 ＣＤ２ｇ、ＣＴＬＡ−４およびＩＬ−２の発現を、次いで、ノーザンプロットに より分析した。ＩＬ−２発現は、ＣＤ２ｇ経路活性化に続＜　ＣＴＬＡ−４発現 とよく相関した。ＣＴＬＡ−４およびルー２発現はまた、ハルビマイシンと同程 度まで抑制されたが、ＣＤ２１１発現は未変化のままであった。このことは、　 ＣＤ２ｇ経路活性化に対するタンパク質−チロジンキナーゼインヒビターの抑制 作用が、ＣＴＬＡ−４発現の抑制を通じて介在され得ることを示唆する。 実施例Ｘ１ｌ ＣＤ２８およびブドウ球菌エンテロトキシンによるＭＨＣ独立Ｔ細胞増殖の誘導 プロトコール Ｔ細胞の単離、健常人ボランティアから末梢血を採血した。 Ｆｉｅｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クッションを用いた密度 勾配遠心分離法により単核細胞フラクシヨンを得た。このワラクシ１ンを末梢血 単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を利用する実験に使用した。上記単核細胞と８細胞、単 球、および活性化Ｔ細胞に対する抗体カクテルとをインキユベートすることによ り、精製静止Ｔ細胞を得た。次いで、前述のＪｕｎｅ（１９ｇ？）に記載のヤギ 抗マウス免疫グロブリン被覆磁気ビーズ（＾ｄｖａｎｅｅｄ　Ｍｉｇｎｅｔｌｅ ｓ　Ｉｎｃ、）とインキュベートすることにより、抗体被覆細胞を除去した。 この方法を適宜行うことにより、フローサイトメトリーによれば、９９駕超過が ＣＤ２＋である個体群を得た。 増殖アブセイ、９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウェル中で５！１０ ’個の精製Ｔ細胞またはＰＢＭＣｇを培養することにより、増殖を調べた。最終 培養容積は、１０％ｐｃｓ、ペニシリン（１０００７ｍｌ）、ストレプトマイシ ン（１００μｇ／ｍｌ）および２■ＭＬ−グルタミンを補足したＲＰＭｌ　１６ ４０（Ｇｉｂｃｏ）２００μ＋であった。培養開始時に、ブドウ球菌エンテロト キシンＡ　（ＳＥＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ　（ＳＥＢ）　（Ｔｏｘ ｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびシクロスポリンＡ　（ＳａｎｄｏＺ） を指示された用量で加えた。 培養期間の開始時に、抗ＣＤ２ｇモノクローナル抗体（■＾ｂ９．３゜Ｊ、Ｌｅ ｄｂｅｔｔｅｒより供与された）および抗）ＩＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ ｍＡｂ　Ｌ２４３．　Ｊ、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒより供与された）を加えた。 培養の最後の８時間に、トリチウム標識チミジン（”＋１−ＴｄＲ，ＩＣＮ）を ｌμＣ４／ウエルの濃度で含有させた。７２時間後、ＰＨＤ細胞採集機（Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ガラス製ミクロファイバ ーフィルターストリップ（Ｗｈａｔ■ａｎ）上に細胞を採集し、そして液体シン チレータ１ンカウンター（ＩＪＢ）で計１１１Ｊした。すべての計測値は、３回 または４回の培養の平均ｃｐ−ｐ−準標準偏差される。 フローサイトメトリー、１ｍｌのＴ細胞を培地のみで、ＳＥＡ（１００ｎｚ／ｍ ｌ）または５ＥＢ（Ｉμｇ／＠ｌ）で、ＳＥＡまたはＳＥＢに抗ＣＤ２ｇ抗体（ ｌμｇ／ｍｌ）を加えたもので、あるいはＰＶＡ（３Ｂｇ／ｍｌ）に抗ＣＤ２Ｂ 抗体（１μｇ／■ｌ）を加えたもので、３７℃、７２時間インキユベートシた。 各試料のアリコートをＤａｒｚｙｎｋｉｅｖｉｃｚ、　Ｚ、によりＭｅｔｈ、　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　３３：２８Ｓ　（１９９０）に記載のような細胞周 期分析用のアクリジンオレンジ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｅｅｓ）、ＦＩＴＣ結合抗 結合スル−２レセプター抗 ｉｅｋｉｎｓｏｎ）、またはイソタイプ−敢無関連抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ）で染色した。各試料をＦＡＣＳｅａｎフローサイトメーター（Ｂ ｅＣｔａｎ−Ｄｌｃｋｊｎｓｏｎ）で分析した。 結果 ＣＤ２ｇは、超抗原で活性化される精製Ｔ細胞に対する共刺激活性を与える．高 度に精製されたＴ細胞を、濃度変化を伴う５ＥＡ（０．　１Ｂｇ／ｗｌから１． ０μｇ／＋＋１）または５ＥＢ（０．０１μｇ／＋＊１から１００μｇ／■ｌ） のいずれかで培養した。ＣＤ２ｇに対する刺激抗体を加え、複製培地を調製した 。７２時間培養の最後の８時間で”Ｈ−ＴｄＲを適用し、取り込まれたチミジン を上述のように液体シンチレーション計測により測定した。各条件とも４回実施 した。 ＳＥＢ単独による処理では、上記コントロール培養以上のチミジン取り込みは得 られなかった。しかしながら、抗ＣＤ２ｇ抗体を加えると、一定のＳＥＢ投与量 に対して有意な増殖を得た。抗ＣＤ２ｇ抗体単独による処理は、何ら効果を示さ なかった。補助細胞の欠如は、Ｐ［ｌＡに対する増殖がないことにより立証され た。 ＳＥＡを用いた場合も同様の結果を得た。 ＳＦＡまたはＳＥＢによる刺激は細胞周期開始を導く。 ＣＤ２８の刺激単独ではＴ細胞周期開始は誘導されないことより、ＣＤ２δがＳ ＥＡまたはＳＥＢのいずれかで処理されたＴ細胞に対して共刺激活性を与えると いう観察は、これらのエンテロトキシンが精製Ｔ細胞における細胞周期開始を誘 導し得ることを示唆した。このことを調べるために、５ＥＢ（１ｇｇ／ｍｌ）単 独で、あるいは５ＥＢ（１ｇｇ／■ｌ）および抗ＣＤ２ｇモノクローナル抗体（ １ｇｇａｓ　Ｉ　）で、精製Ｔ細胞培養物を４８時間刺激し、細胞周期分析のた めにアクリジンオレンジで染色した。Ｇ、／Ｇ、Ｍ期を決定するために、刺激さ れない細胞を同時に処理した。ＲＮＡ含有量が増加しＤＮＡ含有量が変化しない ものは６３期の細胞であると考察した。ＲＮＡ５　ＤＮＡ含有量がともに増加し た細胞は、Ｓ期、６３期またはＭ期のものであると考察した。付随的に、アリコ ートをＦＩＴＣ結合抗ＩＬ−２レセプター抗体で染色した。エンテロトキシン単 独による４８時間処理により、１０％を超えるＴ細胞がＧ、からＧ、へと進行し たことが、ＤＮＡ含有量の増加なしのＲＮＡ染色の増加により決定された。 同様に、エンテロトキシン単独では、７２時間の時点で、上記細胞の１５％にＩ Ｌ−２レセプター発現が誘導された。一方、抗ＣＤ２Ｂモノクローナル抗体が存 在すると、細胞周期のＧ１段階に残っていた細胞のかなりの割合でＤＮＡ含有量 が増加し、従って細胞周期のＳ期、６３期またはＭ期に移行した。これらのデー タは、ＳＥＢ単独の刺激はＴ細胞の活性化には十分であるが、細胞周期の完全な 進行には不十分なシグナルしか送れないことを示す。ＣＤ２Ｂ経路の同時刺激に より第２のシグナルが細胞に送られ、上記細胞は、Ｓ期に進行し、そして増殖す る。 ＳＥＡおよび抗ＣＤ２ｇにより刺激されたＴ細胞の増殖はシクロスポリンＡに対 して耐性である。　ＣＤ２Ｂは最初のシグナルがＰＶＡにより供給される場合に は、シクロスポリンＡ　（ＣｓＡ）の効果に耐性であるシグナル伝達経路を利用 し、細胞がＴ細胞レセプターを介して最初に活性化される場合には、ＣｓＡに対 して部分的に耐性である経路を利用することが示される。上述のＪｕｎｅ（１９ ８７）を参照のこと。エンテロトキシンにょるＴ細胞活性化に包含される上記経 路をさらに調べるために、ＳＥＡ、ならびに、ＳＥＡおよび抗ＣＤ２Ｂ抗体（上 述のように”ＩＩ−ＴｄＲ取り込みを調べた）により活性化された培養物にシク ロスポリンＡ（１ｇｇ／■ｌ）を含ませた。ＳＥＢ、　ＳＥ＾単独ではチミジン 取り込みは誘導されなかったが、ＣＤ２ｇに対する抗体を加えると有為な増殖を 生じた。 シクロスポリンＡ（１μｓ／ｍｌ）の存在下でさえ、培養物がＳＥＡと抗ＣＤ２ ｇ抗体の組み合わせで活性化される場合には、投与量に依存した増殖が起こる。 ＰＶＡおよび抗ＣＤ２ｇ抗体により活性化されるコントロール培養物は、シクロ スポリンＡに対して耐性であり、ＰＶＡおよびイオノマイシンによる活性化は、 シクロスポリンＡに対して感受性であった。 ＳＥＢおよび抗ＣＤ２１１による活性化はＭＩＩＣクラスＩ＋とは無関係である 。以前の研究は、ブドウ球菌エンテロトキシンが抗原存在細胞表面（ＡＰＣｓ） のＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩ＋分子を同時に結合し得ることを示した。　Ｈｅ ｒｒｍａｎｎ、　ＴらのＥｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。 １９：２１７１　（１９８９）；およびＣｈｌｎｔａｇｕｍｐａｌａ、　Ｍ、　 Ｍ、らのＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４７：３８７Ｇ　（１９９１）を参照のこ と。