KR20090039748A - 암의 치료, 진단 또는 검출을 위한 ａｍｉｇｏ-2 억제제 - Google Patents

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비비안 찬
궈잉 유
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Abstract

본 발명은 특히 암 치료 방법, 암 치료 조성물, 및 암 진단 및/또는 검출 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 AMIGO-2 과발현과 관련된 암의 치료, 진단 및 검출을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
Figure 112009007423111-PCT00005
암, 치료, 진단, AMIGO-2, 과발현

Description

암의 치료, 진단 또는 검출을 위한 ＡＭＩＧＯ-2 억제제{AMIGO-2 INHIBITORS FOR TREATING, DIAGNOSING OR DETECTING CANCER}
본 발명은 일반적으로 종양학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 암치료 방법, 암치료 조성물, 및 암의 진단 및/또는 검출을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
미국에서 암은 두 번째로 중요한 사망 원인이다. "암"은 많은 상이한 타입의 암, 즉 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 췌장암을 설명하는데 사용되지만, 각 타입의 암은 표현형적 수준 및 유전적 수준에서 모두 상이하다. 하나 이상의 유전자의 발현이 돌연변이로 인해 조절불능이 되고 세포 성장이 더 이상 통제될 수 없을 때 암의 조절불가한 성장 특성이 나타난다.
유전자는 대체로 종양 유전자 및 종양 억제인자 유전자의 두 부류로 분류된다. 종양 유전자는 그 정상 기능이 특정 조건 하에서만 세포 성장을 촉진하는 것인 유전자이다. 종양 유전자가 돌연변이를 획득한 다음 그 통제력을 상실했을 때, 그것은 모든 조건 하에서 성장을 촉진한다. 그러나 암이 제대로 확립되려면 암은 종양 억제인자 유전자에도 돌연변이를 획득해야 한다. 종양 억제인자 유전자의 정상 기능은 세포의 성장을 중단시키는 것이다. 종양 억제인자의 예로는 p53, p16, p21, 및 APC가 있는데, 이들은 모두 정상적으로 작용한다면 세포의 통제되지 않는 분할 및 성장을 중단시킨다. 종양 억제인자에 돌연변이가 생기거나 종양 억제인자가 상실되었을 때 세포 성장에 대한 제동 역시 상실되며, 세포는 이제 억제력 없이 성장할 수 있게 된다.
AMIGO-2(Alivin 1 및 DEGA라고도 알려져 있다)는 AMIGO(암포테린-유도 유전자 및 ORF) 패밀리의 구성원이다(Kuja-Panula et al., JCB 160:963, 2003). AMIGO 패밀리는 세포 운동성에 관련되며, 패밀리 구성원들은 동종친화성 상호작용과 이종친화성 상호작용을 모두 가진다. 또한, AMIGO-2는 세포사멸을 억제하고 신경세포(뉴런)의 생존을 촉진한다(Ono et al., J. Neurosci. 23:5887, 2003). AMIGO-2는 위암에서 상향-조절되며(Rabenau et al., Oncogene 23:5056, 2004), AMIGO-2의 안정한 억제는 종양 세포의 염색체 안정성, 이주 및 성장을 억제할 수 있다.
그러나 지금까지 암 및 다른 질환 및 장애에서 AMIGO-2의 역할은 충분히 해명되지 않았다. 따라서, AMIGO-2를 조정하는 조성물 및 방법을 확인하는 것이 필요하다. 본 발명은 이런 필요성뿐만 아니라 기타 중요한 필요성에 관한 것이다.
발명의 개요
어떤 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 조정제와 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 억제제와 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 이때 AMIGO-2 억제제는 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNS); SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군에서 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드; 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군에서 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체; 소 분자; 의태체; 가용성 수용체; 또는 유인체이다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 특징으로 하며, 이때 에피토프는 신호 펩티드 도메인, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 또는 Ig 도메인 내에 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 분리된 세포를 특징으로 하며, 이때 에피토프는 신호 펩티드 도메인, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 또는 Ig 도메인 내에 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 특징으로 하며, 이때 에피토프는 신호 펩티드 도메인, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 또는 Ig 도메인 내에 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 동물을 특징으로 하며, 이때 에피토프는 신호 펩티드 도메인, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 또는 Ig 도메인 내에 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드의 분리된 에피토프-보유 단편을 특징으로 하며, 이때 단편은 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드의 분리된 에피토프-보유 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 하며, 이때 단편은 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드의 에피토프-보유 단편을 사용한 피험체의 면역화에 의해 획득되는 정제된 AMIGO-2 항체를 특징으로 하며, 이때 단편은 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO:17-24에 제시된 서열의 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 뉴클레오티드 가닥, 및 제 1 가닥에 실질적으로 상보성인 서열을 포함하는 제 2 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 분리된 dsRNA 분자를 특징으로 하며, 이때 dsRNA 분자는 3769개 뉴클레오티드 길이 미만이다.
다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO:17-24에 제시된 서열의 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 뉴클레오티드 가닥, 및 제 1 가닥에 충분히 상보성인 서열을 포함하는 제 2 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 분리된 dsRNA 분자를 특징으로 하며, 이때 dsRNA 분자는 3769개 뉴클레오티드 길이 미만이다.
다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO:7-16에 제시된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 억제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 환자에서 암 또는 암 증상을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이때 억제제는 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNS); SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군에서 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드; 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체; 소 분자; 의태체; 가용성 수용체; 또는 유인체이다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 활성을 조정하는데 효과적인 AMIGO-2 억제제의 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 AMIGO-2 활성을 조정하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 (a) 샘플에 AMIGO-2 발현에 대한 증거가 존재하는지 또는 부재하는지를 검출하는 단계로서, 이때 샘플에 AMIGO-2 발현에 대한 증거의 존재는 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보자임을 표시하고, 샘플에 AMIGO-2 발현에 대한 증거의 부재는 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보자가 아님을 표시하는 단계; (b) 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보자인 경우에는 환자에게 AMIGO-2 억제제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계; 및 (c) 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보자가 아닌 경우에는 환자에게 종래의 암치료제를 투여하는 단계를 포함하는, AMIGO-2 치료요법에 민감한 환자를 확인하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 대조군과 비교하여 적어도 20%까지 세포 성장을 억제하는데 효과적인 AMIGO-2 억제제의 양을 암세포와 접촉시키는 것을 포함하는 암세포 성장을 억제하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2 억제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 환자에서 암세포 표현형을 억제하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커를 조정하는 화합물을 AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 암을 보유한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암세포 성장을 억제하는 방법을 특징으로 한다. AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커는 c-MYC, c-Jun, FosL1 및 세포외 신호-조절 키나제(ERK)일 수 있다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 하류 마커의 조정은 하나 이상의 하류 마커의 발현 억제, 예를 들어 단백질 또는 mRNA 발현의 억제일 수 있다. 어떤 구체예에서, 조정은 또 AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커의 활성 억제를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, ERK의 조정은 ERK의 인산화의 조정을 포함한다. 어떤 구체예에서, ERK의 조정은 하나 이상의 ERK 기질을 향한 ERK 키나제 활성의 조정을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 조영제에 연결된 AMIGO-2 억제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계, 및 환자 체내에서 조영제의 국소화를 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 종양을 검출하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 환자에게 AMIGO-2 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 둘 이상의 세포의 상호작용을 억제하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에서 AMIGO-2 항체를 발현하는 방법을 특징으로 하며, 이때 AMIGO-2 항체는 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 방법은 세포에서 AMIGO-2 항체를 암호화하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암 억제제를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 이때 암은 대조군과 비교하여 AMIGO-2의 과발현을 특징으로 한다. 이 방법은 후보 화합물과 AMIGO-2-발현 세포를 접촉시키는 단계, 및 AMIGO-2 활성이 조정되는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하며, 이때 AMIGO-2 활성의 조정은 암 억제제임을 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암 억제제를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 이때 암은 대조군과 비교하여 AMIGO-2의 과발현을 특징으로 한다. 이 방법은 후보 화합물 및 AMIGO-2 리간드와 AMIGO-2-발현 세포를 접촉시키는 단계, 및 AMIGO-2의 하류 마커의 활성이 조정되는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하며, 이때 하류 마커의 조정은 암 억제제임을 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 환자의 암 샘플에서 AMIGO-2의 차등 발현에 대한 증거를 검출하는 것을 포함하는, AMIGO-2 억제제에 대한 환자의 감수성을 측정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 AMIGO-2의 차등 발현에 대한 증거는 AMIGO-2 억제제에 대해 환자가 감수성임을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 (a) 고체 지지체에 결합된 항-AMIGO-2 항체를 포함하는 친화성 바탕질을 제공하는 단계; (b) 친화성 바탕질과 샘플을 접촉시켜 친화성 바탕질-AMIGO-2 단백질 복합체를 형성하는 단계; (c) 친화성 바탕질-AMIGO-2 단백질 복합체를 나머지 샘플로부터 분리하는 단계; 및 (d) AMIGO-2 단백질을 친화성 바탕질로부터 유리시키는 단계를 포함하는, 샘플로부터 AMIGO-2 단백질을 정제하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포로 세포독성제 또는 진단제를 송달하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 항-AMIGO-2 항체 또는 그것의 단편에 컨쥬게이트된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계; 및 (b) 항체-제제 또는 단편-제제 컨쥬게이트에 세포를 노출시키는 단계를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 후보 AMIGO-2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 하류 AMIGO-2 마커의 수준 또는 활성이 감소하는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하는, 후보 AMIGO-2 억제제의 유효성을 측정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 하류 마커의 수준 또는 활성의 감소는 후보 AMIGO-2 억제제가 효과적인 항암제임을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 후보 AMIGO-2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 PARP1 절단이 증가하는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하는, 후보 AMIGO-2 억제제의 유효성을 측정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 PARP1 절단의 증가는 후보 AMIGO-2 억제제가 효과적인 항암제임을 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암세포와 대조군 세포에서 AMIGO-2 발현을 비교하는 것을 포함하는, 암이 AMIGO-2-관련 암인지의 여부를 판정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 대조군 세포와 비교하여 암세포에서 상향-조절된 AMIGO-2 발현은 암이 AMIGO-2-관련 암임을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 암 샘플 및 대조군 샘플을 AMIGO-2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 암 샘플과 대조군 샘플에서의 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성을 비교하는 단계를 포함하는, 암이 AMIGO-2-관련 암인지의 여부를 판정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 감소된 수준 또는 활성은 암이 AMIGO-2-관련 암임을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 암 샘플 및 대조군 샘플을 AMIGO-2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 암 샘플과 대조군 샘플에서의 PARP1 절단을 비교하는 단계를 포함하는, 암이 AMIGO-2-관련 암인지의 여부를 판정하는 방법을 특징으로 하며, 이때 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 증가된 PARP1 절단은 암이 AMIGO-2-관련 암임을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 암이 AMIGO-2-관련 암인지의 여부를 판정하는 단계, 및 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유한 경우에는 AMIGO-2 억제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 한편, 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하지 않는 경우에는 종래의 암치료제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 환자 암 샘플에서의 AMIGO-2 발현과 대조군 샘플에서의 AMIGO-2 발현을 비교하는 단계, 및 (1) 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 AMIGO-2 발현이 상향-조절되는 경우에는 AMIGO-2 억제제를 포함하는 조성물로 환자를 치료하는 단계, 및 (2) 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 AMIGO-2 발현이 불변이거나 하향-조절되는 경우에는 2차 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 후보 암세포에서 AMIGO-2 국소화에 대해 분석하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 진단하는 방법을 특징으로 하며, 이때 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 대하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비가 적어도 2:1인 경우, 환자는 AMIGO-2-관련 암을 보유한 것으로 진단된다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2 활성의 조정을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) AMIGO-2 활성을 조정하기에 충분한 시간 동안 샘플과 AMIGO-2 억제제를 접촉시키는 단계; (b) AMIGO-2를 항-AMIGO-2 항체로 면역침전시키는 단계; 및 (c) 포스포-세린/트레오닌 항체를 사용하여 샘플과 대조군에서의 AMIGO-2 세린/트레오닌 인산화를 비교하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 샘플에서 AMIGO-2의 세린/트레오닌 인산화의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2 활성의 조정을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) AMIGO-2 활성을 조정하기에 충분한 시간 동안 샘플에서 AMIGO-2를 과발현시키는 단계; AMIGO-2를 항-AMIGO-2 항체로 면역침전시키는 단계; 및 (c) 포스포-세린/트레오닌 항체를 사용하여 샘플과 대조군에서의 AMIGO-2 세린/트레오닌 인산화를 비교하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 샘플에서 AMIGO-2의 세린/트레오닌 인산화의 변화는 AMOGO-2 활성의 조정을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2 활성의 조정을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) AMIGO-2 활성을 조정하기에 충분한 시간 동안 샘플과 AMIGO-2 억제제를 접촉시키는 단계; (b) AMIGO-2를 항-포스포-세린/트레오닌 항체로 면역침전시키는 단계; 및 (c) 항-AMIGO-2 항체를 사용하여 샘플과 대조군에서의 인산화된 AMIGO-2 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 샘플에서 인산화된 AMIGO-2 수준의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2 활성의 조정을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) AMIGO-2 활성을 조정하기에 충분한 시간 동안 샘플에서 AMIGO-2를 과발현시키는 단계; (b) AMIGO-2를 항-포스포-세린/트레오닌 항체로 면역침전시키는 단계; 및 (c) 항-AMIGO-2 항체를 사용하여 샘플과 대조군에서의 인산화된 AMIGO-2 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 샘플에서 인산화된 AMIGO-2 수준의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플에서 후보 화합물이 존재할 때와 부재할 때 AMIGO-2의 인산화를 비교하는 것을 포함하는, AMIGO-2 조정제를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 이때 후보 화합물 부재시 샘플에서의 AMIGO-2 인산화와 비교하여 후보 화합물 존재시 샘플에서의 AMIGO-2 인산화의 조정은 후보 화합물이 AMIGO-2 조정제임을 표시한다.
본 발명의 이들 및 다른 양태들이 본 발명의 상세한 설명에서 명확해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는 Affymetrix GeneChip®(Human Genome U133 Plus 2.0 Array, Affymetrix, Inc.) 올리고뉴클레오티드 어레이로부터 생성된 유전자 발현 데이터(도 1A) 및 사내에서 합성된 cDNA 마이크로어레이(도 1B)를 도시한다.
도 2는 정상 조직 및 결장, 유방, 및 전립선 조직 샘플에서의 상대적 AMIGO-2 mRNA 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 암성 조직 및 정상 조직으로부터 분리된 AMIGO-2 mRNA로부터의 올리고뉴클레오티드 어레이 데이터(Human Genome U133 Plus 2.0 Array, Affymetrix, Inc.)를 그래프로 나타낸 것이다. x-축을 따라 정상 조직 및 암성 조직의 타입이 설명된다. 수직 축 상의 각 스폿은 단일 환자로부터의 조직 샘플을 나타내고, 수직 축(선형) 상의 각 스폿의 높이는 프로브 세트의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 색칠한 원은 발현 수준이 선형 검출 범위 내인 샘플을 표시한다. 빈 원은 유전자가 프로브 세트의 검출 한계 이하일 때 샘플에서 유전자 발현의 상한을 표시한다. 빈 사각형은 프로프 세트가 포화될 때 샘플에서 유전자 발현의 하한을 표시한다.
도 4는 도 3에서 y-축을 log2 기준으로 나타낸 것이다. 수평 축을 따라 정상 및 암성 조직 타입이 설명된다. 암성 조직의 이름 앞에는 'c_'를, 정상 조직의 이름 앞에는 'n_'을 붙였으며, 'ns'는 비특이적 조직 서브타입을 표시한다.
도 5는 6개의 상이한 셀라인으로부터 분리된 AMIGO-2 단백질을 보이는 웨스턴 블롯 분석이다. 상대적 반-정량 RT-PCR Ct 수준이 4개 셀라인의 이름 옆에 괄호 안에 표시된다.
도 6은 siRNA 투여 후 SW620 세포에서 AMIGO-2 mRNA 수준을 그래프로 나타낸 것이다. y-축은 상대적 스케일로서 숫자는 임의적이다. UT = 비-트랜스펙션; Eg5 = Eg5(무관 유전자) 표적화 siRNA; Neg Control = 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열; C315-1.2 내지 C315-4.3은 AMIGO-2 siRNA 패널이다.
도 7A는 siRNA 투여 후 Colo320 세포에서 AMIGO-2 mRNA 수준을 그래프로 나타낸 것이다. y-축은 상대적 스케일로서 숫자는 임의적이다. Eg5 = Eg5(무관 유전자) 표적화 siRNA; 음성 대조군 = 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열; C315-1.2 내지 C315-4.3은 AMIGO-2 특이적 siRNA이다.
도 7B는 siRNA 투여 후 HCT116 세포에서 AMIGO-2 mRNA 수준을 그래프로 나타낸 것이다. y-축은 상대적 스케일로서 숫자는 임의적이다. Eg5 = Eg5(무관 유전자) 표적화 siRNA; 음성 대조군 = 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열; C315-1.2 내지 C315-4.3은 AMIGO-2 특이적 siRNA이다.
도 8A는 SW620 세포의 세포사에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. "양성 대조군"은 Eg5 표적화 Eg5 siRNA이다. "음성 대조군"은 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열이다. y-축은 발광 수준으로서 이것은 죽은 세포의 수에 비례한다.
도 8B는 MRC9 세포의 세포사에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. "양성 대조군"은 Eg5 표적화 Eg5 siRNA이다. "음성 대조군"은 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열이다. y-축은 발광 수준으로서 이것은 죽은 세포의 수에 비례한다.
도 9는 AGS 세포에서 AMIGO-2, PARP, M30, 및 튜블린(tubulin) 단백질의 발현 및 프로세싱에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 패널이다. "양성 대조군"은 Eg5 siRNA로 트랜스펙션된 세포로부터의 세포용해물을 표시한다. "음성 대조군은" 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열로 트랜스펙션된 세포로부터의 세포용해물을 표시한다.
도 10A는 SW620 세포에서 AMIGO-2, ERK, c-Myc, 및 튜블린 단백질의 발현 및 프로세싱에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 패널이다. pERK는 인산화된 ERK 단백질이다. "음성 대조군"은 도 9에서 설명된 것과 같다.
도 10B는 SW620 세포에서의 c-MYC mRNA 수준에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. "양성 대조군"은 Eg5 표적화 Eg5 siRNA이다. "음성 대조군"은 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열이다. y-축은 qPCR에 의해 측정된 mRNA의 상대적 발현 수준이다.
도 11은 AGS 세포에서 AMIGO-2, ERK, c-Myc, 사이클린 D1, 및 튜블린 단백질의 발현 및 프로세싱에 대한 AMIGO-2-특이적 siRNA의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 패널이다. pERK는 인산화된 ERK 단백질이다. "항-유사분열 유전자"로 표시된 레인은 Eg5 siRNA로 트랜스펙션된 세포로부터의 세포용해물을 표시한다. "음성 대조군"은 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열로 트랜스펙션된 세포로부터의 세포용해물을 표시한다.
도 12A-12C는 cJun 발현에 대한 AMIGO-2 조정의 효과를 나타낸다. 도 12A는 cJun이 AMIGO-2 siRNA로 트랜스펙션된 세포에서 하향-조절되는 것을 보이는 웨스턴 블롯 패널이다. "UT"는 비-트랜스펙션 대조군 샘플을 표시하고, "DharmNeg"는 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 음성 대조군 siRNA 서열이고, C315-1.3si는 AMIGO-2-특이적 siRNA이다. 도 12B는 cJun 발현이 AMIGO-2로 안정하게 트랜스펙션된 셀라인에서 상향-조절되는 것을 보이는 웨스턴 블롯 패널이다. 도 12C는 작동제 항-AMIGO-2 항체 MAB2080에 AGS 세포를 노출시킨 후 cJun가 상향-조절되는 것을 보이는 웨스턴 블롯이다. "ISO"는 이소타입 대조군을 표시한다.
도 13은 AGS 및 SW620 세포에서 사이클린 B1 및 cFosL1에 대한 AMIGO-2 녹다운의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 패널이다. "UT"는 비-트랜스펙션 대조군 샘플을 표시하고, "DharmNeg"는 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 음성 대조군 siRNA 서열이고, C315-1.3si 및 C315-4.3si는 AMIGO-2-특이적 siRNA이다.
도 14A-C는 c-Myc 발현에 대한 AMIGO-2 조정의 효과를 나타낸다. 도 14A 및 14B는 AMIGO-2 siRNA C315-1.3si 및 C315-4.3si에 SW620(도 14A)와 AGS(도 14B) 세포를 노출시킨 후 c-Myc가 하향-조절되는 것을 보이는 웨스턴 블롯 패널이다. "UT"는 비-트랜스펙션 세포 배양물이다. "Neg"는 어떤 공지 유전자와 상동성이 아닌 siRNA 서열로 트랜스펙션된 샘플을 표시한다. "Eg5"는 Eg5 표적화 siRNA로 트랜스펙션된 샘플을 표시한다. 도 14C는 항-AMIGO-2 항체 MAB2080에 세포를 노출시킨 후 SW620과 AGS 세포에서 c-Myc가 상향-조절되는 것을 보이는 웨스턴 블롯이다.
도 15A-15B는 AMIGO-2 조정제에 의해 조화로이 하향-조절(도 15A) 및 상향-조절(도 15B)되는 유전자들을 나타낸다.
도 16은 SW620 세포로부터의 전-세포 세포용해물에서 cJUN, cFosL1, 및 튜블린 단백질의 발현에 대한 AMIGO-2-특이적 항체 MAB2080(A)의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 패널이다(위쪽 2개 패널). 아래쪽 패널의 일련의 웨스턴 블롯은 세포 중의 총 ERK와 비교하여 ERK의 인산화(pERK)에 대한 MAB2080(A)의 효과를 나타낸다. "I" 또는 "이소타입 대조군"은 SW620 세포를 비-특이적 마우스 IgG로 처리한 것을 표시한다.
발명의 상세한 설명
본 출원의 발명자들은 AMIGO-2가 폐암 및 결장암을 포함하는 몇몇 암에서 과발현되며, 정상 조직에서는 발현이 제한된다는 것을 발견했다. 놀랍게도 AMIGO-2의 억제는 암세포 생존을 억제한다. 또한, AMIGO-2의 억제가, 예를 들어 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, cJun, FosL1, VEGF, 유로키나제 또는 ERK를 포함하는 하류 마커들의 수준을 조정한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 암의 치료, 진단 및 조영을 위한, 특히 AMIGO-2-관련 암들의 치료, 진단 및 조영을 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 뿐만 아니라 AMIGO-2의 비정상적 발현과 관련된 다른 질환 및 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 이들 및 다른 양태들이 본 출원에서 제공된다.
정의
여러 정의가 본 명세서에서 사용된다. 대부분의 단어는 당업자가 생각하는 의미를 가진다. 본 명세서에서 구체적으로 정의된 단어들은 전체적으로 본 발명과 관련하여 제공되는 의미를 가지며, 대체로 당업자에 의해 이해된다.
달리 지시되지 않는다면 본 발명의 실시에는 본 분야의 기술 범위 내에서 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약학 분야에서의 종래 방법이 채택될 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(Easton, Pennsylvania Mack Publishing Company, 1990), Methods In Enzymology(S. Colowick and N. Kaplan, eds, Academic Press, Inc.), and Handbook of Experimental Immunology, Vols I-IV(D.M. Weir and C.C. Black well, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications), 그리고 Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989)을 참조한다.
본원에서 사용된 단수 형태, "한", "어떤" 및 "그"는 문맥상 명확히 다르게 지시하지 않는다면 복수를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 항체"라고 언급한 것은 둘 이상의 이러한 항체의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어, "약"은 어떤 값의 +/- 30%, +/- 20%, +/- 10%, 또는 +/- 5%를 말한다.
본원에서 사용된 용어, "AMIGO-2"는 Alivin 1(ALI1) 및 DEGA로도 알려져 있으며, Ig-유사 도메인 2와의 유착 분자를 말한다. AMIGO-2의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1(GenBank Accession No NM_181847)에 제시되며, AMIGO-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2(GenBank Accession No NM_181847)에 제시된다. 또한, "AMIGO-2"라는 용어는 핵산 호모로그(homolog)와 아미노산 호모로그를 모두 포함한다. 어떤 구체예에서, 이러한 AMIGO-2 핵산 및 아미노산은 자생 AMIGO-2 핵산 또는 아미노산의 하나 이상의 활성을 보유한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환하여 사용되고, 어떤 길이의 아미노산의 중합체 형태를 말하며, 이것은 코딩된 및 비-코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 가진 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이 용어는 융합 단백질을 포함하며, 제한되지는 않지만, 이종 아미노산 서열과의 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 이종 및 동종 리더 서열과의 융합체, 면역학적으로 택이 붙은 단백질 등을 포함한다.
용어 "개체", "피험체", "숙주" 및 "환자"는 상호 교환하여 사용되고, 진단, 치료, 또는 치료요법이 바람직한 어떤 피험자, 특히 인간을 말한다. 기타 피험체는 소, 개, 고양이, 기니아피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등일 수 있다. 어떤 구체예에서, 피험체는 인간이다.
본원에서 사용된 용어, "암"은 원발성 또는 전이성 암을 말한다. 용어 "암세포"는 형질전환된 세포를 말한다. 이들 세포는 암을 보유한 환자로부터 분리될 수 있거나, 또는 시험관내에서 암성으로 형질전환된 세포일 수 있다. 암세포는 어떤 조직 또는 세포 배양물 라인을 포함하는 많은 타입의 샘플로부터 유래될 수 있다. 어떤 구체예에서, 암세포는 과다형성물, 종양 세포, 또는 신생물이다. 어떤 구체예에서, 암세포는 폐 조직, 방광 조직, 신장 조직, 결장 조직, 유방 조직, 자궁 조직, 난소 조직, 또는 췌장 조직으로부터 분리된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 공개적으로 이용가능한 확립된 셀라인으로부터 입수된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 기존의 환자 샘플로부터 또는 암세포를 포함하는 라이브러리로부터 분리된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 분리된 다음 상이한 숙주에, 예를 들어 이종이식편에 이식된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 이식되며, SCID 마우스 모델에서 사용된다. 어떤 구체예에서, 암은 폐암 또는 결장암이다. 어떤 구체예에서, 암은 위암 이외의 다른 암이다.
본원에서 사용된 용어, "형질전환된"은 자손에게 안정하게 유전되는 세포 특성에 있어서의 어떤 변화를 말한다. 어떤 구체예에서, "형질전환된"은 정상 세포의 암성 세포로의, 예를 들어 종양을 유발할 수 있는 세포로의 변화를 말한다. 어떤 구체예에서, 형질전환된 세포는 불멸화된다. 형질전환은 수용체 인산화 부재시의 수용체 과발현, 바이러스 감염, 종양 유전자 및/또는 종양 억제인자 유전자 내 돌연변이, 및/또는 세포의 성장 및/또는 불멸화 특성을 변화시키는 어떤 다른 기술을 포함하는 많은 요인들에 의해 야기될 수 있다.
