CN105017393A - 与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下a)或b)：a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗逆性相关的蛋白质。实验证明，将蛋白的编码基因导入野生型拟南芥，得到转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，抗旱、抗盐和抗碱性明显提高。本发明对于培育抗旱、抗盐和抗碱性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用。
背景技术
随着全球水资源的缺乏和极端气候事件的增长，逆境对作物的产量和品质的影响日趋显著。因此，通过分子操作技术提高作物的抗逆性日显重要。
生物体受到干旱胁迫或其它不良环境因素后，会产生一系列的应激反应，其中热激蛋白(heat shock protein，HSP)一方面能促使新生蛋白折叠和错误折叠的蛋白重新正确折叠，另一方面还能使变性聚集蛋白降解，同时维持一系列酶和细胞膜的稳定性。进一步研究发现，HSPs的含量与生物体耐胁迫性呈正相关，且能够提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率。
复苏植物可以忍受极度干旱的条件，待水份充足时又能很快恢复正常生命活动。已知被子植物中的复苏植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亚。旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)是在我国分布的一种苦苣苔科复苏植物，该植物在以石灰岩为主的喀斯特高盐重碱地区生长旺盛，其叶片具有很强的耐旱复苏能力，在室温、相对空气湿度为0的条件下生长72小时后，叶片相对含水量降为3％左右，叶片面积皱缩至原叶片面积的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新给水，叶片就可以吸水伸展，并恢复成未处理前的叶片表观状态和生理状态(包括光合作用的恢复)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白BhDNAJC2及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，名称为BhDNAJC2，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将(a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗逆性相关的蛋白质。
为了便于BhDNAJC2蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
编码所述BhDNAJC2蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述BhDNAJC2蛋白的基因(命名为BhDNAJC2)；所述BhDNAJC2基因可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2的第193-696位所示的DNA分子；
2)序列表中序列2的第181-721位所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)中任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列2由913个核苷酸组成，第193-696位为ORF，编码序列表中序列1所示的BhDNAJC2蛋白。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述BhDNAJC2基因转录的启动子具体为pA35S启动子；终止所述BhDNAJC2基因转录的终止子具体为pA35S终止子。
更为具体的，所述重组表达载体为在pLeela载体的重组位点attR1和attR2之间***所述BhDNAJC2基因得到的重组质粒。
所述表达盒由能够启动所述BhDNAJC2基因表达的启动子，所述BhDNAJC2基因，以及转录终止序列组成。
所述BhDNAJC2蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a1)调控植物抗逆性；
(a2)选育抗逆性提高的植物品种。
在本发明中，所述调控植物抗逆性体现在：在所述植物体内，若所述BhDNAJC2基因的表达量越高，则所述植物的抗逆性越强。
在本发明中，所述选育抗逆性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述BhDNAJC2基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
a)向目的植物中导入所述BhDNAJC2蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗逆性提高的转基因植物。
所述BhDNAJC2蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物。编码所述BhDNAJC2蛋白的基因(即所述BhDNAJC2基因)具体可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2的第193-696位所示的DNA分子；
2)序列表中序列2的第181-721位所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)中任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述BhDNAJC2基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。
在上述应用或方法中，所述抗逆性均具体可为如下中的至少一种：抗旱性、抗盐性、抗碱性。
在上述应用或方法中，所述植物既可以为双子叶植物，也可为单子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，如野生型拟南芥Col-0。