培養物中にＡＰＣｓが存在しなければ増殖は認められないという結果により 、超抗原によるＴ細胞活性化は、ＭＩＩＣクラスＩ＋の発現に依存すると解釈さ れる。このことは、Ｆｌｅｉｓｅｈｅｒ、　ＢらのＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、 　１６７：１６９７（１９８８）；　Ｃａｒｌｓｓｏｎ、ＲらのＪ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、１４０：２４８４　（１９０）：および［Ｉｅｒｍａｎ、＾らのＪ、　 Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、、　１７２ニア０Ｇ　（１９９Ｇ）で議論されている。高度 に精製されたＴ細胞がエンテロトキシンと抗ＣＤ２ｇ抗体との同時刺激により増 殖が誘導され得るという我々の知見は、Ｔ細胞の超抗原活性化にＭＩＩＣクラス Ｉ＋が全く必要とされ得ないことを示唆した。あるいは、活性化Ｔ細胞がＭＨＣ クラスＩ＋を発現し得、従って、他のＴ細胞に対してトランスに、クラス１！依 存性超抗原を提示し得る。 この可能性を調べるために、図１６に示すように、ＨＬ＾−ＤＲに対するプロソ 牛ング抗体（モノクローナル抗体Ｌ２４３）を、エンテロトキシンあるいはエン テロトキシンおよび抗ＣＤ２ｇ抗体で活性化されたＴ細胞およびＰＢＭＣｓの培 養物に含ませた。図中の各点は３回または４回の培養の平均上標準偏差で表され る。ＳＥＢ単独区では、顕著な増殖は認められない。先に示したように、抗ＣＤ ２１１抗体を含むと、ＳＥＢがその投与量に依存してＴ細胞増殖を誘導する。抗 りラス１１抗体が投与量１．０またはｉｏμｇ／ｍｌ　（１０μｇ／ｍｌのデー タは示されない）で含まれる場合には、増殖は減少しない。一方、図１７に示す ように、同じドナーから単離されエンテロトキシンで刺激されたＰＢＶＣ＋＋の 増殖は、抗りラス１１抗体により顕著に阻害された。さらに、２４時間および７ ２時間でのＨＬ＾−ＤＨの発現を、ＣＤ２ａ共刺激を伴うまたは伴わないＳＥＡ （０，１または１．Ｏｎｇ／■１）で活性化された精製Ｔ細胞により調べた。フ ローサイトメトリーで測定した結果、どちらの条件でもＩＩＬＡ−ＤＲは発現し なかった。これにより、エンテロトキシンおよび抗ＣＤ２Ｂにより誘導される、 Ｔ細胞の増殖が、Ｍ［ＩＣクラス１１分子による提示には依存しないことを示し た。 実施例Ｘ１ｌｌ プログラムされた細胞死の防止 抗ＣＤ２１１ｍＡｂが、成熟Ｔ細胞における細胞死を防止し得るか否かを試験す るために一連の実験を行った。一般に、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞が、末梢血Ｔ細 胞にみられる生理的効果に類似の効果を有する成熟Ｔ細胞の例として使用される 。例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで、Ｉ Ｌ−２の分泌が誘導され得、そして該Ｊｕｒｋａｔ細胞は、旧Ｖ−１により感染 され殺され得る。Ｊｕｒｋａｔ系ＪＨＭＩ−２，２をＡ、　Ｗｅｉｓｓ（ＵＳＣ Ｆ）から得た；ムスカリンＭＩレセプターサブタイプをトランスフェクトし、こ れらの細胞内で安定して発現させる。０．３Ｘ１０’／ウエルのＪ［１Ｍ＋−２ ，２細胞を、完全培地中の培養ウェル、あるいは、１０μｇ／ｍｌの９．３■＾ ｂの存在または非存在下で、プラスチックに吸着された抗ＣＤ３■＾ｂＧ１９− ４を含有するウェルまたは９．３■Ａｂ単独を含むウェルに加えた。培養１〜３ 日後に細胞死を記録し、ウェルの目視検査により、０（死滅せず）、ｌ＋（２０ から７０％の細胞が死滅）、モして２＋（Ｔｏから１００％の細胞が死滅）にグ レード化し、トリパンブルー浸透性により確認した。表１Ｏに示すように、抗Ｃ Ｄ３処理したウェル中の細胞が死滅したが、培地中の細胞は成長し続け、生存し 続けた。対照的に、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８とを含有するウェル中の細胞は増殖し 続けた。抗ＣＤ３に誘導された細胞死から細胞を救う抗ＣＤ２ｇの能力は特異的 である。なぜなら、カルバコール（３０μＭ）（Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３複合 体と異なるメカニズムを介する細胞中のシグナル伝達を活性化すると思われるＭ ルセプターの特異的アゴニスト）もまたＪｕｒｋａｔ細胞中の細胞死を誘導した からである。抗ＣＤ２８はカルバコールに誘導された細胞死を阻害しなかった。 （以下余白） 表１０ 実施例ｘｒｖ 骨髄の研究。 可溶性または固定化抗ＣＤ３　（Ｏ［Ｔ３）にょるＴ細胞活性化後のＴ細胞増殖 、Ｔ細胞増殖を活性化し誘導する、可溶性または固定化０１Ｔ３を用いて、一連 のタイトレージ冒ン試験を行った。 固定化０ＫＴ３（２μｇ／■■で３７℃、１時間プレコートしたプレート）およ び可溶性０ＫＴ３　（１０ｎｇ／ｍｌ）はともに、Ｅｏゼット（Ｈ＋）精製Ｔ細 胞またはＰＢＬがらのＴ細胞増殖性の応答を誘導した。ＰＢＬまたは精！２Ｔ細 胞を、固定化０ＫＴ３上で、または培養開始時にＬｏｎｇ／−＋の可溶性０ＫＴ ３を加えて、１時間から７日間インキュベートして活性化した。一連の実験にお いて、固定化０ＫＴ３によるＴ細胞の活性化後の増殖は、可溶性０ＫＴ３による 活性化後のＰＢＬによる増殖性の応答に匹敵した。 抗ＣＤ３および抗ＣＤ２１１に引き起こされたＰＢＬにより介在される細胞毒性 、低投与量のＩＬ−２または抗ＣＤ２ｇの存在下での培養７日後の抗ＣＤ３活性 化ＰＢＬの細胞毒性を調べた。この一連の実験において、先に報告したインビト ロでのＩＬ−２によるＴ細胞処理の免疫増大効果に代わる、リンホカインの生産 を増加させるＣＤ２ｇの能力を調べているｏ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｈ，Ｐ、らのＪ、 　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｔ、　１；５１−８３　（１９８１）で議論されて いるように、１溶解単位は、１ｘｌＯ＠個のエフェクター細胞あたり５ｘｌＯ’ 個の標的細胞の２０％溶解に相等する。Ｄａｕｄｉおよびに５６２を含む種々の 標的を試験した。表１１に代表的な実験における細胞毒性の結果を示す。 Ｔ細胞に匹敵するＰＢＬ中の０［Ｔ３誘導細胞毒性、異なる被検体５例において 、０ＫＴ３による活性化から８日後のＤａｕｄｉ、　Ｋ５６２およびＢＳＢ細胞 を殺す能力について、ＰＢＬをＴ細胞（Ｅ＋）と比較した。これらの実験は、５ ％ヒト血清（■Ｓ）を補給したｘ−ｖｉｖｏ　１０中で行った。ＰＢＬを使用し た５例の正常な被検体のＤａｕｄｉ％［５６２およびＢＳＢに対する平均細胞毒 性は、それぞれ、１５゜０．７．４、そして９．２Ｌυであった。同じ５例の被 検体のＴ細胞における、Ｄａｕｄｉ、　［５６２およびＢＳＢに対する平均細胞 毒性は、それぞれ、１４．３．７．７、そして９．３ＬＵでありな。 細胞培養中のインビトロ時間の関数としての細胞毒性、　最適な細胞毒性につい て調べるために、Ｔ細胞を抗ＣＤ！およびＩＬ−２と共に３１日間培養し、Ｄａ ｕｄ［および［５６２に対する細胞毒性を１週間ごとに調べた。この期間中、対 数的な細胞増殖が維持され、細胞数が３００倍に増加した。細胞毒性は、いかな る培養期間でも有力な関数であった（０．８．１５．２２、および２１日の培養 時点で、〈０．１．２４．３．５、Ｏ，Ｓ、および１．０ＬＵ）。Ｄａｕｄｉが 標的の場合にも、類似の結果が得られた（０．　８、Ｉｓ、２２、および２９日 の培養時点で、＜０．０１．２３．５．２、および５ＬＵ）。 可溶性または固定化０［Ｔ３により誘導される細胞毒性、７種の実験において、 活性化後のＴ細胞に介在された細胞毒性を、可溶性または固定化０ＫＴ３と比較 した。いずれの方法とも、Ｄａｕｄｉおよびに５６２に対する細胞毒性を誘導し た。可溶性０ＫＴ３活性化Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉに対する２７ＬＵ（ＳＤ−１８ ）の平均細胞毒性、およびに５６２に対する２１ＬＵ（ＳＤ−１６）の平均細胞 毒性に介在した。固定化０ＫＴ３活性化Ｔ細胞は、Ｄａｕｄ　ｉに対する２２Ｌ Ｕ（ＳＤ−１６）の平均細胞毒性、およびｌ５６２に対する１２ＬＵ（ＳＤ−８ ＞の平均細胞毒性に介在した。これらの実験は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ） を補給したＲＰＭｌ　１！４０中のＥ３細胞で実施した。可溶性０１Ｔ３（１０ ｎｇ／ｍｌ）または固定化０［Ｔ３　（２μｇ／謹ｌ）による誘発後、７から８ 日目に、細胞毒性を評価した。 ＩＬ−２濃度の影響、　Ｏ［Ｔ３活性化の最適時間を確立した後、ＩＬ−２の投 与量をタイトレートした。い（つかの実験で、ＩＬ−２の投与量を６０００１Ｕ ／ｍｌから６０１０／璽ｌに徐々に減少させた。ＩＬ−２がこの範囲でタイトレ ートされた場合には、３日間の培養後タイトレートされたチミジン取り込みによ り調べた増殖は一定であった。