CN101914475B - 一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌，该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。所述乳酸菌可用于水果防腐保鲜，具体应用时，方法为：先将酸化剂加热溶解于水，降温至常温后加入菌粉混匀，喷雾方式喷洒到水果上，然后将水果在常温或低温下储存。在常温条件下，水果可保鲜3个月；低温条件下，水果可保鲜6个月。本发明的植物乳杆菌是从众多乳酸菌中筛选得到的，其不但可以防治果皮褐变，降低果实发病率，还可以适当减少果实水分挥发，抑制水果的新陈代谢，延长保鲜期。
Description
技术领域
本发明涉及一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌及其在水果防腐保鲜中的应用。
背景技术
目前，果实采后损失是一个全球性问题，已引起世界范围内的极大关注。我国每年约有8000万吨蔬菜、水果腐烂，果蔬采后损失率达20％～40％，损失总价值近800亿元。
在世界范围内，新鲜水果贮藏过程中有25％的产品因腐烂变质而不能利用。有些易腐水果采后腐烂损失达30％以上。1992年我国水果产量达2440万吨，估计因采后病害所致损失达610万吨。1998年果品总产量达5452.9万吨，估计损失1363万吨。近年来，随着产业结构的调整，我国果业迅猛发展，水果栽培面积为1.54亿亩，总产量达8500万余吨，占世界总产量40％，但出口量不足我国总产量1％，贮藏保鲜量不足产量的20％。因此保证采后果蔬的品质、延长其保存期限、防止其腐败变质、减小腐烂损失是我国果蔬采后保鲜亟待解决的问题。
随着科技的发展，利用设施设备控制外部条件(如气调、低温、减压贮藏等)将成为果蔬贮藏保鲜技术的主流。但从目前的情况看，我国水果的冷藏能力不足总产量的5％，气调贮藏能力不足总产量的1％，减压贮藏还处于研究阶段，而且，当这些措施通过市场***运转时，如果冷链***不完善，果蔬一旦处于常态下，其带来的经济损失相当严重。因此，使用保鲜剂无疑成为采后保鲜的一项独立而不可或缺的措施，它将引起人们广泛的关注。
防腐剂根据其来源不同，可分为天然防腐剂和化学合成防腐剂两大类。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注，人们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求。长期的研究表明，化学合成防腐剂存在致癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题；天然防腐剂不但对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值，所以越来越多的研究者开始把目光投向天然防腐剂的开发。在天然防腐剂中，有一大类肽类防腐剂，由于其安全无毒害，甚至某些成分对人体有保健作用而受到人们的广泛关注。如乳酸链球菌素(Nisin)就是其中比较有代表性的一类防腐剂，其研究开发将会对我国乃至世界食品业的发展做出卓越贡献。
发明内容
针对上述现有技术，本发明旨在筛选出一株高效乳酸菌，与安全高效的酸化剂混合使用，通过梨和草莓的体外保鲜模拟试验，来研究乳酸菌在水果防腐保鲜上的作用，为研究天然的生物保鲜剂提供参考价值和理论依据。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌，该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。
所述乳酸菌的菌种生物学特性如下：该菌种的细胞大小为(0.6μm～0.9μm)×(1.5μm～5.0μm)，短杆或近球状，无鞭毛，不产芽孢，单个或呈链状排列；该菌种能在MRS琼脂培养基上生长，菌落呈乳白色，圆形，规则，中央凸起，表面光滑，质地均匀，而且在挑取菌体时有一定的黏性；该菌种属于同型发酵乳酸菌，能够发酵果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖，不能发酵鼠李糖、棉籽糖、***糖；接触酶试验、产氨试验、水解淀粉试验、乙酰甲基甲醇试验(V.P.反应)和甲基红反应(M.R.反应)等均为阴性；最适生长温度为30～37℃，能在10℃生长，45℃不生长，兼性厌氧，在pH值4.5～9.5生长，最适pH值6.0左右。