扩增所述BhDNAJC2基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明从复苏植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)中筛选到一个受干旱诱导表达的BhDNAJC2基因，将该基因导入野生型拟南芥，得到BhDNAJC2转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，抗旱、抗盐和抗碱性明显提高，说明BhDNAJC2是与植物抗旱、抗盐和抗碱相关的蛋白。因此BhDNAJC2蛋白及其编码基因对于培育抗旱、抗盐和抗碱性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
附图说明
图1为BhDNAJC2基因在旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)干旱复苏过程中的表达情况。图中，不同的小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。
图2为T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7中BhDNAJC2基因表达的RT-PCR检测结果。
图3为T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的抗旱能力鉴定。其中，A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型；B为1/2MS+20％PEG培养基上各植株表型C为根长统计结果；D为离子渗漏结果；E为Fv/Fm结果。图中，不同的小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。
图4为T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的抗盐能力鉴定。其中，A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型；B为1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基上各植株表型；C为根长统计结果；D为离子渗漏结果；E为Fv/Fm结果。图中，不同的小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。
图5为T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的抗碱能力鉴定。其中，A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型；B为1/2MS培养基(pH9.0)培养基上各植株表型；C为根长统计结果；D为离子渗漏结果；E为Fv/Fm结果。图中，不同的小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
RNase抑制剂(购自Takara公司)。反转录酶SuperScript TM III(购自Invitrogen公司)。pENTR/D-TOPO载体(购自Invitrogen公司)。Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(购自NEB公司)。
植物表达载体pLeela：记载于“A novel role for histone methyltransferaseKYP/SUVH4in the control of Arabidopsis primary seed dormancy，New Phytologist(2012)193:605-616”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。
农杆菌Gv3101(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)：记载于“BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation,M Bevanin,Nucleic Acids Research(1984)12(22):8711-8721”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。
野生型拟南芥Col-0(ecotype Columbia-0，Arabidopsis thaliana)：记载于“Arabidopsis,a useful weed.Meyerowitz EM,Cell(1989)56:263-270.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。
实施例1、BhDNAJC2基因的克隆及表达
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片总RNA，利用文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因进行测序，发现其中1个编码DNAJ类型热激蛋白。分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。结果发现，该基因受干旱诱导上调，获取该基因的方法具体如下：
提取经干旱胁迫处理的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA，并以其为模板进行反转录。详见Zhennan Zhang,Bo Wang,Dongmei Sun*&Xin Deng*.2013,Molecular cloning and differential expression of sHSP gene family members from theresurrection plant Boea hygrometrica in response to abiotic stresses.Biologia68(4):651-661一文。
(1)DNA消化(10μl)：总RNA2μg；10×DNase buffer1μl；DNaseI(50U/μl)0.4μl；RNase抑制剂0.1μl；DEPC-H2O补足至10μl。37℃30min。
(2)反转录(25μl)：经过DnaseI消化处理的总RNA10μl；OligodT1μl；DEPC-H2O2.5μl；70℃温育5min，冰上放置5min；然后加入5×buffer5μl；2mM dNTP5μl；RNase抑制剂0.5μl；反转录酶SuperScript TM III1μl。42℃温育1h。
