CN104774105A

CN104774105A - 一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104774105A
Application number: CN201510164252.2A
Authority: CN
Inventors: 高克祥; 田叶韩; 刘晓光; 尹成林; 郭君兴; 李超; 王献礼; 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-08
Also published as: CN104774105B

Abstract

本发明公开了一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用。本发明的球毛壳菌生物菌肥粉剂是将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35CGMCC No.4136的孢子、腐植酸、壳聚糖混匀制备得到的。通过试验表明：该生物菌肥粉剂不仅能够防治多种植物病害，还对作物具有良好的促生作用，使作物在生物量和产量方面有显著的提高，具有良好的经济效益；并且该生物菌肥粉剂使用简单，避免了飞扬的微粉，减少了环境污染。在理论上和市场需求上都具有非常大的可行性。

Description

一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用，尤其涉及以球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35菌株的子囊孢子为活性成分的生物肥料粉剂的制备方法，属于农业微生物领域。

背景技术

球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35菌株是一株分离自健康毛白杨的植物内生真菌，属于子囊菌门、核菌纲、球壳目、黑孢壳科、毛壳菌属。

球毛壳菌ND35菌株的抑菌谱很广，对黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜霜霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果树腐烂病菌、杨树烂皮病菌和水泡溃疡病菌以及立枯丝核菌的菌丝生长都有明显的拮抗作用，代谢过程中能够产生具有抑菌活性的抗生物质，并能抑制黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌和杨树水泡溃疡病菌等的孢子萌发。在透射电镜下观察，发现球毛壳ND35与立枯丝核菌接触并发生重寄生作用后，球毛壳ND35菌丝寄生到病原菌菌丝内部后，在互作过程中产生了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶，会使其细胞结构发生紊乱、细胞壁降解。

已有的试验结果表明，球毛壳菌ND35菌株能有效定殖于蔬菜植物如苦瓜、黄瓜、番茄、菜豆和经济林木如杨树、核桃、板栗以及大田作物如甘薯、小麦、马铃薯、烟草、生姜的植株中，并对黄瓜、苦瓜、茄子和番茄的生长有明显的促进作用；盆栽条件下接种球毛壳菌ND35菌株后，可有效地防治黄瓜苗期猝倒病的发生，也能诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生***抗病性；还可有效防治菜豆立枯病。大田条件下对杨树的侧根和胸径生长具有一定的促进作用并诱导其对腐烂病菌和叶锈病菌产生抗性。球毛壳菌ND35菌株对板栗侧根和毛细根的生长具有积极影响，可增加板栗花序的数量、侧根和毛细根数量，在后期对地茎生长和一级分枝数也产生明显促生作用；对杨树扦插苗、菜豆、黄瓜、烟草、生姜的生长表现出促生作用。通过扫描电镜观察球毛壳菌ND35菌株对杨树组培苗的侵染定殖发现：子囊孢子萌发后，产生的菌丝多集中于根毛，但并不侵染根毛，主要通过根、茎部表面细胞间的缝隙侵入，或在根表面形成附着胞或菌丝足，通过形成侵染钉直接从表皮细胞侵入，在叶部主要从气孔侵入叶片内部，侵入根部的菌丝主要定殖于表皮细胞、外皮层细胞和细胞间隙，未进入内皮层和维管束组织。

球毛壳菌ND35菌株抗生物质粗提物对黄瓜、菜豆和小麦种子的萌发没有抑制作用，能够显著增加须根数、根鲜重和促进苗期生长，球毛壳菌ND35菌株活体菌剂的施用并不会减少黄瓜、番茄和菜豆根际土壤的细菌总量，而对黄瓜根际土壤的有益菌数量积累有一定的促进作用。球毛壳菌ND35菌株的子囊孢子在河水、水库水、自来水中均不能萌发且能自行消解，当浓度不大于10⁵cfu/ml时，不会对鱼类的生长造成影响；球毛壳菌ND35菌株的子囊孢子对小白鼠急性经口毒性属于“低毒”级，急性经皮肤单次刺激试验和经兔眼单次刺激试验结果均表明为“无刺激性”；可推断，球毛壳菌ND35菌株作为活体微生物制剂，与其它微生物制剂一样无毒、无污染、无残毒，对土壤中其它有益微生物无不良影响，不影响土壤和环境中微生态循环，用于设施蔬菜及陆地等作物土传病害的生物防治和增产促生无明显性风险。

