CN101919875A

CN101919875A - 一种浒苔香菇多糖复合物及其制备方法以及其作为保健药品的应用

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Publication number: CN101919875A
Application number: CN2010102608259A
Authority: CN
Inventors: 吴明江; 杨海龙; 廖志勇; 于萍; 李楠
Original assignee: Wenzhou University
Current assignee: Wenzhou University
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-08-24
Also published as: CN101919875B

Abstract

本发明提供了一种浒苔香菇多糖复合物及其制备方法以及其作为保健药品的应用，本发明的浒苔香菇多糖复合物由浒苔多糖和香菇多糖组成。本发明采用现代科学方法，对所述的浒苔多糖和香菇多糖进行分离、提纯，并将它们按一定的比例混合制备多糖复合物。所制得的多糖复合物安全无毒，原料易得，制备工艺可靠，适合规模化工业生产。

Description

一种浒苔香菇多糖复合物及其制备方法以及其作为保健药品的应用

技术领域

本发明涉及海藻与食用菌中的生物活性成分，更具体地，涉及浒苔多糖与香菇多糖组成的复合物、浒苔多糖和香菇多糖制备方法，以及用于提高人体免疫或者抑制肿瘤用途的含有浒苔香菇多糖复合物的保健药品。

背景技术

多糖作为来自高等植物、动物和微生物细胞中的天然高分子化合物，是由多个单糖分子缩合、失水而成的一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，是构成生命的四大基本物质之一。多糖由于其重要的生理功能及广泛的应用被不断挖掘，多糖作为药物始于1943年，目前人们已成功地从许多生物材料中提取出了多糖，这些多糖具有非常重要与特殊的生理活性。

浒苔（Enteromorpha）自古即为食用和药用藻类，浒苔属绿藻门石莼目石莼科植物，长在潮间带，在我国野生藻类中资源丰富，尤其在东南沿海一带分布广泛。香菇（lentinus edodes）味道鲜美，是药食两用真菌。

到目前为止，对单种多糖的研究与应用已有不少报道，但都是以各自特有的药效发挥其各自的单一作用，而将多种生物材料提取的多糖尤其是对于浒苔多糖和香菇多糖进行复合的研究和应用，通过检索，目前尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种将浒苔多糖和香菇多糖进行复合应用，并使得的复合物的生物活性进一步增强，起到增效的作用的浒苔香菇多糖复合物。

本发明的另一个目的是提供一种浒苔香菇多糖复合物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供能够提高人体免疫能力且能有效抑制肿瘤的浒苔香菇多糖复合物作为保健药品的应用。

为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是其由浒苔多糖和香菇多糖组成。

进一步设置是浒苔多糖，30～50%；香菇多糖，50～70%。

进一步设置是优选该多糖复合物由下列重量百分比的组分混合而成：浒苔多糖，50%；香菇多糖，50%。

为实现本发明的第二个目的，其技术方案是分别制备浒苔多糖和香菇多糖，并将浒苔多糖和香菇多糖进行混合制的浒苔香菇多糖复合物，其中浒苔多糖的制备步骤包括以下工序：

（1）提取，浒苔样品清洗后，风干，切碎，以浒苔与水的质量比为1：15加入蒸馏水，90℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心取沉淀得浒苔粗多糖；

（2）冻融，将浒苔粗多糖溶液，-20℃冷冻过夜，室温缓慢融化，高速离心去除沉淀物；

（3）乙醇分级，在冻融后的浒苔粗多糖溶液中，加乙醇使其终浓度达50%，4℃过夜，离心去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心取沉淀；

（4）脱蛋白，将70%乙醇沉淀得到的多糖用蛋白酶去除蛋白，按酶与蛋白质量比为1：200取蛋白酶加入至多糖溶液中，边加边搅拌，混合液装入透析袋，1%NaCl做激活剂，37℃保温24 h。酶处理后的溶液，浓缩，透析，冻干，得浒苔多糖；

其中香菇多糖由以下过程制备：

（1）提取，香菇子实体清洗后，风干，粉碎，以香菇与水的质量比为1：20加入蒸馏水，95℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心取沉淀得香菇粗多糖；

（2）乙醇分级纯化，在香菇粗多糖溶液中，加乙醇使其终浓度达30%，4℃过夜，离心去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心取沉淀得香菇多糖。

为实现本发明的第三个目的，浒苔浒苔多糖复合物应用于制备免疫增强保健产品以及抗肿瘤辅助药物。优选地，该，浒苔浒苔多糖复合物以浒苔多糖占50%（重量）和香菇多糖占50%（重量）混合而成进行应用。

