CN101921721A - 一种新的海洋疣孢菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从海绵中分离并筛选到一株抗肿瘤活性很好的放线菌，该放线菌为海洋疣孢菌菌株FIM06031(Verrucosispora sp.FIM06031)，并且提供了从该疣孢菌菌株FIM06031发酵液中提取分离得到对肿瘤细胞具有细胞毒活性的萜类化合物FW03104的方法。本发明的优点在于：为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种新的海洋疣孢菌菌株FIM06031及应用其产生的抗肿瘤活性先导化合物FW03104。
【背景技术】
疣孢菌属(Verrucosispora)最早分自沼泽淤泥，属于放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae)，因孢子表面有疣状突起而得名，随培养时间增长，孢子表面的疣会变为毛发状，革兰氏阳性，不抗酸，严格好氧，化能异养菌，基丝发达，分枝有隔，直径0.4μm，产生单个不游动孢子。已报道的疣孢菌属菌种很少，菌种大部分来自于海洋、红树林。来源于疣孢菌属菌种的次级代谢产物的研究报道少。2004年德国Tübingen大学Bister等从疣孢菌AB-18-032次级代谢产物中得到了结构新颖的多环聚酮类抗生素abyssomicinB～D，其中abyssomicin C强烈抑制革兰氏阳性菌的生长，甚至可以抑制耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的生长。2008年德国Tübingen大学Fiedler等从疣孢菌MG-37中发现新型抗肿瘤的呋喃衍生物Proximicin A，B和C。Proximicins在结构上含有4-氨基呋喃-2-羧酸，是一种新发现的γ-氨基酸。Proximicins抗菌活性较弱，但具有很强的针对肠道上皮肿瘤细胞、乳腺癌、肝癌的抗肿瘤活性，正被作为新的抗癌候选药物进行深入地研究和开发。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新的海洋疣孢菌菌株FIM06031，该疣孢菌菌株FIM06031于2010年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3924，且通过提取分离该新菌株的发酵液获得一种能够抑制肿瘤的萜类先导化合物。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室从东海福建莆田平海海域的海绵中分离到几十株共附生放线菌，并筛选到一株抗肿瘤活性很好的放线菌。通过菌株培养特征、生理生化特性和16S rRNA基因***进化分析，将其鉴定为疣孢菌属的一个菌株。
进一步地，从该菌株的发酵液中分离到一个具有细胞毒活性很强的结构新颖的萜类化合物FW03104，该萜类化合物FW03104的化学结构式为：
进一步地，该萜类化合物FW03104具有下述物理化学性状：
(1)颜色和外观：白色无定形粉末；
(2)分子式：C23H32O3；
(3)高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)
测量值：m/z 379.2249[M+Na]+
理论值：m/z 379.2351[M+Na]+；
(4)1H核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：4.54(dd)，1.03，1.79，1.41，1.76，1.92(m)，1.49，1.94，1.11，1.84，1.75(s)，4.71(d)，0.94(s)，1.15(s)，3.38(s)，7.36，7.31，7.50；
(5)13C核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：83.0，41.7，72.0，54.1，26.2，26.8，27.6，47.2，41.4，39.5，151.6，21.5，108.9，14.5，22.5，173.3，49.9，135.9，130.4，129.6，128.1；
(6)溶解度：溶于甲醇，丙酮，乙腈，乙酸乙酯和二甲亚砜；微溶于正己烷和石油醚；不溶于水。
进一步地，所述萜类化合物FW03104制备方法的具体步骤为：
(1)制备疣孢菌FIM06031的发酵液：首先将一铂环疣孢菌FIM06031淀粉天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基，温度35℃，转速240rpm/min，培养时间45h，然后按10％移种量转入发酵培养基，温度28℃，转速240rpm/min，振荡培养96～120h；
(2)提取：将经步骤(1)培养所得的疣孢菌FIM06031菌株发酵液通过4500rpm离心15min后，把获得的菌丝渣用2倍体积的95％乙醇浸泡2次，浸泡液减压浓缩，浓缩液用等量体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；