球毛壳菌ND35菌株的环境适应性非常强，能够适应恶劣的盐碱条件。在室内，以PDA为基础培养基，研究酸碱度和盐分浓度对球毛壳菌ND35的菌丝生长和孢子萌发的影响，结果发现：在pH值3-12范围内，球毛壳菌ND35的菌丝能够正常生长，在含1％-10％的Ca²⁺、K⁺、N和P的培养基中，球毛壳菌ND35的菌丝依旧能够正常生长，且生长速率未受到酸碱度和盐分的影响；球毛壳菌ND35的子囊孢子在pH值为3-12范围内的PDB培养液中，孢子的萌发也未受到影响。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备生物菌肥的方法。

本发明提供的制备生物菌肥的方法包括如下步骤：将球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、腐植酸和壳聚糖混匀，得到生物菌肥。

上述方法中，所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、所述腐植酸和所述壳聚糖的配比为2×10¹¹cfu：(245-275)g：(35-45)g。

上述方法中，所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子为小于100目的孢子粉。

上述方法中，所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子粉为将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136孢子在培养料中发酵得到的产物。

上述方法中，所述发酵为将所述孢子以(1-3)×10⁸cfu/ml的量接种在含有食用菌菌糠的培养料中；所述孢子具体以2×10⁸cfu/ml的量接种在所述含有食用菌菌糠的培养料中。

上述方法中，所述含有食用菌菌糠的培养料为将食用菌菌糠和培养液混匀得到的；所述培养液是将土豆、葡萄糖和水混匀得到的；所述土豆、所述葡萄糖和所述水配比为70-100)g︰(7-10)g︰1000ml；所述土豆、所述葡萄糖和所述水的配比具体为70g∶7g∶1000ml。

上述方法中，所述食用菌菌糠和培养液的质量比为1︰(2-4)；所述食用菌菌糠和培养液的质量比具体为1︰2。

上述方法中，所述发酵时间为25～30天；所述发酵温度为20-30℃。

上述方法中，所述发酵时间具体为28天；所述发酵温度具体为25℃。

上述方法中，在将所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、所述腐植酸和所述壳聚糖混匀后还包括如下步骤：选取小于100目混匀后的产物。

上述方法中，还包括在混匀时添加填料的步骤。

上述方法中，所述填料为高岭土。

本发明的另一个目的是提供由上述方法制备的生物菌肥。

本发明的最后一个目的是提供上述生物菌肥在如下(1)-(14)中至少一种中的应用：

(1)增加植物的株高；

(2)提高植物的叶绿素a含量；

(3)提高植物的叶绿素b含量；

(4)提高植物的叶绿素总含量；

(5)提高植物的类胡萝卜素含量；

(6)提高植物叶片的还原糖含量；

(7)提高植物叶片的脯氨酸含量；

(8)提高植物单株产量；

(9)增加植物的叶宽；

(10)增加植物的叶长；

(11)增加植物的地径；

(12)促进植物苗期的生长；

(13)促使植物提前开花结果；

(14)防治植物苗期猝倒病。

上述应用中，所述植物为辣椒和/或黄瓜。

上述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136或其孢子或其发酵产物在作为生物菌肥添加剂或在制备生物菌肥添加剂的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的优势如下(1)-(5)所示：

