CN109929785A - 一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株能够降解2,6‑二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂。经鉴定该降解菌株B5‑4为一株生物安全性较好的新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum),已保藏于典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2019088。本发明所述菌株可用于2,6‑二甲基苯酚的降解,24h内可完全降解50mg·L‑1的2,6‑二甲基苯酚;72h内对浓度在1~300mg·L‑1的2,6‑二甲基苯酚的降解率高达99%以上;短时间内可将土壤中的2,6‑二甲基苯酚残留量降低99%,该菌株可用于清除环境中2,6‑二甲基苯酚残留污染。
Description
技术领域
本发明属于生物高技术领域,公开了一株能够高效降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂。
背景技术
二甲基苯酚(dimethylphenol,DMP)是自然界中一类常见的芳香烃,共有6种异构体:2,3-DMP,2,4-DMP,2,5-DMP,2,6-DMP,3,4-DMP和3,5-DMP。作为一类重要的化工中间体,DMP广泛应用于合成树脂、农药、香料、染料、抗氧剂、阻聚剂和抗菌剂等化合物。例如,2,6-二甲基苯酚(2,6-DMP)可用于合成工程塑料聚苯醚、农药甲霜灵和呋酰胺等,世界五大聚苯醚生产商里中国占两家(即“蓝星”和“鑫宝”),由此可见,我国对2,6-DMP的需求量之大可见一斑。
2,6-DMP可以从煤炭裂解产生的煤焦油、石油裂解的混合酚中提取或通过化学合成。我国煤炭资源丰富,炼焦和煤焦油提取工业发达,产生大量含有2,6-DMP的废水。由于处理这些废水的能力不足且存在泄漏和违法偷排情况,每年有大量的2,6-DMP被释放到自然环境中。进入环境中的2,6-DMP对鱼类和水生无脊椎动物具有高的毒性;对人体而言,2,6-DMP容易被皮肤、粘膜和呼吸***吸收,造成烧伤、肠道紊乱和神经错乱等伤害。环境中残留的2,6-DMP污染问题亟待解决。
微生物降解是清除环境中残留的2,6-DMP的一种理想方法,但是还缺乏相应的降解菌株资源。目前已报道的可以将2,6-DMP彻底分解代谢的菌株只有一株细菌(Ewers等,1989),但由于该菌株分离获得至今已有40年,菌株已无从获得且其降解2,6-DMP能力的稳定性也需要进一步验证。因此,有必要继续分离筛选能降解代谢2,6-DMP的菌株并实现菌剂的大规模工业化生产,以应对修复环境中2,6-DMP的污染问题。
发明内容
技术问题本发明针对以上问题,分离筛选出一株可以高效降解2,6-DMP的菌株,该菌株72h内对浓度范围在1~300mg·L-1的2,6-DMP的降解率高达99%以上。
技术方案下面为本方案的主要内容:
本发明提供一种催化2,6-DMP的降解菌B5-4,于2019年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019088。该菌株经鉴定为一株新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum),该种属极少被报道为病原菌且其模式菌株Mycobacteriumneoaurum ATCC 25795的生物安全等级为一级,因此我们初步认为该菌株的生物安全性较好。该菌株在LB平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明;无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌。在实验室摇瓶条件下,24h内可完全降解50mg·L-1的2,6-DMP(pH 7.0,30℃);菌株B5-4催化2,6-DMP的浓度范围为从1mg·L-1到500mg·L-1,特别地,72h内对浓度在1~300mg·L-1的2,6-DMP的降解率高达99%以上。
本发明所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。
本发明所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在制备降解2,6-二甲基苯酚的菌剂中的应用。
一种用所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4生产的降解菌剂。
2,6-DMP降解菌株B5-4生产菌剂的流程:斜面接种——摇瓶种子液——发酵菌剂生产。
本发明所用培养基:
1、LB培养基:酵母粉,5.0g;蛋白胨,10.0g;NaCl,5.0g;去离子水,1L。(固体培养基加1.5%的琼脂粉)
2、发酵培养基:葡萄糖,10.0g;柠檬酸,1.5g;柠檬酸铁胺,0.1g;NH4NO3,2.0g;MgSO4·7H2O,0.2g;去离子水,1L。
3、基础盐培养基(MSM培养基):NH4NO3,1.0g;KH2PO4,0.5g;K2HPO4,1.5g;NaCl,1.0g;MgSO4·7H2O,0.2g;去离子水,1L。(固体培养基加1.5%的琼脂粉)
本发明的详细实施步骤为:
1、将降解菌株B5-4划线LB试管斜面并置于30℃条件下培养;
2、挑取上述培养好的菌株单菌落至液体LB摇瓶中在30℃,180rpm条件下振荡培养至对数生长期作为种子液;
3、将培养好的种子液按5%的接种量接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液,培养至对数生长期后再以5%的接种量接种至500L的发酵罐中继续发酵培养,所用培养基为发酵培养基,培养温度为30℃,通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2,搅拌速度为180-200转/分钟,整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后,将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。
