CN101912048A - 一种兽用t4溶菌酶预混剂及其制备方法 - Google Patents

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本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及制备一种含有来源于T4噬菌体的T4溶菌酶的预混剂。本发明以来源于T4噬菌体的T4溶菌酶替代传统的兽用抗生素，制备含有T4溶菌酶的抗菌促生长类饲料预混剂。所涉及的T4溶菌酶原液经过离心去杂质，膜浓缩，阳离子交换树脂精制纯化，低温喷雾干燥法制备蛋白酶粉，酶粉过筛，加入辅料，混合机高速混合均匀后制备得到T4溶菌酶预混剂制剂。添加的辅料包括豆粕粉，麸皮，小麦粉，小麦次粉，膨润土，CaCO3，沸石粉。实验结果表明，含有T4溶菌酶的预混剂治疗仔猪腹泻病效果明显优于含有来源于鸡卵清蛋白的溶菌酶预混剂；对肉鸡和鲤鱼的饲喂试验结果则表明，在增重效果和提高饲料利用率上，含有T4溶菌酶的预混剂稍优于含有来源于鸡卵清蛋白溶菌酶的预混剂。

Description

一种兽用T4溶菌酶预混剂及其制备方法
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及制备一种含有来源于T4噬菌体的T4溶菌酶预混剂。
背景技术
我国幅员辽阔，人口众多，近年来经济发展迅速，人民生活水平逐步提高，对高质量动物性蛋白产品需求量不断上升，由此带动了国内动物保健品行业的快速发展，国内食品动物保健品市场已是继美国之后的第二大市场。
随着中国陆续出台各种食品安全措施，相对应的开发安全高效无毒动物饲料添加剂类产品已经成为动物保健品行业的发展方向。溶菌酶是一种能有选择性使对象微生物细胞壁溶解，而对生物体本身有保护作用的酶类，并且具有广谱高效杀菌、体内无残留、环境无污染的特性，近年来被广泛研究。将溶菌酶用于动物饲料添加剂中以替代传统的兽药抗生素产品，具有较高的经济和社会效益。
人们最早开始研究溶菌酶是从Nicoile 1907年发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始；两年以后Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶的结果；1922年英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，所以命名为溶菌酶。后来人们逐渐在人和动物的多种组织、分泌物和植物、微生物也发现了溶菌酶的存在。随着对溶菌酶的研究不断地深入发展，人们对其特性有了进一步的了解。
溶菌酶是能溶解微生物细胞壁的一种酶，是一类物质的的总称。根据其来源以及作用机制不同可以分为动物源溶菌酶：包括C型(chicken-lysozyme type)、G型(goose-type)、I型(intertebrate-type)；植物源溶菌酶；微生物源溶菌酶：包括N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内肽酶、β-1，3、1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、壳多糖酶；噬菌体T4溶菌酶。溶菌酶来源不同其作用功效不同。
噬菌体溶菌酶则是由各种能够感染细菌细胞的噬菌体自身所编码的，通常位于噬菌体的蛋白衣壳内，在感染宿主细胞的过程中，它们在溶解细菌细胞壁方面起重要作用。T4溶菌酶是由T4噬菌体在感染大肠杆菌E.coli时所产生的，它是迄今为止人们发现的杀菌活性最高的一种溶菌酶。
目前在饲料添加剂中使用的常用溶菌酶大都是采用化学法从鸡蛋清中提取制备的，但是由于生产规模和高成本限制，使其难以在饲料行业中大规模推广。中国农业科学院的刘德虎研究员发明的专利200610137767公开了一种构建表达高杀菌活力T4溶菌酶重组蛋白基因工程酵母菌的方法。本发明所阐述的T4溶菌酶采用刘德虎研究员构建的基因工程菌大规模发酵生产，大幅度降低了产品成本。并且由于其抑菌活性高，使用剂量低，在饲料添加剂行业中应用前景广阔。在本发明前，还未见有规模化制备来源于T4噬菌体的T4溶菌酶的方法及相应的预混剂产品的报道。