"암성 표현형"은 일반적으로 암성 세포에 특징적인 여러 가지 생물학적 현상 중 어느 것을 말하는데, 이런 현상들은 암의 타입에 따라 바뀔 수 있다. 암성 표현형은 일반적으로, 예를 들어 세포 성장 또는 증식(예를 들어, 통제되지 않는 성장 또는 증식), 세포 주기 조절, 세포 운동성, 세포-세포 상호작용, 또는 전이 등에 있어서의 비정상성에 의해 확인된다.
본원에서 사용된 용어, "전이"는 암이 암의 기원으로부터, 예를 들어 원발성 종양으로부터 멀리 떨어진 부위까지 퍼진 것을 말한다. 전이 부위는, 제한되지는 않지만, 뼈, 림프절, 폐, 간, 및 뇌를 포함한다.
본원에서 사용된 용어, "혈관형성"은 환자에서 혈관의 발생을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "임상적 종점"은 암을 표시하는 측정가능한 결과물을 말한다. 임상적 종점은, 제한되지는 않지만, 1차 전이까지의 시간, 후속 전이까지의 시간, 전이의 크기 및/또는 수, 종양의 크기 및/또는 수, 종양의 위치, 종양의 공격성, 삶의 질, 통증 등을 포함한다. 임상적 종점을 결정하고 측정하는 능력이 당업자에게 있다고 생각된다. 임상적 종점을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용된 용어, "샘플"은 환자로부터의 생물학적 물질을 말한다. 본 발명에서 분석되는 샘플은 어떤 특정한 종류에 제한되지 않는다. 비제한적인 예로서, 샘플은 단일 세포, 다수 세포, 조직, 종양, 생물학적 유체, 생물학적 분자, 또는 전술한 것들 중 어느 것의 상청액 또는 추출물을 포함한다. 예로는 생검용으로 제거된 조직, 절제술 도중 제거된 조직, 혈액, 소변, 림프조직, 림프액, 뇌척수액, 점액, 및 대변 샘플이 있다. 사용되는 샘플은 분석 형식, 검출 방법 및 분석될 종양, 조직, 세포 또는 추출물의 성질에 기초하여 바뀔 것이다. 샘플의 제조 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 쉽게 개조하여 이용 방법과 양립가능한 샘플을 획득할 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "생물학적 분자"는, 제한되지는 않지만, 폴리펩티드, 핵산, 및 당류를 포함한다.
본원에서 사용된 용어, "조정하는"은 세포 내부, 세포 외부, 또는 세포 표면에 있는 유전자, 단백질, 또는 어떤 분자의 질 또는 양에 있어서의 변화를 말한다. 이 변화는 분자 발현이나 분자 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 또한, 용어 "조정한다"는 생물학적 기능/활성의 질 또는 양의 변화를 포함하며, 이러한 기능/활성은, 제한되지는 않지만, 세포 신호화 활성, 세포 주기 조절, 키나제 활성, 세린/트레오닌 키나제 활성, 세포-세포 상호작용 활성, 배수성에 영향을 미치는 활성, 염색체 안정성, 종양형성능(tumorigenicity), 세포 운동성, 전이, 암세포 생존, 암세포 성장, 증식, 세포 주기를 통한 진행, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1(GenBank Accession No NM_020703, SEQ ID NO:63에 제시된 아미노산) 또는 AMIGO-3(GenBank Accession No NM_198722, SEQ ID NO:64에 제시된 아미노산) 중 하나 또는 양자 간의 상호작용을 포함하는 세포-세포 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 혈관형성, 신경세포 성장물 또는 세포사를 포함한다.
본원에서 사용된 용어, "조정제"는 암과 관련 있는 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 결과물을 조정하는 조성물을 말한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 암과 관련 있는 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 소 분자, 항체, 의태체, 유인체, 또는 올리고뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 조정제는 리간드 결합을 차단하거나, 리간드-결합 부위를 차지하려고 경합함으로써 작용한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 리간드 결합에 독립적으로 작용한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 리간드-결합 부위를 차지하려고 경합하지 않는다. 어떤 구체예에서, 조정제는 암에 수반되는 유전자 산물의 발현을 차단한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 암에 수반되는 둘 이상의 생물분자의 물리적 상호작용을 차단한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 조정제는 세포 신호화 활성, 세포 주기 조절, 키나제 활성, 세린/트레오닌 키나제 활성, 세포-세포 상호작용 활성, 배수성에 영향을 미치는 활성, 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 운동성, 전이, 암세포 생존, 암세포 성장, 증식, 세포 주기를 통한 진행, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용을 포함하는 세포-세포 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 혈관형성 또는 신경세포 성장물로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 AMIGO-2 활성을 억제한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2 발현을 억제한다. 어떤 구체예에서, 조정제는 세포가 세포 주기의 G2/M 기로 분할되는 진행을 억제한다.
"유전자 산물"은 유전자에 의해 발현되거나 생산되는 생물중합체 산물이다. 유전자 산물은, 예를 들어 비-스플라이스 RNA, mRNA, 스플라이스 변이체 mRNA, 폴리펩티드, 번역 후 변형된 폴리펩티드, 스플라이스 변이체 폴리펩티드 등일 수 있다. 또한, 이 용어는 주형(즉, RNA의 cDNA)으로서 RNA 유전자 산물을 사용하여 제조된 생물중합체 산물을 포함한다. 유전자 산물은 효소적으로, 재조합적으로, 화학적으로, 또는 유전자가 자생하는 세포 내에서 만들어질 수 있다. 어떤 구체예에서, 유전자 산물이 단백질성이라면 그것은 생물학적 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 유전자 산물이 핵산이라면 그것은 생물학적 활성을 나타내는 단백질성 유전자 산물로 번역될 수 있다.
본원에서 사용된, "AMIGO-2 활성의 조정"은, 예를 들어 어떤 제제와 AMIGO-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상호작용, AMIGO-2 전사 및/또는 번역의 억제(예를 들어, AMIGO-2 유전자 또는 AMIGO-2 유전자 발현 산물과 상호작용하는 안티센스 또는 siRNA를 통한, AMIGO-2 발현을 촉진하는 전사인자의 조정을 통한) 등의 결과일 수 있는 AMIGO-2 활성의 증가 또는 감소를 말한다. 예를 들어, AMIGO-2 활성의 조정은 생물학적 활성의 증가 또는 생물학적 활성의 감소를 말한다. 또한, AMIGO-2 활성의 조정은 하나 이상의 AMIGO-2 표현형의 증가 또는 감소를 말한다. AMIGO-2 활성은, 제한되지는 않지만, AMIGO-2 폴리펩티드 수준의 평가 또는 AMIGO-2 전사 수준의 평가를 포함하는 수단에 의해 평가될 수 있다. 또한, AMIGO-2 활성의 비교는 AMIGO-2 하류 마커 수준 측정, 염색체 안정성 측정, 키나제 활성 측정, 종양형성능 측정, 전이 측정, AMIGO-2 신호화 측정, AMIGO-2-매개 세포 유착 측정, AMIGO-2-매개 암세포 세포사멸 측정, ERK 인산화 측정, 암세포 성장 측정, 종양 형성 측정, 사이클린 생산 측정, 세포 증식 측정, 암세포 성장 측정, 비부착 성장 측정, 세포 주기 조절 측정, 신경세포 유도 측정, 암세포 운동성 측정, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화 측정, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용을 포함하는 세포-세포 상호작용 측정, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준 측정, 혈관형성 측정 및 세포사 측정 등에 의해 달성될 수 있다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 활성의 억제가 특히 흥미롭다. 본원에서 사용된 용어, "억제한다"는 활성 또는 양의 감소, 축소, 불활성화 또는 하향-조절을 말한다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여, AMIGO-2 조정제는 종양형성능; 암세포 운동성; 세포 유착; 전이; 암세포 생존; 키나제 활성; 증식; 비부착 성장; 암세포 운동성; AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화; AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용; 신경세포 유도; 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준; 인산화 ERK 수준; 및 혈관형성 중 하나 이상을 억제할 수 있다. 이러한 활성의 억제는 대조군과 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%일 수 있다. AMIGO-2 조정을 측정하는 능력이 당업자에게 있다고 생각되며, 전형적인 분석법들의 비제한적 리스트가 아래 제시된다.
따라서, 본원에서 사용된 용어, "AMIGO-2의 억제"는 하나 이상의 AMIGO-2-매개 생물학적 활성의 감소, 축소, 불활성화 또는 하향-조절을 말한다. "AMIGO-2 생물학적 활성"의 억제는, 예를 들어 종양형성능; 암세포 운동성; 세포 유착; 전이; 암세포 생존; 키나제 활성; 증식; 비부착 성장; 암세포 운동성; AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화; AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용; 신경세포 유도; 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준; 인산화 ERK 수준; 또는 혈관형성의 감소, 축소, 불활성화 또는 하향-조절을 말한다. 이러한 활성의 억제는 대조군과 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 100%일 수 있다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 활성을 활성화하거나 증가시키는 AMiGO-2 활성의 조정이 특히 흥미롭다. AMIGO-2 조정제는 배수성 및 세포사 중 하나 이상을 억제할 수 있다. AMIGO-2 활성의 상향-조절 또는 증가는 대조군과 비교하여 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 500%일 수 있다. 예를 들어, 세포사를 200% 증가시키는 AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2 조정제가 없는 대조군과 비교하여 세포사를 2배 증가시켰다.
본원에서 사용된 용어, "암세포에서 차등 발현되는" 및 "암세포에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드"는 상호 교환하여 사용되고, 암성이 아닌 동일한 세포 타입의 세포와 비교했을 때 암성 세포에서 차등 발현되는 유전자를 나타내거나 그에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 말하며, 예를 들어 mRNA는 적어도 약 25%, 적어도 약 50% 내지 약 75%, 적어도 약 90%, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 이상의 차등 수준(예를 들어, 더 높거나 더 낮게)으로 발견된다. 예를 들어, 제자리 혼성화 또는 조직 내 세포 타입들 간의 어떤 정도의 구별을 허용하는 다른 분석 방법을 이용하여 조직을 비교할 수 있다. 또한, 또는 대안으로서, 조직 출처로부터 제거된 세포들 간의 비교, 또는 제자리의 제 1 세포와 조직 출처로부터 제거된 제 2 세포 간의 비교가 이루어질 수 있다. 어떤 구체예에서, 유전자는 정상 세포에 비하여 암 유전자에서 상향-조절된다.
적어도 하나의 암 증상이 완화, 종결, 지체 또는 예방될 경우 AMIGO-2-관련 암이 "억제된다"고 말한다. 본원에서 사용될 때, 암의 재발 또는 전이가 감소, 지체, 지연 또는 예방될 경우에도 AMIGO-2-관련 암이 "억제된다"고 말한다.
본원에서 사용된 문구, "AMIGO-2-매개 세포 유착을 억제한다"는 AMIGO-2 조정제 존재하의 세포-세포 유착의 축소, 감소, 또는 전폐를 말하며, 이때 적어도 하나의 세포는 AMIGO-2를 차등 발현한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 세포 유착은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 세포 유착에 비하여 AMIGO-2 조정제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. AMIGO-2-매개 세포 유착의 비교는, 예를 들어 관심의 세포를 표지하고 이들을 기질에 고정된 비-표지 세포 개체군과 함께 인큐베이션한 다음 세척하여 유착 개체군과 비-유착 개체군을 분리함으로써 달성될 수 있다. 이 방식에서 세포 유착은 기질 상에 보유된 표지의 양을 측정함으로써 결정된다. 분석 시스템의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 칼세인 AM, CFMDA(5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트), 5(6)-CFDA-SE[5-(및-6)-카르복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르]와 같은 형광 프로브로 표지한 다음 형광 플레이트 리더에서 또는 유세포계수기에 의해 형광을 측정하는 것이 있다.
본원에서 사용된 문구, "암세포 성장을 억제한다"는 AMIGO-2 조정제 존재하의 AMIGO-2를 발현하는 암세포 성장의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 어떤 구체예에서, 세포는 다른 정상 세포 및/또는 다른 암세포에 비해 AMIGO-2를 차등 발현한다. 이와 관련하여, 세포 성장은 AMIGO-2 조정제 부재시의 암세포 성장에 비하여 AMIGO-2 조정제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. 암세포 성장의 비교는, 예를 들어 MTT 분석(예를 들어, Vybrant® MTT 세포 증식 분석 키트((Invitrogen)); BrdU 편입(예를 들어, Absolute-S SBIP 분석(Invitrogen)); 세포내 ATP 수준 측정(예를 들어, ATPLite™-M, 1,000 분석 키트(PerkinElmer) 또는 ATP 세포 생육능력 분석 키트(BioVision) 사용); 막 투과 염료인 DiOc18 분석(Invitrogen); 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 활성 분석(예를 들어, Vibrant 세포독성 분석(Invitrogen)); 또는 세포의 LDH 활성 측정을 이용하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "종양 형성을 억제한다"는 AMIGO-2 조정제 존재하의 종양 형성의 축소, 감소 또는 전폐를 말하며, 이때 종양은 AMIGO-2를 차등 발현하는 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 종양 형성은 AMIGO-2 조정제 부재시의 종양 형성에 비하여 AMIGO-2 조정제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. 종양 형성의 비교는, 예를 들어 세포 기반 분석(예를 들어, 연 한천에서의 콜로니 형성); 일반적으로 관심의 세포를 동물에 주사하는 것에 의한 생체내 종양 형성 모델(예를 들어, 가슴샘 없는 마우스 또는 래트, 방사선 조사된 마우스 또는 래트; 뇌, 볼주머니 또는 눈과 같은 면역학적 특별 격리 부위에의 접종; 동계 동물의 접종); 및 정해진 시간 경과 후 덩어리 크기의 측정에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "사이클린 D1을 억제한다"는 AMIGO-2-매개 사이클린 생산의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 사이클린 생산은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 사이클린 생산에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. 사이클린 생산의 비교는, 예를 들어 RT-PCR 또는 노던 블롯팅에 의한 사이클린 mRNA 수준의 측정; 면역블롯팅, 면역침전 또는 ELISA에 의한 사이클린 폴리펩티드 수준의 측정; 또는 예를 들어, CDK, p21WAF1, p27 KIP-1을 표적으로 하는 항체를 이용하여 사이클린-의존성 키나제(CDK)와 같은 사이클린 조절제와 복합체를 이룬 사이클린의 수준을 측정할 수 있는 동시-면역침전 분석을 포함하는 기능적 분석의 이용; 및 방사선 표지화 및 면역침전 분석 또는 FRET-기반 분석, 예를 들어 CDK2/사이클린 A 분석 키트(Molecular Devices)를 통해 분석될 수 있는 CDK에 의한 사이클린의 인산화의 측정에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "사이클린 B1을 억제한다"는 AMIGO-2-매개 사이클린 생산의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2 매개 사이클린 생산은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 사이클린 생산에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. 사이클린 생산의 비교는 사이클린 D1에 대해 상기 설명된 방법들에 따라서 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "FosL1의 억제"는 AMIGO-2-매개 FosL1 생산의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 FosL1 생산은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 FosL1 생산에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. FosL1 생산의 비교는, 예를 들어 RT-PCR 또는 노던 블롯팅에 의한 FosL1 mRNA 수준의 측정; 또는 면역블롯팅, 면역침전, ELISA 또는 면역조직화학에 의한 FosL1 폴리펩티드 수준의 측정에 의해 달성될 수 있다. FosL1 발현(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)을 측정하는 적합한 방법의 예들이 본원 실시예에 제시되며, 예를 들어 Matsuo et al., (2000) Nature Genet. 24:184-187; 및 Sahin et al., (2005) Pancreas 30(2):158-167에도 설명된다.
본원에서 사용된 문구, "c-Myc의 억제"는 AMIGO-2-매개 c-Myc 생산의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 c-Myc 생산은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 c-Myc 생산에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. c-Myc 생산의 비교는, 예를 들어 RT-PCT 또는 노던 블롯팅에 의한 c-Myc mRNA 수준의 측정, 또는 면역블롯팅, 면역침전, ELISA 또는 면역조직화학에 의한 c-Myc 폴리펩티드 수준의 측정에 의해 달성될 수 있다. 대안으로서, 또는 추가로, c-Myc는, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 촉진하는 c-Myc 전사인자의 능력에 의해 "기능적으로" 측정될 수 있다. 표적 유전자는 내인성 유전자일 수 있거나, 외인성 트랜스젠(즉, 리포터 유전자)일 수 있다. 표적 유전자 mRNA 또는 단백질 발현 측정은 본원에 설명된 방법 중 어느 것을 이용하여 달성될 수 있다. 어떤 예에서, 리포터 유전자는 측정가능한 활성(예를 들어, 루시페라제, 클로람페니콜, 아세틸트랜스페라제, 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제) 또는 검출가능한 단백질(예를 들어, 녹색형광 단백질 또는 적색형광 단백질)을 가진 효소일 수 있다. c-Myc 발현(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)을 측정하는 적합한 방법의 예들이 본 분야에 공지되어 있고 본 실시예에서도 충분히 제시된다. 리포터 유전자 발현, 특히 상기 설명된 효소나 검출가능한 리포터 유전자를 모니터하는 방법이 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 Cziepluch et al., (1993) Oncogene 8(10):2833-8에 설명된다.
본원에서 사용된 문구, "c-Jun의 억제"는 AMIGO-2-매개 c-Jun 생산의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 c-Jun 생산은 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGO-2-매개 c-Jun 생산에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. c-Jun 생산의 비교는, 예를 들어 RT-PCT 또는 노던 블롯팅에 의한 c-Jun mRNA 수준의 측정, 또는 면역블롯팅, 면역침전, ELISA 또는 면역조직화학에 의한 c-Jun 폴리펩티드 수준의 측정에 의해 달성될 수 있다. 대안으로서, 또는 추가로, c-Jun은, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 촉진하는 c-Jun 전사인자의 능력에 의해 "기능적으로" 측정될 수 있다. 표적 유전자는 내인성 유전자일 수 있거나, 또는 외인성 트랜스젠(즉, 리포터 유전자)일 수 있다. 표적 유전자 mRNA 또는 단백질 발현 측정은 본원에 설명된 방법 중 어느 것을 이용하여 달성될 수 있다. c-Jun 발현(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)을 측정하는 적합한 방법의 예들이 본 분야에 공지되어 있고 본 실시예에서도 충분히 제시되며, 또 예를 들어 Kharbanda et al., (1991) Biochemistry 30:7947-7952, 및 Kayahara et al., (2005) Mol. Cell Biol. 25(9):3784-3792에 설명된다. 리포터 유전자 발현, 특히 상기 설명된 효소나 검출가능한 리포터 유전자를 모니터하는 본 분야에 공지되어 있으며 상기 설명된다.
본원에서 사용된 문구, "ERK 인산화를 억제한다"는 AMIGO-2-매개 ERK 인산화의 축소, 감소 또는 전폐를 말한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-매개 ERK 인산화는 AMIGO-2 조정제 부재시의 AMIGI-2-매개 ERK 인산화에 비하여 AMIGO-2 조정제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다. ERK 인산화의 비교는 당업자에게 공지된 인산화 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
어떤 특정한 작용 이론이나 메커니즘에 제한되지는 않지만, ERK 인산화는 일반적으로 ERK의 활성화를 이끌기 때문에 "ERK 인산화를 억제한다"라는 말은, 어떤 구체예에서는 인산화된 ERK에 의한 하나 이상의 ERK 기질의 AMIGO-2-매개 인산화의 축소, 감소 또는 전폐를 말하기도 한다. ERK 기질은, 제한되지는 않지만, IEX-1, ELK1, Paxillin, Bcl-2, SOS, 또는 SP1을 포함한다. 그 기질 상에서 ERK의 키나제 활성화를 모니터하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Mechant et al., (1999) BBRC 254:454-461, Chemiack et al.,(1994) J. Biol. Chem. 269:4717-4720, Cano et al., (1995) J. Cell Sci. 108:3599-3609, Garcia et al., (2004) EMBO J. 21:5151-5163, 및 Tamura et al., (2004) FEBS Lett. 569:249-255에 설명된다.
본원에서 사용된 문구, "암세포 생존을 억제한다"는 AMIGO-2를 발현하는 암세포의 생존의 축소 또는 감소를 말한다. 어떤 구체예에서, "암세포 생존을 억제한다"라는 말은 AMIGO-2를 발현하는 암세포가 세포사멸되는 것을 말한다. 어떤 구체예에서, 암세포는 다른 정상 세포에 비해 및/또는 다른 암세포에 비해 AMIGO-2를 차등 발현한다. 이와 관련하여, AMIGO-2-발현 암세포 생존은 AMIGO-2 조정제 부재시 및/또는 정상 세포에서의 암세포 생존에 비하여 억제제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 축소될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "AMIGO-2 신호화를 억제한다"는 AMIGO-2를 포함하는 세포 신호화 연속단계의 하류 구성원에 대한 AMIGO-2의 효과를 축소, 감소 또는 전폐시키는 것을 말한다. AMIGO-2를 포함하는 세포 신호화 연속단계는 세포 성장 및 생존을 매개하는 경로들을 말한다. 어떤 구체예에서, 세포 성장 및 생존을 매개하는 경로는 EGFR 경로 또는 베타-카테닌 경로와 같이, 활성화 성장인자 경로의 하류에 있다. 어떤 구체예에서, 이 경로는 돌연변이된 베타-카테닌 경로이며, 이것은 특히 베타-카테닌을 안정화시킨다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 신호화의 억제는 하나 이상의 하류 마커를 상향-조절한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 신호화의 억제는 하나 이상의 하류 마커를 하향-조절한다.
AMIGO-2 신호화의 억제는 세포 신호화 경로의 하류 구성원의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 수준의 측정에 의해 결정될 수 있다. AMIGO-2 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 수준을 측정하는 능력이 당업자에게 있다고 생각된다. 또한, 당업자는 AMIGO-2 하류 마커의 수준을 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "세포-세포 상호작용을 억제한다"는 AMIGO-2를 발현하는 둘 이상의 세포 간의 상호작용을 감소 또는 제거하는 것을 말한다. 어떤 구체예에서, 세포 간 상호작용은 세포 신호를 가져온다. 세포-세포 상호작용은, 제한되지는 않지만, 예를 들어 PKH26 및 PKH67(Sigma)을 포함하는 상이한 형광 막 염료로 표지된, 공-배양, 사전-표지된 세포들 간의 막 교환의 관찰을 포함하여, 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "증식을 억제한다"는 AMIGO-2-매개 증식을 감소 또는 제거하는 것을 말하며, 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식 분석은, 제한되는 것은 아니지만, MTT 분석(예를 들어, Vybrant® MTT 세포 증식 분석 키트(Invitrogen)); BrdU 편입 분석(예를 들어, Absolute-S SBIP 분석(Invitrogen)); 세포내 ATP 수준 측정(상업용 분석 버전으로 ATPLite™-M, 1,000 분석 키트(PerkinElmer) 및 ATP 세포 생육능력 분석 키트(Bio Vision)가 있다); 막 투과 염료인 DiOc18 분석; 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 활성 분석(예를 들어, Vibrant 세포독성 분석(Invitrogen)); 세포의 LDH 활성 측정; 및 3H-티미딘 편입 및 세포 역가 Glo 분석(Promega)을 포함한다.
본원에서 사용된 문구, "혈관형성의 억제"는 AMIGO-2-매개 혈관형성을 감소 또는 제거하는 것을 말한다. 혈관형성은 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 검출될 수 있으며, 제한되지는 않지만, 세포 증식 분석, 세포 이주 분석, 세포 분화 분석, 기관 배양 (생체외) 분석, 병아리 융모막요막(CAM) 분석, 각막 혈관형성 분석, Matrigel 플러그 분석, 및 SCID 마우스, 누드 마우스 또는 C57BL 마우스 내 종양 부피 분석 방법 등이 있다.
세포 이주 분석으로는, 제한되지는 않지만, 블라인드-웰 화학주성 챔버, 예를 들어 변형된 Boyden 챔버 및 포식운동학(Phagokinetic) 트랙 분석이 있다. 세포 분화 분석으로는, 제한되지는 않지만, 콜라겐 내 관 형성, 피브린 응집체, 또는 전자현미경에 의해서 추적되는 Matrigel이 있다. 기관 배양 (세포외) 분석으로는, 제한되지는 않지만, 래트 대동맥 환 분석 및 병아리 대동맥 활 분석이 있다.
본원에서 사용된 문구, "세포 주기를 통한 진행을 억제한다"는 세포 분할의 지체 또는 중단을 말한다. 세포 주기 진행은 브로모데옥시우리딘(BRDU) 편입에 의해 분석될 수 있다. 이러한 분석에서는 새로 합성되는 DNA에 BRDU가 편입됨으로써 DNA 합성 세포 개체군이 확인된다. 다음에, 새로 합성된 DNA가 항-BRDU 항체를 이용하여(Hoshino et al., 1986, int. J. Cancer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107, 79), 또는 다른 수단에 의해 검출될 수 있다. 또한, 세포 증식은 포스포-히스톤 H3 염색에 의해 분석될 수 있는데, 이것은 히스톤 H3의 인산화에 의해 유사분열한 세포 개체군을 확인한다. 세린 10에서 히스톤 H3의 인산화는 히스톤 H3의 세린 10 잔기의 인산화된 형태에 특이적인 항체를 이용하여 검출된다 (Chadlee, D. N., 1995, J. Biol. Chem. 270:20098-105). 세포 증식은 또한 [3H]-티미딘 편입을 이용하여 시험될 수 있다(Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403, Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367-73). 이 분석은 S-기 DNA 합성을 정량적으로 특성화한다. 이 분석에서는 DNA-합성 세포가 새로 합성되는 DNA에 [3H]-티미딘을 편입시킬 것이다. 다음에, 섬광계수기에서 방사선 동위원소를 계수하는 것 등의 표준 기술에 의해 편입이 측정될 수 있다(예를 들어, Beckman L S 3800 액체 섬광계수기). 다른 증식 분석은 Alamar Blue(Biosource International에서 입수) 염료를 이용하는데, 이것은 살아 있는 세포에서 환원되면서 형광을 방출하므로 세포 수의 간접 측정이 가능하다(Voytik-Harbm S. L. et al., 1998, In Vitro Cell Dev. Biol. Arum. 34:239-46). 또 다른 증식 분석으로 MTS 분석이 있는데, 이것은 산업용 화학물질의 시험관내 세포독성 평가에 기초하며, 가용성 테트라졸륨 염 MTS를 이용한다. MTS 분석은 상업적으로 이용가능하며, 예로는 Promega CellTiter 96® AQueous 비-방사선 활성 세포 증식 분석(Cat # G5421)이 있다. 세포 증식은 또한 연 한천에서의 콜로니 형성에 의해 분석될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). 세포 증식은 또한 대사 활성 세포의 지시제로서 ATP 수준을 측정함으로써 분석될 수 있다. 이러한 분석은 상업적으로 이용가능하며, 예로는 Cell Titer-Glo™(Promega)이 있다. 세포 주기 증식은 또한 유세포분석법에 의해서 분석될 수 있다(Gray J. W. et al., (1986) Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 49:237-55). 요오드화 프로피듐으로 세포를 염색한 다음 유세포분석기에서 평가하여 상이한 세포 주기 단계에서 세포의 축적을 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 "AMIGO-2 하류 마커"는 정상 조직 또는 건강한 조직에서의 발현 수준과 비교하여 암 조직 또는 암세포에서 변화된 발현 수준을 나타내는 유전자 또는 활성, 또는 AMIGO-2 조정제의 존재하에 변화된 특성이다. 어떤 구체예에서, 하류 마커는 AMIGO-2가 본 발명의 AMIGO-2 조정제에 의해 교란될 때 변화된 발현 수준을 나타낸다. AMIGO-2 하류 마커는, 제한되지는 않지만, 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, VEGF, 유로키나제, cJun, FosL1 또는 ERK를 포함한다. 어떤 구체예에서, PARP1의 절단이 AMIGO-2 활성의 하류 마커이다.