所述乳酸菌可用于水果防腐保鲜，具体应用时，方法为：先将酸化剂加热溶解于水，降温至常温后加入菌粉混匀，喷雾方式喷洒到水果上，然后将水果在常温(10～25℃)或低温(4～6℃)下储存。在常温(10～25℃)条件下，水果可保鲜3个月；低温(4～6℃)条件下，水果可保鲜6个月。
所述酸化剂为蔗糖、酒石酸和山梨酸钾三者的混合物，蔗糖、酒石酸和山梨酸钾三者的质量比为100∶4∶3；溶解于水时，每1000mL水中，溶解有蔗糖100g、酒石酸4g、山梨酸钾3g；酸化剂与菌粉的用量比例为112∶5(质量比)，混匀后，菌的浓度为5×106～5×107CFU/mL。
所述菌粉是通过以下步骤得到的：
(i)菌种：选用植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，CCTCC M 2010150；
(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～42℃培养22～26h；
(iii)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养6～16h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于30～42℃条件下，静置培养14～22h；
(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；
(vii)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。
上述步骤(iii)、(iv)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至5.5～6.5，115℃条件下灭菌20min；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5～6.5。
一种防腐保鲜制剂，是由以下原料组成的：蔗糖、酒石酸、山梨酸钾、菌粉和水，其中，每1000mL水中，溶解有蔗糖100g、酒石酸4g、山梨酸钾3g，菌粉5g；所述菌为可用于生物防腐保鲜的乳酸菌，命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。
使用时，将防腐保鲜制剂以喷雾方式喷洒到水果上即可。
本发明的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，CCTCC M 2010150是从众多乳酸菌中筛选得到的，其不但可以防治果皮褐变，降低果实发病率，还可以适当减少果实水分挥发，抑制水果的新陈代谢，延长保鲜期。
附图说明
本发明提供的可用于生物防腐保鲜的乳酸菌命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。
图1为病原菌(L1)病变及孢子示意图，其中，a为病原菌L1对梨的病害图，b为将病原菌L1回接梨后发病图，c为病原菌L1的孢子图。
图2为病原菌(L2)病变及孢子示意图，其中，a为病原菌L2对梨的病害图，b为将病原菌L2回接梨后发病图，c为病原菌L2的孢子图。
图3为病原菌(P1)病变及孢子示意图，其中，a为病原菌P1对苹果的病害图，b为将病原菌P1回接苹果后发病图，c为病原菌P1的孢子图。
图4为病原菌(P2)病变及孢子示意图，其中，a为病原菌P2对苹果的病害图，b为将病原菌P2回接苹果后发病图，c为病原菌P2的孢子图。
图5为病原菌(T1)病变及孢子(T1、T2)示意图，其中，a为病原菌T1对桃的病害图，b为病原菌T2的孢子图，c为病原菌T2的孢子图。
图6为梨的失重率变化图。
图7为梨保鲜试验中各组总糖含量变化图。
图8为梨保鲜试验中各组糖酸比变化图。
图9为梨保鲜试验中各组保鲜效果示意图。
