CN117430716A - 靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用 - Google Patents

靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用。具体地公开了靶向干扰素融合蛋白ZP‑IC，包括10E8抗体或其抗原结合片段，以及集成干扰素α，所述10E8抗体或其抗原结合片段与集成干扰素α通过接头连接。本发明用能识别HIV外膜糖蛋白高度保守的gp41亚基MPER区的抗体10E8作为集成干扰素的定向工具，能够准确识别病毒在侵染细胞中外膜蛋白变构所暴露出来的靶点，阻止病毒侵染，发挥中和作用，同时，携带的干扰素分子可以更有效地与HIV病毒周围的细胞上的干扰素受体结合，发挥抗病毒功能。实验证明，ZP‑IC具有优良的抗病毒活性，并且具有广谱抑制绝大多数的HIV毒株的能力。

Description

靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用。
背景技术
艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)引起。HIV能破坏人体免疫***，把人体免疫***中非常重要的CD4+T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该类细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。艾滋病毒入侵CD4+T细胞的时候，以细胞表面的CD4分子为主要受体，CCR5或CXCR4为辅助受体。侵染第一步，病毒通过其外膜蛋白gp120与CD4+T细胞上的受体分子CD4结合而靠近细胞，进而gp120与嵌在宿主细胞膜上的辅助受体CCR5或CXCR4的进一步结合，拉近病毒与细胞的距离，触发病毒外膜蛋白分子gp120的变构，暴露其另一个膜蛋白亚基gp41，随后，gp41亚基中的HR1和HR2结构域折叠形成六螺旋束(亚基均为三聚体)，最终将病毒与宿主细胞无限拉近，病毒的外膜与宿主细胞膜融合，促成了病毒RNA入侵CD4+T宿主细胞。
HIV抗病毒药物的种类包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶链转移抑制剂、结合及膜融合抑制剂5大类。HIV感染者需终身服用药物控制病毒载量。长期服用化药凸显出来的药物的长期毒性、病毒耐药性，会导致病人依从性降低。所以需要寻找更有效、更安全的治疗药物，比如抗体类药物或重组的融合蛋白药物。它们不进入细胞，通常在细胞外发挥作用，通过中和病毒等方式，阻止病毒入侵细胞，从而控制感染。
HIV的治疗性中和抗体的靶点集中在HIV外膜糖蛋白上。HIV病毒粒子表面唯一一种抗原外膜糖蛋白是gp160，即三聚体(gp160)3，它可以裂解成为(gp120/gp41)3。HIV外膜蛋白上的许多显性的抗原表位是高度变异的，导致感染者自身产生的抗体结合效力不高。但HIV外膜蛋白上也有几个公认的相对保守的位点，成为广泛中和抗体(broadlyneutralizing antibodies，bNAb)的识别表位。其中一个是gp120亚基上的CD4结合位点，负责与人T细胞分化抗原CD4受体分子结合；还有一个是gp41亚基上靠近膜区的结构域，通常称为“近膜端外区”(membrane-proximal external region，MPER)，该区域功能与膜融合相关。(Huang JH,et al.Broad and potent neutralization of HIV-1by a gp41-specifichuman antibody.Nature.2012,491(7424):406–412.doi:10.1038/nature11544.)。
HIV gp41亚基分子量约41kDa，其主要的结构域从N端开始依次是融合肽(fusionpeptide，FP)，α-螺旋七肽重复域HR1(或称NHR)，α-螺旋七肽重复域HR2(或称CHR)，近膜端外区(MPER)，跨膜区(TM)。当位于外侧的gp120亚基寻找靶细胞及受体的任务完成以后，就会通过变构暴露出隐藏的gp41亚基。gp41亚基的N端融合肽FP会易位并***宿主细胞膜，而此时C端的跨膜区仍然锚定在病毒膜上，使gp41亚基呈现一种短暂的延伸构象，被称为“前发卡中间体”(pre-hairpin intermediate)。这种状态下，不管是NHR，CHR，还是MPER结构域，都暴露出来了，有利于膜融合抑制剂或相关抗体的识别。
许多多肽类膜融合抑制剂，都是通过模拟CHR的序列结构来设计，通过竞争性地结合在NHR上，从而阻止NHR和CHR的对折结合，破坏病毒的膜融合环节，防止病毒的侵染。此类的融合多肽包括2003年上市的HIV融合抑制剂药物T20(enfuvirtide，恩夫韦地)，2018年上市的艾可宁(albuvirtide)、T1249、T2635等升级换代多肽类候选药物(Eggink D,etal.Detailed Mechanistic Insights into HIV-1Sensitivity to Three Generationsof Fusion Inhibitors.J Virol.2011,85(20):10785-97.doi:10.1128/JVI.05331-11.)，以及LP51，LP98等多肽-脂质类候选药物(Xue J,et al.Efficient treatment and pre-exposure prophylaxis in rhesus macaques by an HIV fusion-inhibitorylipopeptide.Cell,2022.185(1):131-144.e18.doi:10.1016/j.cell.2021.11.032.)。
一些抗体则靶向了gp41的MPER结构域，比如2F5，4E10，Z13e1，10E8等，其作用机制是通过攻击gp41的“前发卡中间体”，阻止NHR和CHR结构域折叠形成六螺旋束。由于天然状态下的病毒粒子，其gp41的MPER结构域总是被gp120亚基遮蔽，所以这一类的抗体的特征是对处于融合前的“前发卡中间体”gp41亲和力非常高，而对三聚体的HIV膜蛋白(gp120和gp41组成的gp160)则表现出极低的亲和力。MPER结构域的抗体中，10E8研究最为广泛。据文献报道，10E8靶向HIV gp41亚基上的MPER区，其关键结合位点包括MPER区Trp672、Phe673、Trp676，以及其C末端的Tyr681、Ile682、Arg683。更细致的研究采用了10E8 Fab段与底物肽的X-射线晶体结构分析，表明gp41的MPER区由两个螺旋组成，而10E8主要识别的是从671位开始的第二个螺旋，该螺旋不仅包含MPER区的C端，还延伸了跨膜区(TMD)的N端的几个氨基酸。提供抗体识别的肽结构基础至少要延伸到TMD的第690位。结构解析显示，10E8的抗体重链上第3互补决定区(CDRH3)的尖端可以浸入脂质双分子层与TMD的N端螺旋结构结合，从而锁紧抗体对MPER螺旋结构的结合(Rujas E,et al.Neutralization of HIV-1through themolecular recognition of 10E8 helical epitope at the membrane interface.SciRep 6,38177(2016).https://doi.org/10.1038/srep38177.)。在亲和力方面，据文献测定，10E8与gp41的前发卡中间体(含TMD)的亲和力(解离平衡常数)约为1.85nM，与全长的MPER区肽段(656–683)的亲和力为17nM，与MPER区被隐藏的gp140则结合力极弱(Chen J,etal.Mechanism of HIV-1 neutralization by antibodies targeting a membrane-proximal region of gp41.J Virol.2014,88(2):1249-58.doi:10.1128/JVI.02664-13.)(Huang JH,et al.Broad and potent neutralization of HIV-1by a gp41-specifichuman antibody.Nature.2012,491(7424):406–412.doi:10.1038/nature11544.)。