反转录得到的cDNA稀释10倍作为模板，以BhDNAJC2-F和BhDNAJC2-R为引物，采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行基因全长的扩增。反应条件为：先98℃预变性45sec；然后98℃变性10sec，55℃退火20sec，再72℃延伸1.5min，共40个循环；最后72℃延伸10min。
BhDNAJC2-F：5’-CACCTTTGATTTCTGAATGGAGTTC-3’(下划线处为与pENTR/D-TOPO载体缺口处匹配的序列，其后的序列为序列2的第181-201位)；
BhDNAJC2-R：5’-TTGTGAA GCTGGTACACTC GAATTT-3’(序列2的第697-721位的反向互补序列)。
反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到大小为541bp左右的PCR产物，回收该PCR产物条带。
将该PCR产物与pENTR/D-TOPO载体连接，将测序正确的质粒记为中间载体BhDNAJC2-pENTR。中间载体BhDNAJC2-pENTR的结构描述为：将序列表中序列2的第181-721位所示DNA序列与pENTR/D-TOPO载体连接后得到的重组质粒。
将序列2所示的基因命名为BhDNAJC2基因，该基因的编码区为序列2中自5’末端第193-696位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为BhDNAJC2蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。
实施例2、BhDNAJC2基因在旋蒴苣苔干旱复苏过程中的表达研究
对旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)进行2种不同程度的干旱处理，分别为：
新鲜植株(F)：每天正常浇水；
新鲜植株土里慢速干旱5天(S5D)：连续5天不进行浇水；
新鲜植株土里慢速干旱14天(S14D)：连续14天不进行浇水。
新鲜植株土里慢速干旱14天后复水3天(A)：连续14天不进行浇水后进行3天的正常浇水复苏。
每个处理的植株数至少为5株。
分别提取3种处理旋蒴苣苔叶片的总RNA、反转录获得cDNA。用基因特异性引物BhDNAJC2-f和BhDNAJC2-r进行Q-PCR扩增。并以18S rRNA基因为内参，扩增引物为18S-f和18S-r。
BhDNAJC2-f：5’-GTTCTTGGTGTTCGCTCGTAC-3’(序列2的第229-249位)；
BhDNAJC2-r：5’-AGCAGAGCCGTACAATCCAG-3’(序列2的第419-438位的反向互补序列)。
18S-f：5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’；
18S-r：5’-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’。
反应体系为：cDNA1μl，10μl2×SYBR Green Master Mix，上下游引物各0.5μl，ddH2O8.5μl。反应程序为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延伸30分钟，共40个循环。
结果如图1所示，可以看出S14D组中BhDNAJC2基因的表达量显著高于F组。可见，BhDNAJC2基因明显受干旱诱导。
实施例3、BhDNAJC2转基因植株的获得及抗逆性鉴定
一、BhDNAJC2转基因拟南芥的获得
1、重组表达载体pLeela-BhDNAJC2的获得
将实施例1中构建的中间载体BhDNAJC2-pENTR通过LR反应(LR克隆酶，购自Invitrogen公司)将实施例1的PCR产物导入植物表达载体pLeela，同源重组得到重组载体。
将经测序表明在植物表达载体pLeela的attR1和attR2重组位点间***了实施例1的PCR产物(即序列2的第181-721位所示DNA片段)的重组载体命名为pLeela-BhDNAJC2。
在重组表达载体pLeela-BhDNAJC2中，启动所述BhDNAJC2基因转录的启动子为pA35S启动子，终止所述BhDNAJC2基因转录的终止子为pA35S终止子。
2、重组农杆菌的获得
将上述重组表达载体pLeela-BhDNAJC2转化到农杆菌Gv3101中，用含有50μg·mL-1硫酸卡那霉素、50μg·mL-1庆大霉素和50μg·mL-1利福平的YEB培养基进行筛选，得到重组农杆菌。
提取重组菌的质粒送去测序，结果该质粒为pLeela-BhDNAJC2(测序表明在pLeela载体的attR1和attR2重组位点间***了序列2的第181-721位所示DNA片段的重组质粒)，说明为阳性重组菌，将重组菌其命名为Gv3101/pLeela-BhDNAJC2。
实验同时设置向农杆菌Gv3101中转入pLeela空载体的对照，所得农杆菌命名为Gv3101/pLeela。
3、BhDNAJC2转基因拟南芥的获得及鉴定
(1)BhDNAJC2转基因拟南芥的获得
将重组菌Gv3101/pLeela-BhDNAJC2和Gv3101/pLeela分别采用花序浸泡法转化野生型拟南芥Col-0(ecotype Columbia-0，Arabidopsis thaliana)，得到T0代转BhDNAJC2转基因拟南芥和T0代转入pLeela空载体的拟南芥。
取T0代BhDNAJC2转基因拟南芥种子，全部均匀地播种于含有10mg·L-1草胺膦的1/2MS培养基上，将具有抗性的成活幼苗(T1代)移至温室培养(培养温度22℃，光周期16/8小时)，收集T1代BhDNAJC2转基因拟南芥的种子。
分别取100粒T1代BhDNAJC2转基因拟南芥种子播种于含10mg·L-1草胺膦的1/2MS培养基中，将分离比为3：1的T2代BhDNAJC2转基因拟南芥的成活幼苗(5-10棵)移至温室培养，收集T2代BhDNAJC2转基因拟南芥的种子。
分别取100粒T2代BhDNAJC2转基因拟南芥种子播种于含10mg·L-1草胺膦的1/2MS培养基中，将不发生分离T3代BhDNAJC2转基因拟南芥的成活苗(10棵左右)移至温室培养，收集T3代BhDNAJC2转基因拟南芥的种子(纯合体)。
从获得的T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系中随机选取3株，分别记为：OE4-5、OE7-7、OE8-7。