(3)分离：将步骤(2)获得的提取物采用正相硅胶柱层析，以环己烷∶丙酮溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经C18反相柱层析，以甲醇∶水梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以丙酮洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，得到对肿瘤细胞具有细胞毒活性的萜类化合物FW03104纯品。
进一步地，所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，(NH4)2SO40.05％，CaCO30.1％，50％陈海水配制，pH 7.5；
发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4％，葡萄糖0.5％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO40.05％，CaCO30.1％，50％陈海水配制，pH7.8。
本发明的有益效果在于：提供了一种分离自海绵的海洋疣孢菌菌株FIM06031，并且提供了从该疣孢菌菌株发酵液中提取分离得到萜类化合物FW03104的方法，该萜类化合物FW03104对肿瘤细胞具有细胞毒活性，该发明为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明一种新的海洋疣孢菌菌株FIM06031及最接近的典型种的基于16S rRNA基因序列的***发育树的示意图。
图2是本发明中萜类化合物FW03104的氢核磁共振图谱。
图3是本发明中萜类化合物FW03104的碳核磁共振图谱。
图4是本发明中萜类化合物FW03104的异核多键相关图谱。
图5是本发明中萜类化合物FW03104的氢氢化学位移相关二维图谱。
图6是本发明中萜类化合物FW03104的异核单量子相干图谱。
图7是本发明中萜类化合物FW03104的135度无畸变极化转移增益图谱。
【具体实施方式】
本发明一种新的海洋疣孢菌菌株FIM06031是从东海福建莆田平海海域的海绵中分离、筛选并通过菌株培养特征、生理生化特性和16S rRNA基因***进化分析鉴定获得的。另外，从该疣孢菌菌株FIM06031发酵液中提取分离获得一种对三种肿瘤细胞HepG2、EC109和HeLa均具有细胞毒活性的萜类化合物FW03104纯品。
1.该菌株FIM06031的分离：
(1)将10克海绵(未定名，2006年6月采集自我国东海福建莆田平海海域)用无菌水清洗3遍，剪刀减碎，加入无菌陈海水30mL于无菌研钵研磨3-5分钟，制成海绵悬液，取部分海绵悬液用陈海水稀释成10-1和10-2倍；
(2)分别取原液及稀释过的海洋生物样品悬液0.1mL涂布于淀粉天冬素分离琼脂平板上，平板于32℃下培养7-20d；
(3)肉眼观察上述已培养的分离琼脂平板，菌落形态类似(菌落圆形、***、小、光滑)，菌落在培养初期为橙色，随培养时间延长转变为棕色、黑色，挑取放线菌单菌落转接于淀粉天冬素琼脂斜面培养基，于32℃下培养10-15d，共获得47株放线菌，通过菌株抗肿瘤活性初筛，获得一株发酵产物具有显著抗肿瘤活性的菌株FIM06031。
其中，淀粉天冬素分离琼脂的组分为：可溶性淀粉2％，L-天冬素0.5％，KNO30.1％，K2HPO4·3H2O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO30.1％，K2Cr2O70.005％，多菌灵(含50％苯丙咪唑)0.1％，琼脂1.5％，pH7.5；
淀粉天冬素琼脂斜面培养基的组分为：可溶性淀粉2％，L-天冬素0.05％，KNO30.1％，K2HPO4·3H2O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO30.1％，琼脂1.8％，pH7.5。
2.该菌株FIM06031的鉴定：
(1)将菌株FIM06031的斜面培养物划线于高氏天冬素琼脂平板斜插盖玻片于32℃下培养5-20天，观察气丝、基丝及色素；取出盖玻片用光学显微镜观察，电子显微镜下观察孢子形态及外观；培养特征和生理生化特性采用国际链霉菌计划推荐的培养基进行培养、观察和描述；菌株FIM06031孢子单个着生在孢子梗上，孢子表面有疣状突起；在无机培养基上孢子少，在有机培养基上生长良好，在20-40℃均可生长(最适生长温度35℃)，45℃以上不生长；能液化明胶、凝固胨化牛奶；能利用蔗糖、麦芽糖、淀粉、D-葡萄糖、D-木糖和D-甘露糖等，不利用蜜二糖、鼠李糖、棉籽糖、松三糖、D-果糖、山梨醇和肌醇等；不水解纤维素；
(2)菌株FIM06031基因组DNA采用酶解法提取，得到的DNA样品储存于-20℃，将该DNA样品作为DNA模板进行16S rRNA基因PCR扩增，PCR产物送北京三博公司测序；将所测得的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，***进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行***进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；结果发现菌株FIM06031与稀有放线菌疣孢菌属(Verrucosispora)发表生效的模式菌株Verrucosispora gifhornensis DSM 44337T的同源性最高，相似性99.78％，与疣孢菌Verrucosispora sp.AB-18-032相似性最高达99.85％；