(1)本发明使用的孢子为毛壳菌的有性孢子，相对于木霉菌和非致病镰刀菌等真菌的无性孢子，有性孢子在抗逆性方面更具有优势，能够有较长的货架期。

(2)本发明发酵球毛壳菌ND35菌株的原材料是平菇、香菇、金针菇出菇后的废弃菌糠，该原料具有成本低、易获得、培养性状优良、物理性状好等优点。

(3)本发明中球毛壳菌ND35菌株的固体培养流程方便简单，且适于大规模培养。

(4)本发明粉剂配方中添加了腐植酸与壳聚糖。腐植酸不仅具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能，还能够为球毛壳菌孢子提供一个缓冲环境，提高孢子的生存能力；壳聚糖不仅能够给孢子的萌发提供营养，而且能够诱导球毛壳菌产生几丁质酶，增强球毛壳菌对多种植物病原菌的拮抗活性。

(5)本发明粉剂产品使用方法简单，可用于作物育苗前的拌种和移栽苗时的穴施，因其活性成分--球毛壳菌ND35菌株是一种植物内生真菌，可以快速定殖于植物体内，使植物终生受益。

(6)本发明采用简单的生产技术和生产设备，生产出的粉剂生物肥料价格低廉。该产品不仅能够防治多种植物病害，而且还对作物具有良好的促生作用，促生作用主要表现在生物量的增加和产量的提高，具有良好的经济效益。

本发明通过发酵生产球毛壳菌ND35的孢子粉，然后经过粉碎、过筛后添加腐植酸和壳聚糖，得到生物菌肥粉剂。通过试验表明：该生物菌肥粉剂不仅能够防治多种植物病害，还对作物具有良好的促生作用，使作物在生物量和产量方面有显著的提高，具有良好的经济效益；并且该生物菌肥粉剂使用简单，避免了飞扬的微粉，减少了环境污染。在理论上和市场需求上都具有非常大的可行性。

附图说明

图1为田间应用的球毛壳菌生物菌肥粉剂产品。

图2为球毛壳菌生物菌肥粉剂对辣椒生长的影响。其中，A为对辣椒株高生长的影响；B为对辣椒叶绿素含量的影响(图柱上方不同小写字母表示0.05水平上差异显著)。

图3为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜苗生长的影响。其中，A为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜叶片中还原糖含量的影响；B为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜叶片中脯氨酸含量的影响(图柱上方不同小写字母表示0.05水平上差异显著)；C为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜苗生长的促生效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35菌株的分类命名为球毛壳菌，保藏号为CGMCC No.4136，在公开号为CN 102311925 B中公开过。

PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g和自来水1000ml。

PDA培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g，放入1000ml自来水中煮沸30min后，用双层纱布过滤掉马铃薯残渣，滤液中放入琼脂17g，加热使其融化，再加入葡萄糖20g，溶解后，加入自来水定容至1000ml。然后分装三角瓶中，于121℃灭菌25min后，备用。

