CN101942026B - 长效干扰素融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域。具体涉及一种重组长效干扰素融合蛋白及其用途。本发明那个要解决的技术问题是提高干扰素的体内作用时间。解决该问题的技术方案是提供一种融合蛋白。该融合蛋白由N-端的干扰素和C-末端的人白蛋白结合肽以及链接二者之间的甘氨酸链接肽所组成。该蛋白可在大肠杆菌中高效表达，而且纯化工艺简单，可用于大规模工业化生产制备药物级的rcIFN-ABP融合蛋白纯品。与重组同源干扰素(rcIFN)本身相比较，本发明所获得的rcIFN-ABP融合蛋白具有血清半衰期更长的特点。同时其特异性抗病毒比活性与cIFN相当。该rcIFN-ABP融合蛋白可用于治疗病毒感染性疾病，诸如艾滋病、肝炎、SARS、禽流感等；同时也可用于肿瘤以及其它细胞增殖性疾病的治疗。

Description

长效干扰素融合蛋白及其用途

技术领域：

本发明涉及生物制药领域。具体涉及一种用于治疗病毒性感染疾病和肿瘤以及细胞增殖性疾病的重组长效同源干扰素(cIFN)-人蛋白结合肽(ABP)融合蛋白，及其用途。

背景技术：

人们早期在研究病毒的干扰现象(virus interference)时发现了一种作为抗病毒物质的蛋白称之为干扰素(interferon)。1957年Isaacs和Lindenmann证明流感病毒感染的鸡细胞可分泌一种可溶性因子介导细胞对同源和异源病毒都产生抵抗作用。1958年Nagano和Kojima也观察并得到了相似的结果。这些都为后来更详细地阐明生物机体干扰素***打下了早期的基础。1970年代，从白细胞中纯化出干扰素蛋白才使得干扰素真正可用于研究用途。1980年，由于成功用基因工程方法可获得大量纯化干扰素制剂，这样人们能够用干扰素对病毒感染疾病和肿瘤患者进行临床实验和治疗。

干扰素是由一组诱导产生的细胞因子组成的多基因家族蛋白。干扰素具有广泛作用，它可调控包括病毒增殖等一系列生物学功能。干扰素通常分为两种：I型干扰素，也称病毒干扰素(Viral IFNs)，包括α-干扰素(白细胞干扰素)和β-干扰素(成纤维细胞干扰素)，以及ω-干扰素。II型干扰素也称免疫干扰素(γ-干扰素)。病毒干扰素由病毒感染诱导生成。II型干扰素则由促有丝***或抗原刺激诱导生成。大部分病毒感染的细胞在培养中可合成α/β-干扰素。然而γ-干扰素只能由免疫***的活性细胞合成之，包括自然杀伤细胞(NK)，CD4⁺Th₁细胞以及CD8⁺胞毒/抑制性T细胞。