图10为草莓保鲜试验中第一批各组处理对草莓好果率的影响。
图11为草莓保鲜试验中第二批各组处理对草莓好果率的影响。
图12为草莓保鲜试验中补充试验的前3d各处理组好果率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实验1菌株的筛选
1病原菌的分离与纯化
取发病但未产孢的苹果、梨、桃子果品组织，切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，然后依次用75％的酒精消毒30s、0.1％升汞消毒1min后，再用无菌水清洗3次，放到PDA培养基上，30℃下恒温培养。
2病原菌的鉴定
2.1病原菌回接
将上述病原菌纯化后的培养物在PDA培养基上培养5d，用打孔器(φ6mm)打饼，用***果实(苹果、梨、桃子)表面，将菌饼回接到果实上，用无菌棉加无菌水保湿，30℃培养，观察其发病情况是否与分离前相同，如果发病情况相同，由柯赫氏法则可知，此病症就是由分离纯化的病原菌引发的。
2.2鉴定
挑取分离纯化后的培养物在PDA培养基上培养7d，观察其孢子形状，大小，初步确定出病原菌的属，按陆家云《植物病原真菌学》进行鉴定。
3拮抗菌的筛选
由于实验室对不同拮抗菌对病原菌的抑菌试验方法不同，故通过筛选，确定最佳培养基及最佳培养方式。
3.1供试菌株
拮抗剂：芽孢菌：Y1～Y3；乳酸菌：R1～R10；酵母菌：油脂酵母、毕赤酵母、粘红酵母、热带假丝酵母、丝孢酵母。上述菌种均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏室保存。
病原菌：链格孢L1、L2、P1、P2、T1和T2，从苹果、桃和梨上分离纯化获得(即步骤1中所得)。
3.2拮抗菌发酵液对病原菌的抑菌试验
各种拮抗菌发酵液中产生的抑菌物质的抑菌试验及培养基的筛选。
3.2.1将分离所得病原菌制成1×105CFU/mL孢子悬浮液，吸取0.5mL制好的孢子悬浮液均匀涂布到PDA培养基上，将牛津杯置于含有孢子悬液的PDA培养基上，加入255μL的拮抗菌发酵液，将平板置于30℃培养箱中培养2～3d，测定其抑菌圈直径大小，并用无菌水做空白对照，确定抑菌效果；其中，每组试验处理做3个平行。
3.2.2为了筛选培养基，另在培养皿中倒入15mL营养肉汤培养基，晾干后加0.5mL制好的病原菌孢子悬浮液和6mL冷却至45℃的营养肉汤培养基，摇匀后放置晾干。然后将牛津杯置于平板上加入255μL的拮抗菌发酵液，培养方法同3.2.1。
3.2.3对于产孢较少的病原菌P1打饼(φ6mm)放置在PDA平板中央，距离菌丝块中央2.5cm处放牛津杯，加入255μL的拮抗菌发酵液，培养方法同3.2.1。
3.3拮抗菌菌体对病原菌的抑菌试验
3.3.1点接法筛选乳酸菌、芽孢菌
在培养皿中倒入15mL营养肉汤培养基，晾干后加0.5mL制好的孢子悬浮液和6mL冷却至45℃的营养肉汤培养基，取适量拮抗菌的纯培养物点于平板上，于30℃培养2～3d后测量抑菌圈大小。
3.3.2打饼法筛选酵母菌
选用无菌水将培养1d的酵母洗下，吸取1mL涂布到酵母平板上，待长满整皿后用直径为6mm的打孔器打饼，用接种针接到含0.5mL 1×105CFU/mL病原菌孢子悬浮液酵母培养基上，2～3d后测量菌落直径和抑菌带宽度。
3.4混菌试验
通过混菌试验来确定最低抑菌浓度。
用无菌水将酵母菌配成5×105CFU/mL、5×106CFU/mL、5×107CFU/mL、5×108CFU/mL四种浓度，分别对103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL病原菌的孢子悬浮液进行抑制，分别吸取1mL混合于20mL营养肉汤培养基的培养皿中，测定其抑菌情况。
乳酸菌以109CFU/mL和108CFU/mL对105CFU/mL病原菌进行抑制。
4试验结果
4，1病原菌分离结果
4.1.1从梨上分离出2株病原菌，编号分别为L1、L2。如图1、图2所示。
4.1.2从苹果上分离出2株病原菌，编号分别为P1、P2，如图3、图4所示。
4.1.3从桃上分离出2株病原菌，编号分别为T1和T2，如图5所示。