发明内容
本发明描述的是一种含有来源于T4噬菌体的T4溶菌酶预混剂及其的制备方法。
本发明包括以下两个方面：
1.从发酵液中提取T4溶菌酶，发酵液经过板框过滤，过滤液上清经陶瓷膜超滤，陶瓷膜过滤液经过中空纤维柱层析精滤，然后根据T4溶菌酶产品的分子量，优选合适孔径大小的有机纳滤膜纳滤浓缩，纳滤液用阳离子交换树脂层析精制纯化，优选CM-Sephadex-C25(实验用)或AmberliteIRC-50(工业规模，50～100目)阳离子交换树脂。离子交换液喷雾干燥制得酶粉，其喷雾干燥母液起始固含量为2-10％，进风温度为80-180℃，出风温度为40-80℃，酶干粉蛋白杀菌活性能达到喷雾前固形物活性的95％。
2.喷雾干燥制备的酶粉过60-120目筛，加入过80-120目筛玉米蛋白，脱脂豆粕粉，麸皮，小麦次粉，同时加入膨润土，沸石粉和CaCO3，高速混合均匀，制备含量为1-10％的T4溶菌酶预混剂。
本发明的优点是采用的溶菌酶来源于T4噬菌体，生产方式为发酵法规模化生产，选用优化的提取工艺提取的T4溶菌酶纯度高活性强，同时成本低，相对于现有来自于鸡卵清蛋白的溶菌酶产品，具有更大的实际应用价值和经济效益。
具体实施方式
实施例1
T4溶菌酶发酵液，板框过滤除去菌丝体，框过滤液用0.1微米陶瓷膜超滤，优选孔径为50,000道尔顿的中空纤维柱层析精滤，根据T4溶菌酶产品的分子量，优选孔径为2500道尔顿的有机纳滤膜纳滤浓缩，纳滤液用阳离子交换树脂层析精制纯化，优选CM-Sephadex-C25阳离子交换树脂。离子交换液喷雾干燥制得酶粉，其喷雾干燥母液起始固含量为4％，进风温度为90℃，出风温度为60℃。酶粉过60-120目筛，称取62.5g过筛物，加入过80-120目筛的玉米蛋白350g和麸皮250g，同时加入膨润土50g，CaCO3 200g，沸石粉87.5g，高速混合机混和均匀，制得T4溶菌酶预混剂(5％)。
实施例2
T4溶菌酶发酵液，板框过滤除去菌丝体，框过滤液用0.2微米陶瓷膜超滤，优选孔径为25,000道尔顿的中空纤维柱层析精滤，根据T4溶菌酶产品的分子量，优选孔径为2500道尔顿的有机纳滤膜纳滤浓缩，纳滤液用阳离子交换树脂层析精制纯化，优选AmberliteIRC-50阳离子交换树脂。离子交换液喷雾干燥制得酶粉，其喷雾干燥母液起始固含量为8％，进风温度为100℃，出风温度为80℃。酶粉过60-120目筛，称取118g过筛物，加入过80-120目筛的玉米蛋白350g和麸皮200g，同时加入膨润土100g，CaCO3 150g，沸石粉82g，高速混合机混和均匀，制得T4溶菌酶预混剂(10％)。
实施例3
T4溶菌酶发酵液，板框过滤除去菌丝体，框过滤液用0.1微米陶瓷膜超滤，优选孔径为25,000道尔顿的中空纤维柱层析精滤，根据T4溶菌酶产品的分子量，优选孔径为2500道尔顿的有机纳滤膜纳滤浓缩，纳滤液用阳离子交换树脂层析精制纯化，优选CM-Sephadex-C25阳离子交换树脂。离子交换液喷雾干燥制得酶粉，其喷雾干燥母液起始固含量为6％，进风温度为95℃，出风温度为70℃。酶粉过60-120目筛，称取56g过筛物，加入过80-120目筛的脱脂豆粕350g和小麦次粉250g，同时加入膨润土80g，CaCO3 200g，沸石粉64g，高速混合机混和均匀，制得T4溶菌酶预混剂(5％)。
实施例4
T4溶菌酶发酵液，板框过滤除去菌丝体，框过滤液用0.2微米陶瓷膜超滤，优选孔径为50,000道尔顿的中空纤维柱层析精滤，根据T4溶菌酶产品的分子量，优选孔径为2500道尔顿的有机纳滤膜纳滤浓缩，纳滤液用阳离子交换树脂层析精制纯化，优选AmberliteIRC-50阳离子交换树脂。离子交换液喷雾干燥制得酶粉，其喷雾干燥母液起始固含量为5％，进风温度为95℃，出风温度为75℃。酶粉过60-120目筛，称取89g过筛物，加入过80-120目筛的脱脂豆粕400g和小麦次粉250g，同时加入膨润土50g，CaCO3 150g，沸石粉61g，高速混合机混和均匀，制得T4溶菌酶预混剂(8％)。
