CN101139564B - 一株杜擀氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了杜擀氏菌及其应用。本发明所提供的杜擀氏菌，是杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2CGMCC №2056。培养杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2CGMCC№2056即可得到紫色杆菌素。该菌株的发酵条件是4℃-28℃培养24-60小时，发酵培养基每升中含有：淀粉10-20g，硫酸亚铁0.01-0.05g，硝酸钾0.8-1.2g，磷酸氢二钾0.5-1g，硫酸镁0.5-1g；所述发酵培养基的pH为6-9。该菌株生产得到的紫色杆菌素属纯天然产品，没有人工色素潜在的危害，实验证明，紫色杆菌素有很好的生物活性，对动物体不会产生任何副作用，可以广泛应用于医学、工业等各领域中。
Description
技术领域
本发明涉及一株杜擀氏菌及其应用。
背景技术
色素一般分为人工合成色素和天然色素，两者均已广泛应用于食品着色剂、日用化妆品及饲料添加剂等方面。人工合成色素是指用化学合成方法所制得的有机色素，主要是从煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烃类化合物为原料合成。人工合成色素出现后，以其色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、配色方便、价格便宜等优点迅速为使用者所接受，但是随着现代医学、食品卫生学等学科的发展，人们发现合成色素存在着毒理学问题，有些对人体健康有害，甚至诱发癌症等。因此，越来越多的国家停止使用了一些毒性较大的品种，有的国家甚至禁止了合成色素的使用。由于天然色素大部分是来自植物、微生物、动物的可食部分，提取加工过程是纯物理过程，结构上不会起变化。因此，天然色素因其安全性高和大多具有一定的营养价值而引起人们的广泛重视，其开发应用研究成为植物化学和食品科学领域中的热点。
天然色素包括植物色素、动物色素、微生物色素。因微生物发酵容易实现工业化，从微生物中提取色素，不受资源、环境和空间的限制，具有植物色素和动物色素所不可比拟的优越性。
紫色杆菌素是一种吲哚衍生物，是色氨酸在微生物体内经氧化而成，分子结构如式(I)，分子量为343。自从19世纪末发现以来，人们对它的生物功能进行了大量的探索，发现它具有很多生物功能，越来越受人们关注。试验证明，紫色杆菌素具有很强的生物活性：(1)具有广谱的抗菌活性，如抗staploylococcousaureus、Bacilluss sp，streptococcus sp.，mycobacterium，Neisserig，pseudomonas(Sanchez et al.，Reevaluation of the Violacein BiosyntheticPathway and its Relationship to Indolocarbazole Biosynthesis.Journal 2006.7，1231-1240)；(2)抗氧化(Konzen et al.，Antioxidant properties of violacein：possible relation on its biological function.Journal 2006.14，8307-8313)；(3)抗肿瘤细胞(de Carvalho et al.，Cytotoxic activity of violacein in humancolon cancer cells.Journal 2006.)；(4)抗病毒性等等，还可以作为染料加工各种材质布料(Akira SHIRATA*1，Isolation of Bacteria ProducingBluish-Purple Pigment and Use for Dyeing.Japan Agricultural ResearchQuarterly.2000.34)，总之，紫色杆菌素具有很高的医学价值及工业应用前景。
现已公开报道的产紫色杆菌素菌有Chromobacterium violaceum、Chromobacterium fluviatile、Janthinobacterium lividum、Alteromonasluteoviolacea，其中研究主要的是Chromobacterium violaceum，但是它是一个机会致病菌，且产量较低(0.43g/L)(Armando et al.，Factorial design and responsesurface optimization of crude violacein for Chromobacterium violaceumproduction.Journal 2001.V23，1963-1969)。
杜擀氏菌属(Duganella)是Hiraishi等(Proposal to reclassify Zoogloearamigera IAM 12670(P.R.Dugan 115)as Duganella zoogloeoides gen.nov.，sp.nov.Int J Syst Bacteriol 1997，47，1249-1252.)在1997年提出的一个比较新的属，目前包括两个种：1)D.zoogloeoides，菌落略为黄色，19世纪从污水中分离；2)D.violaceinigra(Wen-Jun Li，Yu-Qin Zhang，Dong-Jin Park，Chang-Tian Li，Li-Hua Xu，Chang-Jin Kim and Cheng-Lin Jiang，Duganellaviolaceinigra sp.nov.，a novel mesophilic acterium isolated from forestsoil.Int J Syst Evol Microbiol，2004，54，1811-1814)，菌落呈黑紫色，2004年从云南森林土壤中分离。目前，已知的杜擀氏菌属的种数有限，其应用研究很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种能分泌、产生紫色杆菌素的新菌株。
本发明所提供的产生紫色杆菌素的菌株B2分离自新疆天山冰川，是杜擀氏菌属(Duganella)的一个新种，已于2007年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏登记号为CGMCC №2056。