本发明采用现代科学方法，对所述的浒苔多糖和香菇多糖进行分离、提纯，并将它们按一定的比例混合制备多糖复合物。所制得的多糖复合物安全无毒，原料易得，制备工艺可靠，适合规模化工业生产。

根据药理、药效学研究的结果表明，本发明所制得的浒苔香菇多糖复合物对提高免疫具有明显的作用，对抑制肿瘤也有一定的效果，可开发成免疫增强保健产品以及抗肿瘤的辅助药物。

药效试验结果

浒苔香菇多糖复合物由50%浒苔多糖和50%香菇多糖组成。

A、浒苔香菇多糖复合物对小鼠S-180细胞肉瘤生长的影响结果

将复苏的S-180细胞向小鼠腹腔内注射传代培养，0.3 mL/只。七天后，无菌吸取接种了S-180小鼠的腹水，用生理盐水稀释成l×10⁷个/mL浓度的细胞悬液， 0.2 mL/只（2×106个细胞）接种于小鼠（18～22g）右前肢腋窝皮下。24 h后将小鼠随即分成阴性对照组、多糖组、阳性对照组，每组5只。将浒苔香菇多糖复合物样品溶于生理盐水，连续10天进行灌胃给药（0.2 ml/只），阴性对照组每天用等量的生理盐水灌胃，阳性对照组为环磷酰胺。末次给药的次日，将小鼠称重，颈椎脱臼处死，剥离瘤块，并按公式计算抑瘤率：

抑瘤率（%）＝（阴性对照组瘤重－治疗组瘤重）/阴性对照组瘤重×100%

剖取胸腺和脾脏，称其重量，按下式计算脾指数和胸腺指数：

脾指数SI＝脾重/体重

胸腺指数TI＝胸腺重/体重

实验结果见表1，与浒苔多糖单独作用组相比，浒苔香菇多糖复合物的抗肿瘤活性明显增强，并且也呈现剂量依赖关系。在低剂量（50mg/kg）给药时，浒苔香菇多糖复合物能显著抑制S-180肉瘤的生长；当给药计量在100mg/kg时，抗肿瘤活性即达到极显著水平。

对给予浒苔香菇多糖复合物的S-180肉瘤小鼠的胸腺指数和脾指数测定结果显示，浒苔香菇多糖复合物能够恢复肿瘤小鼠的免疫功能。在低浓度给药处理时，浒苔香菇多糖复合物能够显著地增强脾指数，并且脾指数的增强能力与给药剂量呈现正相关。与浒苔多糖单独给药组相比，活性也明显提高。对于TI的恢复能力，浒苔多糖单独给药组与浒苔香菇多糖复合物给药组在较低剂量即可将肿瘤小鼠的胸腺指数恢复到生理盐水对照组的水平，剂量增加对TI无显著影响。

表1：浒苔香菇多糖复合物抑制肿瘤细胞生长的作用

B、浒苔香菇多糖复合物对淋巴细胞增殖的影响结果

雄性ICR小鼠（18～22g），每组5只。标准环境饲养以适应新环境。腹腔注射多糖（不同剂量，0.2ml/天），对照组注射生理盐水，连续给药10天。于最后一次给药次日颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡消毒2分钟，无菌取脾脏，淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，显微镜计数，调整细胞浓度到5×10⁶/ml，铺96孔板，100ul/孔。多糖组加入10%NBCS-RPMI-1640完全培养基100ul，ConA诱导组加入ConA（终浓度5μg/mL） 100ul，LPS诱导组加入LPS（终浓度10μg/mL）100ul，各实验孔终体积200ul，均设3复孔。37℃、5%CO2孵箱培养48 h。MTT法检测淋巴细胞增殖活性。

浒苔香菇多糖复合物体内给药对正常小鼠淋巴细胞增殖的影响结果（表2）显示，两种多糖的协同作用能力优于浒苔多糖的单独作用能力，浓度关系与单独给药组一致。当ConA和LPS分别作为T、B淋巴细胞的丝裂原存在下，浒苔香菇多糖复合物对T、B淋巴细胞仍具有激活作用，也强于浒苔多糖单独给药组。