人体有许多病毒干扰素编码基因，包括14种α-干扰素基因，1种β-干扰素和1种ω-干扰素基因。它们都不含内含子(intron)，它们在人的第9号染色体短臂排列在一起。小鼠则在它的4号染色体相应区域。γ-干扰素只有1种，它具有3个内含子，它位于人的第12号染色体长臂；小鼠则为第10号染色体。尽管一些干扰素在机体内可经过一些翻译后的修饰诸如N-和O-糖基化修饰，但主要的人α-干扰素没有被糖基化。α-干扰素主要以单体发挥其生物学效应，而β-干扰素和γ-干扰素则以同源二聚源体形式起作用。现在还不知道人体为什么会有这么多α-干扰素基因。当用基因敲除(gene knock-out)方法除去小鼠单个β-干扰素基因，产生的小鼠则对病毒感染十分敏感，这说明众多的α-干扰素基因并不能补偿β-干扰素基因的作用，β-干扰素在抗病毒感染过程中有其独特的作用。由于在实验室中对干扰素进行了大量成功的基础研究，这才有了后来干扰素在临床治疗中的应用。美国FDA已批准三种干扰素：α-，β-和γ-干扰素作为临床治疗药物。对于α-干扰素用于最广泛的病毒感染性疾病包括乙型和丙型肝炎。此外，α-干扰素还被批准用于Kaposi氏肉瘤、性病疱疹、毛细胞性白血病、慢性髓性白血病和恶性骨髓瘤的治疗。β-干扰素被批准用于多发性硬化复发后的治疗。γ-干扰素则被批准用于慢性遗传性免疫紊乱(慢性肾小球疾病)的治疗。有数家生物制药公司生产治疗用的干扰素药物。Hoffman-La Roche公司生产商品名为RoferonA的干扰素-α2a；Schering公司生产商品名为Intron A的干扰素-α2b；Amgen公司生产商品名Infergen的同源干扰素；Interferon Sciences公司生产了商品名为Alferon N的由人白细胞制备而成的干扰素-αN3；Glaxo Wellcome公司生产了商品名为Avonex、Chiron公司商品名为Betaseron的β-干扰素。Genentech公司生产了商品名Actimmune的γ-干扰素。2001年1月，美国FDA批准了Schering公司生产的商品名PEG-Intron的聚乙二醇化干扰素-α2b用于治疗此前未接受过干扰素治疗的慢性丙型肝炎病人。Roche也生产聚乙二醇化得干扰素-α2a(商品名为Pegasys)用于治疗慢性丙型肝炎病人。

同源干扰素(Consensus Interferen，cIFN)是一个全合成的I型干扰素。通过分析比较14种天然α-干扰素亚型蛋白质序列结构，选取不同亚型相应每一位置上最常出现的氨基酸组成一新的蛋白质序列(即同源序列)从而得到一全新的同源干扰素。已经比较了同源干扰素与天然干扰素在抗病毒、抗细胞增殖、激活NK细胞活性、细胞因子诱导以及干扰素刺激基因表达活性方面的作用。在所有这些作用方面，与干扰素-α2a和-α2b相比较，同源干扰素作用都较二者强。这可能是由于细胞表面I型干扰素受体组成对同源干扰素较α-干扰素亲和力较高的原因。相反，在诱导白介素-1β生成方面同源干扰素较α-干扰素弱。这些结果也可能反映了与I型干扰素受体相互作用的多种协同蛋白(accessery proteins)不同结合作用的结果。这些独特的生物学特性使得同源干扰素比天然产生和重组天然干扰素在临床治疗上有明显优势。

临床试验证明同源干扰素可用于治疗一系列疾病包括慢性病毒感染和某些恶性肿瘤。在多个临床实验中心进行的各种安全和有效性实验中对同源干扰素和淋巴细胞源性α-干扰素【IFN-α(NAMALWA)】治疗感染了高滴度丙肝病毒慢性的肝炎患者进行了比较。在不增加额外毒性作用的情况下同源干扰素(18MIU)的有效性明显优于IFN-α(NAMALWA)(9MIU)；特别是当患者干扰了基因型为1b的病毒时效果更为显著。同源干扰素能安全、有效地作用于治疗慢性丙型肝炎病人以及常规干扰素治疗失败和治疗后复发的患者。近来同源干扰素也与其它抗肝类化学药物如ribavirin一起合用于治疗慢性丙型肝炎病人。同源干扰素也成功地用于了乙型肝炎病人的治疗。

然而，干扰素治疗与许多蛋白药物一样有明显不足之处就是血液中的半衰期短，α-干扰素注射入机体后迅速被清除之。在这种短循环半衰期条件下，为了达到有效地治疗效果，往往采用多效量(每日或每周三次)长时间用药(6-12个月或更长)。为了改善α-干扰素的药代动力学，减少用药频率。有些制药公司将α-干扰素与-12-KDa或30-KDa大小的聚乙二醇分子结合在一起制备了一种半合成型的干扰素药物(Pegglated IFN)。这种聚乙二醇化干扰素分子可使α-干扰素在体内作用时间延长，有其正面临床治疗效果。对聚乙二醇化干扰素的物理化学和生物学特性进行研究揭示了这种半合成干扰素分子特异的抗病毒活性与结合的聚乙二醇分子的组成和结合位置明显相关。这种聚乙二醇化作用可降低α-干扰素的特异性生物学比活。