该菌株呈短杆状，无芽胞、荚膜，革兰氏阴性。在高氏培养基(淀粉20g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硝酸钾1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L)平皿上，菌落深兰色，呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐。在营养琼脂养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L)平皿上，菌落淡紫色。色素产生伴随菌体生长，最终菌落直径可达到2～3mm，后期菌落四周蓝色较浅。该菌的氧化酶、过氧化氢酶反应阳性，脲酶反应阴性，可水解七叶灵、明胶，利用纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、拢牛儿糖、、D-岩糖为惟一碳源，不利用甘油、赤藓糖、D-***糖、核糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、beta-甲基-D-木糖甙、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、甘露醇、山梨醇；G+C含量为63.68％，16srDNA序列与杜擀氏菌(Duganella zoogloeoides，ATCC 25935T)相似性为97％，脂肪酸组成成分与杜擀氏菌基本一致。该菌在4℃-28℃的培养温度及pH 6-9的范围下均能生长。
本发明的第二个目的是提供应用杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2CGMCC №2056生产紫色杆菌素的方法。
本发明所提供的生产紫色杆菌素的方法，是发酵杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056得到紫色杆菌素。
所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵条件可为4℃-28℃培养24-60小时。
所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵条件优选为25℃培养50小时。
所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基每升中可含有：淀粉10-20g，硫酸亚铁0.01-0.05g，硝酸钾0.8-1.2g，磷酸氢二钾0.5-1g，硫酸镁0.5-1g；所述发酵培养基的pH为6-9。
为了提高紫色杆菌素的产量，所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基每升中含有0.3-0.5g色氨酸。
所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基具体可按照如下方法配制：淀粉15g，硫酸亚铁0.03g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.5g，色氨酸0.5g加水到1000ml；所述发酵培养基的pH为7.0。
上述生产方法中还包括从所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体中纯化紫色杆菌素的步骤。
所述纯化方法可为用能溶解紫色杆菌素的有机溶剂溶液从所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体细胞或所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体细胞的破碎物中提取紫色杆菌素。
所述有机溶剂溶液为5-100％的乙醇、5-100％的异丙醇或5-100％的四氢呋喃；所述有机溶剂溶液优选为5-100％的乙醇；所述百分含量均为体积百分含量。
为了使发酵的效果更好，在进行发酵培养前，冻存的菌种还经过平板培养活化，常用平板培养基含有下述物质(每升含有量)：蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，琼脂20g，pH为7.0。
在生产过程中，所述得到的菌体一般可采用离心方式，如在7000×g离心即可得到菌体。也可以利用通常发酵工业上常用的板框过滤方法获得细胞。所述菌体细胞经破碎得到紫色杆菌素的过程是向菌体中加入浓度为5-100％的乙醇、5-100％的异丙醇或5-100％的四氢呋喃，超声振荡后得到蓝色素的乙醇溶液，干燥后得到蓝色素。溶剂优选的是5-100％的乙醇，在用乙醇提取紫色杆菌素时，乙醇加入量通常可控制在每100ml发酵液加入20-300ml，带有色素的乙醇溶液常用的干燥方式可采用真空干燥，干燥后即可以得到紫色杆菌素粗产品。由于色素位于细胞膜上，也可以直接利用所述有机溶剂提取细胞，得到色素粗品。
用本发明的杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056生产紫色杆菌素的产率较高，达0.45-1.7g紫色杆菌素/L发酵液，得到的紫色杆菌素属纯天然产品，没有人工色素潜在的危害，本发明的杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056没有致病性，生长速度快，在4℃-28℃的条件下发酵均可产色素，便于工业化生产。实验证明，紫色杆菌素有很好的生物活性，对动物体不会产生任何副作用，在医学、工业等各领域中有很好的应用前景。
附图说明
图1为杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056产生的色素的主要成分的HPLC分离图谱
图2为液质联用杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056色素主要成分质谱结果
图3为杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056色素主成分的核磁氢谱谱图
图4为以16S rDNA序列为基础构建的杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC№2056及其相关属种的***发育树状关系图
具体实施方式
实施例1、杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的分离鉴定
1、样品采集
从新疆1号冰川采集土壤样品。
2、菌株的分离和筛选
配制分离平板培养基：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水1000ml，pH 7.0。将上述培养基以1.05kg/cm2，121℃，高压蒸汽灭菌20分钟。