対照的に、細胞毒性はＩＬ−２投与量により変化 し、ＩＬ−２投与量が低い場合に最大となった（ｒｌＬ−２の投与量が３０．１ ５０．３００．６００、および６０００１υ／ｍｌの培養において、Ｄａｕｄｌ 標的に係る溶解単位はそれぞれ２８．９．８，５．９、および４．８Ｌυであっ た）。このデータは、抗ＣＤ３で引き起こされたＴ細胞の増殖および細胞毒性の 応答がともに、ＩＬ−２の投与量が低い場合に得られ、そして維持され得ること を示す。 増殖および細胞毒性における血清および培地の影響、成長を持続させ、そして細 胞毒性を維持する能力について、ＨＳ、ＦＢＳ、および血清を有さない培地を比 較した。このデータは、増殖ならびにＤａｕｄｉ、に５６２およびＢＳＢに対す る細胞毒性が、血清濃度が２％を下回ると急激に減少することを示す。Ｘ−Ｖｉ ｖ。 １０とＲＰＭＩ　１６４０との間に有意差はなかった。 抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇ処理後のＣＴＣ源としての骨髄単核細胞（ＢＭｋｌＮ Ｃ）　、　ＢＭＭＮＣが悪性腫瘍患者の治療のためのＴ細胞源として機能するか 否かを調べるために、０ＫＴ３およびＩＬ−２または抗ＣＤ２ｇによる刺激後、 ＢＭＭＮＣをＸ−Ｖｉｖｏ　１０培地中で培養した。 ＢＭＭＭＣ群は、最初にＣＤ３°細胞をわずか２５％しか含有していなかったが 、増殖性および細胞毒性の応答は、培養２週間後に最良となった。Ｄａｕｄｌお よびに５６２に対して調べた場合には、Ｔ細胞はＣＤ３およびＩＬ−２刺激後４ ０倍を超えて増殖し、８〜１５日目の白目物の細胞毒性は５ＬＵと１２１．Ｕと の間であった。これらのデータは、骨髄移植前の患者からの自己組織の骨髄採取 物から得られたＢＭＭＭＣが、細胞毒性Ｔ細胞の好適な供給源となることを示す 。表１２は、健常者および患者の骨髄の両方がＣＤ３およびＩＬ−２処理後の満 足し得る細胞毒性源を供給することを示す。 健常者の骨髄または自己組織の骨髄を用いた４種の実験において、９から１９日 の培養後、中央値が８９倍の細胞増殖（１８から１７３倍の範囲）を得た。０Ｋ Ｔ３で刺激されたＢＭＭＮＣに介在されたＤａｕｄｉおよびに５６２に対する平 均細胞毒性は、それぞれ、５．５ＬＵ（範囲２−１１）および４．３ＬＵ（範囲 ２−８）であった。すべての培養物を、０ＫＴ３による活性化後、１４４日目調 べ、Ｓｏｌυ／肩１１Ｌ−２の存在下で増殖した。１０ｎｇ／ｍｌの可溶性０Ｋ Ｔ３（Ｓ）または２μｇ／ｍｌでコートされた固定化０ＫＴ３（＋）のいずれか を表１２に示すように加えた。 （以下余白） 表１２ エフェクターＴ細胞源としてのＢＭＭＭＣの抗ＣＤ！およヒ抗ｃＤｚｓによる処 理、３人の患者の増殖および細胞毒性の応答を調べた。上記患者は長い化学療法 を受けていたが、彼らのＰＢＬまたはＢＭＭＮＣは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇ による処理後、強い増殖性および細胞毒性の応答を維持した。ＰＢＬまたはＢＭ ＭＮＣ（１，５ｘｌＯ’）を、固定化０ＫＴ３　ｍＡｂまたはＳｏｌυ／ｍｌの ｒｌＬ−２またはＯ−Ｓｕ　ｇ／ｍｌの９．３■Ａｂ存在下で、５％ヒト血清を 加えたＲＰＭｌ中で培養した。増殖を培養３日目に、細胞毒性を培養７日目に評 価した。表１３にＢＭＭＮＧに関しての結果を要約する。 （以下余白） ０ＩＴ３活性化Ｔ細胞（ＣＴＣ）は造血前駆体の成長を阻害しない。 造血前駆体アッセイにおいて、（ｌＫＴ３活性化Ｔ細胞（ＣＴＣ）に混在したＢ ＭＭＭＣが、ＣＦＵ−ＧＭの発育を阻害するか否かを調べるため、成長１週間後 にＰＢＬがら得たＣＴＣを新鮮ＢＭＭＮＣと混合し、この混合物を培養してＣＦ Ｕ−０Ｍアッセイを行った。自己組織のＣＴＣを様々な比率でＢＭＭＭＣと混合 し、３７℃で１時間インキュベートシ、次いで標準ＣＦＵ−Ｃｌアプセイを行っ た。ＣＴＣはコロニー形成に有害な影響を示さず、広い範囲のＣＴＣｎＢＭＭＮ Ｃ比（１：２５から１：５まで）に対して、ＣＦＵ−０Ｍコロニー数がコントロ ールの７５％以内であった。ＣＴＣ：ＢＭＭＮＣが１：１の比率においてさえ、 ＣＦＵ−０Ｍコロニー数の９０％を超えるもの（浄化された自己組織骨髄移植片 中のＣＦＵ−ＧＭ阻害の許容％）が阻害されなかった。これらのデータは、ＣＴ Ｃは自己組織骨髄移植片の植え付きを阻害したり遅らせたりしないことを示唆す る。 ＢＭＴ前の患者からのＰＢＬまたはＢＭＭＮＣの増殖および細胞毒性機能、ＡＭ Ｌまたはリンパ腫に対するきびしい治療を予め施された患者から得たＰＢＬまた はＢＭＭＮＣが、抗ＣＤ３で活性化され得、そして低いルー２投与量で成長し得 るか否かを調べるため、数人の患者からＢＭＴ前に得られたＰＢＬまたはＢＭＭ ＮＣを試験した。試験された患者のＰＢＬおよびＢＭ＆ｌＮＣは、健康な同種異 系骨髄ドナーから得られた正常なＰＢＬまたはＢＭＭＮＣに匹敵し得るような様 式で、増殖し、そして細胞毒性を示した。化学療法または放射線治療によりきび しい治療を施された患者が、抗ＣＤ３活性に対して低い計数または低い応答を有 することは知られている。従って、細胞損失または増殖不活性を補うプロトコル において、開始する細胞の数を増加させた。抗ＣＤ３で活性化されたＴ細胞のヘ ルパー活性を高めまたは細胞毒性を高める共刺激因子として９．３を使用すると 、活性化Ｔ細胞のインビトロでの増殖が向上し得る。この実施例（実施例ＸＩＶ ）で示されたデータは、冒Ａｂ９．３が移植後のリンパ球の増殖欠如を矯正し得 、免疫再形成を促進し、さらに、＾ＢＭＴ受容者の悪性腫瘍細胞に対する細胞毒 性を増強する０ＫＴＦ／９．３共刺激アプローチ使用についての理論的根拠をサ ポートし得る。Ｂｌｏｏｄ　？８：１２１１６−１２９１　（１９９１）のＫａ ｔｓａｎｉｓ、　Ｅ、らによる最近の研究は、ＢＭＴ受容者からのＴ細胞が０［ Ｔ３およびＩＬ−２による共刺激により増殖し得ることを示す。 短期間および長期間のＢＭＴ受容者からのＰＢＬ中のＩＬ−２レセプター（ＩＬ −２Ｒ）、ＩＬ−２、およびＩＬＩについてのメフセンジ中−ＲＮＡレベル、初 期の研究（Ｌｕｇ、　Ｌ、　Ｇ、らのＢｌｏｏｄ　５ｕｐｐ１．　（要約）（１ ９９１）を参照のこと）は、ＢＭＴ受容者からのＴ細胞がＩＬ−２を分泌せず、 またはルー２Ｒを発現しないことを示唆した。このような欠損は、リンホカイン またはリンホカインレセプターについてのｍＲＮＡ合成不全に起因し得る。ＢＭ Ｔ受容者からのＴ細胞カ月Ｌ−２、ＩＬ−２Ｒ，およびＩＬ−３についてのｍＲ ＮＡを検出可能なレベルで発現させないか否かを測定した。１１例の同種異系の （３例の短期間、ＳＴで表す、８例の長期間、ＬＴで表す）および４例の自己組 織の（２例のＳＴおよび２例のＬＴ）受容者からのＰＢＬを、刺激なしく＝）あ るいはファイトへマグルチニン（ＰＨＡ）およびホルボールエステル（ＴＰＡ） 刺激（＋）後の、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ，および！Ｌ−３のｍＲＮＡレベルを調 べた。全ＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴアーゼ）により合成されたｃ　ＤＮＡを、 特異的プライマーを用いたＰＣＲで増幅し、そのＰＣＲ生成物をエチジウムブロ マイドを含有する１、５％アガロースゲルで泳動した。表１４は、ＰＢＬが検出 可能なレベルのルー２、ＩＬ−２Ｒ，およ１１Ｌ−３のｍＲＮＡを有する受容者 のフラクシロンおよびパーセントを示す。 大部分のＳＴおよびＬＴの自己由来ならびに同種異系のＢＭＴ受容者からのＰＢ Ｌは、ＰＨＡ＋ＴＰＡによる刺激後、ＩＬ−２、ｌｂ、−２Ｒ，およびＩＬ−３ について、あるレベルのｍＲＮＡを発現した。ＳＴ受容者の場合には、試験した ２例のＡＢＭＴ受容者のうち２例とも、そして試験した３例の同種異系受容者の うち３例とも、ＩＬ−２Ｒおよび！Ｌ−３についてのｍＲＮＡレベルを発現させ るＰＢＬを有し、試験した２例の同種異系受容者のうち２例とも、ＩＬ−２につ いてｍＲＮＡを発現した。はとんどの場合において、！Ｌ−２、ＩＬ−２Ｒ１お よびＩＬ−３についての不完全なｍＲＮＡ合成は、ＩＬ−２分泌およびＩＬ−２ Ｈの発現欠損の原因になり得ない。転写後の事象が、ＢＭＴ受容者からのＴ細胞 による不完全なリンホカインの分泌において、より重要な役割を果たし得る。 ＣＴＣはＩｇの合成を補助し、リンホカインおよびパーポリン（ｐｅｒｆｏｒｉ ｎ）についてのｍＲＮＡを発現する。υｅｄｚ、　Ｍ、らによりＪ、　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｅｈｅｓ、（要約）　（１９９２年に提出）で議論されたように、Ｅ ＬＩＳＡ−プラーク（ＰＰＣ）アッセイにより計測されるようなＰＷ刺激後に、 正常なＴ細胞あるいは０ＩＴ３で活性化されたＴ細胞を正常なり細胞に加えるこ とにより、ヘルパー活性を評価した。２５．５０、または７５Ｘ１０”個の正常 なＴ細胞を加えた場合、培養されたＢ細胞１００万個に対するＰＰＣ数は、それ ぞれ３２０Ｇ。 ４１００．８８００個であった。同数のＣＴＣを加えた場合には、ＰＰＣ数はそ れぞれ２２０．２１００、および２６００個であった。従って、ＣＴＣは実質的 なヘルパー活性を示す。さらに、１．