表2：浒苔香菇多糖复合物对淋巴细胞增殖的作用

C、浒苔香菇多糖复合物对NK细胞毒活性的影响结果

以YAC-1 (ATCC, Rochville, MD, USA) 细胞作为检测NK细胞毒活性的靶细胞。按照效靶比例1：50加96孔板，即：脾细胞 (1 × 10⁶ /孔) 、YAC-1细胞 (5.0×10⁴ /孔)。于CO2培养箱培养6 小时之后。MTT法检测NK细胞毒活性。细胞毒活性计算公式如下：

（OD_E ：效应细胞单独给药组吸光值；OD_T ：靶细胞单独培养组吸光值；OD_(E+T)：效应细胞与靶细胞共培养组吸光值）

将浒苔香菇多糖复合物作用于正常小鼠体内，检测NK细胞对YAC-1细胞的毒性作用，生理盐水组、WEP组作为对照。与生理盐水对照组相比（表3），浒苔香菇多糖复合物具有增强小鼠NK细胞毒性的能力，且活性随着浓度的增大而增强；与浒苔多糖单独给药组相比，浒苔香菇多糖复合物的NK细胞毒活性亦有增强，在50mg/kg给药浓度下的活性已强于浒苔多糖单独给药浓度100mg/kg下的活性。

表3：浒苔香菇多糖复合物对NK细胞毒活性的影响

D、浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞吞噬中性红能力、巨噬细胞毒活性、巨噬细胞分泌NO及TNF-α的影响结果

将浒苔多糖与浒苔香菇多糖复合物分别作用于正常小鼠，颈椎脱臼处死体内给药小鼠。D-Hanks清洗腹腔，将腹腔中液体收集入离心管中，4℃离心（1000rpm/min,10 min），去上清，用1640完全培养基重悬细胞。调整细胞浓度为2×106个/ml，每孔100μl 加入96孔板中，5 % CO2、37 ℃预孵4h后，用37℃预温的PBS（pH=7.4）洗2-3遍，去除未贴壁细胞，即获得纯化的巨噬细胞。巨噬细胞纯化后，加入浓度为0.075% 中性红溶液，每孔100μl，继续培养1 h，用PBS（PH=7.4）洗去剩余的中性红后，加入100 μl的细胞裂解液（无水乙醇：0.1mol/L乙酸=1:1，v/v），24h后用酶标仪检测540nm吸光值。

表4显示，浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞的吞噬能力要强于浒苔多糖单独给药组，作用的浓度关系与NK细胞毒活性相似。

表4：浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响

将按上述方法制得的腹腔巨噬细胞(1.0×10⁵ /孔)，然后加入完全培养基或靶细胞 B16 淋巴瘤细胞 (1.0×104 /孔; 效靶比为10:1) 继续培养16小时. 最后用MTT法对细胞密度进行检测。细胞毒活性计算公式如下：

巨噬细胞毒活性结果（表5）显示，浒苔香菇多糖的作用非常显著，在低浓度下即能达到极显著水平，且各浓度给药条件下都优于浒苔多糖单独给药组。

表5：浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞毒活性的影响

Griess法测定巨噬细胞产生的NO的水平。细胞以5×10⁵个/孔的浓度加入24孔板中。培养48 h后，吸取细胞培养液上清（50μl）加入另一96孔培养板中，并加入100μl Griess 试剂，30min后用酶标仪检测540nm处吸光值，根据NaNO2溶液绘制的标准曲线，计算出NO 的产量。将腹腔巨噬细胞与待测样品共培养，取上清液用ELISA试剂盒检测TNF-α。

巨噬细胞对肿瘤细胞的毒性作用大都是因为巨噬细胞分泌的因子。从巨噬细胞分泌NO（表6）及TNF-α（表7）的能力来看，WEP-WLDP 的作用要显著强于WEP单独作用组。上述结果与巨噬细胞介导的细胞毒作用结果一致。

表6：浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞分泌NO能力的影响

表7：浒苔香菇多糖复合物对巨噬细胞分泌TNF-α能力的影响

下面结合具体实施方式对本发明做进一步介绍。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：浒苔多糖制备

浒苔样品清洗后，风干，切碎，取500g浒苔材料，加入7.5L蒸馏水，90℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩至500mL，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心（3000r/min）取沉淀得浒苔粗多糖。将2%的浒苔粗多糖溶液，-20℃冷冻过夜，室温缓慢融化，高速离心（7000r/min）去除沉淀物。