由柯赫氏法则和陆家云的《植物病原真菌学》鉴定方法，得出引起苹果、梨和桃黑斑病的主要病原菌为链格孢。
4.2拮抗菌发酵液抑菌试验结果
4.2.1PDA培养基涂布法培养链格孢时容易被细菌污染，且未污染的培养基其抑菌圈不明显，不易测量。故不用PDA涂布法做抑菌试验。
4.2.2营养肉汤培养基牛津杯法对拮抗菌产生抑菌物质的能力进行了筛选，芽孢菌样品编号依次为Y1、Y2、Y3，乳酸菌样品编号依次为R1～R10，结果如表1所示。
表1芽孢菌、乳酸菌发酵液对病原菌抑制作用
注：“-”表示无抑菌带。
试验结果表明，芽孢菌对链格孢抑菌试验中产生抑菌圈，其中Y3对各病原菌的抑菌作用较明显，除T外都有抑菌圈，且较大。Y1作用较不明显。乳酸菌对各链格孢的抑菌作用表现为抑菌带，抑制病原菌的菌丝生长，使其颜色由灰白色变为黄色，无透明抑菌圈。由表1可知，R4和R10产生的抑菌带较宽。研究资料表明，酵母菌的拮抗机理一般为营养竞争和寄生，抗生作用较少，故此试验未阐述酵母发酵液对病原菌的拮抗作用。
4.3拮抗菌菌体抑菌试验结果
4.3.1点接法筛选乳酸菌和芽孢菌试验结果
通过点接法筛选出拮抗菌菌体对病原菌抑制作用较强的菌株，如表2所示。
表2乳酸菌和芽孢菌抑菌试验结果
注：“-”表示无抑菌带。
从拮抗菌发酵液对病原菌的抑制试验知，对每株菌的抑制作用大小基本一致，故以下试验选用致病性和产孢能力均较强的L2、T2和P2菌株。由表2可知，乳酸菌菌落较小，对不同的病原菌的抑制作用不同。部分表现出抗生作用，但抑菌带宽度较小，R10和R4是10株乳酸菌中菌落直径和抑菌带宽度均较大的2株菌。芽孢菌3株菌中，Y3菌落直径较大，具有较强的空间竞争能力。抑菌带宽度Y3与Y2差异不显著。综合两个指标，筛选出R4、R10和Y3作为后续体外拮抗试验候选菌株。
4.3.2酵母菌菌饼抑菌试验结果：如表3所示
表3抑菌试验中酵母菌菌落及对病原菌抑菌带宽度表
注：“-”表示无抑菌带。
因酵母生长速度较快，涂布法培养的酵母菌在平板上长满平皿且较均匀，故用菌饼法测定其菌体对链格孢的抑制作用。由表3可知，油脂酵母和热带假丝酵母生长速度较快，具有较强的空间竞争能力。热带假丝酵母生长过程中产生较大抑菌圈，其他菌株未产生抑菌圈。综合两个数据结果，故选择油脂酵母和热带假丝酵母做为后续试验备选菌株。
4.4混菌试验结果
当热带假丝酵母5×106CFU/mL和油脂酵母5×107CFU/mL浓度时，可完全抑制105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL三种浓度的链格孢生长；当油脂酵母为5×106CFU/mL时，前2d能抑制住病原菌，但第3d病原菌又长出，不能完全抑制；当两株酵母菌的浓度为5×105CFU/mL时都不能抑制105CFU/mL、104CFU/mL链格孢的生长。由此可知，在浓度相同情况下，热带假丝酵母比油脂酵母的抑菌能力更强，故酵母菌中选择热带假丝酵母为下一步体外拮抗试验的候选菌株。
乳酸菌以109CFU/mL和108CFU/mL对105CFU/mL病原菌进行抑制，但乳酸菌在固体培养基上培养菌落较小，病原菌长势较乳酸菌快，故其体外抑菌浓度可参照酵母菌进行，比酵母菌浓度高一个数量级。由高浓度筛选，逐渐降低抑菌浓度。
芽孢菌与酵母菌平板生长速度、菌落大小相似，且液体发酵菌浓度相同，故可以酵母菌的最低抑菌浓度为参考浓度，做下一步保鲜试验。
实验2水果的防腐保鲜体外模拟试验
1梨的保鲜试验
1.1梨：河北水晶梨，从市场买回。
1.2处理：将梨用洗洁精清洗，自然晾干。分设10个组，每组30个果，各组按表4所示处理，贮存3个月，期间测定其失重率、总糖、总酸、维生素C(Vc)、硬度和可溶性固形物的含量等理化指标，每隔2d测一次，每次测两个果。记录其色泽、气味、肉质、口感等感官指标，以及腐烂率、好果率等。
表4各组处理方法
2草莓的保鲜试验
2.1草莓江苏大棚种植草莓，采摘24h内运往山东，从市场买回。
2.2试验设计1：
试验设14个试验组，CK1为未处理试验组，CK2为喷水对照组；其他按表5所示配方设计。每组30个果，记录每天草莓的好果率，腐烂果率，色泽，口感等。
表5试验方案
2.3试验设计2：