采用10E8来中和基于不同序列HIV外膜蛋白而构建的假病毒，若以IC50低于50μg/ml(约330nM)为判定标准，该单抗可以中和181种测试假病毒中的98％；若以IC50低于1μg/ml(约6.6nM)为判定标准，该单抗则可中和这些测试病毒中的72％，大大高于结合位点同为MPER区的4E10单抗(后者的中和覆盖范围仅为37％)。此外，10E8的结合位点虽然极靠近病毒包膜，但它与磷脂双分子层的结合能力较弱，表明其有良好的安全性(Huang JH,etal.Broad and potent neutralization of HIV-1by a gp41-specific humanantibody.Nature.2012,491(7424):406–412.doi:10.1038/nature11 544.)(Chen J,etal.Mechanism of HIV-1neutralization by antibodies targeting a membrane-proximal region of gp41.J Virol.2014,88(2):1249-58.doi:10.1128/JVI.02664-13.)。而2F5和4E10这两株抗体与细胞的脂膜反应强，不适合后续开发。因此，10E8是一株有广泛中和活性的抗体，而且安全性高于同靶点的其它抗体。
干扰素(IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用，在生物学上属于一种细胞因子。根据干扰素的产生细胞、受体和生物活性等因素作为标准可将其分为I型和II型干扰素。I型干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-ω)具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用；II型(只有IFN-γ)的主要生物学活性为活化T细胞、NK细胞等，起到免疫调节作用。所有的I型干扰素分子结合相同的受体，即由IFNAR1和IFNAR2两个亚基所组成的异源二聚体。干扰素结合其受体后，能够活化下游的非受体酪氨酸激酶家族Jak1和Tyk2，进一步招募和活化信号传导及转录激活蛋白STAT1和STAT2，并与干扰素调节因子9(IRF9)形成复合物ISGF3(IFN-stimulated gene factor 3)，从而激活一系列干扰素刺激基因(interferon-stimulatedgene，ISG)的表达，诱导这些下游基因发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的功能。干扰素的功能包括如下两方面：一是通过与周围未感染的细胞上的相关受体作用，激发细胞合成多种效应蛋白，比如抗病毒蛋白tetherin，APOBEC1，以及蛋白激酶R，从而起到抗病毒作用；二是通过增强淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的活力来发挥免疫调节及抗肿瘤作用。
I型干扰素在抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)感染的治疗中发挥着重要的作用，有多款重组I型重组干扰素上市，比如罗氏的派罗欣，默沙东的佩乐能，国产的运德素，赛若金，安达芬等。但是在抗HIV感染领域，I型干扰素的治疗或辅助治疗作用却不十分明显。有学者认为I型干扰素在HIV感染进展中扮演着双重角色：在HIV感染的急性期，干扰素通过激发效应蛋白和刺激免疫***，发挥抗病毒的作用；但在慢性感染期，干扰素的持续暴露会导致机体脱敏和有害免疫反应的激活([1]Scagnolari C,et al.Type I interferon and HIV:Subtle balance between antiviralactivity,immunopathogenesis and the microbiome.Cytokine Growth FactorRev.2018,40:19-31.doi:10.1016/j.cytogfr.2018.03.003.[2]张立国.I型干扰素在HIV-1感染中的作用具有两面性.生物化学与生物物理进展Progress in Biochemistry andBiophysics.2018,45(9):966-970.doi:10.16476/j.pibb.2018.0191.[3]Sugawara S,etal.People with HIV-1demonstrate type 1interferon refractoriness associatedwith upregulated USP18.J Virol.2021,95(10):e01777-20.doi:10.1128/JVI.01777-20.)。这些观点无疑让干扰素在HIV治疗领域的应用前景变得不明朗，并逐渐从HIV感染治疗的候选药物名单中消失。
人I型干扰素包括12种IFN-α亚型、1种IFN-β和1种IFN-ω，每种干扰素的抗病毒活性差异都较大(Bekisz J,et al.Human Interferons Alpha,Beta and Omega.GrowthFactors.2004,22(4):243–251.doi:10.1080/08977190400000833)。在一项有20位临床病例的HIV治疗研究项目显示，聚乙二醇修饰的干扰素α-2a单药治疗，能够抑制HIV-1型病毒的复制，以及降低HIV的DNA在细胞中的整合(Azzoni L,et al.Pegylated Interferonalfa-2a monotherapy results in suppression of HIV type 1replication anddecreased cell-associated HIV DNA integration.J Infect Dis.2013,207(2):213-222.doi:10.1093/infdis/jis663.)。另外，I型干扰素的不同亚型也具有不同的抗HIV的功能。这主要由于不同亚型干扰素蛋白序列存在差异，这会导致它们对共有受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力会有数十倍或数百倍的差距，由此引发的下游信号传导及抗病毒能力的强弱也各不相同。研究人员比较了I型中α亚型干扰素不同分子的抗HIV能力，发现IFNα8、IFNα6、IFNα14等分子活性较高，而常见的IFNα1、IFNα2抗HIV能力较弱([1]Harper MS,etal.Interferon-αSubtypes in an Ex Vivo Model of Acute HIV-1 Infection:Expression,Potency and Effector Mechanisms.PLoS Pathog.2015,11(11):e1005254.doi:10.1371/journal.ppat.1005254.[2]Lavender KJ,et al.InterferonAlpha Subtype-Specific Suppression of HIV-1Infection In Vivo.J Virol.2016,90(13):6001-6013.doi:10.1128/JVI.00451-16.)。因此I型干扰素在HIV抗感染领域的成药性研究还在初级阶段，需要不断的探索和改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有更好的抗HIV病毒能力的HIV感染治疗药物。所要解决的技术问题不限于本文中所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为实现上述目的，本发明首先提供了融合蛋白，名称为ZP-IC，所述融合蛋白ZP-IC包括10E8抗体或其抗原结合片段，以及集成干扰素α，所述10E8抗体或其抗原结合片段与所述集成干扰素α通过接头连接。