4、本发明所述的菌剂在降解2,6-二甲基苯酚中的应用;优选在降解土壤中残留的2,6-二甲基苯酚中的应用。
有益效果
本发明提供一种能够高效快速降解2,6-DMP的菌株B5-4。在24h内可完全降解50mg·L-1的2,6-DMP,特别是在72h内对浓度在1~300mg·L-1的2,6-DMP的降解率高达99%以上,适用于2,6-DMP污染较轻、严重或非常严重的地区,因此该菌株具有广泛的应用潜力和价值。
该菌剂的生产具有成本低、使用方便、去除效果好等优点,适合在全国2,6-DMP污染区域,特别是煤矿开采行业地区大面积推广使用。本发明对于保护生态环境和保护人民身体健康都具有重要的意义。
附图说明
图1菌株B5-4的菌落形态(A)和透射电镜(B)照片
图2菌株B5-4的16S rRNA基因进化树分析
图3菌株B5-4对2,6-DMP的降解及生长曲线
图4菌株B5-4降解2,6-DMP的中间代谢物LC-MS分析
图5菌株B5-4降解2,6-DMP的代谢物途径
图6温度对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响
图7pH对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响
图8 2,6-DMP的初始浓度对菌株B5-4降解的影响
生物材料保藏信息
菌株B5-4,分类命名为分枝杆菌B5-4Mycobacterium sp.B5-4,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2019088,保藏日期为2019年1月28日,保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
实施例1菌株的分离与鉴定
本发明提供一种高效降解2,6-DMP的菌株B5-4,分离自江苏省某长期受二甲基苯酚污染的土壤中。具体的菌株筛选方法为:取1g土样加入到含有50mg·L-1 2,6-DMP的100mLMSM培养基中,于30℃、180rpm条件下振荡富集培养,5天后以5%的接种量转移到含有50mg·L-1 2,6-DMP的100mL MSM新鲜培养基中继续振荡富集培养,以此方式连续进行四次传代富集培养。将第四次传代的富集液稀释涂布于含有50mg·L-1 2,6-DMP的MSM固体培养基上,30℃条件下培养5天后挑取单菌落于含有50mg·L-1 2,6-DMP的液体MSM试管中振荡培养,一周后取1mL培养液并加入等体积的二氯甲烷萃取,采用紫外分光光度计分析检测降解效果。将有降解效果的菌株经进一步纯化后保存于-80℃冰箱中待用。
经分离培养,筛选到一株可以高效降解2,6-DMP的菌株,命名为B5-4。该菌株经鉴定属于Mycobacterium neoaurum,并于2019年1月28日保存于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2019088。菌株B5-4在LB平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明(图1A);主要生物学特征为无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌(图1B)。菌株B5-4的16S rRNA基因序列经构建***进化树比对分析,结果表明该菌株与Mycobacteriumneoaurum模式株ATCC 25795进化关系最近,二者的16S rRNA基因序列完全一致(图2)。根据以上形态、生理和16S rRNA基因序列分析结果,最终将菌株B5-4鉴定为Mycobacteriumneoaurum。
实施例2实验室降解实验
2.1降解菌液制备
挑取单菌落接种至LB培养基中振荡培养至对数生长期(30℃,180rpm);离心收集菌体(4℃,6000rpm离心10min),经MSM培养基洗涤两次后重悬于液体MSM培养基中,加入50mg·L-1 2,6-DMP诱导培养细胞,12h后,6000rpm离心10min收集菌体,经MSM培养基洗涤两次后重悬于液体MSM培养基中作为降解菌液。
2.2菌株B5-4对2,6-DMP的降解
将降解菌液的OD600调节至0.25左右接种至加了50mg·L-1 2,6-DMP的新鲜MSM培养基中,30℃,180rpm条件下培养24h,定时取样,测定相应的OD600值,同时采用高效液相色谱(HPLC)检测培养基中残留的2,6-DMP浓度,绘制菌株B5-4对2,6-DMP的降解及生长曲线。如图3所示,菌株B5-4能以2,6-DMP作为唯一碳源生长,24h内可完全降解50mg·L-1的2,6-DMP。与此同时,采用高效液相色谱质谱联用仪(LC-MS)鉴定菌株B5-4降解2,6-DMP的代谢中间产物(图4),并由此推测了一条2,6-DMP的微生物代谢途径(图5)。
2.3温度对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响
将降解菌液的OD600调节至0.5接种到加了50mg·L-1 2,6-DMP的新鲜MSM培养基中,在180rpm条件下振荡培养12h,温度分别设定为10℃、20℃、30℃、40℃和50℃,HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量并计算出相应的降解率。如图6所示,菌株B5-4在30℃时对2,6-DMP的降解率最高,高温(大于40℃)对降解效率的影响较为显著。
2.4pH对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响
向pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的MSM培养基中分别加入终浓度为50mg·L-1的2,6-DMP,再向其中分别加入OD600为0.5的降解菌液,在30℃、180rpm条件下振荡培养12h,HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量并计算出相应的降解率。如图7所示,菌株B5-4在pH为7.0时对2,6-DMP的降解率最高;在pH在5.0到11.0范围内,菌株B5-4对2,6-DMP均表现出较高的降解活性,这表明菌株B5-4对催化环境的酸碱度具有极强的适应能力,特别是在碱性环境中仍然表现出很高的降解活性。
2.5 2,6-DMP的初始浓度对菌株B5-4降解的影响
在自然环境中,2,6-DMP的浓度很低。因此,菌株降解低浓度2,6-DMP具有非常重要的意义。相反,菌株对高浓度2,6-DMP污染物的耐受性和降解能力也需要进一步测定。本发明将OD600为0.5的降解菌液分别加入含有不同2,6-DMP初始浓度的MSM中,2,6-DMP浓度分别设定为1mg·L-1、2mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1和500mg·L-1;定时取样,HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量。如图8所示,菌株B5-4在72h内对浓度在1~300mg·L-1的2,6-DMP的降解率高达99%以上,特别是对1mg·L-1或300mg·L-1的2,6-DMP的降解率达到了99%以上,这表明菌株B5-4是修复环境中2,6-DMP污染物的良好候选菌株。
实施例3土壤降解实验
供试土样采自江苏南京紫金山下田园土,经磨碎过2mm筛,按20mg·kg-1的终浓度将水溶的2,6-DMP母液均匀地喷洒到土壤中,置于通风橱中挥干搅拌均匀待用。每份土壤样品的质量为1kg,含水量维持在35%;调节降解菌液的OD600为1,按5%(v/m)的接种量向土壤样品接种50mL菌液,混匀后置于30℃黑暗条件下恒温培养,并以不接菌的土壤作为对照。15天后,通过HPLC检测土壤样品中2,6-DMP的残留量并计算降解效率。结果表明菌株B5-4对土壤中残留的2,6-DMP降解效率达到99%。
实施例4菌剂制备
将本发明的2,6-DMP降解菌株B5-4经试管斜面活化测定其降解性能后,接种于LB培养基中振荡培养至对数生长期作为种子液;将培养好的种子液准备接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液,所用的培养基为发酵培养基,投料量20L,投料完成后121℃高压湿热灭菌,经冷却至30℃后,将LB中培养的种子液按5%的接种量接种至该25L的发酵罐中,培养至对数生长期,培养温度设定为30℃,通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2,搅拌速度为180-200转/分钟;将培养好的25L的发酵罐中的菌液按5%的接种量接种至500L的发酵罐中扩大发酵培养,投料量400L,所用培养基、灭菌过程及发酵过程中条件参数与25L发酵罐相同,整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后,将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。
Claims (7)
1.一株2,6-二甲基苯酚的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4,于2019年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC M 2019088。
2.权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。
3.权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在制备降解2,6-二甲基苯酚的菌剂中的应用。
4.一种用权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4生产的降解菌剂。
5.根据权利要求4所述的降解菌剂,其特征在于所述的降解菌剂是通过以下方法生产而成:
1)将降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4划线LB试管斜面并置于30℃条件下培养;
2)挑取上述培养好的菌株单菌落至液体LB摇瓶中在30℃,180rpm条件下振荡培养至对数生长期作为种子液;
3)将培养好的种子液按5%的接种量接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液,培养至对数生长期后再以5%的接种量接种至500L的发酵罐中继续发酵培养,所用培养基为发酵培养基,培养温度为30℃,通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2,搅拌速度为180-200转/分钟,整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后,将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。
6.权利要求5所述的菌剂在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于权利要求5所述的菌剂在降解土壤中残留的2,6-二甲基苯酚中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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