设11个试验组，其中两个对照组，CK1为未处理对照组，CK2为喷水对照组；其他按表6所示配方设计。每组30个果，记录每天草莓的好果率，腐烂果率，色泽，口感，气味等。
表6试验方案
注：表中“酸化剂”为表5中的酸化剂2。
2.4补充试验：为了进一步摸索菌粉与酸化剂的比例，补充试验以保鲜效果比较好的Lp和酸化剂2为主，做不同浓度的筛选，以确定最佳使用浓度，笔者设计了如下方案。
表7试验方案
3统计分析方法
对上述试验所得到的数据，采用DPS分析软件进行分析。
4结果
4.1梨的保鲜试验结果
4.1.1失重率：如表8所示，根据表8的数据，绘制图6。
表8失重率随时间的变化
从表8和图6可知，随着时间的变化，梨的失重率越来越大。第0、1、4、9组即对照、壳聚糖、乳酸菌和酸化剂组的失重率较其他组小，36d时失重率分别是3.3％、3.5％、3.6％和3.7％，从外观看，梨较饱满，口感脆度较好，色泽较好。而第6，7，8组有部分果皮失水皱缩，感官较差，口感脆度下降。
4.1.2总糖：如表9所示，根据表9中的数据绘制图7。
表9总糖含量的变化
由表9和图7可知，总糖含量随着时间的变化有曲折下降的趋势。4、5组变化幅度较对照组及其他组较小，较平稳。且4，5，6组总糖含量较大，说明这三组的保鲜剂抑制了梨的呼吸强度，减缓了淀粉转化为糖的速度。各组第49d达到较大值，笔者推测可能是贮存温度在10℃左右，呼吸跃变时间较晚，第49d才产生呼吸跃变，糖含量在呼吸跃变之后又呈下降趋势。
4.1.3总酸：如表10所示。
表10总酸含量的变化
从表10可知，总酸含量有曲折下降的变化趋势。9组的酸度变化幅度较其他组小，且总酸含量均值高于其他各组，说明酸化剂对梨果实内的有机酸有一定的保护作用；第1，4，5组次之，各组之间无显著差异。
4.1.4糖酸比：如表11所示，根据表11中所示的数据，绘制图8。
表11糖酸比变化
由表11和图8可知，0对照组、1壳聚糖、7乳酸菌+芽孢菌+酵母菌和8壳聚糖+酸化剂组糖酸比第40d达到最大值，3壳聚糖+乳酸菌、4乳酸菌、5芽孢菌、6酵母菌和9酸化剂组第46天达到最大值，比对照延迟了6d；4、5组变化幅度较小，且第4组糖酸比平均值较其他各组都小，说明第4组保鲜剂减缓了淀粉等转化成糖的速率，减小了酸的消耗。第6组缓慢上升，第46d达到最大值，后慢慢下降；0、1、2、3组变化幅度较大。
4.1.5维生素C含量：如表12所示。
表12Vc含量变化
注：“-”为未测出。
由表12可知，Vc的含量随贮藏时间的延长，含量降低较快。由前9d梨的Vc含量看，第9组和第8组Vc较高。由此可得，酸化剂对Vc具有一定的保护作用。10d以后的梨Vc含量均较低，故10d之后的Vc含量不作为试验的保鲜参考指标。
4.1.6硬度：如表13所示。
表13硬度的变化
由表13可知，第9组酸化剂组硬度整体较大，且果肉脆度较好，其次是第1组壳聚糖，第6组酵母菌组硬度最小，其他各组硬度与对照组相比无显著差异。由此可知，酸化剂组和壳聚糖组对梨的果肉硬度和脆度有一定的保护作用。
4.1.7可溶性固形物：如表14所示。
表14可溶性固形物
由表14可知，第3组壳聚糖+乳酸菌组可溶性固形物的均值最高，其次是第四组乳酸菌组，可溶性固形物较高，且变化较稳定，与对照组有极显著差异，由此可知，第3组壳聚糖+乳酸菌组及第4组乳酸菌组，可减少可溶性固形物的消耗，减缓呼吸作用。
4.1.8感官评价：如表15所示。
表15综合评价
注：黑斑为表皮病症，未伤及果肉。
从表15可知，从色泽看，第4，5，6组即乳酸菌、芽孢菌、酵母菌组较好，都表现为鲜黄色，而第1、2、3和8组色泽较差，呈现暗黄色，色泽暗淡无光，果皮褐变较严重；从好果率看，贮藏100d后，第4组乳酸菌组最高，为100％，硬度较硬，果肉脆度较好，果皮未发生皱缩现象。第9组果皮色泽次之，果肉脆度较好，但随着时贮存时间的延长，果实发病率较高，尤其是蒂腐病发病率较高。整体比较0、4、5组色泽、手感最好；9组次之；2、6较好；3、7、8、1果皮褐变严重，手感较软。
4.1.9效果图：如图9所示。
由图9可知，第4、5、6组腐烂率较小，且色泽较好，果皮未发生褐变；而第8组及第1组褐变最为严重，且失水软化，果皮皱褶。第2、7组次之。第9组色泽较好，但随贮藏时间的增长，其蒂腐病发病率较高。
4.2草莓保鲜试验结果