(3)综上得知，菌株FIM06031为疣孢菌属(Verrucosispora)的一个菌株，定名为Verrucosispora sp.FIM06031。另外，菌株FIM06031的16S rRNA基因部分序列长1375bp，在DNA数据库GenBank登录号为EU696742。其***发育树见图1。
3.萜类化合物FW03104制备方法的具体步骤为：
(1)制备疣孢菌FIM06031的发酵液：首先将一铂环疣孢菌FIM06031淀粉天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基，温度35℃，转速240rpm/min，培养时间45h，然后按10％移种量转入发酵培养基，温度28℃，转速240rpm/min，振荡培养96～120h；
其中，种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，(NH4)2SO40.05％，CaCO30.1％，蒸馏水配制，pH 7.5；
发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4％，葡萄糖0.5％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO40.05％，CaCO30.1％，蒸馏水配制，pH 7.8；
(2)提取：将经步骤(1)培养所得的疣孢菌FIM06031菌株发酵液通过4500rpm离心15min后，把获得的菌丝渣用2倍体积的95％乙醇浸泡2次，浸泡液减压浓缩，浓缩液用等量体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；
(3)分离：将步骤(2)获得的提取物采用正相硅胶柱层析，以环己烷∶丙酮溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经C18反相柱层析，以甲醇∶水梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以丙酮洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，得到萜类化合物FW03104纯品，从外形上看，其为白色无定形粉末。
4.通过MS和NMR技术鉴定萜类化合物FW03104的结构：
高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)
测量值：m/z 379.2249[M+Na]+
理论值：m/z 379.2351[M+Na]+
1H核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：4.54(dd)，1.03，1.79，1.41，1.76，1.92(m)，1.49，1.94，1.11，1.84，1.75(s)，4.71(d)，0.94(s)，1.15(s)，3.38(s)，7.36，7.31，7.50(见图2)；
13C核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：83.0，41.7，72.0，54.1，26.2，26.8，27.6，47.2，41.4，39.5，151.6，21.5，108.9，14.5，22.5，173.3，49.9，135.9，130.4，129.6，128.1(见图3)；
同时，本发明还测定了该化合物多种核磁共振图谱(见图4至图7)，从而确定了该化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该化合物的化学结构，确定其为结构新颖的萜类化合物，结构式如下：
5.对萜类化合物FW03104进行体外抗肿瘤试验：
本实施例对萜类化合物FW03104进行了体外抗肿瘤试验，表明其具有显著的抑制肿瘤的作用。试验所用菌株为国际通用的肿瘤细胞株，即：
EC109(食管癌细胞)；
HepG2(肝癌细胞)；
HeLa(***细胞)。
具体实施方式：分别取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，调细胞悬液密度至1×105～4×105个/mL，按100μL/孔接种于96孔板，于5％CO2、37℃条件下培养24h；将培养孔内的培养基吸净，每孔加入100μL已配制好的相应浓度的含药物的培养液，同时设对照和空白(对照和空白按照最高浓度的药物中的甲醇的百分比配制)，此时培养基血清浓度为2％，于5％CO2、37℃条件下继续培养；在培养24h，48h和72h后，分别取出相应的孔板，倒置显微镜下观察，并拍下细胞的形态图；72h后每孔加入MTT液(5mg/ml)10μL，于培养箱中继续孵育3-4h；吸净培养液，每孔加入150μL的DMSO，在脱色摇床上摇动(约10min)溶解结晶；选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。按如下公式计算药物对肿瘤细胞抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率(IC)＝(OD对照组-OD实验组)/OD对照组*100％。