본원에서 사용된 문구, "암세포 세포사멸의 증가"는 AMIGO-2 조정제의 존재하에 AMIGO-2를 발현하는 암세포의 세포사멸의 증가를 말한다. 이와 관련하여, 암세포 세포사멸은 AMIGO-2 조정제 부재시의 암세포 세포사멸에 비하여 AMIGO-2 조정제에 의해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%까지 증가될 수 있다. 어떤 구체예에서, 암세포는 다른 정상 세포에 비해 및/또는 다른 암세포에 비해 AMIGO-2를 차등 발현한다. 암세포 세포사멸의 비교는, 예를 들어 DNA 단편화, 카스파제 활성, 미토콘드리아 막 전위의 상실, 반응성 산소 종(ROS)의 생산 증가, 세포내 산성화, 염색질 응축, 세포 표면의 포스파티딜 세린(PS) 수준, 및 세포막 투과성 증가를 측정함으로써 달성될 수 있다.
DNA 단편화는, 예를 들어 TUNEL 분석(터미날 데옥시뉴클레오티드 트랜스페라제 dUTP 닉 엔드 라벨링)에 의해 측정될 수 있다. 상업용 분석 버전이 널리 이용되며, 예를 들어 APO-BrdU™ TUNEL 분석 키트(Invitrogen), APO-DIRECT™ 키트(BD Biosciences Pharmingen) 및 ApoAlert™ DNA 단편화 분석 키트(Clontech, a Takara Bio Company)가 있다.
카스파제 활성은 특정한 카스파제에 특이적인 형광, 발색 및 발광 기질에 의해 모니터될 수 있다. 적어도 카스파제 1, 2, 3, 6, 7, 8 및 9에 대해 상업용 분석 키트가 이용가능하다(예를 들어, Invitrogen, Chemicon, CalBiochem, BioSource International, Biovision 참조).
미토콘드리아 막 전위 상실은 건강한 활성 미토콘드리아에 차등 축적되는 형광 염료를 사용하여 측정될 수 있다. 비제한적 예로는 Invitrogen의 Mito Tracker Red 시스템이 있다.
반응성 산소 종(ROS) 생산은, 예를 들어 H2DCFDA(Invitrogen) 등의 형광 염료를 사용하여 측정될 수 있다.
세포내 산성화는 형광 또는 발색 염료를 사용하여 측정될 수 있다.
염색질 응축은, 예를 들어 Hoechst 33342 등의 형광 염료를 사용하여 측정될 수 있다.
포스파티딜 세린(PS)의 수준은 세포 표면에서 측정될 수 있다. 예를 들어, Annexin V가 PS에 대해 높은 친화성을 가진다. 여러 상업적으로 이용가능한 분석이 표지된 Annexin V와 세포 표면의 결합을 모니터하는데 적합하다.
세포막 투과성은 세포사멸 세포로는 진입하지만 괴사 세포에는 진입하지 않는 형광 염료 YO-PRO-1(Invitrogen)과 같은 염료를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "상향-조절한다"는 활성 또는 양의 증가, 활성화 또는 자극을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "N-말단"은 단백질의 처음 10개 아미노산을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "C-말단"은 단백질의 끝의 10개 아미노산을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "도메인"은 생물분자의 기지의 기능 또는 추측된 기능에 기여하는 생물분자의 구조 부분을 말한다. 도메인은 영역 또는 그것의 부분과 동일 공간에 있을 수 있으며, 그 영역의 전체 또는 부분에 더하여, 특정 영역과 구별되는 생물분자의 일부분을 편입시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "세포외 도메인"은 세포 바깥쪽 또는 세포 외부에 있는 분자의 부분을 말한다. 본 발명과 관련하여, N-말단 세포외 도메인은 제 1 막통과 도메인 직전에서 분자의 N-말단에 존재하는 세포외 도메인을 말한다. 두 막통과(TM) 도메인 사이, 예를 들어 TM 2&3 사이의 세포외 도메인과 관련하여, 세포외 도메인은 AMIGO-2의 제 2 막통과 도메인과 제 3 막통과 도메인 사이의 있는 세포막 외부의 AMIGO-2 부분을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "리간드 결합 도메인"은 AMIGO-2의 상응하는 자생 서열의 적어도 하나의 정성적 결합 활성을 보유하는 수용체의 어떤 부분 또는 영역을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "영역"은 생물분자의 주 구조에서 물리적으로 연속되는 부분을 말한다. 단백질의 경우, 영역은 단백질의 아미노산 서열의 연속 부분으로서 정의된다. 어떤 구체예에서, "영역"은 생물분자의 기능과 관련된다.
본원에서 사용된 용어, "단편"은 생물분자의 주 구조에서 물리적으로 연속되는 부분을 말한다. 단백질의 경우, 부분은 단백질의 아미노산 서열의 연속 부분으로 정의되며, 적어도 3-5개 아미노산, 적어도 8-10개 아미노산, 적어도 11-15개 아미노산, 적어도 17-24개 아미노산, 적어도 25-30개 아미노산, 그리고 적어도 30-45개 아미노산을 말한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 부분은 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 연속 부분으로 정의되며, 적어도 9-15개 뉴클레오티드, 적어도 18-30개 뉴클레오티드, 적어도 33-45개 뉴클레오티드, 적어도 48-72개 뉴클레오티드, 적어도 75-90개 뉴클레오티드, 그리고 적어도 90-130개 뉴클레오티드를 말한다. 어떤 구체예에서, 생물분자의 단편은 생물학적 활성을 가진다. 본 발명과 관련하여, AMIGO-2 폴리펩티드 단편은 SEQ ID NO:2에 제시된 전체 AMIGO-2 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 단편은 자생 AMIGO-2의 하나 이상의 활성을 보유한다.
본원에서 사용된 문구, "AMIGO-2-관련 세포/종양/샘플" 등은 비-암성 및/또는 비-전이성 세포, 샘플, 종양 또는 기타 병리상태에 비해 AMIGO-2의 차등 발현을 특징으로 하는 세포, 샘플, 종양 또는 기타 병리상태를 말한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2-관련 세포, 샘플, 종양 또는 기타 병리상태는 비-전이성 세포, 샘플, 종양 또는 기타 병리상태에 비해 증가된 AMIGO-2 발현을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 용어, "항체"는 표적 단백질 또는 그것의 단편에 특이적인 단클론 항체 및 다클론 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체, 이중기능/이중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 상보성 결정 영역(CDR)-접목 항체를 말하며, 또한 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, 카멜보디(camelbody), 또는 마이크로항체 등의 항체 단편을 포함한다. 또한, 용어 "항체"는 치료상의 생체내 항체 유전자 전달을 포함한다.
본원에서 사용된 용어, "단클론 항체"는 실질적으로 동종성인 항체의 개체군으로부터, 즉 개체군을 구성하는 개별 항체들이 소량 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이의 가능성을 제외하고는 동일한 개체군으로부터 획득된 항체를 말한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 더욱이, 상이한 결정소들(에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와는 달리, 각 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대해 지시된다. 이들의 특이성에 더하여, 단클론 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. "단클론"이란 수식어는 실질적으로 동종성인 항체 개체군으로부터 획득된 것이라는 항체의 특질을 나타내며, 어떤 특정한 방법에 의한 항체 생산의 필요성을 구성하는 것을 아니다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라서 사용되는 단클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한, "단클론 항체"는, 예를 들어 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
단클론 항체는 본원에서 구체적으로 "키메라" 항체를 포함하며, 키메라 항체에서는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 동종성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한에서 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 동종성이다(미국특허 제4,816,567호, 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심의 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, Ape 원숭이 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열과 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분을 포함하며, 어떤 구체예에서는 그것의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아체(diabody); 선형 항체(Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다중특이적 항체가 있다.
"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 자생 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 자생 서열 불변 도메인) 또는 그것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 어떤 구체예에서, 무손상 항체는 한 가지 이상의 이펙터 기능을 가진다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(자생 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합, 보체-의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCD), 포식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향-조절 등이 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 어떤 세포독성 세포(예를 들어, 자연살상(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 위에 결합된 분비된 Ig에 의해 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 다음 세포독소에 의하여 표적 세포를 죽이게 되는 형태의 세포독성을 말한다. 항체가 세포독성 세포를 "무장시키며" 이러한 세포사에 절대적으로 필요하다. 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현하지만, ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현이 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해 미국특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 설명된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포로는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연살상(NK) 세포가 있다. 대안으로서, 또는 추가로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)에 설명된 것과 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하며 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 어떤 구체예에서, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC-매개 인간 백혈구의 예로는 말초혈액 단핵세포(PBMC), 자연살상(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 및 호중구가 있다. 이펙터 세포는 그것의 자생 출처, 예를 들어 본원에 설명된 대로 혈액 또는 PBMC로부터 분리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 어떤 구체예에서, FcR은 자생 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 어떤 구체예에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 것으로서(감마 수용체), FcγFI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 택일적 스플라이스 형태도 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 유사한 아미노산 서열을 가지는데 세포질 도메인에서만 주로 상이하다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(Daron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcR들은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994), 및 de Haas et al., J. Lab. Clim. Med. 126:330-41 (1995)에서 다뤄졌다. 본원에서는 장차 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR들도 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체의 IgG를 태아로 전달하는 신생아 수용체 FcRn도 포함한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해하는 분자의 능력을 말한다. 보체 시스템(C1q)의 제 1 성분과 동계 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들어, 항체)가 결합함으로써 보체 활성화 경로가 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에 설명된 대로 CDC 분석이 수행될 수 있다.
용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정소를 말한다. 어떤 구체예에서, 에피토프는 에피토프에 독특한 공간적 입체형태 내에 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태형 에피토프이다. 일반적으로 에피토프는 적어도 4개, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 및 적어도 12개의 이러한 아미노산으로 구성되며, 더 일반적으로 적어도 8-10개의 이러한 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 공간적 입체형태를 판정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 x-선 결정학 및 2-차원 핵자기공명을 이용한다.
문구 "상보성 결정 영역"은 자생 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성과 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 말한다. Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Kabat et al., U. S. Dept. of Health and Human Services NTH Publication No. 91-3242 (1991)를 참조한다. 문구 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 본 발명에서는 마우스 불변 영역이 인간 불변 영역으로 치환된다. 해당 인간화된 항체의 불변 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 중쇄 불변 영역은 5개의 이소타입, 즉 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 항체를 인간화하는 한 방법은 비-인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열에 맞춰 정렬하는 단계, 이러한 정렬에 기초하여 비-인간 프레임워크를 선택하여 인간 프레임워크로 치환하는 단계, 분자를 모델링하여 인간화된 서열의 입체형태를 예측하는 단계, 및 모 항체의 입체형태와 비교하는 단계를 포함한다. 이 과정에 다음에, CDR 구조를 교란하는 CDR 영역 내 잔기들의 역 돌연변이를 인간화된 서열 모델의 예상된 입체형태가 모 비-인간 항체의 비-인간 CDR의 입체형태와 아주 근접해질 때까지 반복한다. 이러한 인간화된 항체는, 예를 들어 Ashwell 수용체에 의한 흡수 및 청소가 촉진되도록 더 유도체화될 수 있다. 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호를 참조한다.
결과의 폴리펩티드가 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 광범위한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 면역글로불린의 주요한 5개 유전자형, 또는 이들의 단편(본원에 개시된 것들과 같은)을 포함하며, 바람직하게는 인간화된 양태의, 다른 동물 종들의 면역글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 카멜리드(camelid)에서 확인된 것들과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 흥미롭다. 본 분야에서는 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편들의 발견 및 개발이 계속되고 있다.
비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린 기반 항체를 생성할 수 있으며, 여기에 본 발명의 CDR을 접목시킬 수 있다. 표적에 특이적인 결합 영역을 포함하는 공지된 또는 장차 발견될 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 화합물들은 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"라고 본 분야에 알려져 있다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드로서는, 제한되지는 않지만, Adnectins(피브로넥틴)(Compound Therapeutics, Inc., 매사츄세츠 월댐), 앤키린(Molecular Partners AG, 스위스 취리히), 도메인 항체(Domantis Ltd.(매사츄세츠 캠브리지) 및 Ablynx nv(Zwijnaarde, 벨기에)), 리포칼린(Anticalin)(Piens Proteolab AG, 독일 프라이싱), 소분자 면역약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., 워싱턴 시애틀), Maxybody(Avidia Inc.(캘리포니아 마운틴뷰)), 단백질 A(Affibody AG, 스웨덴) 및 Affilin(γ-결정체 또는 유비퀴틴)(Sell Proteins GmbH, 독일 할레)가 있다.
(iii) Maxybody/Avimer - Avidia
Avimer는 LRP-1과 같은 단백질을 함유하는 천연 A-도메인으로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 사용되며, 인간에서는 250개 이상의 단백질이 A-도메인에 구조적으로 기초하고 있다. Avimer는 아미노산 링커에 의해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 모노머들(2-10개)로 구성된다. 표적 항원에 결합할 수 있는 Avimer가 생성될 수 있으며, 예를 들어 미국특허 공보 제20040175756호, 제20050053973호, 제20050048512호, 및 제20060008844호에 설명된 방법을 사용한다.
용어 "길항제"(antagonist)는 광의의 의미로 사용되며, 본원에 개시된 종양 세포 항원의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 또는 중화하는 어떤 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "작동제"(agonist)도 광의의 의미로 사용되며, 본원에 개시된 종양 세포 항원의 생물학적 활성을 의태하는 어떤 분자를 포함한다. 적합한 작동제 또는 길항제 분자는 구체적으로 작동제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 종양 세포 항원의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 유기 분자 등을 포함한다. 종양 세포 항원의 작동제 또는 길항제를 확인하는 방법은 관심의 항원을 발현하는 종양 세포를 후보 작동제 또는 길항제 분자와 접촉시키는 단계, 및 정상적으로 종양 세포 항원과 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에 있어서의 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 길항제는 합리적 디자인 또는 파지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수 있다(예를 들어, 1998년 8월 13일자 공개된 W0 98/35036을 참조한다). 한 구체예에서, 선택된 분자는 "CDR 의태체" 또는 항체의 CDR에 기초하여 디자인된 항체 유사체일 수 있다. 이러한 펩티드는 단독으로 길항제일 수 있지만, 펩티드는 펩티드의 길항성을 추가하거나 증진시키기 위해 선택적으로 세포독성제와 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "올리고뉴클레오티드"는 일련의 연결된 뉴클레오티드 잔기들을 말한다. 올리고뉴클레오티드는, 제한되지는 않지만, 안티센스 및 siRNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열의 부분을 포함하며, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 많게는 약 500개 뉴클레오티드를 가진다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 그리고 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있으며, 프로브로서 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 이중-가닥 부분을 포함한다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드(RNAi 올리고뉴클레오티드)이다.
본원에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 AMIGO-2의 전사 또는 번역에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, AMIGO-2 폴리뉴클레오티드의 프로모터)을 포함하는 AMIGO-2 폴리뉴클레오티드 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 가진 미-변형된 또는 변형된 핵산을 말하며, 이 경우 안티센스 폴리뉴클레오티드는 AMIGO-2 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 AMIGO-2 폴리펩티드-암호화 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드가 특히 흥미롭다.
본원에서 사용된 용어, "siRNA 올리고뉴클레오티드", "RNAi 올리고뉴클레오티드", "짧은 간섭 RNA", 또는 "siRNA"는 상호 교환하여 사용되고, RNA 간섭(RNAi)이라고도 하는 전사-후 유전자 침묵(silencing)을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이 용어는 RNA 간섭 "RNAi"가 가능한 이중-가닥 핵산 분자를 일컫는다(Kreutzer et al., WO 00/44895, Zernicka Goetz et al., WO 01/36646, Fire, WO 99/32619, Mello and Fire, WO 01/29058 참조). siRNA 분자는 일반적으로 RNA 분자이지만, 화학적 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드도 포함한다. 세포로의 순간적 siRNA 전달에 의해 siRNA 유전자-표적화 실험이 수행되었다(리포솜-매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 또는 마이크로인젝션과 같은 고전적 방법에 의해 달성된다). siRNA 분자는 21- 내지 23-뉴클레오티드 RNA이며, 통상 RNAi를 개시하는 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 RNase III 프로세싱 산물을 닮은 특징적인 2- 내지 3-뉴클레오티드 3' 오버행 말단을 가진다.
본원에서 사용된 용어, "유인체 수용체"는 AMIGO-2 리간드와 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 의태체 또는 다른 거대분자의 적어도 일부분을 포함하는 수용체를 말한다. 본원에서 사용된 용어, "치료적 유효량"은 의약의 치료적 유효량이 개체에 투여되었을 때, 개체에서 하나 이상의 임상적 종점, 암세포 성장 및/또는 생존, 또는 암세포 전이에 있어서 감소 또는 반전으로서 관찰되는 의학적 효과를 야기하는 의약의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 전형적으로 이들이 가지는 효과를 활성 성분을 포함하지 않는 조성물을 유사한 처지의 개체에 투여하여 관찰된 효과와 비교하여 결정한다. 피험자마다 정확한 유효량은 피험자의 치수 및 건강상태, 질환의 성질 및 범위, 그리고 투여하도록 선택된 치료제 또는 치료제의 조합에 따를 것이다. 그러나 주어진 상황에 따른 유효량은 통상의 실험에 의해서 결정되며, 임상의의 판단 범위 내이다.
본원에서 사용된 용어, "와 조합하여" 또는 "와 함께"는 다른 치료법과 함께 본 발명의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "민감한"은 AMIGO-2 치료요법이 치료 방법으로서 허용되는 환자, 즉 양성 반응이 예상되는 환자를 말한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 치료요법에 민감한 암 환자는 AMIGO-2 치료요법에 민감하지 않은 환자에 비해 높은 수준의 AMIGO-2를 발현한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 치료요법에 대한 좋은 후보자가 아닌 암 환자는 종양 샘플에서 암세포 내에 또는 암세포 상에 AMIGO-2가 존재하지 않거나 낮은 수준으로 존재하는 암 환자를 포함한다. 어떤 구체예에서, 암세포의 다른 영역들에 국소화된 AMIGO-2와 비교했을 때 높은 비율의 AMIGO-2가 세포막에 국소화된 환자는 이러한 환자가 비-세포막에 국소화된 AMIGO-2에 비하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비율이 낮은 환자들보다 AMIGO-2 치료요법에 더욱 민감하다는 것을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 대하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비가 적어도 2:1일 경우, 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하며 AMIGO-2 치료요법에 민감하다는 것을 의미한다. 어떤 구체예에서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 대하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비가 적어도 3:1일 경우, 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하며 AMIGO-2 치료요법에 민감하다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어, "검출"은 활성(예를 들어, 유전자 발현) 또는 생물분자(예를 들어, 폴리펩티드)에 대한 증거의 확립, 발견, 또는 확인을 의미한다.
"자생 서열" 폴리펩티드는 천연 유래의 폴리펩티드와 동일한 아미노산을 가진 것이다. 이러한 자생 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 분리될 수도 있고, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수도 있다. 따라서, 자생 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 어떤 다른 포유류 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 자생 서열 폴리펩티드와 어떤 정도로 상이한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 말한다. 일반적으로 아미노산 서열 변이체는 자생 리간드의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인 또는 자생 수용체의 적어도 하나의 리간드 결합 도메인 또는 이들의 리간드 결합 도메인들과 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 상동성 또는 적어도 약 90% 상동성을 보유할 것이다. 아미노산 서열 변이체는 자생 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 어떤 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유한다.
본원에서 사용된 문구, "상동성 뉴클레오티드 서열" 또는 "상동성 아미노산 서열" 또는 그것의 변이체는 뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서 적어도 특정한 퍼센트의 상동성을 특징으로 하는 서열을 말하며, "서열 동일성"과 상호 교환하여 사용된다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 단백질의 동형(isoform)들을 코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 동형들은 동일한 유기체의 상이한 조직에서, 예를 들어 택일적 RNA 스플라이싱의 결과로서 발현될 수 있다. 대신하여, 동형들은 상이한 유전자들에 의해 암호화될 수 있다. 상동성 뉴클레오티드 서열은, 제한되지는 않지만, 포유류를 포함하는 인간 이외의 다른 종들의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 상동성 뉴클레오티드 서열은, 제한되지는 않지만, 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 자연 발생 대립형질 변이 및 돌연변이를 포함한다. 상동성 아미노산 서열은 50개 이하의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50 이하의) 보존성 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함하며, 이들 폴리펩티드는 자생 폴리펩티드의 결합 능력 및/또는 활성의 적어도 25%(예를 들어, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 이상)를 보유한다. 보존성 치환은 전형적으로 다음 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소로이신 및 로이신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 그리고 페닐알라닌 및 티로신.
상동성 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 세그먼트(둘 이상의 아미노산 중) 또는 비-연속 단일 아미노산을 결여한 아미노산 서열의 결실 변이체를 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 상동성 아미노산 서열은 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 20 초과) 아미노산의 삽입을 함유할 수 있다.
어떤 구체예에서, 상동성 아미노산 서열은 보존성 치환, 삽입 및/또는 결실을 함유할 수 있다.
상동성 또는 동일성 퍼센트는, 예를 들어 Gap 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, UNIX용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 위스콘신 메디슨)으로 측정할 수 있는데, 이것은 스미스 앤 워터만의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)에 의한 디폴트 세팅을 이용한다. 어떤 구체예에서, 프로브와 표적 간 상동성은 약 50% 내지 약 60%이다. 어떤 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1 또는 그것의 부분과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 약 100% 상동성인 뉴클레오티드를 가진다. 어떤 구체예에서, 호모로그들은 SEQ ID NO:1과 동일한 활성을 가진다. 어떤 구체예에서, 호모로그들은 SEQ ID NO:1과 동일한 발현 프로파일을 공유한다.
상동성은 또한 폴리펩티드 수준에서의 상동성일 수 있다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 부분과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 약 100% 상동성이다. 어떤 구체예에서, 호모로그들은 SEQ ID NO:2와 동일한 활성을 가진다. 어떤 구체예에서, 호모로그들은 SEQ ID NO:2와 동일한 발현 프로파일을 공유한다.
본원에서 사용된 용어, "프로브"는 다양한 길이의 핵산 서열을 말한다. 어떤 구체예에서, 프로브는 적어도 10개, 많게는 약 6,000개 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 프로브는 적어도 12개, 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 50개 또는 적어도 75개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 동일한, 유사한, 또는 상보성 핵산 서열의 검출에 사용된다. 길이가 긴 프로브는 일반적으로 자연 출처 또는 재조합 출처로부터 획득되며, 표적 서열에 대해 고도로 특이적이고, 올리고머에 비하여 표적과 혼성화하는 것이 훨씬 느리다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, PCR, 막-기반 혼성화, 제자리 혼성화(ISH), 형광 제자리 혼성화(FISH), 또는 ELISA-유사 기술에 있어서 특이성을 가지도록 디자인된다.
본원에서 사용된 용어, "혼합"은 하나 이상의 화합물, 세포, 분자 등을 동일한 영역 안에서 함께 조합하는 과정을 말한다. 이것은, 예를 들어 시험관, 패트리 접시, 또는 하나 이상의 화합물, 세포, 또는 분자의 혼합을 허용하는 어떤 용기에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "분리된"은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체가 자연 발생한 환경과 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 또는 숙주 세포를 말한다. 세포를 분리하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로 분리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체는 실질적으로 정제된다.
본원에서 사용된 용어, "실질적으로 정제된"은 그것의 천연 환경으로부터 제거된 화합물(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 항체)로서, 자연적으로 결합된 다른 성분들로부터 적어도 60% 유리된, 적어도 75% 유리된, 및 적어도 90% 유리된 화합물을 말한다.
본원에서 사용된 용어, "결합"은 둘 이상의 생물분자 또는 화합물 간의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 결합은 이온, 비-이온, 수소 결합, 반데르발스, 소수성 상호작용 등을 포함한다. 결합은 직접 결합 또는 간접 결합일 수 있다. 간접 결합은 다른 생물분자 또는 화합물의 영향을 통해 또는 그로 인해 이루어진다. 직접 결합은 다른 분자 또는 화합물의 효과를 통해 또는 그로 인해 발생하지 않는 상호작용을 말하며, 다른 실질적인 화학적 중간체가 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 용어, "접촉"은 한 분자가 다른 분자의 물리적 근접범위 안으로 직접적으로 또는 간접적으로 함께 들어오는 것을 의미한다. 분자는 여러 가지 버퍼, 염, 용액 등의 상태일 수 있다. "접촉"은, 예를 들어 핵산 분자를 담은 비이커, 마이크로타이터 플레이트, 세포 배양 플라스크, 또는 마이크로어레이 등에 폴리뉴클레오티드를 배치하는 것을 포함한다. 또한, 접촉은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 담은 비이커, 마이크로타이터 플레이트, 세포 배양 플라스크, 또는 마이크로어레이 등에 항체를 배치하는 것을 포함한다. 접촉은 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 문구, "긴축 혼성화 조건" 또는 "긴축 조건"은 프로프, 프라이머, 또는 올리고뉴클레오티드가 그것의 표적 서열과 혼성화하는 한편 다른 서열과는 최소한도로 혼성화하는 조건을 말한다. 긴축 조건은 서열에 의존하며, 환경이 상이하다면 상이할 것이다. 긴 서열은 고온에서 이들의 적합한 보체와 특이적으로 혼성화할 것이다. 일반적으로 긴축 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열의 열용융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보하는 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 표적 서열은 일반적으로 Tm에서 과잉 존재하므로, 프로브의 50%가 평형 상태에서 이들의 보체와 혼성화된다. 전형적으로, 긴축 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온(또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 30℃, 그리고 긴 프로프, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드에 대해서는 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 또한, 긴축 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "중간 긴축 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드가 그것의 표적 서열과 혼성화되는 한편, 다른 서열과는 제한된 수만 혼성화되는 조건을 말한다. 중간 조건은 서열에 의존하며, 환경이 상이하다면 상이할 것이다. 중간 조건은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 특히 Maniatis et al., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition (December 1989))에 설명된다.