将土壤样品制成2％(2g/100ml)的悬浮液，按10倍递增稀释至2×108，取每个稀释度样品液0.2mL分别均匀涂布于上述分离培养基平板上，25℃培养7天，观察发现有蓝色单菌落，挑选取该菌落，进行划线分离，培养后再挑取细菌单菌落进行划线分离，重复上步骤，直至为纯菌株(用显微镜进行检测，细胞形态一致为纯菌株)，将此菌株命名为B2，也就是杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056。
3、菌株的鉴定
以Duganella zoogloeoides IAM 12670T(购买于日本东京大学应用微生物研究所)和Duganella violaceinigra YIM 31327T(购买于德国微生物菌种保藏中心)为标准株，按照文献(东秀珠等.常见细菌鉴定手册.2001.)中描述的方法，对杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056进行形态特征观察及氧化酶、过氧化氢酶测定；所有的生理生化实验均在25℃条件下测试，所有实验如各种酶活检测、碳源利用等均用API20NE及API50CH试剂盒(BioMerieux)测试。
按照文献(Owen，R.J. & Pitcher，D..Current methods for estimating DNAbase composition and levels of DNA-DNA hybridization.In Chemical Methodsin Bacterial Systematics，(1985)pp.67-93.Edited by M.Goodfellow & D.E.Minnikin.London：Academic Press)中描述的方法，对杜擀氏菌属(Duganellasp.)B2 CGMCC №2056进行G+C含量测定；按照文献(Lane，D.J..16S/23S rRNAsequencing.In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systemat ics，(1991)pp.115-175.Edited by E.Stackebrandt & M.Goodfellow.Chichester：Wiley.)中描述的方法，对杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056进行16s rDNA序列测定，根据测序结果，先利用Blast搜索软件从GenBank与EMBL等数据库中调出的相关细菌菌株的16S rDNA序列，随后用Clustal W 1.8[Thompson，J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F.，Jeanmougin，F.& Higgins，D.G..The CLUSTAL_X windowsinterface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided byquality analysis tools.Nucleic Acids Res(1997)25，4876-4882]进行多序列比对，用MEGA 3(Kumar，S.，Tamura，K.& Nei，M..MEGA3：integrated softwarefor molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment.BriefBioinform (2004)5，150-163.)进行数据分析，重复数1000次，并采用最小进化法(Minimum Evolution)法进行***进化树的构建。脂肪酸组份用美国MIDI的全自动鉴定***分析，按照文献(Sasser，M..Identification of bacteria by gaschromatography of cellular fatty acids.USFCC Newsl(1990)20，16.，Ka¨mpfer，P.& Kroppenstedt，R.M..Numerical analysis of fatty acid patterns ofcoryneform bacteria and related taxa.CanJ Microbiol (1996)42，989-1005)中描述的方法进行。
结果表明：1)杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056呈短杆状，无芽胞、荚膜，革兰氏染色阴性。在高氏培养基(淀粉20g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硝酸钾1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L)平皿上，菌落深兰色，呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐。在营养琼脂养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L)平皿上，菌落淡紫色。色素产生伴随菌体生长，最终菌落直径可达到2～3mm，后期菌落四周蓝色较浅。
2)杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的氧化酶、过氧化氢酶反应阳性，脲酶反应阴性，可水解七叶灵、明胶，利用纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、拢牛儿糖、D-岩糖为唯一碳源，不利用甘油、赤藓糖、D-***糖、核糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、beta-甲基-D-木糖甙、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、甘露醇、山梨醇。
3)杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的G+C含量(mol％)为63.68％，位于杜擀氏菌属的G+C含量(mol％)范围(63-64％)内。
4)杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的16s rDNA序列如序列表中的序列1所示，共有1406bp，与Duganella zoogloeoides(ATCC 25935T)相似性为97％。进行多序列同源性分析，并构建***发育树(图4)，结果表明B2菌应为杜擀氏菌属。图4中，分枝上的数值为自举1000次的结果；线段0.01代表1/100进化距离单位。