进一步地，所述集成干扰素α可通过所述接头与所述10E8抗体或其抗原结合片段的C末端融合。
进一步地，所述集成干扰素α的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第483-648位。
进一步地，所述接头(linker)可为柔性肽接头，如包括甘氨酸和/或丝氨酸残基的肽接头。
进一步地，所述接头包括但不限于GSGSGS、GGGSGGGS、GGGSGGG、GGSSGG、GSGSGSG、GSGSG、GGGGS。
进一步地，所述接头为GSGSGS(SEQ ID No.1的第477-482位)。
进一步地，所述融合蛋白的重链的氨基酸序列可为SEQ ID No.1，所述融合蛋白的轻链的氨基酸序列可为SEQ ID No.3。
其中，SEQ ID No.1的第1-476位为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的重链的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第477-482位为接头(linker)的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第483-648位为集成干扰素α的氨基酸序列。
SEQ ID No.3也为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的轻链的氨基酸序列。
所述融合蛋白ZP-IC也为一种靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可编码本文中任一所述的融合蛋白。
进一步地，所述核酸分子可包括编码所述融合蛋白ZP-IC重链的核酸分子和/或编码所述融合蛋白ZP-IC轻链的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子可为编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子和/或编码序列是SEQ ID No.4的DNA分子。
其中，SEQ ID No.2的第1-1428位为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的重链的核苷酸序列，SEQ ID No.2的第1429-1446位为接头(linker)的核苷酸序列，SEQ ID No.2的第1447-1950位为集成干扰素α的核苷酸序列。
SEQ ID No.4也为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的轻链的核苷酸序列。
所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.4所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
A1)含有所述核酸分子的表达盒；
A2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有A1)所述表达盒的重组载体；
A3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有A1)所述表达盒的重组微生物、或含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A4)含有所述核酸分子的重组细胞、或含有A1)所述表达盒的重组细胞、或含有A2)所述重组载体的重组细胞。
其中，A3)所述的重组微生物和A4)所述的重组细胞可表达所述融合蛋白ZP-IC。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pcDNA3.1Neo(+)载体和/或pcDNA3.1Zeo(+)载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌Trans10。
本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述细胞为CHO细胞(CHO-DG44细胞)。
本文所述重组载体包括ZP-IC轻链表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)/ZP-IC LC和ZP-IC重链表达载体pcDNA3.1 Neo(+)/ZP-IC HC。
pcDNA3.1 Zeo(+)/ZP-IC LC是用核苷酸序列为SEQ ID No.4的ZP-IC轻链基因替换pcDNA3.1Zeo(+)载体的EcoRI识别位点和EcoRV识别位点之间的片段，保持pcDNA3.1Zeo(+)载体的其它核苷酸序列不变，得到的表达融合蛋白ZP-IC轻链的重组表达载体。
pcDNA3.1 Neo(+)/ZP-IC HC是用核苷酸序列为SEQ ID No.2的ZP-IC重链基因替换pcDNA3.1Neo(+)载体的EcoRI识别位点和EcoRV识别位点之间的片段，保持pcDNA3.1Neo(+)载体的其它核苷酸序列不变，得到的表达融合蛋白ZP-IC重链的重组表达载体。
本文所述重组微生物包括将所述融合蛋白的重链基因(SEQ ID No.2)和/或轻链基因(SEQ ID No.4)导入大肠杆菌得到的重组菌。
本文所述重组细胞包括将所述融合蛋白的重链基因(SEQ ID No.2)和轻链基因(SEQ ID No.4)表达于哺乳动物细胞(如CHO细胞)中得到的重组细胞。
本发明还提供了本文中任一所述的融合蛋白、所述核酸分子或所述生物材料的下述任一种应用：
B1)在制备用于预防或治疗HIV感染的产品中的应用；
B2)在制备用于预防或治疗艾滋病的产品中的应用；
B3)在制备用于抑制HIV病毒活性的产品中的应用；
B4)在制备用于结合或检测gp41蛋白的产品中的应用；
B5)在制备用于结合或检测MPER多肽的产品中的应用。
所述产品包括试剂、试剂盒、药物或药物组合物。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物可包含本文中任一所述融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
其中，所述药物组合物具有抑制或中和HIV活性的中和抗病毒作用。所述药物组合物用于改善、预防或治疗HIV感染或艾滋病。
本发明还提供了用于结合或检测gp41蛋白或MPER多肽的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含本文中任一所述融合蛋白。
本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法可包括：分别构建含有所述融合蛋白的重链和轻链基因的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述融合蛋白的重组细胞；培养所述重组细胞，经分离纯化获得所述融合蛋白。
进一步地，所述融合蛋白重链基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.2。
进一步地，所述融合蛋白轻链基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.4。
本发明的融合蛋白可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明融合蛋白的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子***表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的融合蛋白。本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及融合蛋白的分离纯化方法。