본원에 설명된 핵산 조성물은, 예를 들어 생물학적 샘플(예를 들어, 인간 세포 추출물) 중의 mRNA 또는 이러한 샘플로부터 생산된 cDNA를 검출하기 위한 프로브로서 폴리펩티드를 생산하기 위해, 추가의 폴리뉴클레오티드 카피를 생성하기 위해, 리보자임 또는 올리고뉴클레오티드(단일-가닥 및 이중-가닥)를 생산하기 위해, 그리고 단일-가닥 DNA 프로브 또는 삼중-가닥 형성 올리고뉴클레오티드로서 사용될 수 있다. 본원에 설명된 프로브는, 예를 들어 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드가 샘플 중에 존재하는지 또는 부재하는지를 판정하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 암과 관련된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이들 항체는 진단상 방법, 예후를 짐작하는 방법 등에 유용하며, 이들은 본원에서 더 상세히 논의된 바와 같다. 또한, 폴리펩티드는 치료상 개입을 위한 표적으로서 유용하며, 이것은 본원에서 더 상세히 논의된 바와 같다. 또한, 본 발명의 항체는, 예를 들어 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법을 모두 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드를 정제, 검출 및 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플 중의 본 발명의 폴리펩티드의 수준을 정성 및 정량 측정하기 위한 면역분석에서 유용하다. 예를 들어, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)를 참조한다. 이들 및 다른 용도들이 하기 더 상세히 설명된다.
본원에서 사용된 용어, "조영제"는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 검출될 수 있는 본 발명의 항체, 소 분자 또는 프로브에 결합된 조성물을 말한다. 본원에서 사용된 용어, "유전자 발현의 증거"는 유전자가 발현된다는 어떤 측정가능한 표시를 말한다.
용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 항체 또는 폴리펩티드, 유전자, 및 기타 치료제와 같은 치료제의 투여를 위한 담체를 말한다. 이 용어는 스스로는 조성물을 받는 개체에 유해한 항체의 생산을 유도하지 않으며 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 어떤 제약학적 담체를 말한다. 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 덩어리 및 비활성 바이러스 입자와 같은 서서히 대사되는 대형 거대분자일 수 있다. 이러한 담체들은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 치료 조성물 중의 제약학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질도 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료가능한 암의 특정 예로는, 제한되지는 않지만, AMIGO-2-관련 암들이 있다. 본원에서 사용된 용어, "AMIGO-2-관련 암"은 비-암성 세포에 비해 AMIGO-2를 차등 발현하는 세포를 특징으로 하는 암을 말한다. 또한, 본 발명은 AMIGO-2가 특히 염색체 안정성, 키나제 활성, 종양형성능, 전이, 신호화, 세포 유착, 세포사멸, 기질 인산화, 세포 성장, 종양 형성, 사이클린 생산, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 성장, 암세포 생존, 비부착 성장, 및 혈관형성, 세포 이주, 세포-세포 상호작용에서 어떤 역할을 하는 어떤 종양 세포-타입에라도 이용할 수 있다.
어떤 구체예에서, 암은 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암, 또는 췌장암이거나, 또는 암의 전이이다. 어떤 구체예에서, 암은 폐암 또는 결장암이다. 어떤 구체예에서, 암은 위암 이외의 다른 암이다. 어떤 구체예에서, 이러한 암은 대조군과 비교하여 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300%의 AMIGO-2의 차등 발현을 나타낸다.
본 발명은 AMIGO-2 과발현에 관련된 질환 및 장애의 치료, 억제, 및 관리뿐만 아니라 이러한 질환 및 장애의 증상에 관한 치료, 억제, 및 관리를 제공하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예는, 제한되지는 않지만 암 전이, 암세포 생존, 암세포 증식, 암세포 성장, 세포 주기 조절, 혈관형성 및 암세포 침입을 포함하여, 암을 치료, 억제 또는 관리하는 조성물을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 AMIGO-2 조정제와 다른 활성 성분을 조합하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 환자에게 하나 이상의 종래 암치료제를 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 화학요법, 방사선요법 또는 수술 중 한 가지 이상에 의해 환자를 치료하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 수술, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 및 생물학적 요법과 같은 현행 또는 표준 암치료로는 부분적으로 또는 완전히 치료될 수 없는 암 또는 다른 과다증식성 세포 장애 또는 질환의 치료, 억제, 및 관리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 암을 진단하고 및/또는 암의 진행을 예측하기 위한 본 발명의 AMIGO-2 조정제, 특히 AMIGO-2 항체를 이용하는 진단 및/또는 조영 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 종양 및/또는 전이를 조영 및 국소화하는 방법, 및 진단 및 예측하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 AMIGO-2-관련 치료요법의 적합성 및/또는 유효성을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
AMIGO -2 조정제
본 발명은 특히 암의 치료, 진단, 검출 또는 조영을 위한 AMIGO-2 조정제를 제공한다. AMIGO-2 조정제는 또한 암치료 의약의 제조에 유용하다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2 억제제이다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 뉴클레오티드, 소 분자, 의태체, 유인체 또는 항체이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA); SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군에서 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드; 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군에서 선택된 AMIGO-2의 도메인 내 에피토프와 결합하는 항체; 소 분자; 의태체; 가용성 수용체; 또는 유인체이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2의 도메인 내 에피토프와 결합하는 항체는 AMIGO-2 이외의 다른 폴리펩티드와는 특이적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 항체 단편은 AMIGO-1 또는 AMIGO-3와 특이적으로 결합하지 않는다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 대조군과 비교하여 AMIGO-2 활성을 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 억제한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 대조군과 비교하여 LIV-1 발현을 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 억제한다.
항체
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 또는 Fab 단편이다. 항체 또는 Fab 단편은, 예를 들어 효소, 방사선 동위원소 또는 형광단으로 표지될 수 있다. 어떤 구체예에서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2 이외의 다른 폴리펩티드와는 특이적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-1 또는 AMIGO-3와는 특이적으로 결합하지 않는다. 어떤 구체예에서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2 이외의 다른 폴리펩티드에 대해 약 1x105 Ka 미만의 결합 친화성을 가진다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 적어도 1x108 Ka의 친화성으로 AMIGO-2와 결합하는 단클론 항체이다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 면역분석을 이용하여 경쟁 결합을 측정하기 위한 어떤 공지의 방법에 의해 측정했을 때 본 발명의 항체와 에피토프의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 어떤 구체예에서, 항체는 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 에피토프와의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
어떤 구체예에서, 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는, 예를 들어 (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 비-인상 상보성 결정 영역(CDR)을 접목하는 방법("인간화" 과정)이나 또는 (2) 표면 잔기를 치환함으로써 인간-유사 표면으로 덮인 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하는 방법("비니어링"(veneering) 과정)을 포함하는 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에서 인간화 항체는 "인간화된" 항체와 "비니어링" 항체를 모두 포함할 것이다. 유사하게, 인간 항체는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 만들 수 있다. 시험감염시 인간 항체 생산이 관찰되며, 이것은 유전자 재배열, 회합, 및 항체 목록을 포함한 모든 면에서 인간에서 보이는 것과 매우 유사하다. 이 접근법은, 예를 들어 미국특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 및 다음 과학서적들 Marks et al., Bio/Technology 10:779-783(1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995); Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morr-ison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3):169-217 (1994); 그리고 Kettleborough C. A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)에 설명되며, 이들은 각각 본원에 참고자료로 포함된다.
본 발명의 항체는 상이한 메커니즘을 통해 기능할 수 있다. 어떤 구체예에서, 항체는 항체-표적화 세포에 대한 세포용해성 공격인 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 촉발시킨다. 어떤 구체예에서, 항체는, 예를 들어 항원-결합, 세포사멸 유도 및 보체-의존성 세포 세포독성(CDC)을 포함하는 복합적인 치료 기능을 가진다. 어떤 구체예에서, 항체는 독소 또는 방사선 핵종과 콘쥬게이트된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 길항제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와의 수용체/리간드 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 파괴하는 항체를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 에피토프 또는 그것의 부분과 결합한다. 어떤 구체예에서, 항체 부재시의 활성과 비교하여 리간드 활성 또는 수용체 활성을 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 조정하는 항체가 제공된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 중화 항체를 제공한다. 중화 항체는 바이러스나 박테리아, 예를 들어 암과 관련된 바이러스나 박테리아(예를 들어, JC 폴리오마 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 또는 헬리코박터 파일로리)와 같은 감염원과 결합한다. 어떤 구체예에서, 중화 항체는 수용체 길항제로서 효과적으로 작용할 수 있는데, 즉 리간드-매개 수용체 활성화의 생물학적 활성의 전부 또는 일부분을 억제한다. 어떤 구체예에서, 항체는 본원에 개시된 본 발명의 펩티드의 특정한 생물학적 활성들을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작용제, 길항제 또는 역 작용제로서 특정될 수 있다.
어떤 구체예에서, 항체는 특히 염색체 안정성, 키나제 활성, 종양형성능, 전이, 신호화, 세포 유착, 세포 세포사멸, 기질 인산화, 암세포 성장, 종양 형성, 사이클린 생산, 세포 증식, 세포 주기를 통한 진행(예를 들어, 세포 주기의 G2/M 기로의 진행), 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-2 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 AMIGO-2 활성을 억제한다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 항체는 활성화된 EGFR 및 돌연변이된 베타-카테닌에 의해 매개되는 것들과 같은 성장 및 생존 경로를 억제한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 항체는 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, c-Jun, FosL1, 세포외 신호-조절 키나제(ERK); 혈관내피 성장인자(VEGF), 유로키나제, 및 폴리(ADP-리보스)중합효소 1(PARP1) 중 하나 이상을 억제한다(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현을 억제한다). 또한, VEGF 및 유로키나제의 조절은 혈관형성에 있어서의 AMIGO-2의 역할을 시사한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 항체는 암세포 운동성을 조정하며, 암 전이에 영향을 미친다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 항체는 조기 발현 유전자(immediate early genes)를 포함하여 조기 발현 유전자 및 경로를 조절한다. 예를 들어, AMIGO-2 항체는 cFosL1, E2F1, ELK1, JNK, MEKK, SAPK1 p38, 사이클린 D, c-Jun, c-fos, c-myc, JE, KC, junB, 및 BTG2 및 관련된 경로들 중 하나 이상을 조절한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물들과 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드와 재조합 융합되거나, 또는 폴리펩티드나 다른 조성물들과 화학적으로 콘쥬게이트될 수 있다(공유 및 비-공유 콘쥬게이션을 포함). 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사선 핵종 또는 독소와 같은 이펙터 분자와 재조합 융합되거나 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 92/ 08495, WO 91/14438, WO 89/12624, 미국특허 제5,314,995호, 및 EP 제396,387호를 참조한다.
키메라 항체 및 인간화된 항체에 더하여, 완전한 인간 항체가 인간 면역글로불린 유전자를 가진 트랜스제닉 마우스로부터(예를 들어, 모두 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,075,181호, 제6,091,001호 및 제6,114,598호 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자의 파지 디스플레이 라이브러리로부터(예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991), 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) 참조). 어떤 구체예에서, 항체는 scFv-파지 디스플레이 라이브러리에 의해 생산 및 확인될 수 있다. 항체 파지 디스플레이 기술은 Morphosys와 같은 상업적 출처로부터 입수가능하다.
단클론 항체는 Kohler et al., (1975) Nature 256:495-496의 방법, 또는 이 방법의 변형 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 전형적으로 항원 함유 용액으로 마우스를 면역화한다. 식염수에, 어떤 구체예에서 프레운드 완전 애쥬번트(Freund's complete adjuvant)와 같은 애쥬번트에 항원-함유 용액을 혼합하거나 유화한 다음 혼합물 또는 에멀젼을 비경구 주사함으로써 면역화가 수행될 수 있다. 본 분야에 공지된 모든 면역화 방법이 본 발명의 단클론 항체를 획득하기 위해 사용될 수 있다. 동물 면역화 후, 비장(그리고 선택적으로 몇 개의 큰 림프절)을 제거하고 단일 세포로 해리한다. 관심의 항원을 코팅한 플레이트 또는 웰에 세포 현탁액을 도포함으로써 비장 세포를 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 B 세포 발현 막 결합 면역글로불린은 플레이트에 결합되어 씻겨나가지 않는다. 다음에, 결과의 B 세포, 또는 모든 해리된 비장 세포를 골수종 세포와 융합되도록 유도하여 하이브리도마를 형성하고, 선택적 배지에서 배양한다. 결과의 세포를 연속 또는 제한 희석에 의해 평판하고, 관심의 항원에 특이적으로 결합하는(그리고 관련 없는 항원과는 결합하지 않는) 항체의 생산에 대해 분석한다. 다음에, 선택된 단클론 항체(mAb)-분비 하이브리도마를 시험관내(예를 들어, 조직 배양병 또는 중공 섬유 반응기에서), 또는 생체내(마우스에서 복수로서) 배양한다.
하이브리도마 사용 발현의 대안으로서, 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,545,403호, 제5,545,405호 및 제5,998,144호에 개시된 대로, CHO 또는 골수종 셀라인과 같은 셀라인에서 항체가 생산될 수 있다. 간단히 말해서, 각각 경쇄 및 중쇄를 발현할 수 있는 벡터로 셀라인을 트랜스펙션한다. 별도의 벡터 상에서 두 단백질을 트랜스펙션함으로써 키메라 항체가 생산될 수 있다. 모두 본원 참고자료로 포함되는 Immunol. 147:8; Banchereau et al.,(1991) Clin. Immunol. Spectrum. 3:8; 및 Banchereau et al., (1991) Science 251:70을 참조한다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 등의 본 분야에 공지된 기술에 의해 생산될 수도 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). 또한, 인간 단클론 항체의 제조에 Cole 등과 Boerner 등의 기술이 이용가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)). 인간화된 항체는, 예를 들어 (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 비-인상 상보성 결정 영역(CDR)을 접목하는 방법("인간화" 과정)이나, 또는 (2) 표면 잔기를 치환함으로써 인간-유사 표면으로 "덮인" 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하는 방법("비니어링"(veneering) 과정)을 포함하는 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에서, 인간화 항체는 "인간화된" 항체 및 "비니어링" 항체를 모두 포함할 것이다. 유사하게, 인간 항체는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 만들 수 있다. 시험감염시 인간 항체 생산이 관찰되며, 이것은 유전자 재배열, 회합, 및 항체 목록을 포함한 모든 면에서 인간에서 보이는 것과 매우 유사하다. 이 접근법은, 예를 들어 미국특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 다음 과학서적들 Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995); Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498(1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994); 그리고 Kettleborough C. A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)에 설명되며, 이들은 각각 본원에 참고자료로 포함된다. 완전히 인간화된 항체는 Morphosys(Martinsned/Planegg, 독일)와 같은 상업적 출처를 이용하여 스크리닝 분석에서 확인될 수 있다.
또한, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 동물을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, WO 98/24893은 인간 Ig 유전자좌를 가진 트랜스제닉 동물을 개시하는데, 이 동물은 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 불활성화로 인해 기능적 내인성 면역글로불린을 생산하지 못한다. 또한, WO 91/10741은 면역원에 대한 면역반응을 개시할 수 있는 트랜스제닉 비-영장류 포유류 숙주를 개시하는데, 이때 항체는 영장류 불변 및/또는 가변 영역을 가지며, 내인성 면역글로불린-암호화 유전자좌는 치환되거나 또는 불활성화된다. WO 96/30498은 Cre/Lox 시스템을 이용하여 포유류에서 면역글로불린 유전자좌를 변형하는 것, 예를 들어 불변 또는 가변 영역의 전체 또는 일부분을 치환하여 변형된 항체 분자를 형성하는 것을 개시한다. WO 94/02602는 불활성화된 내인성 Ig 유전자좌와 기능적 인간 Ig 유전자좌를 가진 비-인간 포유류 숙주를 개시한다. 또한, 미국특허 제5,939,598호는 내인성 중쇄는 결여되고, 하나 이상의 이종개체 불변 영역을 포함하는 외인성 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 제조 방법을 개시한다. 본 발명의 항체는 또 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,766,886호에 개시된 바와 같은 인간 유전조작 기술을 이용하여 생산될 수도 있다.
상기 설명된 트랜스제닉 동물을 이용하여 선택된 항원 분자에 대한 면역반응이 야기될 수 있으며, 동물로부터 항체-생산 세포를 제거하여 인간 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하는데 사용할 수 있다. 면역화 프로토콜, 애쥬번트 등은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 96/33735에 설명된 대로 트랜스제닉 마우스의 면역화에 사용된다. 단클론 항체는 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리학적 효과를 억제 또는 중화하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 항체는 Fang et al., (2005) Nat. Biotechnol. 23:584-590에 설명된 대로 치료상의 생체내 항체 유전자 전달을 통하여 피험자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Mab 중쇄 암호화 서열과 Mab 경쇄 암호화 서열 사이에 위치한 폴리펩티드의 효소 독립적, 동시-번역 자체 절단을 매개하는 펩티드를 포함하는 다중시스트론(multicistronic) 발현 카세트를 송달하기 위한 재조합 벡터가 생성될 수 있다. 발현에 의해 두 Mab 사슬 모두가 화학량론적 양으로 생산된다. 어떤 구체예에서, 효소 독립적, 동시-번역 자체 절단을 매개하는 펩티드는 구제역 유래 2A 펩티드이다.
전장 항체의 바람직한 친화성을 보유하는 한 항체의 단편도 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 따라서, 항-AMIGO-2 항체의 단편은 AMIGO-2와 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편들은 상응하는 전장 항-AMIGO-2 항체와 유사한 특성을 특징으로 하는데, 즉 단편들은 인간 세포의 표면에서 발현되는 인간 AMIGO-2 항원과 특이적으로 결합할 것이다.
어떤 구체예에서, 항체는 AMIGO-2의 세포외 도메인에 있는 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 어떤 구체예에서, 항체는 하나 이상의 AMIGO-2-관련 생물학적 활성을 조정한다. 어떤 구체예에서, 항체는 특히 키나제 활성, 종양형성능, 전이, AMIGO-2 신호화, AMIGO-2-매개 세포 유착, 암세포 세포사멸, ERK 인산화, 세포 성장, 종양 형성, 사이클린 생산, 세포 증식, 세포 주기를 통한 진행, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 및 혈관형성 중 하나 이상을 억제한다.
어떤 구체예에서, 항체는 AMIGO-2의 신호 펩티드 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, Ig V-set 도메인, Ig 도메인, LRRCT 도메인 및 LRRNT 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 도메인 내의 하나 이상의 AMIGO-2 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. AMIGO-2의 신호 펩티드 도메인은 SEQ ID NO:2의 대략 아미노산 1-33이고; LRR-N-말단(LRRNT) 도메인은 SEQ ID NO:2의 대략 아미노산 41-60이고; LRR1 도메인은 SEQ ID NO:2의 대략 아미노산 69-92이고; LRR2 도메인은 대략 아미노산 94-116이고; LRR3 도메인은 대략 아미노산 118-140이고, LRR4 도메인은 대략 아미노산 142-164이고; LRR5 도메인은 대략 167-191이고; LRR6 도메인은 대략 아미노산 193-216이고; LRR-C-말단(LRRCT) 도메인은 대략 아미노산 222-282이고; Ig V-set 도메인은 대략 아미노산 293-388이고; Ig 도메인은 V-set 도메인 내에 있으며 대략 아미노산 303-365이다. 어떤 구체예에서, 항체는 AMIGO-2의 신호 펩티드 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 AMIGO-2 에피토프가 아닌 에피토프와는 특이적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 한 구체예에서, 항체는 AMIGO-1 에피토프 또는 AMIGO-3 에피토프와 특이적으로 결합하지 않는다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRRNT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR1 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR1 에피토프는 SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:57로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR2 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR2 에피토프는 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:61로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR3 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR3 에피토프는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:58로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR4 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR4 에피토프는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:45로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR5 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR5 에피토프는 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:36 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRR6 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRR6 에피토프는 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 LRRCT 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, LRRCT 에피토프는 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 Ig V-set 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 Ig 도메인의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2의 세포외 도메인(ECD) 내의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 SEQ ID NO:3으로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다.
본 발명에 따른 적합한 항체는 선형 에피토프나 입체형태형 에피토프, 또는 이들의 조합을 인식할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 항원 영역의 에피토프와 결합한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 SEQ ID NO:3로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 Fab 단편이다. 어떤 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:3로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 가진 에피토프에 대해 특이적이다.
반드시 이들 펩티드가 정확히 하나의 에피토프의 지도를 만들 수 있는 것은 아니며, 면역원성이 아닌 AMIGO-2 서열을 함유할 수도 있다.
본 발명의 항체가 결합할 수 있는 다른 잠재적 에피토프를 예측하는 방법들이 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 제한되지는 않지만, 예를 들어 Kyte-Doohttle 분석(Kyte J. and Dohttle R. F., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132), Hopp and Woods 분석(Hopp T. P. and Woods K. R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78:3824-3828; Hopp T. J. and Woods K. R., Mol. Immunol. (1983) 20:483-489; Hopp T. J., J. Immunol. Methods (1986) 88:1-18), Jameson-Wolf 분석(Jameson B. A. and Wolf H., Comput. Appl. Biosci. (1988) 4:181-186), 및 Emini 분석(Emimi E. A., Schlief W. A, Colonno R. J. and Wimmer E., Virology (1985) 140:13-20)가 있다. 어떤 구체예에서, 잠재적 에피토프는 이론적 세포외 도메인을 결정함으로써 확인된다. TMpred(K. Hofmann & W. Stoffel (1993) TMbase - A database of membrane spanning proteins segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166) 또는 TMHMM(A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne and E. L. L. Sonnhammer, Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes Journal of Molecular Biology, 305(3):567-580, January 2001)와 같은 분석 알고리즘을 사용하여 이러한 예측을 수행할 수도 있다. 다른 알고리즘, 예를 들어 SignalP 3.0(Bednsten et al., (2004) J. Mol. Biol. 2004 Jul. 16, 340(4):783-95)을 사용하여 신호 펩티드의 존재를 예측하고, 전장 단백질로부터 이들 펩티드가 어디서 절단될 것인지를 예측할 수 있다. 세포 바깥쪽에 있는 단백질 부분이 항체 상호작용의 표적으로서 사용될 수 있다.
1) 역치 수준의 결합 활성을 나타내고, 및/또는 2) 공지된 관련 폴리펩티드 분자와 현저한 교차반응을 나타내지 않을 경우, 항체는 "특이적으로 결합한다"라고 정의된다. 항체의 결합 친화성은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 예를 들어 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)에 의해 결정될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO 패밀리의 다른 공지된 구성원들(예를 들어, AMIGO-1 및 AMIGO-3)에 비하여 표적 암-관련 폴리펩티드에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 또는 그 이상으로 그들의 표적 에피토프 또는 의태 유인체와 결합한다.
어떤 구체예에서, 항체는 10-4 M 이하, 10-7 M 이하, 10-9 M 이하의 높은 친화성으로 또는 나노몰 이하 친화성(0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM 또는 그 이하)으로 결합한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2에 대한 항체의 결합 친화성은 적어도 1x106 Ka이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2에 대한 항체의 결합 친화성은 적어도 5x106 Ka, 적어도 1x107 Ka, 적어도 2x107 Ka, 적어도 1x108 Ka, 또는 그 이상이다. 본 발명의 항체는 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 친화성에 관하여 설명되거나 특정될 수 있다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 1O-9 M, 5x1O-10 M, 1O-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x1O-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, 또는 10-15 M 또는 그 이하의 Kd를 가진 것들을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 이들이 표준 웨스턴 블롯 분석(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994)에서 AMIGO-2 폴리펩티드와 결합하지만 공지된 관련 폴리펩티드와는 결합하지 않을 경우, 공지된 관련 폴리펩티드 분자와 결합하지 않는 것이다. 공지된 관련 폴리펩티드의 예로는, 제한되지는 않지만, AMIGO 패밀리의 다른 구성원들(예를 들어, AMIGO-1 및 AMIGO-3)이 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 오르토로그(ortholog), 호모로그, 파라로그(paralog) 또는 변이체, 또는 이들의 조합 및 아조합과 결합한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 오르토로그와 결합한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 호모로그와 결합한다. AMIGO-2의 호모로그는 AMIGO-1 및 AMIGO-3을 포함하는 공지된 AMIGO-2-관련 단백질을 말한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 파라로그와 결합한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 변이체와 결합한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 AMIGO-2의 오르토로그, 호모로그, 파라로그 또는 변이체, 또는 이들의 조합 및 아조합과 결합하지 않는다.
어떤 구체예에서, 항체는 AMIGO-2 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 개체군을 분리하기 위해 공지된 관련 폴리펩티드에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 인간 AMIGO-2 폴리펩티드에 특이적인 항체를 적합한 버퍼 조건 하에서 불용성 바탕질에 부착된 AMIGO 단백질(AMIGO-2를 제외하고)을 포함하는 칼럼을 통해 흘려 보낸다. 이러한 스크리닝에 의해 근친 관련된 폴리펩티드에 비-교차반응성인 다클론 및 단클론 항체가 분리된다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특정 항체의 스크리닝 및 분리는 본 분야에 잘 공지되어 있다(Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Goding J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984). 이러한 분석의 대표적 예로는 동시 면역전기영동, 방사선 면역분석(RIA), 방사선 면역침전, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 및 샌드위치 분석이 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO:63(AMIGO-1) 및 SEQ ID NO:64 (AMIGO-3)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 내의 에피토프와 특이적으로 결합하지 않는다. 어떤 구체예에서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-1 또는 AMIGO-3와 교차반응하지 않는다.
또한, 본 발명은 표적 단백질에 대해 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체를 제공한다. 이들 구성체는 항체 이펙터 기능을 수행하는데 필수적인 면역글로불린 도메인과 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드이다. 예를 들어, WO 03/041600, 미국특허 공보 제20030118592호를 참조한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 중화 항체이다. 어떤 구체예에서, 항체는 표적화 항체이다. 어떤 구체예에서, 항체는 표적과의 결합시에 중화된다. 어떤 구체예에서, 항체는 표적과의 결합시에 중화되지 않으며 표면에 잔류한다.
어떤 구체예에서, 중화 항체는 어떤 이펙터 기능을 갖지 않을 것이다. 또는 달리, 중화 항체는 이펙터 기능을 가질 수도 있다.