5)杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的主要脂肪酸组成为C16：0(24.61％)，C14：0(0.88％)，C12：0(6.26％)，3-OH C10：0(4.25％)，3-OH C12：0(4％)，C18：1ω7c(4.27％)，经美国MIDI的全自动鉴定***分析，与Duganellazoogloeoides(ATCC 25935T)相似性达0.682。
根据对菌株B2的形态学、培养特征、生理生化和16S rDNA的研究结果，菌株B2具有典型的杜擀氏菌属的形态特征，脂肪酸的组成以及基因组DNA G+Cmol％含量支持上述结果。但由于其16SrDNA序列同本属的Duganella zoogloeoides lAM12670T、D.violaceinigra YIM 31327T相似性分别仅为97％、96％，而且菌株B2与杜擀氏菌属的两个种有明显区别(如表1)，因此将菌株B2定为杜擀氏菌属的一个新种(DuganeHa sp.)。表1中，营养琼脂培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水到1000ml，调节pH 7.0)生长情况按照如下方法测定：划线接种到营养琼脂平皿中，28℃培养7天，观察有无菌落产生。
杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056在4℃-28℃的培养温度及pH6-9的范围下均能生长。
表1菌株B2与杜擀氏菌属已有模式菌株生理特性差异
注：“+”阳性反应，“-”阴性反应
实施例2、利用杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056生产紫色杆菌素
1、菌株培养
配制平板培养基：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水到1000ml，调节pH 7.0。将平板培养基在121℃下灭菌15min，倒平板，冷却后接入杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056，在25℃下培养72小时。
配制种子液体培养基(每升含量)：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，调节pH7.0。从平板中挑取单个杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌落接种于无菌液体培养基中，在25℃温度下培养，转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养24小时后菌体处于对数生长期。
配制发酵液体培养基：淀粉15g，硫酸亚铁0.03g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.5g，色氨酸0.5g加水到1000ml，pH为7.0。将100ml培养基装入500ml培养瓶中灭菌，将对数期的种子10mL接入发酵培养基中(10％接种量)在25℃下培养，搅拌转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养10小时后菌体处于对数生长，50小时后菌体进入停滞期时而色素产生也处在停滞期，培养50小时，停止发酵。
2、蓝色素的提取
将发酵液在7000×g下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入无水乙醇(每100ml发酵液加入50ml乙醇)，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡1小时，将振荡液9000×g离心5min得到色素的乙醇溶液。若仍有色素残留在细胞残渣中，可重复上述操作步骤，直至不再能提取出色素为止。将所得到的乙醇溶液真空干燥，即得到蓝色素的粗提物。
3、蓝色素的物理化学特性检测
1)光稳定性
将2ml步骤2中未经干燥的色素乙醇溶液加入至透光性较好的10ml玻璃试管中，用封口膜和石蜡密封以防乙醇挥发，分别置于户外自然光下照射0、12和24小时，每种处理重复3次。光照一定时间后色素的损失率如表2所示。
表2.杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056色素在自然光照射下的损失率
由表中的数据可以看出，色素在乙醇溶液中的光稳定性较差，经过24小时后，色素损失达64.2％，颜色也发生变化，由原先的深蓝色变为浅蓝色。
2)热稳定性
将1ml浓度为0.5g/L的色素乙醇(乙醇浓度为100％)溶液和浓度为1.0g/L水溶液分别置于1.5ml聚丙烯管中进行温度处理，根据色素的损失率来定性判断色素的热稳定性。采取三种温度处理方式：空气浴60℃、100℃分别加热4h，高压蒸汽锅121℃加热15min。每种处理重复3次。热稳定性结果如表3所示。结果表明，当以乙醇作为溶剂时，色素吸光度值没有损失。当以水作为溶剂时，作用温度为100℃时的色素损失大于60℃。
表3色素在不同温度下的损失率
将步骤2中未经干燥的色素提取液用锡箔纸遮光在冰箱中4℃下保存，至少在30天内，目测色素颜色基本不发生变化。
3)色素的酸碱稳定性
向5ml步骤2中未经干燥的色素乙醇溶液(色素浓度为0.438g/L)加入HCl，当HCl浓度为2.4mol/L时，溶液颜色由原来的深蓝色变为绿色；加入NaOH，当NaOH浓度为0.24mol/L时，溶液颜色由原来的深蓝色变为黄色。
4)色素在不同溶剂中的溶解性及溶解颜色
所得蓝色素在不同的溶剂中所显示的颜色有很大不同。以水、石油醚为溶剂，显示为灰蓝色；以甲醇、乙醇、异丙醇、50％甲醇、50％乙醇、50％异丙醇、50％丙酮、50％四氢呋喃作为溶剂，显示为蓝色；以丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃作为溶剂，显示为紫色。
由目测可直接观察到一定量的色素粗提物可以很快溶于甲醇，溶解性最好；四氢呋喃和乙醇次之；水和石油醚对色素粗提物的溶解性最差。
4、蓝色素纯化及结构解析
1)蓝色素的分离纯化
采用高效液相色谱(HPLC)(美国Waters公司，Waters 2695)，色谱柱为InertsilODS-35um 250×4.6mm(购于DIKMA公司)，柱温为室温，PDA二极管阵列检测器(Waters 2996)，检测波长为575nm，流动相使用70％的甲醇-水体系(甲醇与水的体积比为70∶30)，每次进样量0.2mL，流速为1mL/min，收集浓缩主要峰(保留时间是4分钟的洗脱峰)得到了色素主要组分。
2)液相色谱-质谱联用
由高效液相色谱分离出的色素主要成分，通过液质联用再分离纯化，(质谱仪为：LCQ Deca XP(美国热电公司)；质谱的条件为：离子源：ESI源；壳气：35arb；辅助气：0arb；喷雾电压：3.5kV；毛细管温度：300℃；流速：1mL/min；分流比9∶1；质谱速度：0.1mL/min。二次质谱碎裂能量：(1)35％(2)38％)，同时质谱给出了一定的结构信息(如图2)。表明色素主要组分的分子量为344.2，这与报道的紫色杆菌素的分子量一致。