本发明提供了一种靶向HIV(人类免疫缺陷病毒)外膜蛋白gp41的靶向干扰素药物(即本发明融合蛋白ZP-IC)及其应用。所述药物为哺乳动物细胞(如CHO细胞)重组表达蛋白，其结构为抗体-细胞因子融合蛋白。该融合蛋白的抗体结构部分，可以靶向识别HIV外膜蛋白gp160中的gp41亚基，负责将干扰素分子携带到HIV或感染HIV的细胞附近，从而引导干扰素的定向抗病毒的作用。具体而言，该靶向干扰素为抗体分子与干扰素的融合分子，其中干扰素分子位于抗体分子重链的C末端。该抗体分子由其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)共同构成了识别HIV gp41亚基的功能区，负责与gp41亚基对应序列的特异性结合。该抗体分子结构的恒定区为IgG1型。在恒定区CH3的C末端，连接一个分子的I型干扰素(α或β亚型)。所述靶向干扰素药物用于HIV感染的治疗，通过靶向位点实现精准给药，在降低药物用量、减少副作用的同时，提高药物抗病毒效果。
本发明中，选用了能识别HIV外膜糖蛋白高度保守的gp41亚基MPER区的抗体10E8作为该集成干扰素的定向工具，发挥两方面的作用。首先，能够准确识别病毒在侵染细胞中外膜蛋白变构所暴露出来的靶点，阻止病毒侵染，发挥中和作用；同时，携带的干扰素分子可以更有效地与HIV病毒周围的细胞上的干扰素受体结合，激活细胞内干扰素信号通路，让细胞发挥抗病毒的功能。
具体而言，本发明通过基因工程技术，将能识别HIV外膜糖蛋白gp160中gp41亚基高度保守的MPER区的抗体10E8，与高活性的集成干扰素融合表达，组成抗体-细胞因子融合蛋白ZP-IC，发挥靶向干扰素的功能。本发明产品ZP-IC靶向HIV gp41高度保守的MPER结构域。ZP-IC的抗体结构部分的重链可变区CDR区(互补决定区)和轻链可变区CDR区序列均来源于单抗10E8的对应部分序列。抗体其余部分的骨架结构则是采用了IgG1型抗体结构。在抗体恒定区CH3的C末端，连接一个分子的集成干扰素。该靶向干扰素分子ZP-IC通过10E8抗体部分识别并结合HIV病毒外膜蛋白gp41，阻断病毒的膜融合入侵过程；通过其集成干扰素功能部分，动员并结合病毒周围细胞上的干扰素受体，激活胞内的干扰素信号通路，产生抗病毒的效应蛋白，发挥抗病毒的功能。本发明采用创新设计，使抗体分子发挥双重作用：即识别病原、中和病毒；引导干扰素的定位，局部富集干扰素。因此，本发明将抗体的中和作用和干扰素抗病毒作用巧妙结合，起到了1+1>2的实用效果。在细胞实验中证明了，ZP-IC的这种“抗体——干扰素”融合分子，其对病毒的复制的抑制效果远强于干扰素分子本身，以及抗体本身。
美国专利US20160333076A1记录了靶向HIV gp41亚基MPER区的单克隆抗体10E8及其突变体及其应用。国际专利WO 2017079479A1，美国专利US20190077849A1记录了靶向HIVgp41亚基MPER区的单克隆抗体10E8的商业化突变改造，包括病毒中和能力的进一步提高、可溶性提高以及免疫原性改造。这些专利申请说明，10E8这株抗体因为其广泛的中和活性，受到了开发者的重视。但到目前为止，还没有报道将10E8与干扰素融合表达，发挥其靶向抗病毒的作用的专利以及文章，说明ZP-IC分子药物设计具备创新性和新颖性。ZP-IC的细胞实验结果证明，ZP-IC的这种“抗体——干扰素”融合分子，其抗病毒效果远强于干扰素分子本身，以及抗体本身。
本发明的实质是基因重组靶向干扰素生物技术药物。所述靶向干扰素用于HIV感染的治疗，通过靶向精准定向给药，在降低药物用量、减少副作用的同时，提高药物抗病毒效果。本药物推荐的临床使用剂量每次应低于0.5mg/dose，治疗间隔时间不少于3天。推荐的本药物使用方法为静脉注射。推荐的本药物治疗HIV感染方式为联用，即与常规HIV治疗药物鸡尾酒(如替诺福韦、拉米夫定、依法韦仑等)联用，发挥协同抗病毒能力。
综上所述，与现有技术相比，本发明的优势和特点是：
(1)通过高亲和力、广谱性结合病毒糖蛋白的抗体片段，将一种集成干扰素分子精准投送到HIV病毒感染细胞附近，阻断病毒侵染，并通过干扰素信号通路途径，动员细胞的抗病毒能力，真正起到了“生物导弹”的作用。
(2)与干扰素相比，“靶向干扰素”作用更精准，会在HIV侵染细胞附近，形成较高浓度干扰素的微环境，更有利于发挥干扰素的抗病毒效应和清除病变细胞的作用，并且降低血液中游离干扰素的浓度，有利于减轻干扰素的毒副作用。
(3)与其它靶向HIV外膜蛋白的抗体相比，靶向其gp41亚基MPER区的抗体更具有广谱性。因为gp41亚基负责膜融合，所有与膜融合相关的功能区都非常保守，包括FP、MPER和七肽重复序列NHR，均具有高度保守性。因此，10E8抗体能中和绝大多数的HIV毒株。选择它作为干扰素的靶向抗体，能让干扰素的功能变得更广谱，更有效，尽最大可能避免病毒的免疫逃逸。
(4)与同靶点抗体类药物相比，“靶向干扰素”更有效。我们利用体外HIV病毒复制抑制细胞模型评价其有效性，实验表明，ZP-IC对测试的8种不同型别的HIV流行病毒株，其IC50在0.01-0.2μg/mL之间，而同型抗体ZP-ab的IC50在5μg/mL以上。每项对比数据表明，靶向干扰素ZP-IC与其同型抗体相比，药物半最大抑制浓度IC50都降低了200倍以上，即药效提高了至少2个数量级，说明其“靶向封闭”+“干扰素抗病毒”的协同效应，使得该分子具有更好的抗病毒活性。
附图说明
图1为融合蛋白ZP-IC的结构设计示意图。
图2为比较12种亚型干扰素-α的氨基酸序列，出现频率最高的共有序列为集成干扰素-α的序列。
图3为ZP-IC的重组真核表达载体的酶切鉴定。
图4为ZP-IC的亲和层析纯化和还原SDS-PAGE。图4中标注①表示ZP-IC的重链，标注②表示ZP-IC的轻链。
图5为ZP-IC的Western blot。
图6为ELISA方法检测融合蛋白ZP-IC与HIV外膜蛋白gp41的亲和力。
图7为ELISA方法检测融合蛋白ZP-IC与HIV外膜蛋白gp41亚基近膜端MPER多肽的亲和力。
图8为ZP-IC与IFNR2的结合。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pcDNA3.1Neo(+)载体为Invitrogen公司产品，货号V79020。
下述实施例中的pcDNA3.1Zeo(+)载体为Invitrogen公司产品，货号V86020。
实施例1、融合蛋白ZP-IC的设计与结构
为提高靶向HIV干扰素的抗病毒活性，本发明选用了重组集成干扰素α与能识别并结合HIV病毒外膜糖蛋白gp41的抗体分子(10E8抗体)融合表达。本发明设计的融合蛋白名称为ZP-IC(也称为靶向干扰素ZP-IC)，结构示意图如图1所示。
集成干扰素α也称共有序列干扰素α(Consensus Interferon-α，Interferonalfacon-1)，是一种非天然的Ⅰ型干扰素，它是通过比较12种干扰素-α的氨基酸序列后，主要把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置组合而成的一种新型干扰素(图2)。集成干扰素α的生物活性与天然I型IFN-α的生物活性的比较，显示出更强的抗病毒活性，例如，集成干扰素α的比活性(定义为每毫克蛋白质的抗病毒活性单位)一直被报道比其它亚型IFN-α高5倍至20倍。一般地，其它亚型的IFN-α的比活性的范围在1×108U/mg至4×108U/mg蛋白，而集成干扰素α的比活性为2×109U/mg蛋白(Blatt LM,et al.The biologicactivity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alphaspecies,consensus interferon.J Interferon Cytokine Res.1996,16(7):489-499.doi:10.1089/jir.1996.16.489.)。