白蛋白(分子量为约67KDa)是血液中最丰富的蛋白质，浓度为50mg/ml(600um)。在人类半衰期为19天。白蛋白的功能包括维持血浆PH值，胶体渗透压，使送代谢产物、脂肪酸等。并且它可作用血浆中的主要药物载体蛋白。人白蛋白(HSA)的长半衰期及稳定性使其提供了一种理想的载体与一些短效治疗蛋白组成融合分子。将葡萄球菌G蛋白的白蛋白结合功能区与人的补体受体-1组成融合蛋白可使后者在大鼠体内半衰期增加3倍达5小时。将α-干扰素与白蛋白融合产生一种全新的融合蛋白分子。人类基因组公司将β-干扰素与HSA编码基因串联在一起从而表达出一种二者融合蛋白(Albuferon-β).这种重组融合蛋白具有抗病毒和抗细胞增殖活性，可启动干扰素刺激应答元件(ISRE)介导的信号传导作用。然而，这种融合蛋白的特异性生物学活性比活仍比α-干扰素低。这可能是由于HSA与干扰素分子共价融合在一起时可影响后者的空间构象。

与白蛋白非共价结合已证明也能延长一些短效蛋白的半衰期。但目前没有关于干扰素的相关研究，而且如何进行实干扰素与白蛋白进行有效的非共价结合目前也是未知的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在延长干扰素的体内半衰期的同时还能尽可能地保持其活性。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种长效干扰素融合蛋白。该长效干扰素融合蛋白是由干扰素的C末端通过一段连接肽连接人白蛋白特异性亲和短肽(HSA-BP)而成。

优选的，上述长效干扰素融合蛋白中的干扰素为同源干扰素。

其中，上述同源干扰素的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE-COOH(SEQ ID NO.1)。

其中，上述长效干扰素融合蛋白中的人白蛋白特异性亲和短肽(HSA-BP)的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

H2N-SQRLMEDICLPRWGCLWEDDF-COOH(SEQ ID NO.2)。

其中，上述长效干扰素融合蛋白的其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKEGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF-COOH(SEQ ID NO.3)。

其中的干扰素的C末端和人白蛋白特异性亲和短肽HSA-BP之间的连接肽的氨基酸序列为GGG。

本发明在提供上述长效干扰素融合蛋白的同时，也提供了编码上述的长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列。

进一步的，编码本发明长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAATTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTCAACCTGTTCTCCACCAAAGACTCCTCCGCTGCTTGGGACGAATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCCCTGTCCACCAACCTGCAGGAACGTCTGCGTCGTAAAGAAGGCGGTGGCTCTCAGCGTCTGATGGAAGATATCTGCCTGCCGCGTTGGGGCTGCCTGTGGGAAGATGATTTCTAA(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的载体。

本发明还提供了含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的宿主细胞。

同时，本发明还提供了上述长效干扰素融合蛋白在制备治疗抗病毒药物或抗肿瘤药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗抗病毒药物或抗肿瘤药物，该抗病毒药物或抗肿瘤药物是以上述长效干扰素融合蛋白为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。

采用高通量筛选方法(HTS)，发现了一个短肽(HSA-BP)能选择性地与人白蛋白进行高亲和力结合。本发明设计和合成了这一短肽的DNA编码序列，将其与干扰素的编码序列通过一甘氨酸链编码序列链接在一起，从而编码干扰素-HSA-BP融合蛋白。HSA-BP位于干扰素的C-末端。将这一融合蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，可通过含有表达载体的大肠杆菌高效表达干扰素-HSA-BP(cIFN-HSA-BP)融合蛋白。采用生化分离纯化方法从大肠杆菌裂解物中得到高纯度的cIFN-HSA-BP融合蛋白。体外实验证明该融合蛋白与同源干扰素有相同的抗病毒和抗细胞增殖作用。