3)核磁共振
由高效液相色谱分离出的色素主要成分按照下述文献中描述的方法进行核磁共振分析，用JNM ECA-600(JEOL公司)核磁共振波谱仪，磁场强度为14.096T，1H共振频率为600.17MHz，溶剂为DMSO，在室温下进行数据采集。90度脉冲宽度为11.3us，采样点数为16384，扫描次数为16次，氘代试剂为d-DMSO，得到了如图3所示的核磁谱图结果。谱图3比较清晰的给出了色素主要成分各位置的H(式(II))的化学位移，通过与文献(T.Hoshino，T.Kondo，T.Uchiyama，N.Ogasawara，Biosynthesis of violacein：a novel rearrangement in tryptophan metabolismwith a 1，2-shift of the indole，Agric.Biol.Chem.51 1987)965-968.)中紫色杆菌素的化学位移值比对(表4)，得到相应的结构信息。
表4杜擀氏B2菌色素主成分核磁氢谱化学位移值与文献数据的比对
式(II)
由于方法和参考文献一样，通过H化学位移图的对比，可知杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056主要成分化合物是紫色杆菌素，其结构如式(III)：
ESI-MSm/z：344.24(posotive) Mw：343.24 式(III)
结果表明杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056在上述发酵条件下的紫色杆菌素的产量为1.7g/L发酵液。
实施例3、利用杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056生产紫色杆菌素
1、菌株的培养
配制平板培养基：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水到1000ml，调节pH7.0。将平板培养基在121℃下灭菌15min，倒平板，冷却后接入杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056，在25℃下培养72小时。
配制种子液体培养基(每升含量)：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，调节pH7.0。从平板中挑取单个杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌落接种于无菌液体培养基中，在25℃温度下培养，搅拌转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养24小时后菌体处于对数生长期。
配制发酵液体培养基：淀粉10g，硫酸亚铁0.01g，硝酸钾0.8g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁1g，色氨酸0.5g加水到1000ml，pH为7.0。将100ml培养基装入500ml培养瓶中灭菌，将对数期的种子10mL接入发酵培养基中(10％接种量)在25℃下培养，搅拌转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养24小时，停止发酵。
2、蓝色素的提取
将发酵液在7000×g下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入乙醇(每100ml发酵液加入50ml乙醇)，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡1小时，将振荡液9000×g离心5min得到色素的乙醇溶液。若仍有色素残留在细胞残渣中，可重复上述操作步骤，直至不再能提取出色素为止。将所得到的乙醇溶液真空干燥，即得到蓝色素的粗提物。
按照实施例2中步骤4的方法进行蓝色素纯化及结构解析，结果表明杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056在上述发酵条件下的紫色杆菌素的产量为0.56g/L发酵液。
实施例4、利用杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056生产紫色杆菌素
1、菌株的培养
配制平板培养基：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水到1000ml，调节pH 7.0。将平板培养基在121℃下灭菌15min，倒平板，冷却后接入杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056，在25℃下培养72小时。
配制种子液体培养基(每升含量)：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，调节pH7.0。从平板中挑取单个杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌落接种于无菌液体培养基中，在25℃温度下培养，搅拌转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养24小时后菌体处于对数生长期。
配制发酵液体培养基：淀粉20g，硫酸亚铁0.05g，硝酸钾1.2g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.8g，加水到1000ml，pH为8.0。将100ml培养基装入500ml培养瓶中灭菌，将对数期的种子10mL接入发酵培养基中(10％接种量)在25℃下培养，搅拌转速为200rpm(旋转半径为32mm)。培养50小时，停止发酵。
2、蓝色素的提取
将发酵液在7000×g下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入乙醇(每100ml发酵液加入50ml乙醇)，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡1小时，将振荡液9000×g离心5min得到色素的乙醇溶液。若仍有色素残留在细胞残渣中，可重复上述操作步骤，直至不再能提取出色素为止。将所得到的乙醇溶液真空干燥，即得到蓝色素的粗提物。
按照实施例2中步骤4的方法进行蓝色素纯化及结构解析，结果表明杜擀氏菌属(Duganella sp.) B2 CGMCC №2056在上述发酵条件下的紫色杆菌素的产量为0.45g/L发酵液。