ZP-IC抗体部分的轻链可变区序列来源于文献：[Huang JH,et al.Broad andpotent neutralization of HIV-1 by a gp41-specific human antibody.Nature,2012,491(7424):406-12.doi:10.1038/nature11544.]。
ZP-IC抗体部分轻链恒定区采用人免疫球蛋白Kappa轻链恒定区(humanImmunoglobulin kappa chain constant region，IGKC，https://www.uniprot.org/uniprot/P01834)。
ZP-IC抗体部分的重链可变区来源于文献：[Huang JH,et al.Broad and potentneutralization of HIV-1by a gp41-specific human antibody.Nature,2012,491(7424):406-12.doi:10.1038/nature11544.]。
ZP-IC抗体部分的重链恒定区采用人免疫球蛋白伽马重链恒定区(Humanimmunoglobulin heavy constant gamma，IgG)，包括人IgG1的重链恒定区(IGHG1，https://www.uniprot.org/uniprot/P01857)，或人IgG2的重链恒定区(IGHG2，https://www.uniprot.org/uniprot/P01859)，或人IgG4的重链恒定区(IGHG4，https://www.uniprot.org/uniprot/P01861)。本实施例采用人IgG1的重链恒定区，序列如SEQ IDNo.1的第149-476位所示。
在重链恒定区的C端通过柔性蛋白linker(如SEQ ID No.1的第477-482位)融合抗病毒活性更强的集成干扰素α或称共有序列干扰素α(Consensus Interferon-α)。集成干扰素α的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第483-648位所示。
本发明融合蛋白包括10E8抗体和集成干扰素α，集成干扰素α通过linker连接在10E8抗体C端的恒定区。具体序列如下所示：
融合蛋白ZP-IC的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.1；融合蛋白ZP-IC的重链的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
融合蛋白ZP-IC的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.3；融合蛋白ZP-IC的轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
其中，SEQ ID No.1的第1-476位为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的重链的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第477-482位为接头(linker)的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第483-648位为集成干扰素α的氨基酸序列。
SEQ ID No.2的第1-1428位为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的重链的核苷酸序列，SEQ ID No.2的第1429-1446位为接头(linker)的核苷酸序列，SEQ ID No.2的第1447-1950位为集成干扰素α的核苷酸序列。
SEQ ID No.3也为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID No.4也为靶向HIV gp41蛋白的10E8抗体的轻链的核苷酸序列。
实施例2、融合蛋白ZP-IC的制备
1、重组真核表达载体的构建和CHO细胞的转染
可以采用商业化的真核表达载体如pCHO1.0(Invitrogen)、pcDNATM3.1/Neo(+/-)和pcDNATM3.1/Zeo(+/-)(Invitrogen)或其它商业化真核表达载体来表达ZP-IC重组蛋白，也可以采用自行研发的真核表达载体(如邵勇，胡显文，等.一种基于GS筛选***的动物细胞高效表达载体及应用，专利号：ZL201410037976.6)来表达ZP-IC重组蛋白。
按照融合蛋白的轻链基因序列和重链基因序列，优化偏好CHO细胞表达的轻链和重链基因，在基因上游增加EcoRI酶识别位点和Kozak序列，在基因下游增加EcoRV酶识别位点，委托北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biotechnology Co.，Ltd.)合成优化后的融合蛋白ZP-IC的轻链基因(SEQ ID No.4)和重链基因(SEQ ID No.2)。用EcoRI/EcoRV分别双酶切轻链基因、重链基因、pcDNA3.1Neo(+)载体和pcDNA3.1Zeo(+)载体(Invitrogen)，回收相关基因及载体，将轻链基因与pcDNA3.1Zeo(+)载体用T4连接酶连接，将重链基因与pcDNA3.1Neo(+)载体用T4连接酶连接，转化大肠杆菌Trans10(北京全式金生物技术有限公司)。
挑取已连接了轻链基因的pcDNA3.1Zeo(+)载体的菌落做为PCR模板，用CMV-F/BGH-R作为上下游引物，进行菌落PCR鉴定，PCR反应条件为：预变性94℃2min；变性98℃10s；退火温度60℃30s；链延伸温度68℃1min，共30个循环；循环完毕进行一次72℃5min的延伸。选取阳性克隆分别用引物CMV-F和引物BGH-R做基因测序，测序正确后的克隆提取质粒，获得表达ZP-IC轻链的真核表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)/ZP-IC LC，该载体的EcoRI/EcoRV双酶切鉴定如图3第2泳道所示，图3中pcDNA3.1/Zeocin表示pcDNA3.1 Zeo(+)载体基因，zp-iclc表示ZP-IC的轻链基因。
CMV-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID No.7)；
BGH-R:5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’(SEQ ID No.8)。
ZP-IC轻链表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)/ZP-IC LC是用核苷酸序列为SEQ ID No.4的ZP-IC轻链基因替换pcDNA3.1Zeo(+)载体的EcoRI识别位点和EcoRV识别位点之间的片段，保持pcDNA3.1Zeo(+)载体的其它核苷酸序列不变，得到的表达融合蛋白ZP-IC轻链的重组表达载体。
挑取已连接了重链基因的pcDNA3.1Neo(+)载体的菌落做为PCR模板，用CMV-F/ZPIC-HC-R做上下游引物，进行菌落PCR，PCR反应条件为：预变性94℃2min；变性98℃10s；退火温度60℃30s；链延伸温度68℃60s，共30个循环；循环完毕进行一次72℃5min的延伸。选取阳性克隆分别做基因测序，测序正确后的克隆提取质粒，获得表达ZP-IC重链的真核表达载体pcDNA3.1 Neo(+)/ZP-IC HC，该载体的EcoRI/EcoRV双酶切鉴定如图3第1泳道所示，图3中pcDNA3.1/Neomycin表示pcDNA3.1 Neo(+)载体基因，zp-ic hc表示ZP-IC的重链基因。