实验证明，本发明融合蛋白注射到小鼠体内其半衰期比单用cIFN延长12倍。这说明cIFN-ABP融合蛋白在具有干扰素的抗病毒、抗细胞增殖生物学活性同时，它在体内的半衰期显著延长，从而其临床治疗作用比干扰素本身有明显的优势。

附图说明

图1、0.7KB大小的cIFN-GGG-ABP编码DNA片段的凝胶电泳验证结果图。

图2、凝胶电泳验证结果图。Lane 1：1KD DNA ladder marker(1μg/10μl)，Lane 2：pBAD-cIFN质粒NheI+SphI酶切物20μl，Lane 3：pBAD-cIFN质粒XbaI+SacI酶切物20μl，Lane 4和5：PCRII反应产物20μl。

图3、凝胶电泳验证结果图。1：1kb DNA ladden Marker(1μg/10μl)；2：集落1SacI+xbaI酶的结果；3：集落2SacI+xbaI酶的结果；4：集落3SacI+xbaI酶的结果；5：集落4SacI+xbaI酶的结果；6：集落5SacI+xbaI酶的结果。

图4、pBAD-cIFN的ECoRV酶切凝胶电泳结果图。1：ECoRV酶切后的pBAD-cIFN质粒；2：未经酶切的pBAD-cIFN质粒；3：1kb DNA Ladder marker(1μg/10μl)。结果显示，ECoRV酶切可使pBAD-cIFN质粒线性化。

图5、pBAD-cIFNm的酶切结果图1：1kb DNA ladder make(1μ/10μl)；2：pBAD-cIFNm#1质粒经ECORV酶切；3：pBAD-cIFNm#1质粒SacI+Xba双酶切；4：PCR-Blunt II Topo-cIFN质粒经SacI+Xbal双酶切。

图6、生产纯化过程的免疫印迹(Western Blot)鉴定图1、未用L-***糖诱导的细菌裂解液；2、L-***糖诱导后的细菌裂解液；3、过Q-Sepharose柱的样品；4最后纯化完成的蛋白。

图7、Western blot免疫印迹结果图。第1道为重组cIFN-ABP可被人白蛋白抗体与人血清白蛋白一起免疫共沉淀下来，第2道为重组cIFN，没有发生免疫共沉淀。

图8、重组cIFN-ABP融合蛋白与其它的动物血清白蛋白结合试验结果。1人白蛋白做对照；2：犬白蛋白；3：大鼠白蛋白；4：猴子白蛋白；5：家兔白蛋白；6：：小鼠白蛋白。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施式进一步说明但不限定本发明。

实施例一重组cIFN-ABP蛋白编码基因的获得及其高效表达工程菌的构建

人工化学合成cIFN编码基因序列，并克隆到pBAD18质粒载体中(购自英俊公司Invitrogen，Carlsbad，USA，其序列参见J.Bacteriol.177，4121-4130(1995))，得到pBAD-cIFN。

首先以该质粒中的cIFN编码序列为模板，用PCR方法在其C-末端加入人白蛋白特异性亲和短肽(HSA-BP，简称ABP)编码序列及连接序列。pBAD18质粒是大肠杆菌高效表达质粒。cIFN编码序列是克隆到该质粒的XbaI和SacI酶切位点处。因此，用PCR方法分2步加入ABP、连接肽以及酶切位点的编码序列以便其cIFN-ABP融合蛋白编码序列能够重新克隆到该pBAD18表达载体中去高效表达。

PCR反应I：在cIFN编码序列C末端引入连接肽(GGG)及ABP(SQRLMEDICLPRW GCLWEDDF)的编码序列，在0.2mlPCR管中加入下列成分混匀之：

PCR反应周期为：

I：98℃2分钟

II：25个周期

III：72℃5分钟

IV：4℃备用

将反应物于1％琼脂糖胶中电泳。结果如下图所示，如预测结果一致，得到了一个0.7KB大小的cIFN-GGG-ABP编码DNA片段(凝胶电泳验证结果见图1)。

将该0.7kb大小从琼脂糖胶中回收纯化出来作为下一次PCR的模板，以在3’端下游引入XbaI酶切位点用于后续克隆。

PCR反应II：向0.2ml的PCR管中加入下列成份并混匀：

PCR反应周期同前述PCR反应周期。

然后将pBAD-cIFN质粒进行XbaI+SacI双酶切：

于37℃温育2小时.