4.2.1第一批草莓保鲜试验结果：如表16所示，根据表16中的数据绘制图10
表16处理后草莓的保鲜效果
由表16和图10可知，各处理后的草莓经3d放置，颜色部分加深，香味变化不大；从饱满度指标看，对照组、7340、7348及Lp等菌处理组水浸斑较严重，且有部分腐烂，可能是处理过程中喷水较多导致，酸化剂1，2和壳+Lp、Lp+酸化剂2和壳+苯甲酸钠组较好，水浸斑较轻，光泽度较好，好果率较高，分别为40.0％、40.0％、46.7％、76.7％和46.7％。从图10和表16可知，保鲜效果Lp+酸化剂2(第11组)保鲜效果最好，比对照延长3d，效果显著好于其他各组。故保鲜试验以Lp和酸化剂2为主，做不同浓度的筛选，以确定最佳使用浓度。
4.2.2第二批草莓保鲜试验结果：如表17所示，根据表17中的数据绘制图11。
表17第二批处理后草莓的保鲜效果
由表17和图11可知，用Lp+酸化剂处理的试验组草莓好果率保鲜效果都比对照高。以Lp 5×107+酸化剂原浓度试验组效果最好，第2d好果率仍为80％，饱满度高，色泽鲜亮，气味酸甜，口感正常，可比对照延长保鲜期1d。Lp 2.5×107+1/2浓度酸化剂试验组前3d保鲜鲜果亦较好，但第1d好果率高于其他各组许多，而第2d和第3d都较Lp 5×107+酸化剂原浓度低，故本次试验推荐选用Lp 5×107+酸化剂原浓度最为保鲜剂参考浓度。草莓在保鲜剂内浸泡10min，取出自然晾干，其保鲜效果较喷雾保鲜效果差，且经浸泡的草莓晾干过程时间较长，费时费力。经壳聚糖浸泡过的草莓保鲜1d后酸味较大，而经酸化剂浸泡过的草莓气味较正常。
4.2.3补充试验结果：如表18所示，根据表18中的数据绘制图12。
表18补充试验草莓的保鲜效果
参照宝来利来生物工程股份有限公司产品青贮宝中乳酸菌的使用浓度，补充试验补充了LP 5×107以下的浓度：5×107至5×105。由表18和图12可知，处理第1d以第3、7和11组较高，好果率分别为73.3％、70.0％和第66.7％，第2d以第5、8和11组较好，好果率分别为60.0％、50.0％和50.0％；第3d以第5、8和9组较高，分别为46.7％、30.0％和30.0％，均高于对照组；使用1/2酸的组整体比原浓度酸的组好果率低，建议酸化剂使用原浓度；Lp浓度由5×107降低到106浓度，其保鲜效果好果率有上升趋势，浓度到5×105时又下降，故LP最佳使用浓度为5×106～107，综合三批草莓的保鲜试验，建议使用LP 5×106+酸化剂原浓度。
5结论
综合上述实验1和实验2，得出以下结论：
(1)对苹果、梨和桃的采后病害病原菌进行分离，得到6株致病力较强的病原菌，鉴定得知，其均为链格孢。
(2)最佳筛选培养基为营养肉汤培养基。处理方法为先将培养皿中倒入15mL营养肉汤培养基，凝固后，吸1mL105CFU/mL的病原菌孢子悬浮液和6mL冷却至45℃的营养肉汤培养基，混匀凝固。置于30℃培养箱培养。此方法不容易污染，且病原菌长势均匀，抑菌圈明显。
(3)通过拮抗菌发酵液和菌体对链格孢的抑菌试验，测定其菌落生长直径和抑菌带宽度，从5株酵母菌、3株芽孢菌和10株乳酸菌中各筛选出1株酵母菌热带假丝酵母、1株芽孢菌Y3和2株乳酸菌R4和R10。
(4)通过混菌试验，确定热带假丝酵母对105CFU/mL链格孢的最低抑制浓度为5×106CFU/mL。芽孢菌和乳酸菌的最低抑菌浓度参照酵母菌。
(5)由梨的保鲜试验结果知：酸化剂对梨的Vc含量和果肉硬度、水分含量及脆度具有一定的保护作用，乳酸菌、酵母菌和芽孢菌可显著抑制梨的腐烂及防治果皮的褐变。壳聚糖可适当抑制梨的失重率。保持采后梨的品质和风味，处理后对果实原有风味未产生任何不良影响，并可减少梨的总酸的消耗。
由防效试验结果可以得出，生物防治保鲜方法不但可以防治果皮褐变，且降低果实发病率，又可以适当减少果实水分挥发，抑制梨的新陈代谢，延长梨的保鲜期。
Vc含量：从初期保鲜效果看，酸化剂可有效保护梨的Vc。
硬度：酸化剂可保护其硬度和脆度。
色泽：经乳酸菌，芽孢菌和酵母菌处理过的梨的果皮褐变较轻，颜色保持鲜黄。
发病率：贮藏初期除个别冻伤之外，没有腐烂病发生，但随着时间的延长，到第90d时，乳酸菌一组腐烂病发病率为零，酸化剂一组蒂腐病发生率较高，由此可知，乳酸菌可有效的抑制霉菌，链格孢等果蔬病原菌的发病率。