PDB培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g和自来水1000ml。

PDB培养基的制备方法基本与PDA培养基的制备方法相同，只是没有添加琼脂，制备成为液体培养基。

腐植酸是山东汉高生物工程有限公司的产品。

壳聚糖是河北百味生物科技有限公司的产品。

高岭土是国药集团化学试剂有限公司的产品，产品目录号为20020528。

实施例1、球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法

一、球毛壳菌生物菌肥粉剂生产原料的制备

1、制备原料

以金针菇(平菇、香菇、金针菇等食用菌)出菇后的废弃菌糠为原材料，将其粉碎、晾干后作为培养球毛壳菌的原料。

2、配制营养液

营养液的配制方法为将一定量的土豆、葡萄糖和水(马铃薯70g、葡萄糖7g、自来水1000ml)放入锅中煮沸保持一定时间(40min)，配制成营养液。

3、培养料的制备

将步骤1制备得到的粉碎晾干后的菌糠与步骤2制备的营养液按照质量比为1：2的比例搅拌混匀(湿度控制在55％左右，自然pH)，得到培养料；将培养料装聚丙烯袋。

4、培养料的灭菌

将步骤3制备得到的培养料在121℃高温高压灭菌100min，得到灭菌后的培养料备用。

5、接种液的制备

将球毛壳菌ND35菌株接种于PDA培养基上培养，待产孢后刮取孢子加入PDB培养基中，得到孢子悬浮液(浓度为2×10⁸cfu/ml)即接种液。

6、接种与发酵培养

将步骤5中制备得到的孢子悬浮液接种步骤4中灭菌后的培养料中，孢子悬浮液以2×10⁸cfu/ml的量接种在所述含有食用菌菌糠的培养料中。25℃条件下将接种后的培养料发酵培养28天(当培养到25天时，将袋口解开)，得到含有孢子粉发酵产物。

7、粗孢子粉的获得

待球毛壳菌ND35菌株完全产孢后，将含有孢子粉发酵产物取出晾干，使用超微粉碎机将其粉碎，先后通过80目和100目的筛网，得到小于100目的含有孢子粉发酵产物(命名为粗孢子粉)，再采用梯度稀释法检测粗孢子粉中的孢子数量，具体检测方法如下：

(1)称取粗孢子粉0.02-0.05g；

(2)将称取的粗孢子粉放入含有5ml无菌水的烧杯中，搅拌，放置5-10min；

(3)取上悬液滴到准备好的血球计数板上，进行镜检；

(4)按照血球计数板的使用规则进行计量；

(5)按照血球计数板的计算公式计算出1ml菌液中的总菌数(1ml菌液中的总菌数＝A/5×25×10000×B，A为5个中格中的总菌数，B为菌液稀释倍数)；

(6)根据1ml菌液中的总菌数计算1g样品中的孢子数；

(7)重复上述步骤2-3次，计算平均数。

经检测，粗孢子粉中的孢子量为2×10⁸cfu/g，将其作为球毛壳菌生物菌肥粉剂的生产原料备用。

二、球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备

1、称取260g腐植酸、39g壳聚糖和上述一制备的1kg粗孢子粉；充分混匀，得到混匀后的粉剂。

2、将混匀后的粉剂过100目筛网，得到球毛壳菌生物菌肥粉剂(如图1所示)。

3、按照农用微生物菌剂(GB20287—2006)标准检测球毛壳菌生物菌肥粉剂的有效活菌数、霉菌杂菌数、水分和杂菌率、细度和pH值等指标。

检测结果如下：有效活菌数为2.55×10⁸cfu/g；霉菌杂菌数为2.4×10⁶个/g(mL)；杂菌率为20.0％；水分为35.0％；细度为85％；pH值为7.5。

实施例2、不同组分的粉剂对黄瓜生长的影响

1、试验地点和方法

试验地点在山东农业大学温室。分如下4组进行处理：

第1组为空白对照CK(记做CK)；

第2组为粉剂A(按照实施例1的方法制备得到的粉剂，组分：腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉；腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉的质量比分别为260g：39g：1000g)；

第3组为粉剂B(按照实施例1的方法制备得到的粉剂，组分：腐植酸、粗孢子粉和高岭土；腐植酸、粗孢子粉和高岭土的质量比分别为260g：1000g：39g)；

第4组为粉剂C(按照实施例1的方法制备得到的粉剂，组分：壳聚糖、粗孢子粉和高岭土；壳聚糖、粗孢子粉和高岭土的质量比为39g：1000g：39g)

在种植时，每棵黄瓜添加2g粉剂。

在黄瓜生长期对其株高和地茎进行测量，并用SPSS软件对数据进行统计分析。

2、试验结果

试验结果如表1所示：施加粉剂的三个处理(粉剂A、粉剂B、粉剂C)的黄瓜苗均与空白对照CK有显著差异，粉剂A、粉剂B、粉剂C处理的黄瓜苗的株高和地径分别比空白对照黄瓜苗的株高和地径提高23.92％、16.70％、9.26％和8.47％、8.06％、0.62％，而且粉剂A处理组的黄瓜苗(4-5叶期)的株高、地径均高于其他组(CK、粉剂B、粉剂C)的黄瓜苗。