同时将该质粒用NheI和SphI双酶切作为对照：

37℃温育2小时.

将质粒酶切反应物和PCR产物于1％琼脂糖胶中电泳(凝胶电泳验证结果见图2)。将Lane4的PCRII反应产物DNA片段和Lane 3XbaI-SacI酶切后的pBAD质粒载体DNA片段从琼脂糖胶中回收、纯化。

将PCRII反应物克隆到pCR-BLUNTII ToPo载体(lnvitrogen，USA)中去。

反应如下：

反应物混匀，置20℃反应10分钟。

然后将反应物转化Mach1(Invitrogen)感受态细菌细胞。将转化细菌涂于LB+Amp(100μg/ml)的琼脂糖平板中，置37℃培养过夜。次日挑选单菌集落，于LB培养基中扩增细菌，制备质粒DNA(Qiagen Miniprep Kit)。将质粒DNA用XbaI和SacI进行双酶切筛选鉴定。酶切反应为：

37℃温育2小时.

将酶切反应物加入到1％琼脂糖胶中电泳，结果如图3所示：

将图3中5号集落0.7kb大小的SacI-XbaI酶的片段从琼脂糖中分离回收纯化。该片段含有cIFN-GGG-ABP编码序列。

最后，将该含cIFN-GGG-ABP编码序列的SacI-XbaI DNA片段克隆到pBAD18 SacI-XbaI酶切位点中去。DNA连接反应如下：

连接反应20℃4小时.

如前所述，将该DNA连接反应物转化MachI感受态细菌细胞(Invitiogen，USA)，将转化细菌涂于LB+Amp(100μg/μl)琼脂糖培养板上，量37℃培养过液。次日排选单个菌落接种于2ml LB+Amp(100μg/ml)培养基中扩增细菌。然后用Qiagen Mini-Prep kit抽提纯化细菌质粒DNA，将质粒DNA进行酶切鉴定之。先用SacI，XbaI双酶切筛选出含有PCRII SacI-XbaI***序列的阳性克隆。

将筛选出的含有cIFN-ABP***序列的pBAD质粒命名为pBAD-cIFNm，进一步将pBAD-cIFN和pBAD-cIFNm质粒进行酶切图谱的比较，在pBAD-cIFN质粒中只含有一个ECoRV酶切位点，因此，用ECoRV酶切可使该质粒线性化，ECoRV酶切结果如图4所示。结果显示，ECoRV酶切可使pBAD-cIFN质粒线性化。

然后，选取1个pBAD-cIFNm质粒克隆分别进行SacI+XbaI双酶切和ECoRV单酶切。方法同前。由于除了pBAD18质粒本身含有一个ECoRV酶切位点，因此pBAD-cIFNm经ECoRV酶切可以产生2个DNA片段，结果如图5所示，完全与预测结果一致。