본 발명의 항체는 해당 종양 세포 항원과의 결합시에 신속히 내재화되는 능력에 대해서, 또는 결합 후 세포 표면에 잔류하는 능력에 대해서 스크리닝될 수 있다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 어떤 타입의 면역콘쥬게이트를 구성하는데 있어서, 독소 부분을 방출하는데 내재화가 필요한 경우, 항체의 내재화 능력이 바람직할 수 있다. 또는 달리, 항체가 ADCC 또는 CDC를 촉진하는데 사용될 예정이라면, 항체는 세포 표면에 잔류되는 것이 더 바람직할 수 있다. 스크리닝 방법을 사용하여 거동의 타입을 분류할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 항원 보유 세포가 사용될 수 있으며, 이 세포를 인간 IgG1(대조군 항체) 또는 본 발명의 항체 중 하나와 함께 약 1 ㎍/mL의 농도로 얼음(내재화를 차단하기 위해 0.1% 나트륨 아지드와 함께)에서 또는 37℃(나트륨 아지드 없이)에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 다음에, 세포를 차가운 염색 버퍼(PBS + 1% BSA + 0.1% 나트륨 아지드)로 세척하고, 염소 항-인간 IgG-FITC로 30분 동안 얼음에서 염색한다. FACS 칼리버로 기하 평균 형광 강도(MFI)를 기록한다. 나트륨 아지드의 존재하에 얼음에서 본 발명의 항체와 함께 인큐베이션된 세포와 나트륨 아지드 없이 37℃에서 인큐베이션된 세포에서 MFI의 차이가 관찰되지 않는다면, 이 항체는 내재화되기 보다는 세포 표면에 결합되어 잔류한 항체인 것으로 짐작된다. 그러나 나트륨 아지드 없이 37℃에서 세포를 인큐베이션했을 때 표면 염색성 항체의 감소가 발견된다면, 이 항체는 내재화가 가능한 항체인 것으로 짐작된다.
항체 콘쥬게이트
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 콘쥬게이트된다. 어떤 구체예에서, 콘쥬게이트된 항체는 암 치료, 암 진단, 또는 암성 세포의 조영에 유용하다.
진단 용도에서 항체는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지될 것이다. 많은 표지가 이용가능하며, 이들은 일반적으로 다음 범주로 분류될 수 있다:
(a) 하기 논의된 것들과 같은 방사선 핵종. 예를 들어, Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)에 설명된 기술을 이용하여 항체가 방사선 동위원소로 표지될 수 있으며, 섬광계수기를 이용하여 방사선 활성이 측정될 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인과 그 유도체, 로다민과 그 유도체, 단실(dansyl), 리사민(Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드(Taxas Red)와 같은 형광 표지가 이용될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Immunology(상동)에 설명된 기술을 이용하여 항체에 형광 표지가 콘쥬게이트될 수 있다. 형광분석기를 이용하여 형광이 정량될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용될 수 있으며, 미국특허 제4,275,149호에 이들 중 일부에 대해 고찰되어 있다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변화를 촉매하며, 이것은 여러 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있고, 이것은 분광광도기에 의해 측정될 수 있다. 또는 달리, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 설명되었다. 화학발광 기질이 화학 반응에 의해서 전자적으로 여기되어 측정가능한(예를 들어, 화학발광분석기에 의해서) 빛을 방출하거나, 또는 형광 어셉터에 에너지를 제공한다. 효소 표지의 예로는 루시페라제(예를 들어, 개똥벌레 루시페라제 및 박테리아 루시페라제, 미국특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 유레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당 산화효소(예를 들어, 글루코오스 산화효소, 갈락토오스 산화효소 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로고리 산화효소(예를 들어, 요산분해효소 및 크산틴 산화효소), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 효소와 항체를 콘쥬게이션하는 기술은 O'Sulhvan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)에 설명된다.
또한, 항체는 생체내 진단 분석에 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 항체를 방사선 핵종으로 표지하고, 면역섬광조영술을 이용하여 종양을 국소화할 수 있다. 편리함에 관한 문제로서, 본 발명의 항체는 키트 내에 제공될 수 있는데, 즉 정해진 양의 시약과 진단 분석 수행을 위한 지침서를 함께 패키지로 만들어 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 필요한 기질 및 보조인자를 포함할 수 있다(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체). 이에 더하여, 안정제, 버퍼(예를 들어, 차단 버퍼 또는 세포용해 버퍼) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석 감도를 실질적으로 최적화하는 용액 중 시약 농도가 제공되도록 광범위하게 바뀔 수 있다. 특히, 용해시 적합한 농도의 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하여, 시약들은 건조 분말로서, 통상 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다.
어떤 구체예에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신(maytansine) 분자에 콘쥬게이트된다(예를 들어, 항체 분자 1개 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자). 메이탄신은, 예를 들어 May-SS-Me로 전환될 수 있고, 이것이 May-SH3로 환원되어 변형된 항체와 반응하고(Chan et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)), 이로써 메이탄시노이드-항체 면역콘쥬게이트가 생성된다. 어떤 구체예에서, 이 콘쥬게이트는 약 10-11 M(예를 들어, Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212 참조)의 IC50을 갖는 매우 효능 있는 메이탄신 유도체 DM1((N2'-데아세틸-N2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)메이탄신)(예를 들어, 2002년 12월 12일자 공개된 WO 02/098883 참조) 또는 DM4(N2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)메이산틴)(예를 들어, 2004년 12월 2일자 공개된 WO 2004/103272 참조)이다.
어떤 구체예에서, 항체 콘쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신(calicheami-cin) 분자에 콘쥬게이트된 항-종양 세포 항원 항체를 포함한다. 칼리케아미신 항생제 패밀리는 피코몰 이하 농도로 이중-가닥 DNA 손상부분(break)을 생산할 수 있다. 칼리케아미신의 사용가능한 구조적 유사체로는, 제한되지는 않지만, 감마1I, 알파2I, 알파3I, N-아세틸-감마1I, PSAG 및 세타I1이 있다(Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)). 또한, 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,714,586호, 제5,712,374호, 제5,264,586호 및 제5,773,001호를 참조한다.
어떤 구체예에서, 항체는 많은 암에서 과잉 생산되는 효소에 의해 그것의 활성 형태로 방출될 수 있는 전구약물(prodrug)에 콘쥬게이트된다. 예를 들어, 항체 콘쥬게이트가 독소루비신의 전구약물 형태를 사용하여 제조될 수 있으며, 플라스민에 의해 콘쥬게이트로부터 활성 성분이 방출된다. 플라스민은 많은 암성 조직에서 과잉 생산되는 것으로 알려져 있다(Decy et al., (2004) FASEB Journal 18(3):565-567 참조).
어떤 구체예에서, 항체는 효소 활성 독소 및 그것의 단편에 콘쥬게이트된다. 어떤 구체예에서, 독소는, 제한되지는 않지만, 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 아레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 리보뉴클레아제(Rnase), 데옥시리보뉴클레아제(Dnase), 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신, 및 트리코테신을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 어떤 구체예에서, 독소는 낮은 고유 면역원성 및 암성 세포가 독소에 내성을 가질 기회를 감소시키는 작용 메커니즘(예를 들어, 세포독성 메커니즘 대 세포증식억제 메커니즘)을 가진다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체와 면역조정제 사이에 콘쥬게이트가 만들어진다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이들 분자는 항원-특이적 항체 반응을 도출할 수 있는 효능 있는 면역원이다(Datta et al., (2003) Ann. N. Y. Acad. Sci. 1002:105-111 참조). 추가의 면역조정성 화합물은 "S1 인자"와 같은 줄기세포 성장인자, 종양괴사인자(TNF)와 같은 림프독소, 인터류킨과 같은 조혈인자, 과립구-콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-자극인자(GM-CSF)와 같은 콜로니 자극인자(CSF), 인터페론 알파, 베타 또는 감마와 같은 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴, 및 트롬보포이에틴을 포함한다.
어떤 구체예에서, 방사선 콘쥬게이트된 항체가 제공된다. 어떤 구체예에서, 이러한 항체는 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 161Th, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211Pb, 212Pb, 213Bi, 58Co, 67Ga, 8OmBr, 99mTc, 103mRh, 109Pt, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 152Dy, 211At, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 225Ac, 221Fr, 217At, 213Bi, 255Fm 및 이들의 조합 및 아조합을 사용하여 제조될 수 있다. 어떤 구체예에서, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자가 항체에 콘쥬게이트된다. 어떤 구체예에서, 붕소 원자는 10B이고, 가돌리늄 원자는 157Gd이고, 우라늄 원자는 235U이다.
어떤 구체예에서, 방사선 핵종 콘쥬게이트는 20 내지 10,000 keV의 에너지를 가진 방사선 핵종을 가진다. 방사선 핵종은 1000 keV 미만의 에너지를 가진 Auger 방사체, 20 내지 5000 keV의 에너지를 가진 P 방사체, 또는 2000 내지 10,000 keV의 에너지를 가진 알파 또는 'a' 방사체이다.
어떤 구체예에서, 감마-, 베타-, 또는 양전자-방출 동위원소인 방사선 핵종을 포함하는 진단용 방사선 콘쥬게이트가 제공된다. 어떤 구체예에서, 방사선 핵종은 20 내지 10,000 keV의 에너지를 가진다. 어떤 구체예에서, 방사선 핵종은 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 89Zr, 94mTc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 114mIn, 123I, 125I, 13Li 및 197Hg로 구성되는 군으로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 광활성제 또는 조영제인 진단제에 콘쥬게이트된다. 광활성 화합물은 크로마겐(chromagen) 또는 염료와 같은 화합물을 포함할 수 있다. 조영제는, 예를 들어 상자성체 이온일 수 있으며, 이 이온은 크로뮴(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴 (III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)의 군에서 선택된 금속을 포함한다. 조영제는 또한 x-선 기술 또는 컴퓨터 단층촬영에 사용되는 방사선-비투과성 화합물일 수 있으며, 예를 들어 요오드, 인듐, 바륨, 갈륨 및 탈륨 화합물이다. 방사선-비투과성 화합물은 바륨, 디아트리조에이트, 에티오드화 오일(ethiodized oil), 갈륨 시트레이트, 이오캄산, 이오세탐산, 이오다미드, 이오디파미드, 이오독삼산, 이오굴아미드, 이오헥솔, 이오파미돌, 이오판산, 이오프로셈산, 이오세팜산, 이오세르산, 이오술라미드 메글루민, 이오세메트산, 이오타술, 이오테트르산, 이오탈람산, 이오트록스산, 이옥사글산, 이옥소트리조산, 이포데이트, 메글루민, 메트리자미드, 메트리조에이트, 프로필리오돈 및 염화탈루스의 군에서 선택될 수 있다. 어떤 구체예에서, 진단용 면역콘쥬게이트는 본 발명의 항체에 콘쥬게이트된 기체 충전 리포솜과 같은 초음파-강화제를 함유할 수 있다. 진단용 면역콘쥬게이트는, 제한되지는 않지만, 수술중에, 내시경 또는 종양 또는 암 진단 및 검출의 혈관내 방법을 포함하는 여러 과정에 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, 항체 콘쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 제조된다. 예를 들어, Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 설명된 대로 리신 면역독소가 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 방사선 뉴클레오티드와 항체의 콘쥬게이션을 위한 전형적인 킬레이트제이다(WO 94/11026를 참조). 이 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가한능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커(Chan et al., Cancer Research 52:127-131 (1992))가 사용될 수 있다. 제제들이 탄수화물 부분을 통해 본 발명의 항체에 추가로 연결될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 어떤 구체예에서, 세포독성제와 콘쥬게이트된 항-종양 항원 항체를 포함하는 이러한 면역콘쥬게이트가 환자에게 투여된다. 어떤 구체예에서, 결합된 면역콘쥬게이트 및/또는 종양 세포 항원 단백질은 세포에 의해 내재화되며, 그 결과 결합된 암세포를 죽이는 면역콘쥬게이트의 치료적 효능을 증가시킨다. 어떤 구체예에서, 세포독성제는 암세포의 핵산을 표적으로 하거나 그것을 저해한다. 이러한 세포독성제의 예로는 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 있다.
어떤 구체예에서, 항체는 종양 예비-표적화(pre-targeting)에 활용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)에 콘쥬게이트되며, 이 경우 항체-수용체 콘쥬게이트를 환자에게 투여하고, 그 다음 청소제(clearing agent)를 사용하여 미결합 콘쥬게이트를 순환계로부터 제거한 후, 세포독성제(예를 들어, 방사선 뉴클레오티드)에 콘쥬게이트된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
어떤 구체예에서, 항체는 표적 세포 리소좀 내부에 방출되는 세포독성 분자와 콘쥬게이트된다. 예를 들어, 약물 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)가 발린-시트룰린 결합을 통해 콘쥬게이트될 수 있으며, 이것은 항체 콘쥬게이트의 내재화 후에 단백질 분해 리소좀 효소 카셉신(cathepsin) B에 의해서 절단될 것이다(예를 들어, 2003년 4월 3일자 공개된 WO 03/026577를 참조한다). 어떤 구체예에서, MMAE는 절단가능한 부분으로서 히드라존 작용기를 함유하는 산-불안정성 링커를 사용하여 항체에 부착될 수 있다(예를 들어, 2002년 11월 11일자 공개된 WO 02/088172를 참조한다)
항체 의존성 효소-매개 전구약물 치료요법( ADEPT )
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체와 전구약물(예를 들어, 펩티딜 화학치료제, WO 81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환하는 전구약물-활성화 효소를 콘쥬게이션함으로써 ADEPT에 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국특허 제4,975,278호 참조.
어떤 구체예에서, ADEPT에 유용한 면역콘쥬게이트의 효소 성분은 더욱 활성인 세포독성 형태로 전구약물을 전환하는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 모든 효소를 포함한다.
ADEPT에 유용한 효소로는, 제한되지는 않지만, 포스페이트-함유 전구약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신의 항암 약물인 5-플루오로우라실로의 전환에 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 써모리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카셉신(예를 들어, 카셉신 B 및 L); D-아미노산 치환체-함유 전구약물의 전환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물의 유리 약물로의 전환에 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 있다. 어떤 구체예에서, "아비짐"(abzyme)으로서 본 분야에 또한 공지된 효소 활성을 가진 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환할 수도 있다(예를 들어, Massey, Nature 328:457-458 (1987) 참조). 아비짐을 종양 세포 개체군에 송달하기 위해 항체-아비짐 콘쥬게이트가 본원에 설명된 대로 제조될 수 있다.
어떤 구체예에서, ADEPT 효소는 상기 논의된 이종이작용성 교차결합 시약의 사용 등, 본 분야에 잘 공지된 기술에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 분야에 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명의 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질이 구성될 수 있다(Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) 참조).
어떤 구체예에서, 세포독성 방식보다는 세포증식억제 방식으로 작용하는 항체의 확인은 처리된 표적 세포 배양물과 미처리 대조군 배양물의 생육능력을 측정하여 비교함으로써 달성될 수 있다. 생육능력은 CellTiter-Blue® Cell Viability Assay 또는 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(Promega, 각각 카탈로그 번호 G8080 및 G5750)와 같은 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 설명된 수단에 의해 측정했을 때 어떤 세포사의 증거 없이 대조군 배양물에 비해 처리군에서 세포수가 감소된다면 항체는 잠재적으로 세포증식억제성인 것으로 간주된다.
어떤 구체예에서, ADCC를 촉진하는 항체를 확인하기 위해 본 분야에 공지된 분석을 이용하여 시험관내 스크리닝 분석이 수행될 수 있다. 한 전형적인 분석은 바로 시험관내 ADCC 분석이다. 크로뮴 51-표지 표적 세포를 제조하기 위하여, 종양 셀라인을 조직 배양 플레이트에서 성장시키고 멸균된 PBS 중의 10 mM EDTA를 사용하여 수거한다. 분리된 세포를 세포 배양 배지로 2번 세척한다. 세포(5x106)를 37℃에서 1시간 동안 이따금 혼합하면서 200 μCi의 크로뮴 51로 표지한다. 표지된 세포를 세포 배양 배지로 3번 세척한 다음 1x105 세포/mL의 농도로 다시 현탁한다. 세포는 옵소닌화하지 않고 사용하거나 또는 세포를 옵소닌화한 후, PBMC 분석시에는 100 ng/mL 및 1.25 ng/mL의 그리고 NK 분석시에는 20 ng/mL 및 1ng/mL의 시험 항체와 함께 인큐베이션하여 분석한다. 건강한 정상 공여자로부터 헤파린 상에 혈액을 수집하고, 이것을 동 부피의 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 희석하여 말초혈액 단핵세포를 제조한다. 다음에, 혈액을 LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM®(LSM: Organon Teknika) 위에 층으로 만들고 제조자의 지시에 따라 원심분리한다. LSM-혈장 계면으로부터 단핵세포를 수집하고 PBS로 3번 세척한다. 이펙터 세포를 세포 배양 배지에 1x107 세포/mL의 최종 농도로 현탁한다. LSM을 통해서 정제한 후, 제조자의 지시에 따라 NK 세포 분리 키트와 자기 칼럼(Miltenyi Biotech)을 이용하여 음성 선택에 의해서 PMBC로부터 자연살상(NK) 세포를 분리한다. 분리된 NK 세포를 수집하고 세척한 후, 세포 배양 배지에 2x106 세포/mL의 농도로 다시 현탁한다. 유세포 분석으로 NK 세포의 정체를 확인한다. 마이크로타이터 플레이트의 줄을 따라 이펙터(PBMC 또는 NK) 세포를 세포 배양 배지로 2배 연속 희석(최종 부피 100 ㎕)하여 이펙터:표적 비를 변화시키면서 제조한다. 이펙터 세포의 농도는 PBMC에 대하여 1.0x107/mL 내지 2.0x104/mL이고 NK에 대하여 2.0x106/mL 내지 3.9x103/mL 범위이다. 이펙터 세포의 적정 후, 1x105 세포/mL의 크로뮴 51-표지 표적 세포(옵소닌화된 세포 또는 옵소닌화되지 않은 세포)를 100㎕씩 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 이로써 초기 이펙터:표적 비는 PBMC에 대해서 100:1, NK 세포에 대해서 20:1이 된다. 모든 분석은 중복 수행하며, 각 플레이트는 자발적 세포용해(이펙터 세포 없음) 및 총 세포용해(표적 세포 더하기 100 ㎕ 1% 나트륨도데실술페이트, 1N 수산화 나트륨)에 대한 대조군을 모두 함유한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후, 상청액 수집 시스템(Skatron Instrument, Inc.)을 사용하여 세포 배양 상청액을 수거하고, Minaxi 자동-감마 5000 시리즈 감마 계수기(Packard)에서 1분간 계수한다. 다음에, 결과를 다음 식을 사용하여 세포독성 퍼센트로서 나타낸다: 세포독성 % = (샘플 cpm - 자발적 세포용해)/(총 세포용해 - 자발적 세포용해) x 100.
CDC를 촉진하는 항체를 확인하기 위하여, 당업자는 본 분야에 공지된 분석을 수행할 수 있다. 한 전형적인 분석은 바로 시험관내 CDC 분석이다. 시험 항체 없이 또는 상이한 농도의 시험 항체의 존재하에 종양 세포 항원 발현 세포와 인간(또는 다른 출처) 보체-함유 혈청을 함께 인큐베이션함으로써 시험관내 CDC 활성이 측정될 수 있다. 다음에, ALAMAR BLUE®를 사용하여 살아 있는 세포를 정량함으로써 세포독성을 측정한다(Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163-171 (1997)). 대조군 분석은 항체 없이 수행하며, 항체를 사용할 경우 열 불활성화 혈청 및/또는 해당 종양 세포 항원을 발현하지 않는 세포를 사용한다. 대안으로서, 적혈구 세포를 종양 항원 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드로 코팅할 수 있으며, 다음에 적혈구 세포용해를 관찰함으로써 CDC를 측정할 수 있다(Karjalamen and Mantyjarvi, Acta. Pathol. Microbiol. Scand [C]. 1981 Oct; 89(5):315-9 참조).
세포사를 유도하는 항체를 선택하기 위하여, 예를 들어 PI, 트리판 불루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타나는 막 완전성의 손실이 대조군에 대하여 평가될 수 있다. 한 전형적인 분석은 바로 종양 항원-발현 세포를 사용하는 PI 흡수 분석이다. 이 분석에 따라서, 종양 세포 항원-발현 세포는 10% 열-불활성화된 FBS(Hyclone)과 2 mM L-글루타민으로 보충된 듈베코 변형 이글 배지(D-MEM):Ham's F-12(50:50)에서 배양된다(따라서, 이 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포 없이 수행된다). 종양 세포를 100 x 20 mm 디쉬에 디쉬 당 3x106의 밀도로 파종하고 하룻밤 부착시킨다. 다음에, 배지를 제거하고 신선한 배지만으로 또는 적합한 단클론 항체를 10 ㎍/mL를 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각 처리 후, 단일층을 PBS로 세척하고 트립신 처리하여 분리한다. 다음에, 세포를 4℃에서 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하고, 펠릿을 3 mL의 얼음 냉각한 Ca2+ 결합 버퍼(10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 다시 현탁한 다음 세포 덩어리를 제거하면서 35 mm 여과장치-마개가 있는 12 x 75 시험관에 나누어 담았다(시험관 당 1 mL, 처리군 당 3개 시험관). FACSCAN™ 유세포분석기와 FACSCONVERT™를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson). PI 흡수에 의해 측정했을 때 통계적으로 유의한 수준의 세포사를 유도하는 항체가 세포사-유도 항체로서 선택될 수 있다.
또한, 항체는 PET 조영제로서 18F-아넥신을 사용하여 세포사멸 활성에 대해 생체내 스크리닝될 수 있다. 이 과정에서 아넥신 V가 18F로 방사선 표지되어 조사 중인 항체를 투약받은 시험 동물에 제공된다. 세포사멸 과정에서 발생하는 최초의 사건 중 하나는 세포막의 내면으로부터 바깥 세포 표면으로 포스파티딜세린이 외번되는 것이며, 이때 이것이 아넥신에 접근할 수 있다. 다음에, 동물을 PET로 조영한다(Yagle et al., J. Nucl. Med.. 2005 Apr; 46(4):658-66). 또한, 동물을 죽여서 각 기관 또는 종양을 제거하여 표준 프로토콜에 따라 세포사멸 마커에 대해 분석한다.
어떤 구체예에서는 암이 유전자 발현 산물의 과발현을 특징으로 할 수 있지만, 본 출원은 또한 종양 항원-과발현 암으로 간주되지 않는 암을 치료하는 방법도 제공한다. 암에서 종양 항원 발현을 측정하기 위해 다양한 진단/예후 분석이 이용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 유전자 발현 산물 과발현은 IHC에 의해 분석될 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 포매 조직 절편이 IHC 분석되고, 다음과 같은 종양 항원 단백질 염색 강도 기준에 따라 나눌 수 있다:
0 점: 염색이 관찰되지 않거나 종양 세포의 10% 미만에서 막 염색이 관찰됨.
1+ 점: 종양 세포의 10% 이상에서 희미한/거의 알아챌 수 없는 막 염색이 검출됨.
2+ 점: 종양 세포의 10% 이상에서 약 내지 중의 완전한 막 염색이 관찰됨.
3+ 점: 종양 세포의 10% 이상에서 중 내지 강의 완전한 막 염색이 관찰됨.
어떤 구체예에서, 종양 항원 과발현 평가에서 0 점 또는 1+ 점을 받은 종양들은 종양 항원을 과발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있으며, 반면에 2+ 점 또는 3+ 점을 받은 종양들은 종양 항원을 과발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2는 정상 세포에 비해 암세포에서 현저히 상향-조절되지 않지만, AMIGO-2 발현에 대한 암세포와 정상 세포의 의존성에는 차이가 있다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정은 종양-간질 상호작용에 영향을 미친다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2의 억제는 종양-간질 상호작용을 조정한다.
대안으로서 또는 추가하여, 포르말린-고정, 파라핀-포매된 종양 조직에 대해 INFORM™(Ventana(아리조나)에 의해 판매) 또는 PATHVISION™(Vysis, III.)과 같은 FISH 분석을 수행하여 종양에서 종양 항원 과발현의 범위(만일 존재한다면)를 측정할 수 있다.
추가하여, 항체는, 예를 들어 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체와 공유 콘쥬게이션함으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 각 항체 분자는 하나 이상의(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상) 중합체 분자에 부착될 수 있다. 어떤 구체예에서, 중합체 분자는 링커 분자에 의해 항체에 부착된다. 중합체는 일반적으로 합성 중합체 또는 자연 발생 중합체일 수 있으며, 예를 들어 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분기쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분기 또는 미분기 다당, 예를 들어 호모- 또는 헤테로-다당일 수 있다. 어떤 구체예에서, 중합체는 폴리옥시에틸렌 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성으로서, 일반식 R(O-CH2-CH2)n O-R을 가지며, 여기서 R은 수소, 또는 알킬기 또는 알칸올기와 같은 보호기이다. 어떤 구체예에서, 보호기는 1 내지 8개 탄소를 가진다. 어떤 구체예에서, 보호기는 메틸이다. 기호 n은 1 내지 1,000 또는 2 내지 500의 양의 정수이다. 어떤 구체예에서, PEG는 1,000 내지 40,000; 2,000 내지 20,000; 또는 3,000 내지 12,000의 평균 분자량을 가진다. 어떤 구체예에서, PEG는 적어도 하나의 히드록시기를 가진다. 어떤 구체예에서, 히드록시는 말단 히드록시기이다. 어떤 구체예에서, 이 히드록시기는 억제제 상의 자유 아미노와 반응하여 활성화된다. 그러나 본 발명의 공유 콘쥬게이트된 PEG/항체를 달성하기 위해 반응성 기의 타입과 양은 바뀔 수 있다. 중합체, 및 중합체와 펩티드 부착 방법은 본원 참고자료로 포함되는 미국특허 제4,766,106호, 제4,179,337호, 제4,495,285호 및 제4,609,546호에 개시된다.
안전성 연구
본 발명의 항체는 안전성 및 독성학적 특성에 대해서 시험될 수 있다. 이런 종류의 연구에 대한 가이드라인은 USDA DBER에서 발행한 문헌 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use"(Docket No. 94D-0259, 1997년 2월 28일)에서 찾을 수 있으며, 이것은 본원 참고자료로 포함된다. 일반적으로 후보 항체를 다수의 인간 조직 샘플 및/또는 분리된 인간 세포 타입을 이용한 예비 임상 연구에서 스크리닝하여 비-표적 조직 결합 및 교차반응성을 평가해야 한다. 이들 인간 조직 연구로부터 만족할 만한 결과를 얻은 후, 다양한 동물 종들로부터의 조직 샘플 또는 분리된 세포의 패널을 스크리닝하여 일반 독성학 연구에 사용하기 적합한 종을 확인할 수 있다. 만일 교차반응 동물 종이 확인되지 않는다면, 다른 타입의 모델이 적합한 것으로 간주할 수 있다. 이들 다른 모델은 인간 종양 세포를 설치류 숙주에 이식하는 이종이식편 모델과 같은 연구, 또는 독성학 연구를 위해 선택된 동물 종에서 상응하는 종양 세포 항원을 인식하는 대용 단클론 항체의 사용을 포함할 수 있다. 이런 종류의 대안 모델로부터의 데이터는 처음에는 근사값이며, 고등 종으로의 진행이 주의 깊게 이루어져야 함이 인정되어야 한다.