肿瘤细胞生存率＝OD实验组/OD对照组*100％。
用SPSS软件分析半数致死浓度IC50。试验结果见表1
表1FW03104对肿瘤细胞的抑制作用
| 肿瘤细胞 | HepG2 | EC109 | HeLa |
| IC50(μM) | 16.99 | 25.33 | 34.64 |
萜类化合物FW03104在高浓度时可以引起细胞死亡，随浓度的降低，对肿瘤细胞生长的抑制作用减弱。
从该萜类化合物的体外抗肿瘤活性试验表明：其有很强的抗肿瘤活性，因而为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。
另外，本发明中所涉及到的各培养基组分中的百分比均为重量比，除此之外，其它的百分比均为体积比。
Claims (5)
1.一种新的海洋疣孢菌菌株，其特征在于：所述海洋疣孢菌菌株为疣孢菌FIM06031(Verrucosispora sp.FIM06031)，于2010年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3924。
2.一种抑制肿瘤的萜类化合物FW03104，其特征在于：所述萜类化合物FW03104是通过分离提取疣孢菌FIM06031的发酵液获得的，该萜类化合物FW03104的化学结构式为：
3.如权利要求2所述抑制肿瘤的萜类化合物FW03104，其特征在于：其具有下述物理化学性状：
(1)颜色和外观：白色无定形粉末；
(2)分子式：C23H32O3；
(3)高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)
测量值：m/z 379.2249[M+Na]+
理论值：m/z 379.2351[M+Na]+；
(4)1H核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：4.54(dd)，1.03，1.79，1.41，1.76，1.92(m)，1.49，1.94，1.11，1.84，1.75(s)，4.71(d)，0.94(s)，1.15(s)，3.38(s)，7.36，7.31，7.50；
(5)13C核磁共振波谱(MEOD，400MHz)
δ(ppm)：83.0，41.7，72.0，54.1，26.2，26.8，27.6，47.2，41.4，39.5，151.6，21.5，108.9，14.5，22.5，173.3，49.9，135.9，130.4，129.6，128.1；
(6)溶解度：溶于甲醇，丙酮，乙腈，乙酸乙酯和二甲亚砜；微溶于正己烷和石油醚；不溶于水。
4.如权利要求2所述抑制肿瘤的萜类化合物FW03104，其特征在于：其制备方法的具体步骤为：
(1)制备疣孢菌FIM06031的发酵液：首先将一铂环疣孢菌FIM06031淀粉天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基，温度35℃，转速240rpm/min，培养时间45h，然后按10％移种量转入发酵培养基，温度28℃，转速240rpm/min，振荡培养96～120h；
(2)提取：将经步骤(1)培养所得的疣孢菌FIM06031菌株发酵液通过4500rpm离心15min后，把获得的菌丝渣用2倍体积的95％乙醇浸泡2次，浸泡液减压浓缩，浓缩液用等量体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；
(3)分离：将步骤(2)获得的提取物采用正相硅胶柱层析，以环己烷∶丙酮溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经C18反相柱层析，以甲醇∶水梯度洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以丙酮洗脱，薄层层析检测，收集含萜类化合物FW03104的流份；再经正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，得到对肿瘤细胞具有细胞毒活性的萜类化合物FW03104纯品。
5.如权利要求4所述抑制肿瘤的萜类化合物FW03104，其特征在于：
所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，(NH4)2SO40.05％，CaCO30.1％，50％陈海水配制，pH 7.5；
发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4％，葡萄糖0.5％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO4 0.05％，CaCO3 0.1％，50％陈海水配制，pH 7.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101222 |