合成についてのサプレッサーアッセイにお いて、ＣＴＣは正常な自己組織由来のまたは同種異系のＴ細胞ならびにＢ細胞を 抑制しなかった。 ヘルパー活性は放射線抵抗性であった。ＲＴアーゼ−ＰＣＲ法を用いて、０にＴ ３活性化後６時間から３日間で、ＩＬ−２、］Ｌ−３、ルー６、およびパーホリ ンについてのメツセンジャーＲＮＡを検出した。要約すると、ＣＴＣヘルプＢ細 胞はＩｇを産生じ、正常なＴ細胞およびＢ細胞による１ｇ合成を抑制しなかった 。従って、ＢＭＴ後の適用され得るＣＴＣの転移は、ＧＶＬ効果を仲介し得るだ けでな（、免疫再生を促進し得る。 ＢＭＴ受容者のＰＢＬ中の抗ＣＤ３誘導増殖応答の欠如は、抗ＣＤ２Ｂを加える ことにより回復した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８に刺激されたＢＭＴ 受容者からのＴ細胞の増殖応答における、インピトロデータは、■Ａｂ９．３を Ｏ［Ｔ３と組み合わせて用いると、報告されたようなインビボの臨床的効果を有 し得るという前提をサポートする。Ｊｏｓｈｌ、　！、らのＢｌｏｏｄ　５ｕｐ ｐ１．　（要約）　（１９９１）を参照のこと。ＢＭＴ受容者からのＴ細胞は、 マイトジェンまたは抗ＣＤ３刺激後の増殖を欠如する。以前の研究は、正常なＴ 細胞の抗ＣＤ３（Ｇ１９−４）および９．３による共刺激が、リンホカインｍＲ ＮＡの安定化による抗ＣＤＨに誘導された増殖を増強することを示す。自己組織 のおよび同種異系のＢＭＴ受容者（ＢＭＴ後５３−８０５日）のＰＢＬ中の不完 全な抗ＣＤ３誘導増殖応答を矯正する、抗ＣＤ３（Ｇ１９−４または０ＩＴ３） ４９．３の能力を評価するための実験を行った。 受容者からのＰＢＬまたはコントロールを、Ｇ１９−４、Ｇ１９−４＋９．　ｓ 、０［Ｔ３、またはＯ［Ｔ３＋９．３テ３日間刺激した。９．３を１１００ｎ／ ｍｌの最終濃度で加えた。へＢＭＴ受容者に対して１５回の試験を行い、同種異 系の受容者に対して１６回の試験を行った。表１５は、抗ＣＤ３刺激ＰＢＬに９ ．３を加えた後に、受容者のＰＢＬが増殖応答を増大させ（↑）、減少させ（↓ ）、または変化しなかった（−）場合の受容者数を示す。括弧は、９．３を加え た後に、その増殖応答を増大した受容者のパーセントを示す。 （以下余白） 表　１５ Ｇ１９−４＋９．３またはＯ［Ｔ３４９．３の共刺激は、＾ＢＭＴ受容者にお（ １て、Ｇ１９−４または０！Ｔ３単独（ｐ＜０．０５、それぞれの列の合計）で 誘導された増殖応答を顕著に増加させた。要約すると、ＢＭＴ受容者における抗 ＣＤ３銹導Ｔ細胞増殖の欠如は、９．３との共刺激により回復した。これらの発 見は、減損したＴ細胞増殖で明示される免疫欠陥を有する患者に対する治療上の 意味を有する。 実際、ＩＩＩＶ感染患者からのＴ細胞の増殖欠如力（抗ＣＤ２ｇ処理により回復 するという類似の結果が得られた。旧ｖにお各する増殖の欠如に関してはＬａｎ ｅ、　ｆｌ、ｃ、らのＪ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍａｄ、、　３１３：８５（１ ９δ５）を参照のこと。 抗ＣＤ３０１７３および抗ＣＤ２８９．３を用いた共刺激は、ＡＢＭＴ受容者か らのＰＢＬ中でＩＬ−２の測定可能な■ＲＮＡレベルを高めた。０ＡＴ３で刺激 し、Ｏ［Ｔ３／９．３で共刺激した後のＩＬ−２の−ＲＮ＾レベルについて、Ｒ Ｔａｓｅ−ＰＣＲを用いて、短期へ〇ＭＴ受容者からのＰＢＬを研究した。ＲＴ ａｓｅにより全ＲＮ＾から合成されたｃＤＮＡを、ＩＬ−２に特異的なプライマ ーを用いるＰＣＨにより増幅し、そしてこのＰＣＲ生成物を臭化エチジウムを含 有する１、５ｚのアガロースゲル上で展開した。前段落に記した発見と一致して 、ＡＢＭＴ受容者からの活性化Ｔ細胞は、０［Ｔ３による単独の刺激後も、ＩＬ −２についての曹ＲＮＡの測定可能なレベルを有しなかったのに対して、０ＫＴ ３７９．３で刺激した同じＴ細胞は、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲ ル上で測定された４５８ｂｐのルー２の独自のバンドを有していた。これは、＾ ＢＭＴ受容者からのＴ細胞中でのＩＬ−２について■ＲＮＡ発現の明らかな欠如 をいかに０にＴ３７９．３が修復し得るかの例示である。 抗ＣＤ３を用いた活性化後の負に選択されたＣＤ４＋細胞に対する抗ＣＤ２８９ ．３を用いた刺激は、ＩＬ−２非依存性増殖応答を誘導する。　Ｔｈｏｓｐｓｏ ｎ、Ｃ，Ｂ、らのＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：１３３３〜１３３７（１９ｇ９）に 記載されているような一連の負に選択する工程により、ＣＤ４＋細胞を精製した 。ＰＢＬを、非ＣＤ２８″″細胞に対する■＾ｂｓの混合物と共にインキュベー トし、洗浄し、そしてヤギ抗マウス抗体で被覆された免疫磁気ビーズと共にイン キュベートした。このＣＤ２８′″が富んだ細胞画分を、抗ＣＤ８処理によって ＣＤ８“細胞を除去することにより、そしてこのＣＤＩＩ＋細胞を免疫磁気ビー ズに結合させることにより、さらに精製した。 健常ドナーからの残存するＣＤＺＢ“、ＣＤ４”Ｔ細胞を、これらの細胞を０Ｋ Ｔ３が吸着したプラスチックを含有する培養皿に加えることにより、培養した。 ４８時間後、これらの細胞を取り出し、ｒｌＬ−２（２（１０１０／ｍｌ）また は抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）ノイずれかを含有するフラスコ中で培 養した。これらの細胞に、０．５ｘｌＯ６／−１の細胞密度を維持するのに要求 される新鮮培地を加え、そしておよそ週に１回の間隔で０にＴ３が吸着したプラ スチック上で２４時間培養することにより、再刺激した。これら細胞は、細胞数 が４〜５１０ｇ＋ｓ範囲の対数成長期で維持した。図１８に示されるように、抗 ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇを用いて増殖させた細胞は、通常、抗ＣＤ３およびＩＬ −２の最適の量で成長した細胞より、１０〜３０倍も増加した。ＦＢＳを含有し ない合成培地（Ｘ−ＶＩｖｏｌＯ）を使用した場合、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇ で処理された細胞はまた、抗ＣＤ３およびＩＬ−２で処理された細胞より１０倍 にも増加した。ＣＤ４が非常に富んだ細胞は、レクチンファイトへマグルチニン （ＰＨＡ）の最適量存在下では増殖しなかった。それゆえ、抗ＣＤ２ｇを用いた ＣＤ４細胞のインビトロでの増加は、外因性成長因子の添加に依存しない（これ らの細胞にＩＬ−２または他の成長因子を加えない）ので、前記の方法に関して 、利点がある。さらに、このシステムは、副細胞の存在が必要とされないため、 副細胞が制限され、または不足している臨床現場にとって有利である。 抗ＣＤｆｆ活性化Ｔ細胞の発現型。！Ｌ−２存在下で６〜１２日間成長したＣＴ Ｃ細胞群は、多（のＣＤ３＋細胞を含有した（８４％より多い、中間値８８％） 。ＣＤ５８”細胞（Ｎ［細胞のマーカー）の割合は１．３％より少なかった。０ ＩＴ３によるＥ＋細胞の誘発は、優先的にＣＤ３”細胞を選択する。ＣＤ４°細 胞は、１８％またはそれより少なく、そしてＣＤＩＩ＋細胞は６６％より多かっ た。溶解活性は、この培養物中のＣＤ５６”細胞の割合とは関連しなかった。 抗ＣＤ２８および！Ｌ−２が介在する細胞成長後のＴ細胞の免疫発現型は興なっ ている。増加したＴ細胞の部分集合を調べるため、抗ＣＤ３およびＩＬ−２、ま たは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇのいずれかを用いて、ＰＢＬを１６日間、増殖 させた。ＣＤ４およびＣＤ８の割合は、ＩＬ−２存在下で成長した細胞では２３ ．８％および８４．５％であり、そしてＣＤ２８存在下で成長した細胞では５６ ，０％および５２．６％であった。これらの結果は、ＩＬ−２存在下で成長した 細胞ではＣＤ「細胞が優勢であるという良（確立された所見（例えば、前記段落 を参照；　Ｃａｎｔｒｅｌｌ、　Ｄ、＾らのＪ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１５８ ：１８９５（１９８３）も参照）に比べ、ＣＤ２Ｂによる増殖は、ＣＤ４＋細胞 に有利であることを示唆した。この可能性をさらに調べるため、本実施例のいず れかに記載されているように、モノクローナル抗体および磁気免疫ビーズを用い た負の選択を用いて、ＣＤ４細胞を９８％純度まで濃縮した。これらの細胞を、 抗ＣＤ３、およびＩＬ−２または抗ＣＤ２８のいずれかを用いて１力月間培養し て増殖させた。培養の初めの２６日間で、これらの細胞は同等に増加したが、表 １６に見られるように、細胞の発現型は培養時間の増加に伴って、徐々に異なっ てきた。 表１６ インビトロでＴＩＬを増加させるための抗ＣＤ２Ｂの使用　種々の新生物に対し て、後期に適用される免疫療法における、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ細胞）を増 加させるためのＩＬ−２および不活化腫瘍細胞の使用が、有望であることが示さ れている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、＾、らのＮＥＪＭ　３２３：５ ７Ｇ−５７８（１９９０）を参照）、ＴＩＬ細胞を、腎細胞癌患者の腎切除標本 から分離した。