후보 나 항체에 대하여, 간단히 내약성(tolerability)을 조사하는 연구가 수행될 수 있다. 이들 연구에서는 어떤 용량-의존성 약역학적 효과를 관찰함으로써 후보 분자의 치료지수가 특정될 수 있다. 광범위한 용량이 사용되어야 한다(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg). 종양 세포 항원 수의 차이, 교차반응 동물 표적에 대한 후보 항체의 친화성 및 항체 결합 후 세포반응의 차이가 치료지수를 평가하는데 고려되어야 한다. 또한, 후보 항체를 인체 시험할 때 초기 용량 고려에 도움이 되도록 적합한 동물 모델에서 약역학 연구와 약동학 연구가 수행되어야 한다.
후보 면역콘쥬게이트에 대하여, 콘쥬게이트의 안정성 연구가 생체내 수행되어야 한다. 후보 면역콘쥬게이트로부터의 어떤 분해 산물의 결과를 측정하기 위해서 선택적으로 약역학 연구와 약동학 연구가 면역콘쥬게이트의 각 성분에 대해 수행되어야 한다. 또한, 초기 용량 고려에 도움이 되도록 적합한 동물 모델에서 약역학 연구와 약동학 연구가 상기와 같이 수행되어야 한다. 약물이 나 항체로 전처리되어 제공될 경우에는 안전성 연구 설계에 추가의 고려가 제공되어야 한다. 안전성 연구는 나 항체만을 사용하여 수행되어야 하며, 이런 종류의 치료법에서는 면역콘쥬게이트의 최종 용량이 더 낮아질 것이라는 점을 염두에 두고 면역콘쥬게이트를 사용한 연구를 설계해야 한다.
방사선 면역콘쥬게이트에 대하여, 생체분포 데이터를 결정하기 위하여 동물 조직 분포 연구가 수행되어야 한다. 이에 더하여, 투여된 방사선 활성의 총 용량의 대사 분해가 취해진 초기 시점 및 후기 시점에서 모두 계산되어야 한다. 방사선 면역콘쥬게이트는 혈청 또는 혈장을 사용하여 시험관내에서 안정성에 대해 시험될 수 있으며, 유리 방사선 핵종, 방사선 면역콘쥬게이트 및 표지된 비-항체 화합물의 퍼센트를 측정하는 방법이 개발되어야 한다.
올리고뉴클레오티드
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 올리고뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 SEQ ID NO:7-24로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 또는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 AMIGO-2 유전자 또는 유전자 발현 산물의 어떤 영역, 도메인, 부분, 또는 세그먼트에 상보한다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5개 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 12개 내지 약 35개 뉴클레오티드, 및 약 18개 내지 약 25개 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 AMIGO-2 유전자 또는 유전자 발현 산물의 어떤 영역, 부분, 도메인, 또는 세그먼트에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자 또는 유전자 발현 산물의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 100개 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 실질적으로 서열 상동성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자 또는 유전자 산물의 전 길이에 걸쳐 실질적으로 서열 상동성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자 또는 유전자 발현 산물의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 100개 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 완전히 서열 동일성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자 또는 그것의 유전자 산물의 전 길이에 걸쳐 완전히 서열 동일성이다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 중간 또는 긴축 혼성화 조건 하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자와 결합한다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 RNAi(RNA 간섭)을 통해 작동하는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자이다. 어떤 구체예에서, dsRNA 중 1개 가닥은 AMIGO-2 유전자의 어떤 영역, 부분, 도메인, 또는 세그먼트와 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 상동성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000개 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 실질적으로 서열 상동성이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 유전자의 전 길이에 걸쳐 실질적으로 서열 상동성이다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 dsRNA의 1개 가닥 또는 2개 가닥 모두가 AMIGO-2 유전자의 어떤 영역, 부분, 도메인, 또는 세그먼트에 부분적으로 상보성(예를 들어, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)인 RNAi(RNA 간섭)을 통해 작동하는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자이다. 어떤 구체예에서, dsRNA의 1개 가닥 또는 2개 가닥 모두가 AMIGO-2 유전자의 어떤 영역, 부분, 도메인, 또는 세그먼트에 완전히 상보한다. 서열 "상보성"은 수소 결합 특성의 결과로서 특정한 질소 염기들 사이에 생기는 화학적 친화성을 말한다(즉, 아데노신과 우라실(또는 티민, DNA 또는 변형된 RNA의 경우)이 서로 나란히 있고 구아닌과 시토신이 서로 나란히 있을 때 역 평형 듀플렉스의 형성을 가능케 하는 염기 서열을 가진 2개 핵산 사슬의 특성). 따라서, 완전 상보성 서열은 뉴클레오티드 서열이 역 평형 듀플렉스를 형성할 때 염기 서열이 완전히 일대일 대응(즉, 아데닌 대 우라실 및 구아닌 대 시토신)하는 2개 서열일 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 사용된다. 이 서열은 게놈 서열 또는 cDNA 서열에 기초(또는 이로부터 설계)할 수 있으며, 특정 세포 또는 조직에서 동일한, 유사한, 또는 상보성 DNA 또는 RNA의 존재를 증폭, 확인, 또는 검출하는데 사용된다.
소 분자
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 소 분자이다. 본원에서 사용된 용어, "소 분자"는 약 10 킬로달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 비-중합체 화합물을 말한다. 소 분자의 예로는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 유기 화합물, 무기 화합물 등이 있다. 어떤 구체예에서, 소 분자는 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1 킬로달톤 미만의 분자량을 가진다.
의태체
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 의태체이다. 본원에서 사용된 용어, "의태체"는 펩티드의 활성을 흉내 내는 화합물을 말한다. 의태체는 펩티드는 아니지만, 비-펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함할 수 있다. 본원 참고자료로 포함되는 1997년 6월 10일자 발행된 미국특허 제5,637,677호 및 그것의 모 출원은 의태체의 생산에 관한 상세한 가이드를 담고 있다. 간단히 말해서, AMIGO-2의 3-차원 구조와 특이적으로 상호작용하는 펩티드의 3-차원 구조가 펩티드가 아닌 분자에 의해 복제된다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 의태체는 AMIGO-2의 의태체 또는 AMIGO-2의 리간드의 의태체이다.
유인체 수용체
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2 수용체의 적어도 일부분을 포함하는 유인체 수용체이다. 어떤 구체예에서, 유인체 수용체는 AMIGO-2 리간드에 대하여 천연 AMIGO-2 수용체와 경쟁한다. 어떤 구체예에서, 유인체 수용체는 정량, 정성 및/또는 시각화가 용이하도록 표지된다. 다른 구체예에서, 유인체 수용체는 유인체 수용체 및/또는 유인체 수용체-AMIGO-2 복합체의 단리 및/또는 분리를 용이하게 하는 부분을 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 유인체 수용체는 AMIGO-2 수용체 리간드와 결합시에 신호를 증가시킨다(자생 AMIGO-2 수용체와 비교하여). 어떤 구체예에서, 유인체 수용체는 AMIGO-2 리간드를 포획하고, 그것이 신호화 AMIGO-2 수용체와 상호작용하지 못하도록 함으로써 기능하는 비-신호화 분자이다. 어떤 구체예에서, 유인체 수용체는 항체 또는 항체 단편과 융합된 AMIGO-2 수용체의 적어도 일부분을 포함한다.
암의 치료/예방 방법
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에게 암 또는 암의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 암은 AMIGO-2 과발현과 관련된 암이다. 어떤 구체예에서, 암은 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암 또는 췌장암이다. 어떤 구체예에서, 암은 폐암 또는 결장암이다. 어떤 구체예에서, 피험자는 암이 진단되거나 암에 대한 소인이 있다고 진단된 피험자이다. 어떤 구체예에서, 피험자는 위암 이외의 다른 암이 진단되거나 암의 소인이 있다고 진단된 피험자이다.
암의 증상은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 제한되지는 않지만, 유방의 덩어리, 유두의 변화, 유방의 낭종, 유방의 통증, 사망, 체중감소, 쇠약, 과도한 피로, 식사의 어려움, 식욕감퇴, 만성기침, 호흡악화, 기침시 각혈, 혈뇨, 혈변, 메스꺼움, 구토, 간 전이, 폐 전이, 뼈 전이, 비정상적 비만, 붓기, 복막강 내 유체, 질출혈, 변비, 비정상적 팽만, 결장 천공, 급성 복막염(감염, 발열, 통증), 통증, 구토시 각혈, 심한 발한, 발열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 현기증, 오한, 근육경련, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 뼈 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 삼키기 어려움 등을 포함한다.
조정 화합물의 치료적 유효량은 약사에게 잘 공지된 과정에 따라서 경험적으로 결정될 수 있으며, 특히 환자의 나이, 상태의 심각성, 그리고 궁극적으로 바람직한 제약 제형에 따를 것이다. 본 발명의 조정제의 투여는, 예를 들어 흡입 또는 좌약에 의해, 또는 점막 조직에, 예를 들어 질, 직장, 요도, 구강, 설하 조직에 세척에 의해, 경구, 국소, 비강내, 복강내, 비경구, 정맥내, 림프관내, 종양내, 근육내, 사이질내, 동맥내, 피하, 안내, 활액내, 상피경유 및 진피경유 경로에 의해 수행될 수 있다. 어떤 구체예에서, 억제제는 세척에 의해, 경구 경로로, 또는 동맥내 경로로 투여된다. 또한, 다른 적합한 도입 방법으로는 재충전형 또는 생분해형 장치 및 서방형 또는 지속방출형 중합체 장치가 있을 수 있다. 상기 논의된 대로, 본 발명의 치료 조성물은 또한 다른 공지된 항암제 또는 다른 공지된 항-골질환 치료법과의 조합요법의 일부로서 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 환자에서 AMIGO-2-관련 생물학적 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하나 이상의 AMIGO-2 생물학적 활성을 조정하기에 효과적인 양의 AMIGO-2 조정제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. AMIGO-2 생물학적 활성을 측정하는 적합한 분석은 본원에 제시되었다.
더욱이, 본 발명은 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 환자에서 암세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. AMIGO-2-관련 세포 성장을 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며, 본원에 제시되었다.
또한, 본 발명은 AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커를 조정하는 화합물을 하나 이상의 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 암을 보유한 환자에게 투여함으로써 암세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다(예를 들어, 이러한 방법이 필요한 환자에서). AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커는 c-Myc, c-Jun, FosL1 또는 세포외 신호-조절 키나제(ERK)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. ERK의 조정은 ERK의 인산화의 조정이거나, 또는 그것의 기질 중 하나 이상의 ERK에 의한 인산화일 수 있다(상기 참조). 이 방법은 선택적으로 AMIGO-2(예를 들어, AMIGO-2 mRNA 또는 AMIGO-2 단백질)을 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 암을 보유하는 환자를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 필요로 하는 환자에서 암을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자가 본원에 설명된 AMIGO-2 치료요법에 대한 후보인지를 결정하는 단계 및 환자가 AMIGO-2 치료요법에 대한 후보일 경우 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 만일 환자가 AMIGO-2 치료요법에 대한 후보가 아니라면 환자는 종래의 암치료법으로 치료된다.
또한, 본 발명은 암이 진단된 환자 또는 암이 예상되는 환자에서 암을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 환자에서 둘 이상의 세포의 상호작용을 억제하는 방법을 제공한다. AMIGO-2-관련 세포 상호작용을 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 제시되었다.
더욱이, 본 발명은 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 하나 이상의 암 증상을 조정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 환자에서 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 세포 성장을 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 제시되었다.
더 나아가, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 환자에서 암세포의 이주를 억제하는 방법을 제공한다. AMIGO-2-관련 세포 이주를 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 제시되었다.
더 나아가, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 환자에서 암세포의 유착을 억제하는 방법을 제공한다. AMIGO-2-관련 세포 유착을 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 제시되었다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 환자에서 혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 혈관형성을 측정하는 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 제시되었다.
또한, 본 발명은 암 발생, 암 전이의 소인이 있거나, 또는 전이 경험이 있으며, 따라서 재발 또는 재발병에 대한 감수성이 있는 환자를 예방상 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어 암 또는 종양 전이의 가족력이 있거나, 또는 암 전이에 대한 유전 소인을 나타내는 고-위험 개체에서 특히 유용하다. 어떤 구체예에서, 종양은 AMIGO-2-관련 종양이다. 추가하여, 이 방법은 AMIGO-2-관련 종양을 외과적 절제하거나, 또는 종래의 암치료법으로 치료한 경험이 있는 환자로부터 AMIGO-2-관련 종양의 재발을 예방하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 암 진행을 억제하고 및/또는 암 퇴행을 야기하는 방법을 제공한다.
어떤 구체예에서, 항암 치료가 필요한 환자가 화학요법 및/또는 방사선요법과 함께 본 발명의 AMIGO-2 조정제로 치료된다. 예를 들어, AMIGO-2 조정제의 투여 후, 환자는 또한 치료적 유효량의 항암 방사선으로 치료될 수 있다. 어떤 구체예에서, 화학요법 치료가 AMIGO-2 조정제와 조합하여 제공된다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 화학요법 및 방사선요법과 조합하여 투여된다.
치료 방법은 하나 이상의 AMIGO-2 조정제의 단일 또는 중복 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 멸균된 발열원이 존재하지 않는 주사형 제약 조성물로서 투여되며, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 AMIGO-2 조정제를 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 치료법은, 제한되지는 않지만, 수술, 방사선요법, 호르몬 제거 및/또는 화학요법을 포함하는 종래의 암치료법과 함께 사용된다. 본 발명의 AMIGO-2 조정제의 투여는 종래 암치료 이전에, 동시에, 또는 이후에 일어날 수 있다. 어떤 구체예에서, 둘 이상의 상이한 AMIGO-2 조정제가 환자에게 투여된다.
어떤 구체예에서, 환자에 투여되는 AMIGO-2 조정제의 양은 특히 염색체 불안정성, 키나제 활성, 종양형성능, 전이, AMIGO-2 신호화, 세포 유착, 암세포 생존, ERK 인산화, 암세포 성장, 종양 형성, 사이클린 생산, 세포 증식, 세포 주기를 통한 진행, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 및 혈관형성 중 하나 이상을 억제하는데 효과적이다. 어떤 구체예에서, 환자에 투여되는 AMIGO-2 조정제의 양은 세포사멸을 통한 암세포사를 증가시키는데 효과적이다.
신경계와 관련된 질환 및 장애의 치료 방법
또한, 본 발명은 환자에게 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 것을 포함하는 치료가 필요한 환자에서 신경계의 질환 및 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 다발성 경화증, 헌팅톤병, 척수손상, 뇌졸중, 안면신경 손상, 당뇨병-관련 신경 손상, 및 망막변성 중 하나 이상을 치료하는 방법을 제공한다.
하류 유전자 발현 교란 방법
어떤 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 유전자를 교란하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 AMIGO-2를 과발현하는 세포를 AMIGO-2 조정제와 접촉시키는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 환자에 치료적 유효량의 AMIGO-2 조정제를 투여한 후 생체내에서 교란된다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 BNIP3L, FAM46C, LOC339988, SATB1, C11orf21, FAM3B, UCP2, FNDC3A, DRE1, PPIC, ASS, KIAA1718, ALDH6A1, LR8, ADAMTSL2, LIPC, FZD1O, COL4A2, TPP1, SERPINF1, ADCY9, AZGP1, USH1C, RAB40B, SMOC2, RRAGD, NUDT21, C14orf1, TPP1, RPS6KB1, KIAA0657, QPRT, RFK, KCNH2, PAQR8, SEPT6, LOC285758, EFNA1, LGALS8, ATP1OD, ERBB3, CHST13, FLJ25476, MCF2L, FLJ10159, RAB13, ZNF261, USH1C, OSTM1, BMPR2, IPO9, ZNF226, HRASLS3, ERBB3, PROS1, ALDH6A1, PPT2, TFF3, C21orf86, LRRC8B, BAZ2B, HIP1, RNASE4, FAM46C, STARD1O, KLF13, BACE1, FCGRT, QPCT, KCTD14, FRAS1, FAM63B, SPON2, IQWD1, BMPR2, TXNIP, ZBTB4, DDAH2, ZNF420, LGALS8, NEU1, FUCA1, GRN, C20orf194, SEPT6, ASPSCR1, KLHDC5, GRN, STARD1O, MGC12981, C14orf1, EPB41, ALDH2, ARHGEF1OL, FNDC3A, CYP2R1, PAQR8, RNF38, KIAA1327, ALS2CR3, EPS8L3, BACE1, SEPT6, IL27RA, DTX3L, CBPIN, ZNF627, C1orf85, AZGP1, GRN, SUOX, PSMB8, ARHGAP1, DACH1, COL4A2, PLEKHB1, SEC14L1, C2orf7, TPD52L1, PGM2, C14orf4, ZNF286, CAMK2D, PSME1, ZNF268, TRAF5, SEPT6, MGC45474, WIPI-2, CAMK2D, ZBED1, SEC24A, GGTL3, TRIM4, PPM1H, JMJD1A, DOK4, RPS6KB1, PSAP, EXOC7, C6orf80, RERE, ZNF641, MXRA7, RAC1, NDST1, JAG2, ZNF329, SEPT6, KLHDC5, STXBP1 및 UBE2L3, 그리고 이들의 조합 및 아조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제한다.
조합요법
어떤 구체예에서, 본 발명은 더욱 개선된 암 효능을 제공하기 위해 둘 이상의 AMIGO-2 조정제를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 단클론 항체이다. 둘 이상의 AMIGO-2 항체를 포함하는 조성물은 암에 걸린 사람이나 포유류에게, 또는 암에 걸릴 소인이 있는 사람이나 포유류에게 투여될 수 있다. 또한, 하나 이상의 항체가 세포독성제 또는 암 화학치료제와 같은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 둘 이상의 치료제의 동시 투여에서는 제제들의 치료 효과가 발휘되는 시간 기간이 중복되기만 한다면 제제들이 동시에 투여되거나, 또는 동일한 경로로 투여되어야 할 필요는 없다. 동시 투여 또는 연속 투여가 고려되며, 다른 날 또는 다른 주에 투여하는 것이 고려된다.
어떤 구체예에서, 상이한 항체들의 조합, 또는 "칵테일"의 투여가 고려된다. 이러한 항체 칵테일은 이들이 상이한 이펙터 메커니즘을 활용하는 항체들을 함유하거나 또는 세포독성 항체와 면역 이펙터 기능에 의존하는 항체를 직접 조합하는 한에서 어떤 이점을 가질 수 있다. 이러한 조합된 항체들은 상승작용적 치료 효과를 나타낼 수 있다.
세포독성제는 세포 기능을 억제 또는 방해하고 및/또는 세포 파괴를 야기하는 물질을 말한다. 이 용어는 방사선 활성 동위원소(예를 들어, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학치료제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 합성 독소와 같은 독소, 또는 이들의 단편을 포함하는 의미이다. 비-세포독성제는 세포 기능을 억제 또는 방해하지 않고 및/또는 세포 파괴를 야기하지 않는 물질을 말한다. 비-세포독성제는 세포독성으로 활성화될 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 비드, 리포솜, 바탕질 또는 입자를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국특허 공개 2003/0028071 및 2003/0032995 참조, 본원 참고자료로 포함된다). 이러한 제제는 본 발명에 따른 항체와 콘쥬게이트, 커플링, 결합 또는 회합될 수 있다.
어떤 구체예에서, 종래의 암 의약이 본 발명의 조성물과 함께 투여된다. 종래의 암 의약은 a) 암 화학치료제, b) 추가 제제, c) 전구약물을 포함한다.
암 화학치료제는, 제한되지는 않지만, 알킬화제, 예를 들어 카르보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제, 예를 들어 카르머스틴(BCNU); 항대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트; 폴린산; 퓨린 유사체 항대사물질, 예를 들어 메르캅토퓨린; 피리미딘 유사체 항대사물질, 예를 들어 플루오로우라실(5-FU) 및 겜시타빈(Gemzar®); 호르몬성 항신생물제, 예를 들어 고세렐린, 류프롤리드 및 타목시펜; 천연 항신생물제, 예를 들어 알데스류킨, 인터류킨-2, 도세탁셀, 에토포시드(VP-16), 인터페론-알파, 파클리탁셀(Taxol®) 및 트레티노인 (ATRA); 항생제계 천연 항신생물제, 예를 들어 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 다우노마이신 및 미토마이신 C 등의 미토마이신류; 및 빈카 알카로이드 천연 항신생물제, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 히드록시우레아; 아세글라톤, 아드리아마이신, 이포스파미드, 에노시타빈, 에피티오스타놀, 아클라루비신, 안시타빈, 니무스틴, 프로카르바진 염산염, 카르보쿠온, 카르보플라틴, 카르모푸르, 크로모마이신 A3, 항종양 다당류, 항종양 혈소판 인자, 시클로포스파미드(Cytoxin®), 시조필란, 시타라빈(시토신 아라비노시드), 다카르바진, 티오이노신, 티오테파, 테가푸르, 돌라스타틴류, 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 아우리스타틴, CPT-11(이리노테칸), 미토잔트론, 비노렐빈, 테니포시드, 아미노프테린, 카르미노마이신, 에스페라미신류(미국특허 제4,675,187호 참조), 네오카르지노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸르툴론, 브록수리딘, 부술판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴(Ubenimex®), 인터페론-베타, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 멜팔란, 라미닌 펩티드류, 렌티난, 구름버섯(Coriolus versicolor) 추출물, 테가푸르/우라실, 에스트라무스틴(에스트로겐/메클로레타민)을 포함한다.
암 환자 치료요법으로서 사용될 수 있는 추가 제제는 EPO, G-CSF, 간시클로비르; 항생제, 류프롤리드; 메페리딘; 지도부딘((AZT); 돌연변이 및 유사체를 포함하여 인터류킨 1에서 18; 인터페론류 및 사이토카인류, 예를 들어 인터페론 알파, 베타 및 감마; 호르몬류, 예를 들어 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 및 유사체 그리고 생식선자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH); 성장인자류, 예를 들어 형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 섬유아세포 성장인자(FGF), 신경성장인자(NGF), 성장 호르몬 방출인자(GHRF), 표피성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자 상동성 인자(FGFHF), 간세포 성장인자(HGF), 및 인슐린 성장인자(IGF); 종양괴사인자-알파 및 베타(TNF-α & β); 침범억제인자-2(IIF-2); 뼈형태발생 단백질 1-7(BMP 1-7); 스토마토스타틴; 티모신-알파-1; 감마-글로불린; 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD); 보체인자; 항-혈관형성 인자; 항원성 물질; 및 전구약물을 포함한다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제가 하나 이상의 종래 암 면역요법제와 함께 투여될 수 있다. 면역요법제는 면역 시스템의 자극(예를 들어, 자연살상 세포, 대식세포 및 호중구의 생산 또는 활성의 자극)을 목표로 하는 것들을 포함할 수 있으며, 예를 들어 인터페론 알파, 과립구-단핵구 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨-12 또는 인터류킨-2가 있다. 또한, 면역요법제는 암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 백신 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제가 주어진 암 또는 암 항원(예를 들어, MAGE 항원)에 대한 펩티드, 폴리펩티드 또는 바이러스 벡터 백신과 함께(예를 들어, 동시에, 대략 동시에, 또는 환자를 위한 전체적 치료 전략의 한 성분으로서) 투여될 수 있다. 또한, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제는 특정 암 또는 암 항원을 표적으로 하는 하나 이상의 단클론 항체 치료요법(예를 들어, 제제)과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, Rituximab(IDEC-C2B8) - 어떤 B 세포 악성물에 존재하는 CD20 항원을 표적으로 하는 키메라 항체 - 는 면역 이펙터 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 또는 자연살상 세포) 상의 Fc 수용체와 결합하여 이들 면역 이펙터 세포(또는 항체-의존성 세포 매개 독성이라고 한다; 상기 참조)에 의한 종양 세포의 파괴를 촉진한다. 또한, 특정한 종양 세포 또는 종양 세포 항원과 결합하는 항체는 본원에 설명된 대로 보체-의존성 세포독성 반응을 촉발하는데 사용될 수도 있다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제는 암에 대한 하나 이상의 세포 주기-표적화 제제와 함께 투여될 수 있다. 세포 주기-표적화 제제는 세포 주기의 특정 단백질 매개인자(예를 들어, 사이클린-의존성 키나제)를 표적으로 하는 것들을 포함할 수 있으며, 예를 들어 로스코비틴 또는 플라보피리돌이 있다. 또한, 세포 주기-표적화 제제(예를 들어, 화합물)는 분할 중인 세포(예를 들어, 암세포)를 세포 주기의 특정 단계에서 중단시키는 제제들을 포함할 수 있으며, 제한되지는 않지만, 예를 들어 탁솔, 스타우로스포린, UCN-01, 로스코비틴 또는 빈블라스틴이 있다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제 및 하나 이상의 추가 제제는 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제가 1차 투여되고, 하나 이상의 추가 제제는 2차 투여된다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 추가 제제가 1차 투여되고, AMIGO-2 조정제(들)가 2차 투여된다. 하나 이상의 AMIGO-2 조정제는 앞서 투여된 또는 현재 투여 중인 치료요법을 대체하거나 강화할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제를 사용한 치료시 하나 이상의 추가 제제의 투여는 중단되거나 감소될 수 있는데, 즉 더 낮은 수준으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 이전 치료요법의 투여가 지속된다. 어떤 구체예에서, 이전 치료요법은 하나 이상의 AMIGO-2 조정제 수준이 치료 효과를 제공하기에 충분한 수준에 도달될 때까지 지속될 것이다(예를 들어, 주어진 환자에 대한 최적 투약량을 결정할 경우). 두 치료요법은 조합하여 투여될 수 있다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제는 현재 투여 중인 하나 이상의 제제의 수준 또는 투약량을 상쇄하도록 피험자(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 1차 치료요법(예를 들어, 탁솔과 같은 하나 이상의 추가 제제)의 투약량이 환자에게 독성이거나 또는 환자가 견뎌내기 어려울 때, 하나 이상의 AMIGO-2 조정제를 투여하여 상기 투약량을 낮출 수 있다. 상기 하나 이상의 AMIGO-2의 투여는 독성이나 견디기 힘든 부작용 없이 1차 치료요법의 효과와 동등한 또는 더 높은 치료 효과를 제공한다.
전구약물은 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이거나 또는 비-세포독성이며, 활성 형태나 더욱 활성인 모 형태로 효소 활성화되거나 전환될 수 있는 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.) pp. 247-267, Humana Press (1985)를 참조한다. 전구약물로는, 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, b-락탐-함유 전구약물, 선택적 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구약물 또는 선택적 치환된 페닐아세타미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물이 있으며, 이들은 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는, 제한되지는 않지만, 상기 설명된 화학치료제들이 있다.
임상적 측면
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암 또는 췌장암 및 암의 전이에 특히 유용하다. 어떤 구체예에서, 암은 폐암 또는 결장암이다.