所有结果显示pBAD-cIFNm含有正确的酶切位点和cIFN-ABP***序列。

最后，将pBAD-cIFNm进行DNA测序分析。结果表明所有cIFN、连接肽和ABP编码序列与设计序列完全符合，达到了设计目的。

实施例二、rcIFN-ABP蛋白的高效表达和纯化

TOP10感受态细菌购自美国Invitrogen公司。将pBAD-IFNm质粒按常规方法转入TOP10细菌细胞中，将转化细菌接种于LB琼脂糖培养板(含100μg/ml氨苄青霉素)上，置37℃培养过夜。取单菌落接种于5ml LB液体培养基(含100μgml氨苄青霉素)，置37℃摇床中培养(225-250RPM)过夜。取1ml过夜细菌培养物加入到100ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，置37度摇床培养，当OD600＝～0.5时，加入1ml 20％的L-***糖，继续培养4-8小时。收获诱导后的细菌细胞，将细菌培养物于Sorvall离心机(RC-5C，Dupont，USA，转头型号SS-34)于4℃，6000RPM离心15分钟。用缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.2，10mM EDTA，100mM NaCl)将细菌沉淀块洗一次。然后将细菌沉淀物悬浮于100ml Tris缓冲液(50mM Tri-HCl，pH8.5，5mM EDTA，1mM PMSF)。置于超声破碎细菌(30秒破碎/30秒冷却/200-300Wx30个周期)。将细菌裂解物置于4℃12000RPM离心30分钟以获得包涵体沉淀块。将包涵体沉淀块悬浮于前述Tris缓冲液(补加1％deoxycholic acid脱氧胆酸)中，洗2次以除去杂质。然后将包涵体沉淀物单独用Tris缓冲液洗一次。最后再用Milli Q水洗一次。

将包涵体溶于高pH的Tris/尿素缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH12.5，5mM EDTA，1Mm PMSF，2M尿素)。不断震荡以使其溶解。一般0.5g包涵体溶于20ml缓冲液中。将溶液于室温中摇匀5分钟，然后，置12000RPM离心15分钟以除去不溶的细胞杂质。取含包涵体的上清逐滴加入复性缓冲液中(50mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，2M尿素，10％蔗糖，1mM PMSF，0.1mM氧化型和1mM还原型谷胱甘肽(glutamthiones)，边滴加边搅拌。复性缓冲液体积是加入包涵体溶液的10倍。将该溶液置于4℃搅拌4小时以让其蛋白开始部分复性。测定溶液的pH并调到pH8.4。将该溶液针对缓冲液(50mMTri s-HCl，pH8.4，1mM EDTA，2mM尿素，10％蔗糖，1mMPMSF)透析。每透析3小时后，再针对如下缓冲液透析(20mMTris-HCl，pH8.4，0.5mM EDTA，2.5％蔗糖，1mM PMSF，逐步减少其中尿素含量2M，1.5M，1M，0.5M，0)，共5次透析，每次3小时。

将复性蛋白溶液置4℃离心12000RPM 30分钟，取上清经0.45μm膜过滤。将过滤后的蛋白溶液上样于Q-Sepharose柱(50ml)进行纯化。Q-Sepharose先前用缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.4，1mM EDTA，5％蔗糖，1mM PMSF)平衡之。蛋白上样速度为0.5ml/分钟。然后将柱用平衡缓冲液洗涤(20倍柱体积，1ml/分钟速度)。结合在柱上的蛋白用0～1M NaCl盐梯度进行洗脱，速度为1ml/分钟。每管2ml进行收集，用UV检测仪监测收集的蛋白峰。将蛋白质样品于SDS-PAGE电泳分析。并用抗cIFN干扰素抗体进行免疫印迹(Western Blot)鉴定之(结果见图6)。将含有cIFN-ABP融合蛋白的收集管汇合在一起，然后进行进行PBS透析(4℃，4小时×3).透析后的蛋白样品置-70℃冻存。

试验例一、重组cIFN-ABP抗病毒活性的检测及其与cIFN的比较

将A549细胞以1×10⁴细胞/孔加入到96孔培养板中，培养基为DMEM+10％胎牛血清(Sigma)。24小时后，加入干扰素，继续培养24小时。移去干扰素，加入EMCV病毒(1pfu/细胞)溶液(DMEM+2％胎牛血清)感染细胞，培养1小时。移去病毒，加入新鲜培养基(DMEM+10％胎牛血清)继续培养24小时，然后用Cell Biolabs，Inc生产的Cytoselect^TMcell Viabilityand cytotoxicity Assay试剂盒(San Diego，CA，USA)测定活细胞存活率。根据干拢素剂量一应答曲线计标出EC50值。