CMV-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID No.7)；
ZPIC-HC-R:5’-ACAACCCAGTGCGGCTGTGC-3’(SEQ ID No.9)。
ZP-IC重链表达载体pcDNA3.1 Neo(+)/ZP-IC HC是用核苷酸序列为SEQ ID No.2的ZP-IC重链基因替换pcDNA3.1Neo(+)载体的EcoRI识别位点和EcoRV识别位点之间的片段，保持pcDNA3.1Neo(+)载体的其它核苷酸序列不变，得到的表达融合蛋白ZP-IC重链的重组表达载体。
采用电转染或脂质体转染方法，按照相关操作手册中所述的步骤，将pcDNA3.1Neo(+)/ZP-IC HC和pcDNA3.1 Zeo(+)/ZP-IC LC载体共转染至CHO-DG44细胞(赛默飞公司)中。该步骤采用电转染方式时，可采用Lonza公司生产的细胞电转仪Nucleofector及所述方法来进行；该步骤采用脂质体转染方法时，可采用Invitrogen公司生产的转染试剂LipofectamineTM 2000或LipofectamineTM 3000及所述方法来进行。
转染后的CHO-DG44细胞，接种到T形方瓶中培养，采用化学成分明确的无血清培养基(如Gibco公司生产的CD FortiCHOTM无血清培养基)培养。培养24小时后，用含250～400μg/mL博来霉素(ZeocinTM)和500～700μg/mL的遗传霉素(G418硫酸盐)的无血清培养基加压筛选稳定转染细胞系。每3天换一次液，用含ZeocinTM和G418的无血清培养基连续培养2～3周，筛选得到稳定转染的CHO细胞集落。之后，这些稳转集落用胰酶消化后，用有限稀释法在96孔培养板中做单克隆培养和筛选。ELISA法挑选出高表达目的蛋白的单克隆细胞株，进行传代并扩增，用10％ DMSO细胞冻存液冻存稳定转染的、高表达ZP-IC重组蛋白的CHO工程细胞株(重组细胞)。该重组细胞为重组载体pcDNA3.1 Neo(+)/ZP-IC HC和重组载体pcDNA3.1Zeo(+)/ZP-IC LC共同导入CHO-DG44细胞后，得到的表达融合蛋白ZP-IC的细胞。该重组细胞含有SEQ ID No.2所示的ZP-IC的重链基因和SEQ ID No.4所示的ZP-IC的轻链基因。
2、融合蛋白ZP-IC的表达
复苏稳定转染的高表达ZP-IC重组蛋白的CHO工程细胞株，采用无血清培养基在方瓶中传代培养和扩增。将扩增的CHO工程细胞株接种至2升的摇瓶中，细胞起始密度维持在0.2×106～0.6×106细胞/mL，细胞培养体积为摇瓶容积的15％～35％，细胞培养瓶放在摇床(转速135rpm，温度37℃，CO2 5％)中培养。无血清培养基可采用Gibco生产的CDFortiCHOTM，也可以采用国产无血清培养基，如上海多宁生物科技有限公司生产的Media C，上海奥浦迈生物科技股份有限公司生产的OPM-CHO CD08 Medium等。培养3-4天后可按1传3或1传4的比例传代培养，在摇瓶中培养7天后收集培养上清液并纯化其中的融合蛋白ZP-IC。
3、融合蛋白ZP-IC的纯化
利用Protein A亲和层析柱(GE公司的Mabselect SURE)从培养上清液中纯化带有Fc结构域的抗体蛋白。培养上清液首先经过0.45μM的滤膜进行过滤澄清，然后上样至Protein A亲和层析柱(GE Mabselect SURE)。具体操作步骤参考GE公司亲和层析填料Protein A的推荐操作步骤。纯化仪采用中科森辉Protein purification System PPS-HD-100。上样pH控制在中性(pH7.0)，洗脱pH控制在pH3.0。通过Nanodrop仪器对纯化的融合蛋白ZP-IC进行定量。纯化的重组融合蛋白在还原条件下利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量和纯度。SDS-PAGE结果显示，该重组蛋白的重链分子量大小在80kDa左右，轻链分子量大小约25kDa(图4)，均与设计的目标分子量相符。
实施例3、ZP-IC与抗I型干扰素特异性抗体的反应
亲和层析纯化的融合蛋白ZP-IC首先进行SDS-PAGE电泳，设定好阳性对照(重组干扰素IFN-Fc，IFN-Fc的序列参见发明专利：ZL 202310085137.0，其携带的干扰素基因与ZP-IC一致，即集成干扰素α)和阴性对照(IgG，山西康宝生物制品股份有限公司)。同样的样品顺序点样两份。电泳完毕，把PAGE胶一切为二，一份考染，一份进行Western blot。利用PVDF膜(immobilon-P PVDF Membrane货号：IPVH00005，Millipore)进行半干转移。转移完毕，采用PBST溶液洗涤三遍，放入含5％脱脂奶粉的PBST溶液中，4℃封闭过夜。之后，用PBST溶液洗涤三遍。同时，配制含1％脱脂奶粉的PBST作为抗体孵育液。在抗体孵育液中加入1：1000稀释的兔抗干扰素多克隆抗体(Anti-Interferon alpha 2antibody，货号：ab193055，abcam)，与膜在37℃下摇动孵育1小时。之后，用PBST溶液洗涤三遍，每次不少于3分钟。在抗体孵育液中加入1：1500稀释的山羊抗兔IgG(HRP标记，中杉金桥，货号ZB2301)，与膜在37℃下摇动孵育1小时。之后，用PBST溶液洗涤三遍，每次不少于3分钟。采用EnlightTM westernblotting substrate(货号：29050，Engreen)显色，利用化学发光仪(Tanon5200multi)拍照。从Western blot结果可以看出，ZP-IC能在特定分子量(80kD)上显色，恰好对应该分子的重链的大小(图5)。说明ZP-IC分子在其重链上，携带了干扰素分子。
实施例4、ELISA法检测ZP-IC与HIV gp41糖蛋白的结合力
重组HIV gp41蛋白(购自abcam，货号ab49070)用包被液稀释至1.0ug/mL后，以100ng/孔包被到酶标板上，4℃过夜。之后每孔加入含2％ BSA的PBST溶液封闭1.5-2小时。孵育期间，用PBST将封闭液稀释至BSA终浓度为0.5％ BSA，作为抗体稀释液，对抗体融合蛋白ZP-IC进行倍比稀释，从10μg/mL起始，至0.15ng/mL。利用人IgG(山西康宝生物制品股份有限公司)作为对照品1，利用同一靶点的抗体ZP-ab(ZP-ab重链氨基酸序列为SEQ IDNo.5，ZP-ab重链核苷酸序列为SEQ ID No.6，ZP-ab轻链氨基酸序列同ZP-IC轻链的氨基酸序列，ZP-ab轻链的核酸序列同ZP-IC轻链的核酸序列)作为对照品2。酶标板封闭完后，充分洗涤。加入倍比稀释的各抗体，100μL/孔，37℃孵育1小时，充分洗涤后，再加入1：2500稀释的山羊抗人IgG/辣根酶标记(中杉金桥，货号ZB2304)100μL，37℃孵育1小时。充分洗涤后，采用TMB溶液显色15min，2M HCl终止，于450nm处读取光吸收值。测定结果采用GraphPadPrism Software 6.0软件分析，选择非线性回归分析来计算半最大结合效应浓度(EC50)。数据分析结果显示，融合蛋白ZP-IC与重组蛋白gp41的半最大结合浓度EC50＝74ng/mL(约0.37nM)，与ZP-ab(EC50＝60.7ng/mL)亲和力保持一致(图6)；人免疫球蛋白IgG与重组蛋白gp41的亲和力EC50大约在948ng/mL。说明ZP-IC能够特异性地结合HIV病毒外膜蛋白gp41亚基。
实施例5、ELISA法检测ZP-IC与MPER多肽的结合力
MPER多肽位于gp41近膜端外区。MPER多肽序列参考文献(Huang JH,et al.Broadand potent neutralization of HIV-1by a gp41-specific humanantibody.Nature.2012,491(7424):406–412.doi:10.1038/nature11544.)序列为：NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(656-683位，共28个aa，金斯瑞生物科技股份有限公司合成)。因为gp41亚基负责膜融合，所有与膜融合相关的功能区都非常保守，包括FP、MPER和七肽重复序列NHR，均具有高度保守性。因此，靶向gp41亚基MPER区的抗体更具有广谱性。