この細胞を、腫瘍細胞、およびＩＬ−２、または、ＣＤ２ｇおよ びＩＬ−２のいずれかと共に培養し、そして第１４８目から週に一回の間隔で醜 ＾ｂｏＫＴ３を加えた。表１７は、抗ＣＤ２ｇが、幾何かの患者で、上記細胞を 増殖させるのに優れた方法（細胞の収率が２０倍にもなる）であることを示して いる。免疫発現型の分析もまた、ＣＤ４　Ｔ細胞がｒＴＩＬＪ培養物中で増加す ることを表している。さらに、これらの細胞は、ＤＡＵＤ＋標的に対して強力な 細胞毒性、すなわち、エフェクター：標的が、４０：１．２０：１．１０：１お よび５：１比率時に、８２．８％、６９．７％、７８．８％および１０１．５％ の特異的細胞溶解を示した。 表１７ 丁ＩＬ細胞を増加させるための抗ＣＤ２１１の使用抗ＣＤ３および抗Ｃ０２８に よる共刺激は、ＣＤ４＋細胞中のルー２およびＴＮＦ−αの−ＲＮ＾の発現を高 める。インビトロで抗ＣＤ２Ｂにより増殖したＣＤ４細胞がリンホカインの効果 的な供給源で有り得るか否かを調べるため、休止ＣＤ４細胞を、抗ＣＤ３　ｍＡ ｂで４８時間刺激し、続いて５Ｇ１０／■１の組換え型ＩＬ−２を添加し、抗Ｃ Ｄ３および抗ＣＤ２ｇで共刺激したＣＤ４Ｔ細胞と比較した。全ＲＮＡを、各組 み合わせから採集した。全体で１０μｇのＲＮＡを各レーンにロードした。均一 なローディングを示すために、クラス１プローブ（ＨＬＡ　Ｂ？）を用いた。プ ロットを、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよび［ＩＬＡに特異的な１ｌｐＨ識プローブ で連続的にハイブリダイズした。第１日および第８日月に、上記培養物を、！Ｌ −２または抗ＣＤ２８■＾ｂ９．３（０，１Ｂｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３　 峰すを用いて再刺激した。 各レーンの同等のローディングを示すために、このプロットは、はぎとられ、そ してＩＩＬＡクラスＩ■ＲＮＡの定常領域についてのプローブを用いてリハイブ リダイズした。図１９のノーザンブロ・ＩＬに例示されるように、抗ＣＤｆｆお よび抗ＣＤ２δで共刺激した後のＩＬ−２およびＴｌ１Ｆ−αのｍＲＮＡは明ら かに増加し、そしてＩＬ−２およびＴＮＰ−αの＋ｅＲＮ＾は、１１．−２で増 殖された細胞のそれを１０〜５０倍も上回った。同様の結果は、抗ＣＤ３および ！Ｌ−２または抗ＣＤ２ｇで週に１回前刺激して、１力月間培養した培養物を調 べた場合にも、得られた。 抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇで長期刺激したＣＤ４＋細胞培養物の上清は、ＩＬ− ２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＩＩＦ−αのかなりの量を含有する。２００１Ｕ／ｍ ｌのＩＬ−２またはＩＬ−２が存在しない抗ＣＤ３および抗ＣＤ２１１の組み合 わせの存在下で、抗ＣＤ３刺激を行った後、その上清について、ＣＴＬＬ−２細 胞系を用いた！Ｌ−２含有量、ＥＬＩＳＡによるＧＭ−ＣＳＦ含有量、モしてＥ ＬＩＳＡによるＴＮＦ−α含有量を測定した。このＣＤ４”細胞を、抗ＣＤ３お よびＩＬ−２、または、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇを用いて、およそ週に１回の 間隔で各々再刺激した。ＣＤ４＋細胞の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇ培養物は、外 因性ＩＬ−２存在下で成長した抗ＣＤ３活性化細胞から得られた上清中に見られ るＩＬ−２とほぼ同じ量のＩＬ−２が生成された。抗ＣＤ３および抗ＣＤＺ８で 刺激したＣＤ４＋細胞によって産生されたＧＭ−ＣＳＦの量もまた、かなり多か った。上清の測定時期に依存して、ＴＮＦ−αのレベルが変動したが、ＴＮＦ− αの■ＲＮＡを誘導するには、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２ｇを用いた共刺激は、抗 ＣＤ！およびＩＬ−２を用いた刺激より優れていた。これらのデータは、抗ＣＤ ２ｇと抗ＣＤ３との共刺激は、ＩＬ−２のいくつかの機能を代用するだけでなく 、ＣＤ４”細胞の他の合成機能をも増強し得ることを示す。 実施例ＸＶ ＣＤ２１１およびＣＴＬＡ−４発現の研究ＣＤ２ｇ”Ｔ細胞に限定されたＣＴＬ Ａ−４発現。部位特異的プライマーおよびヒトゲノムＤＮ＾のＤＮＡ　ＰＣＲを 利用することにより、ヒトＣＴＬＡ−４のエキソン１１に対応する３４８ｂｐフ ラグメントを作製し、ゲルで精製し、そして１１Ｐ−標識プローブとして使用し た。磁気ビーズ免疫吸着を用いた負の選択により、精製されたヒトＴ細胞を、Ｃ Ｄ２ｇ”フラクン■ンおよびＣＤ２１１−ワラクシ１ンに分離した。ＣＤ２Ｂ− Ｔ細胞を、培地中で、あるいはＰＭＡ＋イオノマインンまたはＰＭＡ十抗ＣＤ２ １１−＾ｂ（ｓＡｂ　９．３）を用いて１２時間刺激し、測定した。ＣＤ２８″ ″細胞を、上記後者の２物質を用いて１２時間刺激した。ＨＡを、グアニジンイ ンチオシアネートにより抽出し、そして塩化セシウム勾配法によって精製した。 等量の（臭化エチジウム染色により決定された）　ＲＮＡを、ホルムアルデヒド −アガロースゲルにかけて分離し、そして同等のＲＮＡローディングを示すよう に、ニトロセルロースに移した。続いて、このプロットを、上記作製したＣＴＬ Ａ−４プローブを用いて調べた。 ＣＴＬＡ−４は、ＰＭＡまたはＰＭＡ＋■Ａｂ９．３刺激後のＣＤ２８＋細胞で 発現されたが、休止細胞または刺激されたＣＤ２ｇ−細胞では発現されなかった 。同じプロットをＨＬ＾プローブでハイブリダイズし、ＲＮＡのローディングが 同等であることを確認した。 ＣＤ２Ｂ経路活性化を引き起こす条件下で誘導されたＣＴＬＡ−４発現。精製さ れた休止ＣＤ２８°細胞を、ＰＭＡ単独で、イオノマイシン単独で、およびＰＭ Ａ＋イオノマイシンで、１時間、６時間、１２時間および２４時間刺激した。Ｒ ＮＡを抽出し、そしてＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４プローブに対するハイブリダ イゼーシ冒ンにより分析した。ノーザンブロノト分析では、ＣＴＬＡ−４発現が 、ＰＭＡまたはＰＭＡ＋イオノマイシン（ＣＤ２Ｂ経路の活性化に対して共刺激 的な条件である）により誘導されたことが示された。ＣＤ２ｇ経路活性化に対し て共刺激的でないイオノマイシン単独では、ＣＴＬＡ−４発現は誘導されなかっ た。対照的に、ＣＤ２８発現は、イオノマイシンまたはＰＭＡに対して一定的で あり、また、ＰＭＡおよびイオノマイシンの刺激に対しては抑制される様であっ た。 また、ＣＴＬＡ−４発現の誘導は、刺激１時間後すぐに生じ、これは、ＣＤ２ｇ 経路活性化に伴うＩＬ−２発現での６〜１２時間に匹敵することも注意されるべ きである。ＣＴＬＡ−４発現が、ＣＤ２ｇ経路活性化（すなわち、増強されたＩ Ｌ−２発現）により生じた生理現象に先行するので、ＣＴＬＡ−４発現は以後の 現象の発生に関して、役割を果たしている様である。 精製されたヒトＴ細胞を、処理しないか、あるいはＰＭＡ＋ＰＨＡ１第二抗体（ ヤギ抗マウスＩｇ）で架橋された抗ＣＤ２８■＾ｂ１　または同様の方法で架橋 された抗ＣＤ５　ｓＡｂを用いて１時間、４時間または２３時間刺激した。ノー ザンプロット分析では、ＣＤ２ｇレセプター（ＰＭＡおよびイオノマイシンとは 異なったメカニズムでｃｏｚａ経路を活性化させる）の架橋がＣＴＬＡ−４発現 を誘導することが示された。 ＣＤ２１１経路活性化に対して、わずかにしか、または全（応答しないＣＤ２１ １＋細胞系は、ＣＴＬＡ−４を発現しない。Ｋｏｚｂｏｒ、　Ｄ、らのＪ、１ｍ ｍｕｎｏ１．．１３８：４１２Ｂ−４１３２（１９８７）およびＬｅｄｂｅｔｔ ｅｒ、　Ｊ、　Ａ、らのＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１１４：１３８４−１３８８（１ ９１１？）ニお０テ議論されるようＥ、ＣＤ２Ｂ＋ではあるが、ＣＤ２ｇ共刺激 に対し反応性力く乏しＩ、Ｓ（Ｔ細胞系Ｊｕｒｋａｔ　ＣＪ）、または反応性が まったくな−）（骨髄腫細胞系ＲＰＭＩＪ２２６）　２つの細胞系を、ＰＭＡ＋ イオノマイシン＋■Ａｂ　９゜３で刺激し、続いて、ＣＤ２ｇおよびＣＴＬＡ− ４発現につ０てノーインプロット法により分析した。■細胞白血病細胞系Ｊｕｒ ｋａｔ　ＣＪおよび骨髄腫細胞系ＲＰＭＩｌ１２２６に対する／−ザンブロ・ノ ド分析では、これらの細胞系は、ＣＤ２１１を発現するにもか力）わらず、ＣＴ ＬＡ−４を発現しないことが示された。 Ｔ細胞を、ファイトへマグルチニン（ＰＩＩＡ）、ホルボールミ１ノステートア セテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（ＩＯＮＯ）または抗ＣＤ２ｇモノク ローナル抗体（α−ＣＤ２ｇ）を包含する種々のマイトジェンの組み合わせと共 にインキ１ベートし、そのＣＴＬＡ−４■ＲＮＡ発現を誘導する能力を調べた。 