将冻融后的浒苔多糖配成5%的溶液，加乙醇使其终浓度达50%，4℃过夜，离心（3000r/min）去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心（3000r/min）取沉淀。将70%乙醇沉淀得到的多糖用蛋白酶去除蛋白，按酶与蛋白质量比为1：200取蛋白酶加入至多糖溶液中，边加边搅拌，混合液装入透析袋，1%NaCl做激活剂，37℃保温24 h。酶处理后的溶液，浓缩至200mL，透析，冷冻干燥，得浒苔多糖23.6g。

实施例2：浒苔多糖制备

浒苔样品清洗后，风干，切碎，取5000g浒苔材料，加入75L蒸馏水，90℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩至1.5L，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心（3000r/min）取沉淀得浒苔粗多糖。将2%的浒苔粗多糖溶液，-20℃冷冻过夜，室温缓慢融化，高速离心（7000r/min）去除沉淀物。

将冻融后的浒苔多糖配成5%的溶液，加乙醇使其终浓度达50%，4℃过夜，离心（3000r/min）去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心（3000r/min）取沉淀。将70%乙醇沉淀得到的多糖用蛋白酶去除蛋白，按酶与蛋白质量比为1：200取蛋白酶加入至多糖溶液中，边加边搅拌，混合液装入透析袋，1%NaCl做激活剂，37℃保温24 h。酶处理后的溶液，浓缩至600mL，透析，冻干，得浒苔多糖272g。

实施例3：香菇多糖制备

香菇子实体清洗后，风干，粉碎，取200g香菇与加入4L蒸馏水，95℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩至500mL，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心（3000r/min）取沉淀得香菇粗多糖。配制10%的香菇粗多糖溶液中，加乙醇使其终浓度达30%，4℃过夜，离心（3000r/min）去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心（3000r/min）取沉淀，冷冻干燥，得香菇多糖20.8g。

实施例4：香菇多糖制备

香菇子实体清洗后，风干，粉碎，取5000g香菇与加入100L蒸馏水，95℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩至2000mL，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心（3000r/min）取沉淀得香菇粗多糖。配制10%的香菇粗多糖溶液中，加乙醇使其终浓度达30%，4℃过夜，离心（3000r/min）去除沉淀，上清继续加乙醇使其浓度达70%，4℃过夜，离心（3000r/min）取沉淀，冷冻干燥，得香菇多糖537g。

Claims

1.一种浒苔香菇多糖复合物，其特征在于：其由浒苔多糖和香菇多糖组成。

2.根据权利要求1所述的一种浒苔香菇多糖复合物，其特征在于：浒苔多糖，30～50%；香菇多糖，50～70%。

3.根据权利要求2所述的一种浒苔香菇多糖复合物，其特征在于：其组分按以下重量百分比混合而成，

浒苔多糖　　50% 香菇多糖　　50%。

4.一种制备权利要求1中的浒苔香菇多糖复合物的制备方法，其特征在于分别制备浒苔多糖和香菇多糖，并将浒苔多糖和香菇多糖进行混合制的浒苔香菇多糖复合物，

其中浒苔多糖的制备步骤包括以下工序：

（1）提取，浒苔清洗后，风干，切碎，以浒苔与水的质量比为1：15加入蒸馏水，90℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次，合并滤液，浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心取沉淀得浒苔粗多糖；

（2）冻融，将浒苔粗多糖溶液，零下20℃冷冻过夜，室温缓慢融化，高速离心去除沉淀物；

(4)脱蛋白，将70%乙醇沉淀得到的多糖用蛋白酶去除蛋白，按酶与蛋白质量比为1：200取蛋白酶加入至多糖溶液中，边加边搅拌，混合液装入透析袋，1%NaCl做激活剂，37℃保温24 h；酶处理后的溶液，浓缩，透析，冻干，得浒苔多糖；

其中香菇多糖制备步骤包括以下工序：

（1）提取，香菇子实体清洗后，风干，粉碎，以香菇与水的质量比为1：20加入蒸馏水，95℃提取2 h，过滤，滤渣重复提取三次；合并滤液，浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，离心取沉淀得香菇粗多糖；

5.根据权利要求4所述的浒苔香菇多糖复合物的制备方法，其特征在于：所述的浒苔多糖和香菇多糖按各自50%质量比混合。

6.一种如权利要求1所述的浒苔浒苔多糖复合物作为保健药品的应用，其特征在于：浒苔浒苔多糖复合物应用于制备免疫增强保健产品以及抗肿瘤辅助药物。

7.根据权利要求6所述的一种浒苔浒苔多糖复合物作为保健药品的应用，其特征在于：所述的浒苔多糖和香菇多糖按以下质量比混合而成，

浒苔多糖　50% 香菇多糖　　50%。