MPER多肽在碱性溶液中溶解，用PBS溶液稀释到1.5μg/mL，以100μL/孔加入到酶标板中进行抗原包被，4℃过夜。之后每孔加入含2％ BSA的PBST溶液封闭1.5-2小时。孵育期间，用PBST将封闭液稀释至BSA终浓度为0.5％ BSA，作为抗体稀释液，对抗体融合蛋白ZP-IC进行倍比稀释，从500μg/mL起始，至0.25μg/mL以下。利用人IgG(山西康宝生物制品股份有限公司)作为对照品。酶标板封闭完后，充分洗涤。加入倍比稀释的抗体溶液，100μL/孔，37℃孵育1小时，充分洗涤后，再加入1：2500稀释的山羊抗人IgG/辣根酶标记(中杉金桥，货号ZB2304)100μL，37℃孵育1小时。充分洗涤后，采用TMB溶液显色15min，2M HCl终止，于450nm处读取光吸收值。测定结果采用GraphPad Prism Software 6.0软件分析，选择非线性回归分析来计算半数最大结合效应浓度(EC50)(见图7)。经过软件计算，ZP-IC的半数最大结合浓度为7.2μg/mL，约40nM；而对照抗体IgG半数最大结合浓度则>500μg/mL(即>3.3μM)。说明ZP-IC能够特异性地结合HIV病毒gp41上的MPER多肽，具有广谱抑制绝大多数的HIV毒株的能力，可尽最大可能避免病毒的免疫逃逸。
实施例6、ELISA法检测ZP-IC与干扰素受体(IFNR2)结合力
重组干扰素受体2(Human IFN-alpha/beta R2 Protein,His Tag，货号：IF2-H5224，购自百普赛斯ACROBiosystems)，用包被液稀释至1.0ug/mL后，以100ng/孔包被到酶标板上，4℃过夜。之后每孔加入含2％ BSA的PBST溶液封闭1.5-2小时。孵育期间，用PBST将封闭液稀释至BSA终浓度为0.5％ BSA，作为抗体稀释液，对抗体融合蛋白ZP-IC进行连续3倍稀释，从90μg/mL起始，至1.5ng/mL。利用人IgG(山西康宝生物制品股份有限公司)作为对照品。酶标板封闭完后，充分洗涤。加入稀释好的待测样品，100μL/孔，37℃孵育1小时，充分洗涤后，再加入1：2500稀释的山羊抗人IgG/辣根酶标记(中杉金桥，货号ZB2304)100μL，37℃孵育1小时。充分洗涤后，采用TMB溶液显色15min，2M HCl终止，于450nm处读取光吸收值。测定结果采用GraphPad Prism Software 6.0软件分析，选择非线性回归分析来计算半最大结合效应浓度(EC50)。数据分析结果显示，融合蛋白ZP-IC与重组的人干扰素受体2的半数最大结合浓度EC50＝140ng/mL(约0.7nM)(图8)。说明ZP-IC能够以较高的亲和力(<1nM)，特异性结合干扰素受体，从而激活干扰素信号通路。
实施例7、ZP-IC的抗病毒活性测试
测试细胞株：TZM-bl细胞，来源于一株Hela细胞系JC.53，稳定表达大量的CD4和CCR5，内源性表达CXCR4，并且其基因组经过改造，整合了受HIV-1启动子控制的荧光素酶和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶。TZM-bl细胞系对不同的HIV-1病毒株的感染均高度敏感，适合于量化检测中和抗体效力。该细胞株通过美国国立卫生研究院艾滋病试剂计划，由JohnC.Kappes博士、吴晓云博士和Tranzyme公司馈赠，目前为中国医学科学院病原生物学研究所保存。
测试HIV病毒株来源于中国医学科学院病原生物学研究所，信息如表1所示：
表1、测试HIV病毒株
试验编号 毒株名称 亚型
TRO11 TRO.11 B
CNE55 CNE55 A/E
CH119 CH119.10 B/C
25710 HIV_25710-2.43 C
X1632 X1632-S2-B10 G
CNE8 CNE8 A/E
CE70301 CE703010217_B6 C
BJOX002000 BJOX002000.03.2 B/C
抗病毒活性测试步骤如下：将待测抗体融合蛋白ZP-IC(或对照抗体药物ZP-ab，HIV-DNS)在96孔细胞培养板进行3倍倍比稀释，50μL/孔，设置3个复孔和9个梯度；将50μL体积的重组病毒(100TCID50)(见表1中列出的测试病毒株)加入培养孔中，于37℃放置60min；然后每孔加入100μL体积的1×104TZM-bl细胞。加入终浓度为15μg/mL的DEAE-dextran后，于37℃、5％ CO2细胞培养箱中孵育48h左右。小心弃掉培养液后，每孔用30μL细胞裂解液于室温裂解细胞15min，之后加入100μL/孔Luciferaese Assay试剂，充分混匀后取100μL转移到96孔白板中。使用化学发光检测仪测定RLU(相对发光单位)，利用GraphPad PrismSoftware软件采用非线性回归分析中S形剂量反应公式计算药物的IC50值及药物抑制曲线。计算方法半数有效抑制浓度(IC50)指药物能够引起最大效应的50％时的剂量。在计算药物对HIV-1病毒的IC50时，先将所有药物浓度均转化为log10(浓度值)，每一浓度的各个样品孔均计算出样品荧光抑制率，计算公式为：抑制率＝[1–(加药孔的RLU值-阴性对照孔的RLU值)/(阳性对照孔RLU均值-阴性对照孔RLU均值)]×100％。数据分析利用GraphPad PrismSoftware软件采用非线性回归分析中S形剂量反应公式分析每种药物的IC50值及药物抑制曲线。药物ZP-IC对HIV病毒株TRO11等侵染细胞的半数有效抑制浓度(IC50)测量结果(μg/mL)见表2，药物ZP-IC等对HIV病毒株X1632等侵染细胞的半数有效抑制浓度(IC50)测量结果(μg/mL)见表3。
表2、ZP-IC对HIV病毒株侵染细胞的半数有效抑制浓度(IC50)
表3、ZP-IC等对HIV病毒株侵染细胞的半数有效抑制浓度(IC50)
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从以上测试数据可以看出，测试的8种不同型别的HIV流行病毒株均对候选药物ZP-IC保持较好的敏感性。ZP-IC除了对X1632毒株的半数抑制浓度IC50在0.2μg/mL以外，对其余测试毒株的半数抑制浓度均在0.01-0.06μg/mL的水平。而同样靶点的抗体药物ZP-ab，对HIV病毒株X1632的半数抑制浓度IC50在33μg/mL以上，对其余三种测试病毒株(CNE8、CE70301、BJOX002000)的半数抑制浓度IC50也在3-16μg/mL之间，其抑制病毒的活性比融合蛋白ZP-IC降低了200倍以上，说明ZP-ab仅通过靶向封闭作用，能达到的抗病毒效果必须在微克级；而通过本发明融合蛋白即靶向干扰素的这种设计方式，ZP-IC比ZP-ab抗体对病毒的抑制能力有了大幅度的提高，药效提升了至少2个数量级。因此，在实际用量中，可以将ZP-IC的使用量比相同靶点的抗体ZP-ab降低两个数量级，便能达到同样的抗病毒效果。
HIV-DNS是靶向gp120的双特异性抗体(见中国专利：ZL 202210196757.7，“靶向HIV gp120蛋白和人CD3分子的多特异性抗体及其应用”)，在本次测试中，平行检测了HIV-DNS对不同HIV病毒株的抑制能力。从几组数据来看，对HIV病毒株X1632的半数抑制浓度IC50为0.166μg/mL，与ZP-IC的IC50值接近。对另外三种测试病毒株(CNE8、CE70301、BJOX002000)的半数抑制浓度IC50为0.3-0.5μg/mL之间，不及ZP-IC的抑制活性高(ZP-IC的IC50在0.02-0.06μg/mL之间)。说明ZP-IC通过靶向干扰素的这种设计，体外抗HIV病毒活性比HIV-DNS高了近1个数量级。这也说明融合蛋白ZP-IC有着非常好的抗病毒效果。