表1、不同组分粉剂对黄瓜苗期生长的影响

注：同一植物同列中不同小写字母表示0.05水平上差异显著。

实施例3、球毛壳菌生物菌肥粉剂对大田辣椒生长的影响

1、试验地点和方法

试验地点在山东省德州市武城县老城镇。分如下3组进行处理：

第1组为处理组，在移栽时施加实施例1制备得到的球毛壳菌生物菌肥粉剂(组分：腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉；腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉的质量比分别为260g、39g、1000g；记做粉剂)，每棵辣椒苗施加2克；

第2组为阳性对照组，使用剂型1的粉剂，在移栽辣椒时施加已授权的专利“一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用”(ZL201110232477.9)中的生物菌肥粉剂(同以下实施例中的剂型1)，每棵辣椒苗施加2克；

第3组为阴性对照组即空白对照CK(记做CK)。

在辣椒生长期对其株高和叶片叶绿素含量进行测量，方法参照王学奎(2006)，并用SPSS软件对数据进行统计分析。

2、试验结果

结果如图2A和2B所示：粉剂和剂型1处理的辣椒苗株高分别比对照组提高7.63％和3.09％，并且在P<0.05水平上差异显著(图2A)，且粉剂处理的比剂型1处理的辣椒苗株高有所增加；粉剂和剂型1处理的辣椒叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、类胡萝卜素含量分别比对照提高29.68％、37.28％、31.85％、11.51％和16.8％、18.70％、31.85％、7.51％(图2B)。由此可看出，在辣椒移栽时施加本发明的粉剂产品可以显著提高苗期的株高和叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量及类胡萝卜素含量，且粉剂处理的效果好于剂型1处理的效果。

实施例4、球毛壳菌生物菌肥粉剂对大田黄瓜生长的影响

1、试验地点和方法

试验地点在山东农业大学南校区植物保护学院试验田。

育苗时在田间搭建两个育苗拱棚，一个不施加粉剂作为对照组CK；另一个在育苗时施加实施例1制备的球毛壳菌生物菌肥粉剂(组分：腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉；腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉的质量比分别为260g、39g、1000g，记作粉剂)，两周后移栽至大田。移栽时将以上两组黄瓜苗再分别分为两组，一组在移栽时不施加粉剂，另一组在移栽时施加粉剂。施加量为2克/棵。试验共分为四组，分别记做：CK+CK、CK+粉剂、粉剂+CK、粉剂+粉剂，每个处理100棵。

试验在自然条件下进行，测量黄瓜叶片中的还原糖和脯氨酸含量，单株产量、叶宽、叶长、地径，用SPSS软件对数据进行统计分析。

2、试验结果

(1)对黄瓜还原糖和脯氨酸含量的影响

还原糖含量试验结果如3A所示：施加粉剂(CK+粉剂、粉剂+CK、粉剂+粉剂)的黄瓜叶片中还原糖含量均高于未施加粉剂(CK+CK)的黄瓜，两次施加粉剂(粉剂+粉剂)的高于一次施加粉剂(CK+粉剂、粉剂+CK)的。仅在育苗时施加粉剂(粉剂+CK)的黄瓜还原糖含量高于仅在移栽时施加的(CK+粉剂)，各处理之间在P<0.05水平上差异均显著。

脯氨酸含量试验结果如图3B所示：施加粉剂(CK+粉剂、粉剂+CK、粉剂+粉剂)的黄瓜叶片中脯氨酸含量均高于未施加粉剂(CK+CK)的黄瓜，两次施加粉剂(粉剂+粉剂)的高于一次施加粉剂(CK+粉剂、粉剂+CK)的。仅在移栽时施加粉剂(CK+粉剂)的黄瓜脯氨酸含量高于仅在育苗时施加粉剂(粉剂+CK)的，除了仅在移栽时施加粉剂的与两次施加粉剂的两种处理外，其余各处理之间在P<0.05水平上均差异显著。