硬度变化：用果实硬度计测定结果看，各组果实硬度相差较小，酸化剂和乳酸菌、芽孢菌可对梨的硬度及果肉脆度有一定的保护作用。
可溶性固形物：乳酸菌、芽孢菌可降低可溶性固形物的消耗速度，延缓果实衰老。
(6)草莓保鲜试验结论：根据梨的保鲜试验结果，将LP和酸化剂复配，其混合物对草莓的保鲜具有协同作用，较单独使用Lp和酸化剂效果好。可降低草莓果实腐烂率，常温下延长草莓的保鲜期1～3d。对草莓的保鲜，喷雾保鲜方法比浸泡好果率高，旦方便快捷。
综合以上试验结论，最终确定出一种防腐保鲜效果最佳的配方，即：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150，菌粉的使用浓度在5×106～5×107CFU/mL范围内，菌粉与酸化剂(蔗糖、酒石酸和山梨酸钾)进行复配，酸化剂与菌粉的比例为112∶5。配方如下：在1000mL水中，加入蔗糖100g、酒石酸4g和山梨酸钾3g，加热溶解，降至常温后加入菌粉(浓度在109)5g混匀，喷雾方式喷洒到水果上
6产品说明书
1主导成分：植物乳杆菌，酸化剂及载体等多种成分组成，活菌总数≥109cfu/g。
2作用：
2.1防治果蔬表皮褐变，保持果蔬原有色泽。
2.2显著抑制病原菌的入侵，降低果实的自然发病率。在常温下贮存3个月，梨的好果率为100％。
2.3保持果蔬的感官性状，增加香甜口感。
2.4减缓果蔬贮存期间总糖、总酸及VC含量的下降。有利于果蔬中营养物质的保存和原有风味的保持。
2.5抑制乙烯的生成，有效的降低自身催熟的程度。
2.6常温延长水果保鲜期3～100d，时间因果蔬品种而异。
3使用方法：先将保鲜剂加热溶解，降至常温后加入菌粉混匀，喷雾使用。
4使用量：每100g兑1L水，混匀喷雾，可处理0.1T草莓(水果)。注：浆果类不易喷得过多。
5规格：100g/袋。
实施例1配制一种防腐保鲜制剂
一、菌种配制方法：
(i)菌种：选用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，CCTCC M 2010150；
(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；
(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养14h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养10h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养18h；
(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达13000cP时，收集发酵液；
(vii)发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。
上述步骤(iii)、(iv)所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH6.0，115℃条件下灭菌20min；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 1mL/L，pH 6.0。
二、配制产品
保鲜制剂配方为：蔗糖、酒石酸和山梨酸钾和菌粉，配制方法如下：在1000mL水中，加入蔗糖100g、酒石酸4g和山梨酸钾3g，配方见表19，加热溶解，降至常温后加入菌粉(浓度在109)5g混匀，喷雾方式喷洒到水果上。
例：包装112g/袋
表19产品配方
注：菌粉单独包装，其他试剂单独包装。
使用方法：先将酸化剂加热溶解，降至常温后加入菌粉混匀，喷雾使用。每100g兑1L水，混匀喷雾，可处理0.1T草莓(水果)。
三、应用：
将市场买回的草莓，挑取无病、无虫和无伤且成熟度色泽一致的草莓按照市场包装方式进行保鲜，在木板上垫4层报纸，然后将草莓放置到其上方，用以上产品进行喷雾，晾干后加保鲜膜。共分4个组，2个对照组，2个使用产品组。每组30个草莓。