序列表
<160>1
<210>1
<211>1406
<212>DNA
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)
<400>1
ccttaccatg caagtcgaac ggcagcgcgg ggcaacctgg cggcgagtgg cgaacgggtg 60
agtaatatat cggaacgtac cctggagtgg gggataacgt agcgaaagtt acgctaatac 120
cgcatacgat ctaaggatga aagtgggggc ttcgcaagaa cctcatgctc ctggagcggc 180
cgatatctga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcatcgat cagtagctgg 240
tctgagagga cgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga attttggaca atgggcgaaa gcctgatcca gcaatgccgc gtgagtgaag 360
aaggccttcg ggttgtaaag ctcttttgtc agggaagaaa cggtgagagc taatatctct 420
tgctaatgac ggtacctgaa gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttttg 540
taagtctgtc gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaattg cgatggagac tgcaaggcta 600
gaatctggca gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccgat ggcgaaggca gccccctggg tcaagattga cgctcatgca cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc tactagttgt 780
cgggttttaa ttaacttggt aacgcagcta acgcgtgaag tagaccgcct ggggagtacg 840
gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg 900
attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtacgga agccacgaga 960
gatcgaggtg tgctcgaaag agaaccgtaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg l080
aaagagcact ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140
tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtacata cagagggccg 1200
ccaacccgcg agggggagct aatcccagaa agtgtatcgt agtccggatt gtagtctgca 1260
actcgactac atgaagttgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgtcg cggtgaatac 1320
gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gcgggtttta ccagaagtag 1380
gtagcttaac cgcaaggggg gcgcta 1406
Claims (10)
1.杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2菌株，其保藏号为CGMCC №2056。
2.一种生产紫色杆菌素的方法，是发酵培养杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2菌株CGMCC №2056得到紫色杆菌素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵条件是4℃-28℃培养24-60小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵条件是25℃培养50小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基每升中含有：淀粉10-20g，硫酸亚铁0.01-0.05g，硝酸钾0.8-1.2g，磷酸氢二钾0.5-1g，硫酸镁0.5-1g；所述发酵培养基的pH为6-9。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基每升中含有0.3-0.5g色氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的发酵培养基按照如下方法配制：淀粉15g，硫酸亚铁0.03g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.5g，色氨酸0.5g加水到1000ml；所述发酵培养基的pH为7.0。
8.根据权利要求2至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括从所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体中纯化紫色杆菌素的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯化方法为用能溶解紫色杆菌素的有机溶剂从所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体细胞或所述杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056菌体细胞的破碎物中提取紫色杆菌素；
所述有机溶剂溶液为5-100％的乙醇、5-100％的异丙醇或5-100％的四氢呋喃；所述百分含量均为体积百分含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂溶液为5-100％的乙醇；所述百分含量均为体积百分含量。
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