図２０に示されるように、上記マイトジェン、ＰＨＡおよびＰＭＡの組み合わせ は、正常ヒトＴ細胞でのＣＴＬＡ−４発現を速やかに誘導するが、全ての調べた 組み合わせは、Ｊｕｒｋａｔ　Ｔ細胞系でのＣＤ２１１イソｆｆｉ　ＣＴＬＡ− ４の発現を誘導しなかった。両方の細胞型とも、全ての試験条件下で、充分なレ ベルのＣＤ２８■ＲＮ＾を発現する。 休止Ｔ細胞を、抗ＣＤ２Ｂモノクローナル抗体で共刺激し、正常ヒト細胞での活 性化を調べた。図２１に示されるように、濃度がｌμｇ／ｍｌである、平板に付 着している抗ＣＤ３　（α−ＣＤ３）モノクローナル抗体は、刺激１時間後で初 めて観察される、低いレベルにすぎないＣＴＬＡ−４ｍＲＮＡ発現を誘導した。 これに対し、抗ＣＤ２ｇ（α−ＣＤ２ｇ）モノクローナル抗体（１ｇｇ／ｍｌ） を溶かした抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｌ　ｕ　ｇ／ｍｌ）を用いた共刺激は 、ＣＴＬＡ−軸ＲＮＡ発現の誘導を著しく増加させた。 上記開示には、修飾、変更または置換の許容される範囲を包含することが意図さ れることは理解されるべきである。従って、添付のクレームは広く、そして本発 明の精神および範囲に一致して解釈されるべきである。 本明細書中で引用された全ての刊行物および出願書類は、本明細書に参考として 援用されている。 ＪＨ−４−ミジ：／　（ｃｐｍ　ｘ　１０づ）”ｇ　’ｙ７ｂ７；ｒ−”）ン　 （Ａ４ｇ／ｎθ０　Ｊｏ　６０　９０　１２０　２４＠４８ｔ、川＞Ｅ、Ｌ’を 支１１−間　と−ｄ琶し 江Ａ’！　’；ｉ、、　、７１叶間（ｇ悼０　５　１０　１５　２０　２５　Ｊ ｏｏ　５　１０　１５　２０　２５　ＪＯェ＝＝＝＝１４ 特表千７−５０８７１１　（３６） フロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内Ｍ　理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２ 　Ｋ　９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ （３１）優先権主張番号　８６４，８６６（３２）優先口　１９９２年４月７日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　９０２，４６７（３２）優先口　１９９２年６月１９ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） Ｉ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　ジューン、カール　エイチ。 アメリカ合衆国　メリーランド　２０８５０゜ロックビル、バーロウ　コート　 ７

Claims (111)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｔ細胞群を有する受容者が、インビボにおいて抗原にさらされて感作され、 ここで該受容者のＴ細胞群の少なくとも一部が該抗原によって活性化されている 、該抗原に対するＴ細胞介在性応答を選択的に増強する方法であって、以下の工 程： ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンド を選択する工程；ｂ）該リガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に連合 し得る形態で提供する工程；およびｃ）該提供されたリガンドを、該活性化され たＴ細胞によりＴｍＣＤ２８リンホカイン平均細胞産生を増加させるのに充分な 量で、該受容者に投与する工程； を包含する、方法。
2. ２．前記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメン ト、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な組 み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記リガンドがＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、請 求項１に記載の方法。
5. ５．前記リガンドが合成物由来である、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記リガンドが組換え分子を包含する、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記リガンドが天然のリガンドの刺激相同物である、請求項２に記載の方法 。
8. ８．前記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、請求項３に記載の方法。
9. ９．前記リガンドがＦ（ａｂ′）■フラグメントを包含する、請求項３に記載の 方法。
10. １０．前記モノクローナル抗体がｍＡｂ９．３を包含する、請求項３に記載の方 法。
11. １１．ＣＤ２８＋Ｔ細胞群を有する受容者に投与され、それにより該Ｔ細胞群の 少なくとも一部を活性化する外来の抗原に対する、インビボでのＴ細胞介在免疫 応答を上昇させる方法であって、以下の工程： ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンド を選択する工程；ｂ）該リガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に適合 し得る形態で提供する工程；およびｃ）該提供されたリガンドを、該ＣＤ２８レ セプターへの結合およびその刺激に充分な量で、該受容者に投与する工程； を包含する、方法：： ここで、該免疫応答の上昇は、該活性化されたＴ細胞によるＴｍＣＤ２８リンホ カイン平均細胞産生の増大を包含する。
12. １２．前記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメ ント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な 組み合わせからなる郡から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、請求項１１に記載の方法。
14. １４．前記リガンドがＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、 請求項１１に記載の方法。
15. １５．前記リガンドが合成物由来である、請求項１１に記載の方法。
16. １６．前記リガンドが組換え分子を包含する、請求項１１に記載の方法。
17. １７．前記リガンドが天然のリガンドの刺激相同物である、請求項１２に記載の 方法。
18. １８．前記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、請求項１３に記載の方法。
19. １９．前記リガンドがＦ（ａｂ′）■フラグメントを包含する、請求項１３に記 載の方法。
20. ２０．前記モノクローナル抗体がｍＡｂ９．３を包含する、請求項１３に記載の 方法。
21. ２１．Ｔ細胞群を有する受容者での、選択された外来の抗原に対する免疫応答の 増強を誘導する方法であって、以下の工程： ａ）該外来の抗原を、該Ｔ細胞群の一部を活性化するのに充分な量で、該受容者 に投与する工程；ｂ）ＣＤ２８レセプターに対して特異的な、選択された刺激リ ガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に適合し得る形態で提供する工程 ；および ｃ）該選択されたリガンドを、該ＣＤ２８レセプターを刺激するのに充分な量で 投与する工程； を包含する、方法。
22. ２２．前記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．前記リガンドがＣＤ２８に対する天然のリガンドを包含する、請求項２１ に記載の方法。
24. ２４．前記リガンドが組換え分子を包含する、請求項２１に記載の方法。
25. ２５．前記リガンドが合成物由来である、請求項２１に記載の方法。
26. ２６．前記外来の抗原が微生物抗原を包含する、請求項２１に記載の方法。
27. ２７．前記抗原が寄生体抗原を包含する、請求項２１に記載の方法。
28. ２８．前記抗原が、前記受容者内での抗原産生のために、該受容者に抗原ｃＤＮ Ａを提供することにより投与きれる、請求項２１に記載の方法。
29. ２９．前記外来の抗原が細菌抗原を包含する、請求項２６に記載の方法。
30. ３０．前記外来の抗原がウイルス抗原を包含する、請求項２６に記載の方法。
31. ３１．前記外来の抗原が天然物由来である、請求項２６に記載の方法。
32. ３２．前記抗原が合成物由来である、請求項２６に記載の方法。
33. ３３．前記抗原が組換え分子を包含する、請求項２６に記載の方法。
34. ３４．細胞のＴｍＣＤ２８リンホカイン産生を増大するのに効果的な量のＣＤ２ ８レセプター刺激リガンドと組み合わせて外来の抗原を含む、ワクチン。