其效果以好果率表示，如下表：
表20产品应用效果表
将菌粉和酸化剂复配，其混合物对草莓的保鲜具有协同作用，较单独使用Lp和酸化剂效果好。可降低草莓果实腐烂率，常温下延长草莓的保鲜期1～3d。对草莓的保鲜，喷雾保鲜方法比浸泡好果率高，且方便快捷。
Claims (6)
1.一株可用于生物防腐保鲜的乳酸菌，其特征在于：该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。
2.权利要求1所述的可用于生物防腐保鲜的乳酸菌在水果防腐保鲜中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：应用时，先将酸化剂加热溶解于水，降温至常温后加入菌粉混匀，喷雾方式喷洒到水果上，然后将水果在常温或低温下储存。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酸化剂为蔗糖、酒石酸和山梨酸钾三者的混合物，蔗糖、酒石酸和山梨酸钾三者的质量比为100∶4∶3；溶于水时，每1000mL水中，溶解有蔗糖100g、酒石酸4g、山梨酸钾3g；酸化剂与菌粉的质量用量比例为112∶5，混匀后，菌的浓度为5×106～5×107CFU/mL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌粉是通过以下步骤得到的：
(i)菌种：选用植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，CCTCC M 2010150；
(ii)斜面培养：将冻于粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～42℃培养22～26h；
(iii)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养6～16h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于30～42℃条件下，静置培养14～22h；
(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；
(vii)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；
上述步骤(iii)、(iv)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至5.5～6.5，115℃条件下灭菌20min；步骤(ii)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5～6.5。
6.一种防腐保鲜制剂，其特征在于：是由以下原料组成的：蔗糖、酒石酸、山梨酸钾、菌粉和水，其中，每1000mL水中，溶解有蔗糖100g、酒石酸4g、山梨酸钾3g，菌粉5g；所述菌为可用于生物防腐保鲜的乳酸菌，命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010150。
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Denomination of invention: A lactic acid bacteria for biological preservation and its application Effective date of registration: 20220527 Granted publication date: 20110824 Pledgee: Taian Taishan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANDONG BOLY-LELY BIOENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980006448 |
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