表1，重组cIFN-ABP在A549细胞中的抗病毒活性及其比较

干拢素	EC50(pg/ml)
		rc IFN-ABP	4.8
rcIFN	4.4
		rIFN-α2b	5.8

由此可见，重组cIFN-ABP与重组cIFN抗病毒活性相当，二者均高于重组IFN-α2b的抗病毒活性。

试验例二、重组cIFN-ABP与人血清白蛋白的结合试验

将0.5ml人血清白蛋白(10μg/ml)溶液(PBS中配制)与0.5ml重组cIFN-ABP(10μg/ml)或重组cIFN(10μg/ml)(都配制于PBS中)混匀，置37℃温育30分钟，加入抗人白蛋白抗体(100μg/200μl)20μl继续温育1小时。取出后，加入G蛋白-琼脂糖试剂，置室温2小时(保持搅拌状态)。然后离心去除上清，将琼脂糖沉淀物用PBS+0.05％Tween20缓冲液洗三次，最后将沉淀物中加入100μl 1×laemmli缓冲液，置沸水中5分钟。取出后将上清加入到15％SDS-PAGE上样电泳，然后进行Western blot免疫印迹试验。用抗cIFN单抗去探测转移后的硝酸纤维膜(抗体应用浓度为1∶1000)，结果如图7所示。

试验结果表明：重组cIFN-ABP可被抗人白蛋白抗体与人血清白蛋白一起免疫共沉淀下来，证明它们二者结合在一起。而重组cIFN蛋白则不能与人血清白蛋白一起共沉淀，证明它们之间无结合。

试验例三、重组cIFN-ABP融合蛋白与其它的动物血清白蛋白结合试验

将小鼠、家兔、猴、大鼠、狗血清白蛋白与琼脂糖交联。然后将琼脂糖-动物白蛋白配制于PBS中蛋白含量为10μg/ml。取0.5ml琼脂糖-动物白蛋白的溶液与0.5ml重组cIFN-ABP(10μg/ml)混匀，置37℃搅拌温育30分钟。取出后用PBS+0.05％Tween20缓冲液洗涤3次。向沉淀物中加入100μl 1x Laemmli缓冲液置沸水中5分钟。取出后将上清加入到15％SDS-PAGE上样电泳，然后进行免疫印迹(Westerm blot)试验，用抗cIFN单抗去探测转移后的硝酸纤维膜(抗体应用浓度为1∶1000)。结果如图8所示，重组cIFN-ABP可与所有动物白蛋白结合并被琼脂糖颗粒沉淀下来。

试验例四、重组cIFN-ABP的小鼠体内清除试验

将三组雌性Balb/c小鼠(7-8周龄)分别经尾静脉注射100μl体积的rcIFN-ABP100μg/kg，rcIFN蛋白100μg/kg和PBS对照缓冲液。注射后不同时期从尾静脉取血样。其血样的抗病毒活性采用前述相同的方法测定之。其实验组血样的抗病毒活性减去相应PBS对照组血样的抗病毒活性等于外源注射于干拢素在循环血样中的抗病毒活性结果见表2。结果表明其半衰期远远大于未改造的普通干拢素。

表2小鼠体内清除试验结果

上述试验结果证明，本发明融合蛋白与同源干扰素有相同的抗病毒和抗细胞增殖作用。并且，本发明融合蛋白注射到小鼠体内其半衰期比单用cIFN大大延长。这说明cIFN-ABP融合蛋白在具有干扰素的抗病毒、抗细胞增殖生物学活性同时，它在体内的半衰期显著延长，从而其临床治疗作用比干扰素本身有明显的优势。

Claims (6)

1.长效干扰素融合蛋白，其特征在于：由干扰素的C末端通过连接肽连接人白蛋白特异性亲和短肽HSA-BP而成，其中的干扰素的C末端和人白蛋白特异性亲和短肽HSA-BP之间的连接肽的氨基酸序列为GGG，所述长效干扰素融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。 

2.编码权利要求1所述的长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列。 

3.根据权利要求2所述的编码长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.4所示。 

4.含有权利要求2或3所述的核苷酸序列的载体。 

5.含有权利要求2或3所述的核苷酸序列的宿主细胞。 

6.权利要求1所述的长效干扰素融合蛋白在制备治疗抗病毒药物中的用途。