35. ３５．ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターを活性化するのに効果的な量のＴＣＲ／ＣＤ３ レセプター刺激リガンドをさらに含む、請求項３４に記載のワクチン。
36. ３６．Ｔ細胞抗原レセプターを介して刺激された無活動Ｔ細胞群のアネルギー誘 導を防止する方法であって、以下の工程： ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンド を選択する工程；ｂ）該リガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程 ；および ｃ）該提供されたリガンドを、該ＣＤ２８レセプターへの結合およびその刺激に 充分な量で、該細胞群に投与する工程を包含する、方法。
37. ３７．前記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメ ント、天然のＣＤ２８リガンドお上びその刺激相同物、および、それらの有効な 組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記リガンドが抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を包含する、請求項３６に 記載の方法。
39. ３９．前記リガンドが前記ＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含す る、請求項３６に記載の方法。
40. ４０．前記リガンドが合成物由来である、請求項３６に記載の方法。
41. ４１．前記リガンドが組換え分子を包含する、請求項３６に記載の方法。
42. ４２．前記リガンドがＦ（ａｂ′）■を包含する、請求項３８に記載の方法。
43. ４３．前記抗体がｍＡｂ９．３を包含する、請求項３８に記載の方法。
44. ４４．Ｔ細胞群における、ＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連す るＣＤ２８経路の活性化を阻害する方法であって、以下の工程： ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得るが、刺激し得ない阻害リ ガンドを選択する工程；ｂ）該リガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供す る工程；および ｃ）該提供されたリガンドを、該ＣＤ２８経路の活性化を阻害するのに充分な量 で、該Ｔ細胞群に投与する工程；を包含する、方法。
45. ４５．前記リガンドが前記ＣＤ２８レセプターと架橋しない、請求項４４に記載 の方法。
46. ４６．前記リガンドが改変された天然のリガンドを包含する、請求項４４に記載 の方法。
47. ４７．前記リガンドが合成物由来である、請求項４４に記載の方法。
48. ４８．前記リガンドが組換え分子を包含する、請求項４４に記載の方法。
49. ４９．前記リガンドがＦ（８ｂ′）を包含する、請求項４４に記載の方法。
50. ５０．以下の工程： ｄ）ＣＤ２８天然リガンドに結合し得る第二の阻害リガンドを投与する工程； をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
51. ５１．前記Ｆ（ａｂ′）がｍＡｂ９．３のＦ（ａｂ′）を包含する、請求項４５ に記載の方法。
52. ５２．Ｔ細胞群におけるＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連する 、ＣＤ２８レセプター刺激結合部位に結合し得る第一の刺激リガンドによる、Ｃ Ｄ２８経路の活性化を阻害する方法であって、以下の工程：ａ）ＣＤ２８刺激リ ガンドに１結合し得る第二のリガンドを選択する工程； ｂ）該第二のリガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および ｃ）該提供された第二のリガンドを、競合的に結合し、そして該刺激リガンドの 該ＣＤ２８レセプター刺激結合部位への結合を阻害するのに充分な量で投与する 工程；を包含する、方法。
53. ５３．前記刺激リガンドが天然のＣＤ２８リガンドを包含する、請求項５２に記 載の方法。
54. ５４．前記第二のリガンドが前記刺激リガンドに対する抗体またはそのフラグメ ントを包含する、請求項５２に記載の方法。
55. ５５．前記第二のリガンドが合成物由来である、請求項５２に記載の方法。
56. ５６．前記第二のリガンドが組換え分子を包含する、請求項５２に記載の方法。
57. ５７．以下の工程： ｄ）前記ＣＤ２８レセプターに結合し得るが刺激し得ない、第三のＣＤ２８レセ プター阻害リガンドを投与する工程；をさらに包含する、請求項５２に記載の方 法。
58. ５８．前記投与がインビボにおいてなされる、請求項５３に記載の方法。
59. ５９．前記第二のリガンドが、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の可溶性形態を包含 する、請求項５２に記載の方法。
60. ６０．活性化されたＴ細胞群によるＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生を抑制 する方法であって、以下の工程：ａ）ＣＤ２８シグナル伝達経路に関連するチロ シンリン酸化のインヒビターを選択する工程； ｂ）該インヒビターを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および ｃ）該提供されたインヒビターを、該チロシンリン酸化を阻害するのに充分な量 で投与する工程；を包含する、方法。
61. ６１．前記インヒビターがチロシンキナーゼのインヒビターを包含する、請求項 ６０に記載の方法。
62. ６２．前記インヒビターが細胞のホスファターゼを包含する、請求項６０に記載 の方法。
63. ６３．前記インヒビターがハルビマイシンを包含する、請求項６１に記載の方法 。
64. ６４．前記インヒビターがチロシンホスファターゼを包含する、請求項６２に記 載の方法。
65. ６５．Ｔ細胞群によるＴｍＣＤ２８リンホカインの内因性の細飽産生の増強によ る、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増大する方法であって、以下の工程： ａ）Ｔ細胞群を活性化する工程；およびｂ）ＣＤ２８特異リガンドでＣＤ２８レ セプターを刺激する工程； を包含する、方法： ここで、該活性化および刺激の程度は、ＴｍＣＤ２８リンホカインの内因性の細 胞産生を増大きせるのに充分な程度である。
66. ６６．前記活性化工程が、前記Ｔ細胞群を活性化するのに充分な量のＴＣＲ／Ｃ Ｄ３レセプターリガンドで、該細胞群を処理する工程をさらに包含する、請求項 ６５に記載の方法。
67. ６７．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグ メントを包含する、請求項６６に記載の方法。
68. ６８．前記ＣＤ２８特異リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激 フラグメント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それら の有効な組み合わせからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
69. ６９．前記ＣＤ２８特異リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、請求項６６に記 載の方法。
70. ７０．前記ＣＤ２８特異リガンドが、ＣＤ２８レセプターに対する天然のリガン ドを包含する、請求項６５に記載の方法。
71. ７１．前記ＣＤ２８特異リガンドが合成物由来である、請求項６５に記載の方法 。
72. ７２．前記ＣＤ２８特異リガンドが組換え分子を包含する、請求項６５に記載の 方法。
73. ７３．前記ＣＤ２８特異リガンドが、天然のＣＤ２８特異リガンドの刺激相同物 である、請求項６８に記載の方法。
74. ７４．前記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、請求項６９に記載の方法。
75. ７５．前記リガンドがＦ（ａｂ′）■フラグメントを包含する、請求項６９に記 載の方法。
76. ７６．前記モノクローナル抗体がｍＡｂ９．３を包含する、請求項７４に記載の 方法。
77. ７７．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する天然 のリガンドを包含する、請求項６６に記載の方法。
78. ７８．前記抗ＣＤ３抗体がＯＫＴ３を包含する、請求項６７に記載の方法。
79. ７９．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが合成物由来である、請求項６６ に記載の方法。