제약 조성물
또한, 본 발명은 하나 이상의 AMIGO-2 조정제와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 제약 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다; 주사 전에 액체 비히클 중에서 용액이나 현탁액으로 되기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체의 정의에는 리포솜이 포함된다. 또한, 제약학적으로 허용되는 염이 제약 조성물에 존재할 수 있는데, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염, 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산 염이 있다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995)(Alfonso Gennaro, Lippmcott, Williams, & Wilkms)에 제약학적으로 허용되는 부형제에 관해 충분히 논의되어 있다.
AMIGO -2 검출 방법
또한, 본 발명은 AMIGO-2 검출 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2는 환자 또는 환자 샘플에 존재한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 환자에서 조영제의 국소화를 검출하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 환자 샘플을 암세포를 포함한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 조영제에 연결되거나, 또는 검출가능하게 표지된다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 조영제에 콘쥬게이트된 AMIGO-2 항체이며, 하나 이상의 종양을 검출하거나 또는 AMIGO-2 치료요법에 대한 환자의 감수성을 측정하기 위해 환자에 투여된다. 표지된 항체는 세포 상의 고밀도 수용체와 결합함으로써 종양 세포 상에 축적된다. 표준 조영 기술을 이용하여 종양 부위가 검출될 수 있다.
또한, 본 발명은 AMIGO-2 조정제를 포함하는 조성물과 샘플을 접촉시키는 단계 및 샘플에서 AMIGO-2 조정제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 AMIGO-2를 발현 또는 과발현하는 세포 또는 종양을 조영/검출하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 샘플은 환자 샘플이다. 어떤 구체예에서, 환자 샘플은 암세포를 포함한다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 조영제에 연결되거나, 또는 검출가능하게 표지된다.
또한, 본 발명은 환자, 세포 또는 샘플에 존재하는 AMIGO-2의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자 또는 샘플에 항체, 프로브 또는 소 분자 중 하나 이상을 투여하는 단계 및 샘플에 존재하는 AMIGO-2의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 항체, 프로브 또는 소 분자는 조영제에 연결되거나, 또는 검출가능하게 표지된다. 이러한 정보는, 예를 들어 종양이 AMIGO-2와 관련되는지 아닌지, 그에 따라 특정 치료가 사용되어야 하는지 회피되어야 하는지를 표시한다. 어떤 구체예에서, 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여, 종양 세포를 포함한다고 생각되는 샘플이 획득되고, 표지된 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 소 분자와 접촉된다. 어떤 미결합된 표지 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 소 분자를 제거한 후, 세포에 결합된 표지 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 의태체의 양, 또는 결합되지 않은 제거된 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 의태체의 양을 측정한다. 이 정보는 존재하는 AMIGO-2의 양과 직접적으로 관련된다.
조영은 당업자에게 잘 공지된 과정을 이용하여 수행될 수 있다. 조영은, 예를 들어 방사선섬광조영술, 핵자기공명영상(MRT) 또는 컴퓨터 단층촬영(CT 스캔)에 의해 수행될 수 있다. 조영제로서 가장 일반적으로 사용되는 방사선 표지로는 방사선 활성 요오드 및 인듐이 있다. CT 스캔에 의한 조영은 철 킬레이트와 같은 중금속을 사용할 수 있다. MRI 스캔은 가돌리늄 또는 망간의 킬레이트를 사용할 수 있다. 추가하여, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출체를 사용하여 양전자 방출 단층촬영(PET)도 가능할 수 있다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2 조정제는 AMIGO-2 항체이다. 어떤 구체예에서, 조정제는 조영제에 연결되거나, 검출가능하게 표지된다. 어떤 구체예에서, 조영제는 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb, 또는 206Bi가 있다.
검출 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 검출 방법으로는, 제한되지는 않지만, PCR, 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, RNA 보호, 및 DNA 혼성화(제자리 혼성화 포함)이 있다. 폴리펩티드의 검출 방법으로는, 제한되지는 않지만, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 효소 활성 분석, 슬롯 블롯팅, 펩티드 질량 지문분석, 전기영동, 면역화학, 및 면역조직화학이 있다. 검출 방법의 다른 예로는, 제한되지는 않지만, 방사선 면역분석(RIA), 화학발광 면역분석, 형광 면역분석, 시간-분해 형광 면역분석(TR-FIA), 2-색 형광현미경, 또는 면역크로마토그래피 분석(ICA)가 있으며, 모두 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 발현은 PCR 방법을 이용하여 검출되고, 폴리펩티드 생산은 ELISA 기술을 이용하여 검출된다.
세포독성제 또는 진단제를 세포에 송달하는 방법
또한, 본 발명은 세포독성제 또는 진단제를 하나 이상의 AMIGO-2-발현 세포에 송달하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 세포독성제 또는 진단제에 콘쥬게이트된 본 발명의 AMIGO-2 조정제를 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
암 환자의 예후 측정 방법
또한, 본 발명은 AMIGO-2-관련 암을 가진 환자의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2 수준과 비교하여 암세포의 세포막에 국소화된 AMIGO-2 수준의 비율을 측정하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 환자에서 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 비해 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 수준이 높은 것은 이 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하며 AMIGO-2 치료요법에 감수성임을 표시한다. 어떤 구체예에서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2과 비교하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비율이 적어도 2:1인 것은 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하며 AMIGO-2 치료요법에 감수성임을 표시한다. 어떤 구체예에서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2과 비교하여 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비율이 적어도 3:1인 것은 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유하며 AMIGO-2 치료요법에 감수성임을 표시한다.
AMIGO -2 치료요법에 대한 감수성의 측정 방법
또한, 본 발명은 AMIGO-2 치료요법에 대한 환자의 감수성을 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자 또는 환자 샘플에서 AMIGO-2의 차등 발현의 증거가 존재하는지 또는 부재하는지를 검출하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 환자 또는 샘플에서 AMIGO-2의 차등 발현 증거의 존재는 환자가 AMIGO-2 치료요법에 감수성임을 표시한다. 어떤 구체예에서, 환자 또는 환자 샘플에서 AMIGO-2의 차등 발현 증거의 부재는 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보가 아님을 표시한다. 어떤 구체예에서, 정상 세포에 비해 암세포에서 AMIGO-2가 현저히 상향-조절되지는 않지만, AMIGO-2 발현에 대한 암세포와 정상 세포의 의존성에는 차이가 있다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2의 조정은 종양-간질 상호작용에 영향을 미친다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2의 조정은 종양과 간질 조직의 상호작용을 억제한다.
어떤 구체예에서, 치료 방법은 먼저 AMIGO-2 치료요법에 감수성인 환자를 확인하는 것을 포함하며, 이것은 조영제에 연결된 AMIGO-2 조정제를 포함하는 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계, 및 환자에서 유전자 또는 유전자 산물의 증거가 존재하는지 또는 부재하는지 검출하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 치료 방법은 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보일 경우 환자에게 하나 이상의 AMIGO-2 조정제를 투여하는 단계, 및 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보가 아닐 경우 종래 암치료법으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
어떤 구체예에서, 환자가 암을 보유하거나 암에 감수성인 것으로 확인된 경우 하나 이상의 AMIGO-2 조정제가 단독으로 또는 다른 항암 약제와 조합하여 환자에 투여된다.
암의 진행의 평가 방법
또한, 본 발명은 제 1 시점에서의 생물학적 샘플에서 AMIGO-2의 발현 산물의 수준과 제 2 시점에서의 동일한 발현 산물의 수준을 비교하는 것을 포함하는 환자에서 암의 진행을 평가하는 방법을 제공한다. 제 1 시점과 비교하여 제 2 시점에서 발현 산물 수준의 변화는 암의 진행을 표시한다.
스크리닝 방법
또한, 본 발명은 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은 AMIGO-2-발현 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 AMIGO-2-관련 생물학적 활성이 조정되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 염색체 불안정성, 키나제 활성, 종양형성능, 암세포 성장, 암세포 생존, 종양 형성, 암세포 증식, 전이, 세포 이주, 기질 인산화, 사이클린 생산, 혈관형성, 세포 증식, 세포 주기 조절, 신호화, 세포-세포 유착, 세포-세포막 상호작용, 세포-세포외 바탕질 상호작용, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 및 AMIGO-2 발현 중 하나 이상의 억제가 항암제임을 표시한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 항암제는 치료 및/또는 진단 방법에서 필요로 하는 환자에게 투여된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어 하류 마커의 활성 또는 수준을 조정하는 능력에 대한 추정적 조정제를 스크리닝하는 것에 의한, 항암제, 특히 전이성 암 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, c-Jun, 세포외 신호-조절 키나제(ERK), 혈관내피 성장인자(VEGF), 유로키나제 및 폴리(ADP-리보스)중합효소 (PARP1)의 수준을 감소시키는 후보 제제가 항암제로서 확인된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AMIGO-2 조정제를 확인하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 후보 화합물의 존재 및 부재하에 하나 이상의 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플 중에서 AMIGO-2의 인산화를 비교하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 후보 화합물이 없을 때의 샘플에서 AMIGO-2의 인산화와 비교하여 후보 화합물의 존재시 샘플에서 AMIGO-2의 인산화의 조정은 후보 화합물이 AMIGO-2 조정제임을 표시한다.
어떤 구체예에서, AMIGO-2는 면역침전 항체를 사용하여 샘플에서 분리된다. 어떤 구체예에서, 면역침전 항체는 본 발명의 항-AMIGO-2 항체이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 인산화는 세린/트레오닌 인산화이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 인산화는 포스포-세린/트레오닌 항체를 사용하여 검출 및/또는 정량된다. 어떤 구체예에서, 면역침전 항체는 포스포-세린/트레오닌 항체이다.
AMIGO -2 조정의 검출 방법
어떤 구체예에서, 본 발명은 세포에서 AMIGO-2 활성 조정을 검출하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 상기 방법은 AMIGO-2 활성 조정에 충분한 시간 동안 AMIGO-2-발현 세포를 포함하는 샘플을 AMIGO-2 억제제와 접촉시키는 단계, 본 발명의 AMIGO-2 항체로 AMIGO-2를 면역침전시키는 단계, 및 포스포-세린/트레오닌 항체를 이용하여 샘플 중의 AMIGO-2 세린/트레오닌 인산화를 대조군과 비교하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 대조군과 비교하여 샘플 세포에서 AMIGO-2의 세린/트레오닌 인산화의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다. 한 구체예에서, AMIGO-2 인산화는 세린/트레오닌 인산화이다. 어떤 구체예에서, AMIGO-2 인산화는 포스포-세린/트레오닌 항체를 이용하여 검출 및/또는 정량된다. 어떤 구체예에서, 면역침전 항체는 포스포-세린/트레오닌 항체이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AMIGO-2를 과발현하는 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2 활성 조정을 검출하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 AMIGO-2 활성 조정에 충분한 시간 동안 세포에서 AMIGO-2를 과발현하는 단계, 본 발명의 AMIGO-2 항체로 AMIGO-2를 면역침전시키는 단계, 및 포스포-세린/트레오닌 항체를 이용하여 샘플 중의 AMIGO-2 포스포-세린/트레오닌 인산화를 대조군과 비교하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 대조군과 비교하여 샘플 중의 AMIGO-2의 세린/트레오닌 인산화의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
어떤 구체예에서, 이 방법은 AMIGO-2 활성 조정에 충분한 시간 동안 샘플과 AMIGO-2 억제제를 접촉시키는 단계, 항-포스포-세린/트레오닌 항체로 AMIGO-2를 면역침전시키는 단계, 및 본 발명의 항체를 이용하여 샘플 중의 인산화된 AMIGO-2의 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 대조군과 비교하여 샘플 중의 인산화된 AMIGO-2 수준의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
어떤 구체예에서, 이 방법은 AMIGO-2 활성 조정에 충분한 시간 동안 샘플에서 AMIGO-2를 과발현하는 단계, 항-포스포-세린/트레오닌 항체로 AMIGO-2를 면역침전시키는 단계, 및 본 발명의 AMIGO-2 항체를 이용하여 샘플 중의 인산화된 AMIGO2의 수준과 대조군을 비교하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 대조군과 비교하여 샘플 중의 인산화된 AMIGO-2 수준의 변화는 AMIGO-2 활성의 조정을 표시한다.
AMIGO -2 정제 방법
어떤 구체예에서, 본 발명은 AMIGO-2를 포함하는 샘플로부터 AMIGO-2 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 고체 지지체에 결합된 본 발명의 AMIGO-2 항체를 포함하는 친화성 바탕질을 제공하는 단계, 샘플과 친화성 바탕질을 접촉시켜 친화성 바탕질-AMIGO-2 단백질 복합체를 형성하는 단계, 나머지 샘플에서 친화성 바탕질-AMIGO-2 단백질 복합체를 분리하는 단계 및 친화성 바탕질에서 AMIGO-2 단백질을 방출하는 단계를 포함한다.
키트
어떤 구체예에서, 본 발명은 AMIGO-2의 차등 발현과 상호관련되는 유전자 또는 유전자 산물을 조영 및/또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 검출가능한 항체, 소 분자, 올리고뉴클레오티드, 유인체, 의태체 또는 프로브와 본 발명의 방법의 수행을 위한 설명서를 포함한다. 선택적으로 키트는 또한 다음 대조군(양성 및/또는 음성), 대조군 용기, 양성 및/또는 음성 결과의 대표예의 사진 또는 묘사를 함유할 수 있다.
본원에 설명된 특허, 특허출원, 승인번호 및 간행물들은 각각 그 전문이 본원 참고자료로 포함된다.
본원에 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형들이 전술한 설명의 관점에서 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 이러한 변형들도 첨부된 구체예의 범위 내에 들어가도록 의도된다. 본 발명은 다음의 실시예들에서 더 증명되며, 이들 실시예는 예시를 목적으로 하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: AMIGO -2 발현은 어떤 암 조직에서 상향-조절된다
mRNA를 레이저 캡처 마이크로절제(LCM) 방식으로 얻은 결장암, 유방암 및 전립선암 조직에서 분리하고, 이 mRNF를 각 정상 조직(도 1A; RSM = 기준 혼합물) 또는 각 조직 샘플 안의 암세포에 인접한 정상 세포(도 1B)의 풀과 비교했다. 샘플을 Affymetrix® GeneChips®(Affymetrix, Inc., 캘리포니아 산타클라라)(도 1A)에 의한 올리고뉴클레오티드 어레이 분석 또는 암성 조직으로부터 제조한 cDNA를 이용하여 만든 인-하우스 어레이(도 1B)에 의해 시험했다. 도 1A 및 1B의 각 표에 환자의 수가 표시되었고, 이어서 암 샘플과 정상 샘플 간의 상대적 발현이 표시되었다(""%GE2X" 및 ">=2X"는 2배까지의 상향-조절을 표시하고, "%LE.5X" 및 "<=2x"는 2배까지의 하향-조절을 표시한다). 두 칩 세트 모두 AMIGO-2가 결장암에서 상향-조절된 것을 증명하였다. 인-하우스 칩으로 수행한 실험도 역시 AMIGO-2가 유방암 및 전립선암에서 상향-조절된 것을 나타냈다. Affymetrix 실험에서는 이들 조직에서의 상향-조절이 관찰되지 않았다.
또한, 역-전사-결합 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 정상 조직 샘플과 암 조직 샘플에서 상대적 AMIGO-2 mRNA 수준을 시험하였다(도 2). 정상 조직의 패널과 결장, 유방 및 전립선 LCM(레이저 캡처 절제) 방식 절제 샘플의 풀(풀 당 8명의 환자)을 반-정량 RT-PCR((GeneAmp®, Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티)에 의해 비교했다. 두 프라이머 세트를 시험했으며 유사한 결과를 얻었다(프라이머 세트 명칭 "ABTP 508/509"로부터의 데이터를 도 2에 도시한다). 시험된 정상 조직들 중에서 유방과 폐가 가장 높은 상대적 발현을 나타냈다. 결장암은 정상 결장에 비해 5배 이상의 상향-조절을 나타냈고, 정상 유방에 비해서는 수배의 상향-조절을 나타냈다.
인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이(Affymetrix, Inc.)를 사용한 암성 조직과 정상 조직에서 AMIGO-2 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드 어레이 분석의 그래프를 도 3 및 4에 도시한다. 정상 조직 타입과 암성 조직 타입이 수평 축에 표시 된다. 도 4에서 암성 조직은 'c_'(예를 들어, "c_breast_duct"는 유방암 조직 샘플을 나타낸다)로, 정상 조직은 'n_'으로 표지된다. 조직 타입은 또한 공지된 경우에는 조직 타입 및 서브타입에 관해서도 표지된다. 예를 들어, "c_breast_duct"는 유방관에 국소화된 유방암으로부터의 암성 조직이다. 제거 수술 도중 서브타입이 불분명했거나 또는 알지 못했던 경우에는 '비-특정'이라는 의미로 'ns'의 표지를 붙인다. 도 3 및 4의 수직 축 상의 각 스폿은 단일 환자로부터의 조직 샘플을 나타내며, 수직 축 상의 각 스폿의 높이(직선)는 프로브 세트의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 도 3은 선형 분석을 나타내고, 도 4의 데이터는 log2 스케일로 나타낸 것이다. 검은 원은 선형 검출 범위에 있는 발현 수준을 가진 샘플을 나타낸다. 흰 원은 샘플들에서 유전자 발현의 상한을 나타내며, 이때 유전자는 프로브 세트의 검출 한계 아래에 있었다. 흰 사각형은 샘플들에서 유전자 발현의 하한을 나타내며, 이때 프로브 세트는 포화되었다. 분석을 수행하기 전에, 매우 다양한 샘플 세트에 대해 구성 프로브들의 거동을 분석하여 각 프로브 세트를 보정하였다. 이 보정에 의해 각 프로브의 상대적 감도, 및 프로브들에서 프로브 세트 반응이 선형이었던 강도 범위를 측정하였다. 이 범위 아래의 강도는 "미검출"이라 칭하고, 이상은 "포화"라 칭한다. 샘플들 간 혼성화 및 효지화 효능의 편차로 인해 보정 적용 후 각 어레이를 정규화하였다. 이로써 유전자 발현에 관한 범위의 상한 및 하한을 샘플마다 다소 변화시켰다.
실시예 2: 면역조직화학에 의해서 AMIGO -2가 결장암 및 폐암에서 발현된다는 것이 드러난다
조직 절편에서 파라핀을 제거하고, Ventana Discovery 기기(Ventana Medical Systems, Inc., 아리조나 투손)에서 항원 검색을 수행하였다. 표준 세포 컨디셔닝을 수행한 다음, 세포를 1차 항체와 함께 60분간 인큐베이션하였다. 토끼 항-인간 AMIGO-2 항체(Chiron, 캘리포니아 에머리빌)와 토끼 IgG Prebleed 대조군(Chiron, 캘리포니아 에머리빌)을 10 ㎍/mL로 사용하였다. Ventana 공통 2차 시약(Ventana Medical Systems, Inc.)과 Ventana DAB 맵 키트(Ventana Medical Systems, Inc.)를 차례로 사용하여 검출하였다. Ventana 헤마톡실린과 Bluing 시약(Ventana Medical Systems, Inc.)을 사용하여 대조염색하고, 절편을 등급 분류된 알코올로 탈수한 다음 크실렌으로 세척하고, 합성 장착 배지를 사용하여 커버 슬립을 만들었다.
염색은 AMIGO-2가 종양 세포와 종양 간질에서 발현된다는 것을 나타낸다. 종양을 둘러싼 간질 조직에서 AMIGO-2의 발현은 종양 자체에서의 발현과 동등하거나 또는 그 이상인 것으로 관찰되었으며, 이는 AMIGO-2가 종양 성장을 지원하는데 필요한 혈관신생에 중요할 수 있음을 시사한다.
실시예 3: AMIGO -2 단백질 수준은 상이한 셀라인에서 변화된다
상이한 셀라인의 세포 펠릿으로 단백질 세포용해물을 만들고, 이 세포용해물을 AMIGO-2는 특이적으로 인식하지만 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 단백질은 인식하지 않는 시판 AMIGO-2 항체(MAB2080, R&D Systems, Inc., 미네소타 미네아폴리스)로 면역침전시켰다. 셀라인은 인간 위암 셀라인(AGS), 2개의 결장암 셀라인(SW620 및 HT29), 2개의 결직장 셀라인(Colo320 및 HCT116) 및 배아 셀라인(293-CMVII)을 포함했다(도 5). 면역침전에 의해 포획된 단백질을 아크릴아미드 겔 전기영동에 의 해 분리한 다음, 인-하우스 제작 항-AMIGO-2 항체를 사용하여 웨스턴 분석했다(도 5). 결장 셀라인과 위 셀라인에서 두 밴드(~63 kD & ~90 kD)가 관찰되었다. 분자량이 더 높은 산물이 AMIGO-2의 글리코실화, 인산화 또는 멀티머 형태일 수 있다. 상대적 반-정량 RT-PCT Ct 수준을 측정했고, 이것을 도 5에서 4개 셀라인 이름 옆의 괄호 안에 나타낸다. Ct 값은 어떤 수의 PCR 사이클 후의 검출 역치를 나타낸다. 더 높은 Ct 값은 cDNA를 검출하기 위해서 더 많은 수의 사이클이 필요하다는 것을 시사하며, 따라서 mRNA 수준이 낮다는 것을 표시한다. 시험된 모든 셀라인은 AMIGO-2 mRNA에 대해 양성이었지만, 단백질을 검출하는 능력은 mRNA의 양이 감소할 수록 감소하였다. 도 5는 AMIGO-2가 결장암 셀라인에서 상당한 수준으로 발현된다는 것을 시사한다.
실시예 4: 기능적 분석
siRNA의 패널을 SW620 세포(AMIGO-2를 발현하는 결장암 셀라인)에서 AMIGO-2 mRNA를 녹다운시키는 능력에 대해 시험했다(도 6). 도 6에서 시험된 siRNA의 서열이 표 3에 제시된다. 도 6에 도시된 AMIGO-2 siRNA는 모두 어떤 정도까지 AMIGO-2 mRNA 수준이 감소하였지만, siRNA 제제 C315-1.3 및 C315-4.3이 mRNA 수준을 감소시키는데 가장 효과적인 것으로 나타났다.
AMIGO-2 단백질 수준은 Colo320 및 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출할 수 없었지만(도 5 참조), AMIGO-2-특이적 siRNA C315-1.3 및 C315-4.3은 이들 셀라인에서 AMIGO-2 mRNA 수준을 감소시켰으며(도 7A 및 7B), 이것은 Colo320 및 HCT116 세포에서의 양성 mRNA 발현과 일치한다.
AMIGO-2 녹다운의 기능적 결과를 몇 가지 방법에 의해서 시험했다. 시판 키트(ToxiLight®, Cambrex Corporation, 뉴저지 이스트러더포드)를 사용하여 결장암 셀라인 SW620에서 AMIGO-2 녹다운시의 세포사 정도를 평가했다. 비-트랜스펙션 세포와 음성 대조군 샘플에서는 세포사가 거의 관찰되지 않았지만, 양성 대조군 유전자 및 AMIGO-2의 녹다운(두 상이한 siRNA 시약에 의한)은 현저한 독성을 나타냈다(도 8A). 또한, MRC9 세포에서 AMIGO-2 녹다운의 기능적 결과를 시험하였다. 음성 대조군 siRNA로 처리한 세포에서는 적은 양의 세포사가 관찰되었지만, CHIR315-1.3SI siRNA로 처리한 MRC9 세포에서는 재현가능한 상당한 양의 세포사가 관찰되었다(도 8B).
또한, AMIGO-2 녹다운의 기능적 결과를 위암 셀라인 AGS에서 PARP 절단 및 MP3 발현에 대한 siRNA CHIR315-1.3SI 및 CHIR315-4.3SI의 효과를 시험함으로써 시험했다. PARP 절단 및 M30 생산은 세포사멸 매개인자인 카스파제의 활성화를 표시한다. 세포를 siRNA와 함께 48시간 인큐베이션한 다음, AMIGO-2, PARP, M30 및 투불린의 발현 및 프로세싱에 대해 세포용해물을 웨스턴 블롯 분석했다. 양성 대조군 샘플과 siRNA 처리 샘플에서는 PARP 절단이 증가하였고, M30 발현 또한 증가하였는데, 이는 이들 셀라인에서의 세포사멸 증가를 시사한다(도 9). 예상된 대로, AMIGO-2 단백질 수준은 각 siRNA에 노출된 후 감소하였다(도 9, 맨 위 패널). 또한, PARP 절단 및 M30 발현에 대한 siRNA CHIR315-1.3SI 및 CHIR315-4.3SI의 효과를 결장암 셀라인 SW620에서 시험하였다. SW620 세포를 AMIGO-2 특이적 siRNA(또는 대조군 siRNA)와 함께 72시간 인큐베이션한 다음, 세포용해물을 상기와 같이 웨 스턴 블롯 분석하였다. CHIR315-1.3SI로 처리한 SW620 세포에서 PARP 절단이 검출되었는데, 이는 이들 세포에서 siRNA 처리의 결과로서 세포사멸이 발생했음을 시사한다.
또한, 다른 분석을 사용하여 AGS, SW620, HT29, A549 및 Colo320 암 셀라인; 184B5 및 HMEC 비-종양형성성 유방 상피 셀라인; 및 MRC9 정상 인간 폐 섬유아세포 셀라인을 포함하는 다양한 셀라인들에서 AMIGO-2 녹다운의 기능적 결과를 시험하였다. 실험은 두 상이한 AMIGO-2 siRNA C315-1.3si 및 C315-4.3si를 사용하여 수행하였다. AMIGO-2 녹다운이 역시 모든 실험에서 확인되었다. 이들 실험의 결과는 다음과 같다.
Sub-G1 DNA 분석을 이용하여 유세포분석에 의해 세포사를 측정하였다. AGS, SW620, A549, 및 Colo320 암 셀라인에서 AMIGO-2 siRNA로 트랜스펙션한 후 증가된 세포사가 관찰되었으며, HT29에서는 작은 정도의 세포사가 관찰되었고, 184B5 또는 HMEC 세포에서는 세포사가 관찰되지 않았다. MRC9 세포에 대한 데이터는 기록되지 않았다.
또한, 세포사멸 분석을 이용하여 PARP 절단 및/또는 M30 생산을 검출함으로써 세포사를 측정하였다. AGS 및 SW620 암 셀라인에서 AMIGO-2 siRNA C315-1.3si 및 C315-4.3si로 트랜스펙션한 후 증가된 세포사가 검출되었으며, A549 세포에서는 세포사가 검출되지 않았다. HT29, Colo320, 184B5, HMEC, 또는 MRC9 셀라인에 대한 데이터는 기록되지 않았다.
또한, ToxiLight® 분석(Cambrex Corporation, 뉴저지 이스트러더포드)를 이 용하여 제조자의 지시에 따라 세포사를 측정하였다.