(2)BhDNAJC2转基因拟南芥的鉴定
分别提取10天苗龄的上述T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7和野生型拟南芥Col-0的总RNA，并以其为模板，以BhDNAJC2-F和BhDNAJC2-R(序列见实施例1)为引物进行RT-PCR。PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后再72℃延伸10分钟。
实验以18S rRNA基因做为内参，扩增引物为18S-f和18S-r(序列见实施例2)。PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环；最后再72℃延伸10分钟。
实验设置以未转基因的野生型拟南芥Col-0和转入pLeela空载体的拟南芥作为对照。
反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每组样品进行2次重复。
结果如图2所示，可以看出，未转基因的野生型拟南芥Col-0(WT)中没有BhDNAJC2基因的扩增出条带，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7中，皆有大小约为541bp的目的片段，可见T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7为阳性。而转入pLeela空载体的拟南芥植株与未转基因的野生型拟南芥Col-0(WT)一致，未扩增出大小约为541bp的目的片段。
二、BhDNAJC2转基因拟南芥的抗逆性鉴定
1、实验方法
将步骤一鉴定阳性的T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7，转入pLeela空载体的拟南芥植株，以及未转基因的野生型拟南芥Col-0，播于1/2MS培养基(pH5.6)上，4℃春化3天后，培养在22℃、50％湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，4天后将小苗进行分别转移至如下三种用于抗性分析的培养基上，10天后照相，统计根长、测定离子渗漏(相对电导率)和PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)，从而分析各株系的抗旱、抗盐和抗碱的能力。每个株系6-8株，实验共设三次重复，结果取平均值。
用于分析抗旱性的培养基：1/2MS+20％PEG(质量百分含量)培养基，pH5.6；
用于分析抗盐性的培养基：1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基，pH5.6；
用于分析抗碱性的培养基：1/2MS培养基(pH9.0)。
实验中，每种抗性分析时均设置1/2MS(pH5.6)作为对照。
细胞膜具有选择透性而维持稳定，但当植物遭受环境胁迫时，细胞膜***先遭到破坏，细胞膜出现大量空洞甚至破裂，细胞内溶物大量溢出到细胞外，导致细胞浸提液电导率急剧增大，相对电导率已作为衡量细胞质膜是否受到伤害的指标(Wang YC,Qu GZ,Li HY,Wu YJ,Wang C,Liu GF,Yang CP(2010).Enhanced salt tolerance oftransgenic poplar plants expressing a manganese superoxide dismutase from TamarixandrossowiI.Molecular Biology Reports37,1119-1124.)。Fv/Fm反映PSⅡ反应中心光能转化效率，其参数值的大小和变化特征往往用于判断和推测植物对环境因子的抗性，也有人用来作为植物耐热、耐低温、耐盐、耐强光、耐干旱、抗污染等方面的重要指标(Yang CW,Peng CL,Duan J,Lin GZ,Chen YZ(2002).Responses of chlorophyllfluorescence and carotenoids biosynthesis to high light stress in rice seedling leaves atdifferent leaf position.Acta Botanica Sinica44,1303-1308.)。
其中，相对电导率测定方法如下：利用电导率仪(EC215，意大利HANNA公司)测定植物的相对电导率，取不同处理下培养完整的各株系的幼苗，用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，各取0.1g(鲜重)，分别置于6ml去离子水的刻度试管中，拧上盖子置于室温下浸泡处理4h。用电导仪测定浸提液电导A，然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导B。相对电导率＝A/B×100％。
Fv/Fm测定方法如下：利用调制叶绿素荧光成像系(MAXI-Imaging-Pam，德国Walz公司)测定PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)，不同处理下培养完整的各株系的幼苗在黑暗下处理20min后，测定叶绿素荧光Fv/Fm。数据用ImagingWin v2.32读出，导入excel中进行分析。
2、实验结果
(1)抗旱性分析
结果如图3所示。
A.根长结果
如图3中A-C所示。其中，图3中A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型观察，可以看出，各植株的根长基本一致(p>0.05)。图3中B为1/2MS+20％PEG(质量百分含量)培养基上各植株表型观察，可以看出，与野生型拟南芥Col-0(WT)相比，T3代转BhDNAJC2拟南芥株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长更长(p<0.05)。图3中B统计根长结果如图3中C所示，在1/2MS+20％PEG(质量百分含量)培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长分别为5.00cm、5.00cm、5.17cm，长于野生型拟南芥Col-0(WT)的根长4.28cm，且与未经干旱处理的1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株的根长无显著差异(p>0.05)。
B.离子渗漏结果