在本次细胞水平抗病毒实验中，我们也同时提交了重组长效干扰素(IFN-Fc，序列参见发明专利：ZL 202310085137.0)进行活性检测。但遗憾的是，几次预实验中，检测方都没有检测到IFN-Fc的体外抗病毒活性。于是在正式实验中，并没有进行IFN-Fc的抗病毒检测。说明单独的干扰素，起不到定向引导，激活细胞抗病毒的作用。
我们通过以下数据，来给融合蛋白ZP-IC和IFN-Fc的细胞水平的抗病毒活性的大小建立数据上的联系。在发明专利：ZL 202310085137.0中，平行比较了HIV-DNS与重组长效干扰素(IFN-Fc)的抗病毒活性，多组数据表明，IFN-Fc的体外抗病毒活性比HIV-DNS低一个数量级(补充数据：IFN-Fc和HIV-DNS对HIV病毒株HIV-1ⅢB在TZM-bl细胞中复制的抑制能力IC50分别为52.17±15.37nM和4.55±4.10nM；IFN-Fc和HIV-DNS对HIV-1IIIB在C8166细胞中复制的抑制作用IC50分别为25.02±8.15nM和1.63±0.71nM)。通过以上数据得知，体外抗病毒活性ZP-IC>HIV-DNS>IFN-Fc。即靶向干扰素分子ZP-IC体外细胞水平抗病毒活性远高于IFN-Fc。
从以上数据和分析表明，通过靶向型干扰素的设计，将干扰素分子在病毒周围选择性富集，增强了抗病毒的信号，从而达到更好的抗病毒效果。其抗病毒效果比同靶点的单抗ZP-ab和同型的长效干扰素分子IFN-Fc强至少1-2个数量级。因此，靶向型干扰素分子(ZP-IC)具有极高的抗HIV病毒的能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括10E8抗体或其抗原结合片段，以及集成干扰素α，所述10E8抗体或其抗原结合片段与所述集成干扰素α通过接头连接。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述集成干扰素α的氨基酸序列为SEQID No.1的第483-648位。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述融合蛋白的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一所述的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码序列是SEQ IDNo.2的DNA分子和/或编码序列是SEQ ID No.4的DNA分子。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
A1)含有权利要求4或5所述核酸分子的表达盒；
A2)含有权利要求4或5所述核酸分子的重组载体、或含有A1)所述表达盒的重组载体；
A3)含有权利要求4或5所述核酸分子的重组微生物、或含有A1)所述表达盒的重组微生物、或含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A4)含有权利要求4或5所述核酸分子的重组细胞、或含有A1)所述表达盒的重组细胞、或含有A2)所述重组载体的重组细胞。
7.权利要求1-3中任一所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述生物材料的下述任一种应用：
B1)在制备用于预防或治疗HIV感染的产品中的应用；
B2)在制备用于预防或治疗艾滋病的产品中的应用；
B3)在制备用于抑制HIV病毒活性的产品中的应用；
B4)在制备用于结合或检测gp41蛋白的产品中的应用；
B5)在制备用于结合或检测MPER多肽的产品中的应用。
8.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一所述融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的载体。
9.用于结合或检测gp41蛋白或MPER多肽的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1-3中任一所述融合蛋白。
10.权利要求1-3中任一所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：分别构建含有所述融合蛋白的重链和轻链基因的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述融合蛋白的重组细胞；培养所述重组细胞，经分离纯化获得所述融合蛋白。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1740197A (zh) * 2004-08-26 2006-03-01 辉阳科技美国公司 具有全新空间构象且功效增强的重组干扰素、其制备方法及应用
EP2096121A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-02 Institut Pasteur Of Shanghai Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use
EP2112164A1 (en) * 2008-04-23 2009-10-28 Institut Pasteur Of Shanghai Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use
CN101942026A (zh) * 2010-10-14 2011-01-12 成都正能生物技术有限责任公司 长效干扰素融合蛋白及其用途
WO2013059885A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CN110546160A (zh) * 2017-02-06 2019-12-06 奥里尼斯生物科学公司 靶向嵌合蛋白及其用途
CN116333166A (zh) * 2023-02-08 2023-06-27 珠海臻谱基因科技有限公司 一种靶向HIV gp120蛋白的重组干扰素及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1740197A (zh) * 2004-08-26 2006-03-01 辉阳科技美国公司 具有全新空间构象且功效增强的重组干扰素、其制备方法及应用
EP2096121A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-02 Institut Pasteur Of Shanghai Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use
EP2112164A1 (en) * 2008-04-23 2009-10-28 Institut Pasteur Of Shanghai Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use
CN101942026A (zh) * 2010-10-14 2011-01-12 成都正能生物技术有限责任公司 长效干扰素融合蛋白及其用途
WO2013059885A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CN104203982A (zh) * 2011-10-28 2014-12-10 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 多肽构建体及其用途
CN110546160A (zh) * 2017-02-06 2019-12-06 奥里尼斯生物科学公司 靶向嵌合蛋白及其用途
CN116333166A (zh) * 2023-02-08 2023-06-27 珠海臻谱基因科技有限公司 一种靶向HIV gp120蛋白的重组干扰素及其应用

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