(2)对黄瓜单株产量、叶宽、叶长、地径的影响

试验结果如表2所示：施加粉剂的三个处理(粉剂+粉剂、粉剂+CK、CK+粉剂)的黄瓜单株产量均与空白对照(CK+CK)有显著差异，粉剂+粉剂、粉剂+CK、CK+粉剂处理的黄瓜单株产量分别比空白对照(CK+CK)提高84.31％、35.29％、15.69％。粉剂+粉剂处理组的黄瓜各项生物量指标(叶宽、叶长、地径)也均高于其他组(CK+CK、CK+粉剂、粉剂+CK)的黄瓜各项生物量指标。

表2、粉剂对黄瓜生长和产量的影响

注：同一植物同列中不同小写字母表示0.05水平上差异显著。

实施例5、球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜苗期猝倒病的防治效果

采用山东农业大学南校区试验田带有瓜果腐霉菌的土壤进行黄瓜盆栽试验，栽培基质为农田土：育苗基质＝1：1等体积的均匀混合物。设三个处理：(1)处理组：播种时施加本发明实施例1制备的球毛壳菌生物菌肥粉剂(组分：腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉；腐植酸、壳聚糖和粗孢子粉的质量比分别为260g、39g、1000g；记作粉剂)；(2)阳性对照组：播种黄瓜种子时施加已授权的专利“一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用”(ZL201110232477.9)中的生物菌肥剂型1；(3)阴性对照组：播种时不加任何球毛壳菌生物菌肥粉剂的空白对照(CK)。温室条件下进行常规水分管理，当黄瓜苗长至三叶一心时(播种后23天)，进行病害调查，统计发病率和防治效果。

试验结果如表3所示，本发明的球毛壳菌生物菌肥粉剂产品对黄瓜苗期猝倒病的相对防治效果为51.25％，剂型1的相对防治效果为44.35％。本发明的粉剂产品对黄瓜苗期猝倒病的相对防治效果与剂型1(阳性对照)的相对防治效果相比有所提高。不仅能促进黄瓜苗期的生长，而且还能促使黄瓜提前开花结果(图3C)。

表3、粉剂对黄瓜苗期猝倒病的防治效果

Claims

1.一种制备生物菌肥的方法，包括如下步骤：将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、腐植酸和壳聚糖混匀，得到生物菌肥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、所述腐植酸和所述壳聚糖的配比为2×10¹¹cfu：(245-275)g：(35-45)g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)ND35CGMCC No.4136的孢子为小于100目的孢子粉。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在将所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136的孢子、所述腐植酸和所述壳聚糖混匀后还包括如下步骤：选取小于100目混匀后的产物。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括在混匀时添加填料的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述填料为高岭土。

7.由权利要求1-6中任一所述的方法制备的生物菌肥。

8.权利要求7所述的生物菌肥在如下(1)-(14)中至少一种中的应用：

(1)增加植物的株高；

(2)提高植物的叶绿素a含量；

(3)提高植物的叶绿素b含量；

(4)提高植物的叶绿素总含量；

(5)提高植物的类胡萝卜素含量；

(6)提高植物叶片的还原糖含量；

(7)提高植物叶片的脯氨酸含量；

(8)提高植物单株产量；

(9)增加植物的叶宽；

(10)增加植物的叶长；

(11)增加植物的地径；

(12)促进植物苗期的生长；

(13)促使植物提前开花结果；

(14)防治植物苗期猝倒病。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为辣椒和/或黄瓜。

10.权利要求1-6中任一所述的球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35 CGMCC No.4136或其孢子或其发酵产物在作为生物菌肥添加剂或在制备生物菌肥添加剂的产品中的应用。