如图3中D所示，可以看出，在1/2MS+20％PEG(质量百分含量)培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的相对电导率分别为38％，31％，28％，显著低于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的相对电导率46％。
C.Fv/Fm结果
如图3中E所示，可以看出，在1/2MS+20％PEG(质量百分含量)培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的Fv/Fm分别为0.62，0.64，0.59，显著高于(P<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的Fv/Fm值0.5。
(2)抗盐性分析
结果如图4所示。
A.根长结果
如图4中A-C所示。其中，图4中A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型观察，可以看出，各植株的根长基本一致(p>0.05)。图4中B为1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基上各植株表型观察，可以看出，与野生型拟南芥Col-0(WT)相比，T3代转BhDNAJC2拟南芥株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长更长(p<0.05)。图4中B统计根长结果如图4中C所示，在1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长分别为1.91cm、1.87cm、2.69cm，明显长于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的根长1.38cm。
B.离子渗漏结果
如图4中D所示，可以看出，在1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的离子渗漏值分别为65％，61％，62％，显著低于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的离子渗漏值77％。
C.Fv/Fm结果
如图4中E所示，可以看出，在1/2MS+150mmol·L-1NaCl培养基上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的Fv/Fm分别为0.80，0.81，0.78，显著高于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的Fv/Fm值0.23。
(3)抗碱性分析
结果如图5所示。
A.根长结果
如图5中A-C所示。其中，图5中A为1/2MS(pH5.6)对照培养基上各植株表型观察，可以看出，各植株的根长基本一致(p>0.05)。图5中B为1/2MS培养基(pH9.0)上各植株表型观察，可以看出，与野生型拟南芥Col-0(WT)相比，T3代转BhDNAJC2拟南芥株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长更长(p<0.05)。图5中B统计根长结果如图5中C所示，在1/2MS培养基(pH9.0)上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的根长分别为7.32cm，6.04cm，8.40cm，明显长于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的根长0.90cm。
B.离子渗漏结果
如图5中D所示，可以看出，1/2MS培养基(pH9.0)上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的离子渗漏值分别为26％，25％，20％，显著低于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的离子渗漏值59％。
C.Fv/Fm结果
如图5中E所示，可以看出，在1/2MS培养基(pH9.0)上，T3代BhDNAJC2转基因拟南芥纯合株系OE4-5、OE7-7、OE8-7的Fv/Fm分别为082，0.79，0.83，显著高于(p<0.05)野生型拟南芥Col-0(WT)的Fv/Fm值0.17。
另外，对于以上各结果，转空载体拟南芥和未转基因野生型拟南芥Col-0(WT)结果无显著差异。
综上所述，BhDNAJC2转基因植株的抗旱、抗盐和抗碱性明显优于未转基因的植株，说明BhDNAJC2是与植物抗旱、抗盐和抗碱相关的蛋白。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将(a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗逆性相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2的第193-696位所示的DNA分子；
2)序列表中序列2的第181-721位所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)中任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中，启动所述基因的转录的启动子为pA35S启动子。
7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4-6中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：
(a1)调控植物抗逆性；
(a2)选育抗逆性提高的植物品种。
8.培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：
a)向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗逆性提高的转基因植物。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为如下中的至少一种：抗旱性、抗盐性、抗碱性。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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