80. ８０．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが組換え分子を包含する、請求項 ６６に記載の方法。
81. ８１．以下の工程： ｃ）前記Ｔ細胞群を活性化前に受容者から除去する工程；および ｄ）該細胞群を刺激後に該受容者に再導入する工程；をさらに包含する、請求項 ６５に記載の方法。
82. ８２．以下の工程： ｃ）前記Ｔ細胞群を刺激前に受容者から除去する工程；および ｄ）該細胞群を刺激後に該受容者に再導入する工程；をさらに包含する、請求項 ６５に記載の方法。
83. ８３．以下の工程： ｃ）前記Ｔ細胞群を活性化および刺激前に受容者から除去する工程；および ｄ）該細胞群を活性化および刺激後に該受容者に再導入する工程； をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
84. ８４．前記活性化工程および刺激工程が、インビボにおけるＴ細胞群に対して行 われる、請求項６５に記載の方法。
85. ８５．免疫学的に近接な個体のＴ細胞群により、ＴｍＣＤ２８リンホカインの内 因性の細胞産生を場大させる方法であって、以下の工程： ａ）該細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な量のＴＣＲ／ＣＤ３刺激 りガンドで、該細胞群を処理する工程；および ｂ）該活性化されたＴ細脂群の少なくとも一部を刺激するのに充分な量のＣＤ２ ８刺激リガンドで、該細胞群を処理する工程； を包含する、方法。
86. ８６．以下の工程： ｃ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化およびＣＤ２８刺激前に、受容者から前記Ｔ細胞群を 除去する工程；およびｄ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化およびＣＤ２８刺激後に、該該 受容者に、該Ｔ細胞群を再導入する工程；をさらに包含する、請求項８５に記載 の方法。
87. ８７．前記ＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２８レセプターリガンドによる処理が、同 時に実行される、請求項８５に記載の方法。
88. ８８．前記丁ｍＣＤ２８リンホカインがＩＬ−２を包含する、請求項８５に記載 の方法。
89. ８９．前記ＴＣＲ／ＣＤ３リガンドが、抗ＣＤ３抗体またはそのＦ（８ｂ′）２ を包含する、請求項８６に記載の方法。
90. ９０．前記ＣＤ２８リガンドが、抗ＣＤ２８抗体またはそのＦ（ａｂ′）２を包 含する、請求項８６に記載の方法。
91. ９１．前記ＣＤ２８リガンドが、天然のＣＤ２８リガンドを包含する、請求項８ ６に記載の方法。
92. ９２．前記ＣＤ２８リガンドが、天然のＣＤ２８リガンドの刺激相同物を包含す る、請求項８６に記載の方法。
93. ９３．前記ＣＤ２８リガンドが合成物由来である、請求項８６に記載の方法。
94. ９４．前記ＣＤ２８リガンドが組換え分子を包含する、請求項８６に記載の方法 。
95. ９５．骨髄移植受容者における、ＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生を増大す る方法であって、以下の工程：ａ）該受容者からＴ細胞群を除去する工程；ｂ） 該除去された細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な重のＴＣＲ／ＣＤ ａレセプター刺激リガンドで、該除去された細胞群を処理する工程； ｃ）ＣＤ２８レセプターを刺激するのに充分な量のＣＤ２８レセプター刺激リガ ンドで、該除去された細胞群を処理する工程；および ｄ）該受容者に、該処理された細胞群の少なくとも一部を再導入する工程； を包含する、方法。
96. ９６．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが、抗ＣＤ３抗体またはそのフラ グメントを包含する、請求項９５に記載の方法。
97. ９７．前記ＣＤ２８レセプターリガンドが、抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメ ントを包含する、請求項９５に記載の方法。
98. ９８．前記抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３またはそのＦ（ａｂ′）２を包含する、請 求項９６に記載の方法。
99. ９９．前記抗ＣＤ２８抗体が、ｍＡｂ９．３またはそのＦ（ａｂ′）２を包含す る、請求項９７に記載の方法。
100. １００．前記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが天然のリガンドを包含する、 請求項９５に記載の方法。
101. １０１．前記ＣＤ２８レセプターリガンドが天然のリガンドを包含する、請求項 ９５に記載の方法。
102. １０２．Ｔ細胞群を有する受容者が、インビボにおいて抗原にさらされて感作さ れ、ここで該受容者のＴ細胞群の少なくとも一部が該抗原によって活性化されて いる、該抗原に対するＴ細胞介在性応答を選択的に増強するための薬剤の製造に おける、ＣＤ２８の油脂外ドメインに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用。
103. １０３．ＣＤ２８＋Ｔ細胞群を有する受容者に投与され、それにより該Ｔ細胞群 の少なくとも一部を活性化する外来の抗原に対する、インビボでのＴ細胞介在性 免疫応答を上昇させるための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターの細胞外 ドメインに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用：ここで、該免疫応答の上昇 は、該活性化されたＴ細胞によるＴｍＣＤ２８リンホカイン平均細胞産生の増大 を包含する。
104. １０４．Ｔ細胞群を有する受容者に対して選択された外来の抗原であって、該Ｔ 細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な量で投与される外来の抗原に対 する、免疫応答の増強を誘導するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプタ ーに特異的な、選択された刺激リガンドの使用。
105. １０５．Ｔ細胞抗原レセプターを介して刺激される無活動Ｔ細胞群のアネルギー 誘導を防止するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメイ ンに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用。
106. １０６．Ｔ細胞群における、ＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連 するＣＤ２８経路の活性化を阻害するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセ プターの細胞外ドメインに結合し得るが、刺激し得ない阻害リガンドの使用。
107. １０７．Ｔ細胞群におけるＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連す る、ＣＤ２８レセプター刺激結合部位に結合し得る第一の刺激リガンドによる、 ＣＤ２８経路の活性化を阻害するための薬剤の製造における、ＣＤ２８刺激リガ ンドに競合的に結合し得、該刺激リガンドの該ＣＤ２８レセプター刺激結合部位 への結合を阻害する、第二のリガンドの使用。
108. １０８．活性化されたｔ細胞群によるＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生を抑 制するための薬剤の製造における、ＣＤ２８シグナル伝達経路に関連するチロシ ンリン酸化のインヒビターの使用。
109. １０９．活性化されたＴ細胞群によるＴｍＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞 産生の増強による、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増大するための薬剤の製造における 、ＣＤ２８レセプターを刺激するＣＤ２８特異リガンドの使用。
110. １１０．免疫学的に近接な個体の活性化されたＴ細胞群による、ＴｍＣＤ２８リ ンホカインの内因性の細胞産生を増大させるための薬剤の製造における、該細胞 群の少なくとも一部を活性化するためのＴＣＲ／ＣＤ３刺激りかンド、該活性化 されたＴ細胞群の少なくとも一部を刺激するためのＣＤ２８刺激リガンド、また はそれらの両方、の使用。
111. １１１．骨髄移植受容者から除去され、薬剤による処理後に該受容者に再導入さ れたＴ細胞群でのＴｍＣＤ２８リンホカインの細胞産生を増大するための該薬剤 の製造における、該細胞群の少なくとも一部を活性化するためのＴＣＲ／ＣＤ３ レセプター刺激リガンド、ＣＤ２８レセプターを刺激するためのＣＤ２８レセプ ター刺激リガンド、またはそれらの両方、の使用。