세포를 1일 후 약 80-95% 컨플루언트(confluent)가 되는 밀도로 96-웰 디쉬에 평판했다. 올리고뉴클레오티드를 OptiMEM™에 2 μM로 희석했다. 다음에, 올리고뉴클레오티드-OptiMEM™을 분석에 사용될 특정 세포 타입에 최적화되도록 선택된 송달 비히클에 첨가했다. 다음에, 올리고/송달 부형제 혼합물을 세포 상에서 혈청-함유 배지로 더 희석했다. siRNA 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 50 nM이다.
올리고뉴클레오티드를 상기 설명된 대로 제조했다. 세포를 약 4시간에서 하룻밤까지 37℃에서 트랜스펙션하고, 트랜스펙션 혼합물을 신선한 배지로 교체했다. 트랜스펙션된 세포를 트립신 처리하고, 48시간 또는 72시간에서 플레이트에 결합되어 잔류한 총 세포를 계수했다.
SW620 및 A549 암 셀라인에서는 AMIGO-2 siRNA로 트랜스펙션한 후 증가된 세포사가 검출되었으며, MRC9세포에서는 검출되지 않았다. AGS, HT29, 184B5, HMEC, 또는 Colo320 셀라인에 대한 데이터는 기록되지 않았다.
세포 역가 글로(glow)(ATP 측정, Promega) 분석을 사용하여 부착성 세포 성장을 측정하였다. 24시간째에 세포를 3000-5000 세포/웰로 96-웰 플레이트에 평판했다. 여러 시점(트랜스펙션 후 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 120시간)에서 세포를 용해하고, 제조자의 지시에 따라 세포 역가 글로를 사용하여 분석했다. 세포 역가 글로 분석의 결과는 형광이며, 이것은 상대적 세포수에 비례한다. AGS, SW620, HT29, Colo320, A549 및 MRC9 세포에서는 부착성 세포 성장의 감소가 관찰 되었으며, 184B5 또는 HMEC 세포에서는 관찰되지 않았다.
연 한천 분석을 사용하여 비부착 세포 성장을 측정했다. 연 한천 분석은 먼저 Poly-HEMA로 비-조직 배양물 처리된 플레이트를 코팅하여 세포가 플레이트에 부착되는 것을 방지함으로써 수행하였다. 트립신을 사용하여 비-트랜스펙션 세포를 수거하고 배지로 2번 세척했다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고, 배지에 mL 당 104 세포로 다시 현탁했다. 50 mL 분취액을 PolyHEMA 코팅한 96-웰 플레이트에 가하고 트랜스펙션했다.
트랜스펙션 다음날 세포를 트립신 처리하고 다시 현탁하여 계수했다. 세포를 약 500 세포/100 ㎕/웰로 희석하고, 딥 웰 블록(최대 부피 = 1 mL/웰, 삼중, 표준 배치에 따름)으로 옮겼다. 세포를 분석용 Corning #7007 초 저 부착 U-플레이트와 평판 효능 검사용 Corning #3799의 2개 분석 플레이트에 평판했다. Seaplaque GTG 아가로스 3%를 약 1분간 가열하여 마이크로파 오븐에서 녹였다. 충분히 녹인 후 약 10 mL를 미리 가온한 50 mL 폴리프로필렌 시험관(Falcon #35-2070)에 붓고, 60℃ 가열 블록에서 적어도 10분간 인큐베이션했다. 약 18.6 mL의 완전 배지를 50 mL 폴리프로필렌 시험관에 첨가하고, 약 37℃ 수조에서 인큐베이션했다. Multimek™ 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 세포에 아가로스를 분배했다. 약 18.6 mL의 가온한 배지를 아가로스 10 mL에 붓고 부드럽게 뒤집어 잘 혼합했다. 플레이트를 약 4℃에서 20-30분간 인큐베이션하여 아가로스를 신속히 고화시켰다. 아가로스가 고화된 후 100 ㎕ 완전 배지를 세포 위에 가했다. Day 0 평판 효능을 측정하기 위 해 Alamar Blue를 약 25 ㎕/웰 가하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음에, 플레이트를 18-24시간 후에 TECAN 플레이트 리더에서 530 ex/590 em에서 판독했다. 분석 플레이트는 Alamar Blue(25 ㎕/웰)로 전개시키기 전에 37℃에서 7일간 인큐베이션하였다.
SW620, A549 및 MRC9 세포에서 비부착 세포 성장의 감소가 관찰되었다. AGS, HT29 또는 Colo320 세포에 대한 데이터는 기록되지 않았다. 이 분석은 MRC9, 184B5 및 HMEC 세포를 시험하는 데는 부적합한데, 왜냐하면 이 종류의 정상 세포는 일반적으로 비부착 방식으로 성장하지 않기 때문이다. AMIGO-2 조정제를 사용한 암 셀라인의 콜로니 형성 억제는 AMIGO-2가 전이 표현형의 생산 및/또는 유지에 중요함을 시사한다.
기능적으로 관련 있는 하류 마커에 대한 C315-1.3si 및 C315-4.3si siRNA에 의한 AMIGO-2 녹다운의 효과를 SW620 및 AGS 세포에서 시험했다. 세포를 siRNA와 함께 48시간 인큐베이션한 다음, 세포용해물을 웨스턴 블롯 분석했다. 항-AMIGO-2 항체인 RBAd70(Chiron, 캘리포니아 에머리빌)을 사용하여 AMIGO-2 단백질을 검출했다. 투불린을 로딩 대조군으로 사용했다. 두 siRNA는 모두 SW620과 AGS 세포에서 AMIGO-2 단백질 수준을 감소시켰다(도 10A 및 11). SW620 세포에서는 C315-1.3si가 C315-4.3si보다 더욱 효과적으로 AMIGO-2 단백질 수준을 감소시키는 것으로 나타났다(도 10A). 또한, SW620 세포에서 c-Myc mRNA 수준에 대한 AMIGO-2 녹다운의 효과를 C315-1.3si 및 C315-4.3si siRNA를 사용하여 시험했다. 세포를 siRNA와 함께 72시간 인큐베이션한 다음, mRNA를 분리하여 분석을 준비했다. c-Myc mRNA는 양성 대조군 siRNA와 2개의 AMIGO-2-특이적 siRNA 모두에 의해 감소하였는데, 이는 AMIGO-2가 전사 수준에서 c-Myc 발현에 영향을 미친다는 것을 시사한다(도 10B). 또한, 두 셀라인 모두에서 인산화된 ERK가 두 siRNA에 의해서 감소하였으며, SW620 세포에서는 C315-1.3si가 C315-4.3si보다 인산화를 더 많이 감소시킨 것으로 나타났다(각각 도 10 및 11). 또한, c-Myc, cFosL1 및 c-Jun이 두 셀라인 모두에서 두 siRNA에 의해 감소하였다(도 11, 12A, 14A 및 14B 참조). 또한, 사이클린 D1 발현이 2개의 AMIGO-2-특이적 siRNA로 트랜스펙션된 AGS 세포에서 모두 감소하였다(도 11). C315-1.3si로 트랜스펙션된 SW620 및 AGS 세포에서는 사이클린 B1 및 cFosL1 수준이 감소하였다(도 13). AMIGO-2 작동제인 항-AMIGO-2 항체 MAB2080에 노출된 SW620 세포는 웨스턴 블롯으로 측정했을 때 c-Myc(도 14C), c-Jun(도 12C), FosL1, 및 포스포-ERK의 상향-조절을 나타냈다(도 16). 또한, MAB2080과 접촉된 AGS 세포는 c-Myc(도 14C) 및 c-Jun(도 12C)의 상향-조절을 나타냈다. 추가하여, AMIGO-2로 안정하게 트랜스펙션된 Rat1 세포도 c-Jun 발현의 상향-조절을 나타냈다(도 12B). c-Myc, 사이클린 B1, cFosL1 및 c-Jun 발현에서 AMIGO-2의 분명한 역할은 AMIGO-2가 조기 발현 유전자의 조절에 관련된다는 것을 암시한다. 이들 관찰 및 사이클린 유전자 발현에 대한 AMIGO-2 하향-조절의 효과(상기 참조)는 세포 주기 조절에 있어서 AMIGO-2의 역할을 뒷받침한다.
유전자 발현에 대한 AMIGO-2 siRNA의 효과를 시험하기 위해 Affymetrix 실험을 수행했다(도 15A 및 15B). 이들 결과는 AMIGO-2 하향-조절과 관련된 cFosL1 및 사이클린 B1의 하향-조절을 확증하며, 이것은 세포 성장 및 생존에 있어서 AMIGO-2 의 역할과 일치한다.
실시예 5: AMIGO -2는 혈관형성을 억제한다
AMIGO-2 녹다운은 모두 혈관형성에 관련되는 유로키나제 및 VEGF 발현을 억제한다. AMIGO-2 발현이 정상 혈관에서 관찰되었는데, 이는 혈관형성에 있어서 이 유전자의 역할을 뒷받침한다(상기 실시예 2 참조). 또한, AMIGO-2처럼 신경 유도 및 운동성에 관련되는 많은 유전자가 혈관형성에 관련된다.
실시예 6: AMIGO -2 항체
Figure 112009007423111-PCT00001
실시예 7: AMIGO -2 안티센스 올리고뉴클레오티드
Figure 112009007423111-PCT00002
실시예 8: AMIGO -2 siRNA
Figure 112009007423111-PCT00003
실시예 9: AMIGO -2 에피토프
Figure 112009007423111-PCT00004
실시예 10: 정상 조직에서의 AMIGO -2 발현
정상 조직 절편을 제조하고, 토끼 항-AMIGO-2 또는 상기 설명된 Prebleed 항체 대조군으로 염색했다. 염색은 AMIGO-2가 부신, 유방, 자궁경부, 폐, 신장, 간, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 비장, 고환, 결장, 및 자궁, 특히 폐, 자궁경부, 심장, 및 간의 간질세포 하위군(예를 들어, 혈관 및 대식세포)을 포함하는 다양한 정상 인간 조직에서 발현된다는 것을 나타낸다. 이들 조직에서 AMIGO-2 단백질 발현 수준은 Affymetrix 실험(상기 참조)에 의해 측정된 상응하는 mRNA 발현 수준과 상호관련되며, 이는 AMIGO-2가 정상 조직에서, 특히 증식성 조직(예를 들어, 고환, 피부, 난소, 비장, 및 결장)에서 광범위하게 발현된다는 것을 나타낸다.
본 발명은 특정 구체예를 참조하여 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 진정한 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 있을 수 있으며, 동등물이 치환될 수 있음을 이해하여야 한다. 이에 더하여, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞춰서 특정 상황, 재료, 물질 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 개조하기 위한 많은 변형이 있을 수 있다. 모든 이러한 변형들은 본 발명의 범위에 들어간다.

Claims (121)

  1. 치료적 유효량의 AMIGO-2 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 환자에서 암 또는 암 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 AMIGO-2 억제제는
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 대조군과 비교하여 AMIGO-2 발현을 적어도 20%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 대조군과 비교하여 적어도 20%의 암세포의 세포사를 야기하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 또는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 87 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 ECD 내의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRRNT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR1 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:57로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR2 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO:61로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR3 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:56, 및 SEQ ID NO:58로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR4 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 35, 및 SEQ ID NO:45로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR5 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:36, 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR6 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRRCT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 Ig V-set 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 Ig 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 ECD의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 환자는 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암 또는 췌장암이 있거나, 또는 이들 암의 소인이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 암은 폐암 또는 결장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 4 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 운동성, 세포 유착, 종양 형성, 전이, AMIGO-2 신호화, 암세포 생존, 사이클린 생산, 키나제 활성, 기질 인산화, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 종양과 간질 조직 간 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 4 항에 있어서, 항체를 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 표지는 효소, 방사선 동위원소, 독소 또는 형광단인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 4 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2 이외의 다른 폴리펩티드에 대해 약 1x105 Ka 미만의 결합 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 SEQ ID NO:17-24에 제시된 서열의 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 제 1 가닥, 및 제 1 가닥에 실질적으로 상보성인 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 제 2 가닥을 포함하는 dsRNA 분자이며, 이때 dsRNA 분자는 3769개 뉴클레오티드 길이 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 SEQ ID NO:7-16에 제시된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 화학요법, 방사선요법 또는 수술 중 하나 이상으로 환자를 치료하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 암 증상은 만성기침, 호흡악화, 체중감소, 과도한 피로, 통증, 기침시 각혈, 혈뇨, 식욕감퇴, 심한 발한, 발열, 고혈압, 빈혈, 설사, 변비, 혈변, 황달, 현기증, 쇠약, 오한, 근육경련, 심정맥 혈전증, 비정상적 팽만, 붓기, 불규칙한 생리, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 신장 전이, 유방 전이, 자궁 전이, 난소 전이, 및 췌장 전이로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. AMIGO-2 활성을 조정하기에 효과적인 양의 AMIGO-2 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 AMIGO-2 활성을 조정하는 방법으로서, 상기 AMIGO-2 억제제는
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, AMIGO-2 활성은 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 운동성, 세포 유착, 종양 형성, 전이, AMIGO-2 신호화, AMIGO-2 하류 마커 조정, 암세포 생존, 사이클린 생산, 키나제 활성, 기질 인산화, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 종양과 간질 조직 간 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 또는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. AMIGO-2 치료요법에 감수성인 환자를 확인하는 방법으로서,
    (a) 샘플에서 AMIGO-2 발현 증거의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 상기 샘플에서 AMIGO-2 발현 증거의 존재는 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보임을 표시하고, 상기 샘플에서 AMIGO-2 발현 증거의 부재는 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보가 아님을 표시하는 단계;
    (b) 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보일 경우,
    (1) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (2) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (3) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (4) 소 분자;
    (5) 의태체;
    (6) 가용성 수용체; 및
    (7) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 억제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계; 및
    (c) 환자가 AMIGO-2 치료요법의 후보가 아닐 경우, 종래의 암치료제를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, AMIGO-2의 발현이 대조군과 비교하여 적어도 20% 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, AMIGO-2 발현의 증거를 AMIGO-2 RNA 수준을 측정함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, AMIGO-2 발현의 증거를 AMIGO-2 폴리펩티드 수준을 측정함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32 항에 있어서, 환자는 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암, 또는 췌장암 중 하나 이상이 있거나, 또는 이들의 소인이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 대조군과 비교하여 적어도 20%까지 세포의 성장을 억제하기에 효과적인 양의 AMIGO-2 억제제를 암세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 암세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 억제제는
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 암세포는 암 환자에 있거나, 또는 암 환자로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 또는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 치료적 유효량의 AMIGO-2 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 필요한 환자에서 암세포 표현형을 억제하는 방법으로서, 상기 AMIGO-2 억제제는
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연 속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 암세포 표현형은 콜라겐 내의 세포 운동성, 종양형성능, 비부착 방식으로 성장하는 능력, 세포 생존, 또는 세포 유착 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, 암세포는 폐암, 방광암, 신장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난소암, 및 췌장암 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. AMIGO-2의 하나 이상의 하류 마커를 조정하는 화합물을 AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 암을 보유한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암세포 성장을 억제하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 하나 이상의 AMIGO-2 하류 마커는 c-Myc, c-Jun, FosL1, 및 세포외 신호-조절 키나제(ERK)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, ERK는 인산화된 ERK인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 조영제에 연결된 AMIGO-2 억제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계, 및 환자에서 조영제의 국소화를 검출하는 단계를 포함하는 환자에서 종양을 검출하는 방법으로서, 상기 억제제는
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 조성물은 조영제에 콘쥬게이트된 AMIGO-2 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 조영제는 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb, 또는 206Bi인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. AMIGO-2를 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계, 및 AMIGO-2 활성이 조정되는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 대조군과 비교하여 AMIGO-2의 과발현을 특징으로 하는 암의 억제제를 확인하는 방법으로서, 이때 AMIGO-2 활성의 조정이 암 억제제임을 표시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 후보 화합물은 암세포에서는 AMIGO-2 활성을 조정하지만 비-암세포에서는 그렇지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  51. AMIGO-2를 발현하는 세포와 후보 화합물 및 AMIGO-2 리간드를 접촉시키는 단계, 및 AMIGO-2 하류 마커의 활성이 조정되는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 대조군과 비교하여 AMIGO-2의 과발현을 특징으로 하는 암의 억제제를 확인하는 방법으로서, 이때 하류 마커의 조정이 암 억제제임을 표시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 하류 마커는 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, c-Jun, FosL1, 세포외 신호-조절 키나제(ERK), 혈관내피 성장인자(VEGF), 유로키나제, 및 폴리(ADP-리보스)중합효소 1(PARP1)의 감소된 발현으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 하류 마커의 활성은 감소된 ERK 인산화 또는 감소된 ERK 발현인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51 항에 있어서, 하류 마커의 활성은 증가된 PARP1 절단인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 51 항에 있어서, 후보 화합물 및 AMIGO-2 리간드는 암세포에서는 AMIGO-2의 하류 마커의 조정을 유도하지만 비-암세포에서는 그렇지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  56. AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포에 세포독성제 또는 진단제를 송달하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 도메인 내에 있는, AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 정제된 항체에 콘쥬게이트된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계; 및
    (b) 세포를 항체-제제 또는 단편-제제 콘쥬게이트에 노출시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 환자로부터의 암 샘플에서의 AMIGO-2 발현과 대조군 샘플에서의 AMIGO-2 발현을 비교하는 단계, 및
    (1) 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 AMIGO-2 발현이 상향-조절되는 경우에는,
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 억제제를 포함하는 조성물로 환자를 치료하는 단계; 및
    (2) 대조군 샘플과 비교하여 암 샘플에서 AMIGO-2 발현이 불변이거나 하향-조절되는 경우에는, 2차 분석을 수행하는 단계
    를 포함하는 암 환자를 치료하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 2차 분석은 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성을 억제제의 존재 및 부재하에 비교하는 단계를 포함하며, 이때
    (1) AMIGO-2 억제제의 부재시에 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성과 비교하여 AMIGO-2 억제제의 존재시에 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성이 감소하는 경우에는,
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 억제제를 포함하는 조성물로 환자를 치료하거나; 또는
    (2) AMIGO-2 억제제의 부재시에 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성과 비교하여 AMIGO-2 억제제의 존재시에 암 샘플에서 AMIGO-2 하류 마커의 수준 또는 활성이 불변이거나 감소하는 경우에는, 종래의 암치료제로 환자를 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 57 항에 있어서, AMIGO-2 하류 마커는 사이클린 D1, 사이클린 B1, c-Myc, c-Jun, FosL1, VEGF, 유로키나제, 및 ERK로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 57 항에 있어서, 하류 마커의 활성은 ERK 인산화 또는 ERK 발현인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 57 항에 있어서, 하류 AMIGO-2 마커의 활성이 감소하는 것을 특징으로 하 는 방법.
  62. 제 57 항에 있어서, 2차 분석은 암 샘플에서 PARP1 절단을 억제제의 존재 및 부재하에 비교하는 단계를 포함하며, 이때
    (a) AMIGO-2 억제제의 부재시에 암 샘플에서 PARP1 절단과 비교하여 AMIGO-2 억제제의 존재시에 암 샘플에서 PARP1 절단이 증가하는 경우에는,
    (1) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (2) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (3) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (4) 소 분자;
    (5) 의태체;
    (6) 가용성 수용체; 및
    (7) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 억제제를 포함하는 조성물로 환자를 치료하거나; 또는
    (b) AMIGO-2 억제제의 부재시에 암 샘플에서 PARP1 절단과 비교하여 AMIGO-2 억제제의 존재시에 암 샘플에서 PARP1 절단이 증가하거나 불변인 경우에는, 종래의 암치료제로 환자를 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 후보 암세포로의 AMIGO-2 국소화에 대해 분석하는 단계를 포함하는 환자에서 암을 진단하는 방법으로서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 대한 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비가 적어도 2:1인 경우, 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유한 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 세포막을 포함하지 않는 암세포의 다른 영역에 국소화된 AMIGO-2에 대한 세포막에 국소화된 AMIGO-2의 비가 적어도 3:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 63 항에 있어서, 환자가 AMIGO-2-관련 암을 보유한 것으로 진단된 경우,
    (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 억제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 후보 화합물의 존재 및 부재하에 AMIGO-2를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플에서 AMIGO-2의 인산화를 비교하는 단계를 포함하는 AMIGO-2 조정제를 확인하는 방법으로서, 이때 후보 화합물의 부재시에 샘플에서 AMIGO-2의 인산화와 비교하여 후보 화합물의 존재시에 샘플에서 AMIGO-2의 인산화의 조정이 후보 화합물이 AMIGO-2 조정제임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서, AMIGO-2를 면역침전 항체를 사용하여 샘플로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 면역침전 항체는 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 에피토프는 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 도메인 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 66 항에 있어서, AMIGO-2 인산화는 세린/트레오닌 인산화인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 66 항에 있어서, AMIGO-2 인산화는 포스포-세린/트레오닌 항체를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 67 항에 있어서, 면역침전 항체는 포스포-세린/트레오닌 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. (a) 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2의 도메인 내의 에피토프와 결합하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:7-16으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드;
    (c) 분리된 이중-가닥 RNA(dsRNA);
    (d) 소 분자;
    (e) 의태체;
    (f) 가용성 수용체; 및
    (g) 유인체
    로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2 억제제 및 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  73. 제 72 항에 있어서, 조성물은 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 운동성, 세포 유착, 종양 형성, 전이, AMIGO-2 신호화, 암세포 생존, 사이클린 생산, 키나제 활성, 기질 인산화, 비부착 성장, AMIGO-2의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 종양과 간질 조직 간 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 AMIGO-2 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  74. 제 72 항에 있어서, 조성물은 암세포에서는 적어도 하나의 세포 표현형을 유도하지만 비-암세포에서는 그렇지 않은 것을 특징으로 하는 조성물.
  75. 제 72 항에 있어서, 조성물은 암세포 생존을 억제하거나, AMIGO-2의 세포질 인산화를 억제하거나, 혈관형성 또는 세포 증식을 억제하거나, 세린/트레오닌 키나제 활성을 억제하거나, ERK 인산화를 억제하거나, c-Jun, c-Myc 또는 FosL1 발현을 억제하거나, 또는 세포 주기의 G2/M 기로의 세포 분할 진행을 억제하는 것을 특징 으로 하는 조성물.
  76. 제 72 항에 있어서, 주사가능한 멸균 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  77. 제 72 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 AMIGO-2 번역을 억제하거나, AMIGO-2 mRNA 분해를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제 72 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 또는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  79. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRRNT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR1 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:57로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR2 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO:61로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR3 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:56, 및 SEQ H) NO:58로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR4 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 35, 및 SEQ ID NO:45로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  84. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR5 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:36, 및 SEQ ID NO:53로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRR6 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ED NO:31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 LRRCT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 Ig V-set 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 Ig 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  89. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2의 세포외 도메인(ECD)의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 서열로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  92. 제 78 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 AMIGO-2와 적어도 1x108 Ka의 친화성으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  93. 제 72 항에 있어서, AMIGO-2 활성은 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 운동성, 세포 유착, 종양 형성, 전이, AMIGO-2 신호화, 암세포 생존, 사이클린 생산, 키나제 활성, 기질 인산화, 비부착 성장, AMIGO-2 단백질의 세포막 국소화, AMIGO-2의 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 종양과 간질 조직 간의 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  94. 제 72 항에 있어서, 항체 또는 Fab 단편은 암세포 생존, AMIGO-2의 세포질 인산화, 또는 ERK 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  95. 제 72 항에 있어서, 조성물은 c-Jun, c-Myc, 또는 FosL1 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  96. 제 72 항에 있어서, 조성물은 세포 주기의 G2/M 기로의 세포 분할 진행을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  97. 제 72 항에 있어서, AMIGO-2 억제제는 SEQ ID NO:17-24로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 제 1 가닥, 및 제 1 가닥에 실질적으로 상보성인 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 제 2 가닥을 포함하는 dsRNA 분자이며, 이때 dsRNA 분자는 3769개 뉴클레오티드 길이 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
  98. 제 97 항에 있어서, dsRNA는 대조군과 비교하여 AMIGO-2 번역을 적어도 20%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  99. 신호 펩티드, LRRNT 도메인, LRR1 도메인, LRR2 도메인, LRR3 도메인, LRR4 도메인, LRR5 도메인, LRR6 도메인, LRRCT 도메인, Ig V-set 도메인, 및 Ig 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된 도메인 내에 있는 AMIGO-2 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 정제된 항체.
  100. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR1 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:57로 구성되 는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  101. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR2 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:39, 및 SEQ ID NO:61로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  102. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR3 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:56, 및 SEQ ID NO:58로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  103. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR4 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:45로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  104. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR5 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:36, 및 SEQ ID NO:53로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  105. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRR6 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  106. 제 99 항에 있어서, 항체는 AMIGO-2의 LRRCT 도메인의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:62로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  107. 제 99 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  108. 제 119 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3로 본질적으로 구성되는 서열 내의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  109. 제 99 항에 있어서, 항체는 염색체 안정성, 종양형성능, 세포 증식, 세포 주기 조절, 암세포 운동성, 세포 유착, 종양 형성, 전이, AMIGO-2 신호화, 암세포 생 존, 사이클린 생산, 키나제 활성, 기질 인산화, 비부착 성장, AMIGO-2의 세포막 국소화, AMIGO-2와 AMIGO-1 또는 AMIGO-3 중 하나 또는 양자 간의 상호작용, 세포질 인산화 AMIGO-2 단백질 수준, 종양과 간질 조직 간 상호작용, 및 혈관형성으로 구성되는 군으로부터 선택된 AMIGO-2 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  110. SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, AMIGO-2 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 정제된 항체.
  111. 제 99 항의 항체를 생산하는 분리된 세포.
  112. 제 99 항의 항체를 생산하는 하이브리도마.
  113. 제 99 항의 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 동물.
  114. SEQ ID NO:3-6 및 25-62로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프를 포함하는, SEQ ID NO:2의 폴리펩티드의 분리된 에피토프-보유 단편.
  115. 제 114 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 약 6개 내지 약 20개 연속 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 에피토프-보유 단편.
  116. 제 114 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 적어도 21개에서 522개 미만의 연속 아미노산을 포함하는 에피토프-보유 단편.
  117. 제 114 항의 분리된 에피토프-보유 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  118. 제 114 항의 에피토프-보유 단편으로 피험자를 면역화함으로써 획득된 정제된 AMIGO-2 항체.
  119. SEQ ID NO:17-24에 제시된 서열의 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 제 1 가닥, 및 제 1 가닥에 실질적으로 상보하는 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 제 2 가닥을 포함하며, 3769개 미만의 뉴클레오티드 길이인 분리된 dsRNA 분자.
  120. 제 119 항에 있어서, 뉴클레오티드의 제 2 가닥이 제 1 가닥에 완전히 상보성인 서열을 포함하며, 3769개 뉴클레오티드 길이 미만인 것을 특징으로 하는 분리된 dsRNA 분자.
  121. SEQ ID NO:7-16에 제시된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산.
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