实施例5
应用实施例
针对仔猪的试验：
(1)实验设计
180头30日龄仔猪(体重8.5kg左右)，采取随机单因子设计，分成三组，分别为对照组(不添加溶菌酶)、试验1组(每公斤饲料添加180mg鸡卵清蛋白溶菌酶)、试验2组(每公斤饲料添加180mgT4溶菌酶)，每组三个重复，每个重复20头仔猪。添加的鸡卵清蛋白溶菌酶制剂和T4溶菌酶制剂含量均为50万U/g，每组3个重复，试验期6周。组间、重复组间体重不超过平均体重的5％。观测各组腹泻头次数，并作记录。出现腹泻立刻治疗。
(2)结果与分析
表1仔猪腹泻情况
  组别   对照组   试验1组   试验2组
  平均腹泻率(％)   57.5   25   10
由表1可以看出，试验2组的平均腹泻率较前两组分别降低了83％和60％。从以上结果可以看出，断奶仔猪中不添加任何抗生素或其他抗腹泻的添加剂，腹泻严重，在断奶仔猪日粮中添加溶菌酶较空白对照组可以有效控制腹泻，但在同样添加量的情况下添加T4溶菌酶的抗腹泻效果较鸡卵清蛋白溶菌酶更优异。
针对肉鸡的试验：
(1)实验设计
将试验肉仔鸡随机分为三组，每组4个重复，每个重复200羽。对照组为日常饲粮组，试验1组是在日常饲粮组的基础上添加鸡卵清蛋白溶菌酶，试验2组是在日常饲粮组的基础上添加T4溶菌酶。试验周期为8周，前四周在试验1组和2组中添加对应溶菌酶量为60g；后四周在试验1组和2组中添加对应溶菌酶量为30g。添加的鸡卵清蛋白溶菌酶制剂和T4溶菌酶制剂含量均为50万U/g。观测各组日增重、日采食量、死亡率，并作记录，组间、重复组间体重不超过平均体重的5％。
(2)结果与分析
表2对肉仔鸡生长性能的影响(1-4周)
  项目  平均日增重(g)   日采食量(g)   料重比   死亡率(％)
  对照组  75.96   95.71   1.26   1.83
  试验1组  76.31   95.03   1.246   1.49
  试验2组  80.01   95.11   1.189   0.79
从表2可以看出1-4周在肉仔鸡的饲料中添加溶菌酶可以提高肉仔鸡的生产性能，添加T4溶菌酶平均日增重较前两者分别提高了5.3％和4.8％，料重比分别降低了5.6％和4.6％，死亡率亦降低了56.8％和46.9％，效果优于鸡卵清蛋白溶菌酶。
表3对肉仔鸡生长性能的影响(5-8周)
  项目  平均日增重(g)   日采食量(g)   料重比   死亡率(％)
  对照组  171.53   349.21   2.036   1.71
  试验1组  173.22   351.08   2.027   1.32
  试验2组  176.94   354.86   2.006   0.68
从表3可以看出5-8周在肉仔鸡饲料中添加T4溶菌酶可以达到良好的生产性能，肉仔鸡的料重比及死亡率都有明显的改善，效果优于鸡卵清蛋白溶菌酶。
针对水产养殖的试验
(1)试验设计
选取平均体重为80g左右的试验鱼，分为3组，分别为对照组(不添加溶菌酶)、试验1组(每公斤饲料添加75mg鸡卵清蛋白溶菌酶)、试验2组(每公斤饲料添加75mgT4溶菌酶)，添加的鸡卵清蛋白溶菌酶制剂和T4溶菌酶制剂含量均为50万U/g，每组设三个重复组。组间、重复组间体重不超过平均体重的5％。试验期30天，在室内水箱中进行，控制水温在25-30℃，pH6.8-7.2之间。
(2)结果与分析
表4对试验鱼(鲤鱼)生长性能的影响
  项目   平均增重(g)   平均摄食量(g)   饵料系数
  对照组   6.68   25.12   3.761
  试验1组   8.78   26.54   3.023
  试验2组   9.81   26.79   2.731
由表4可知，添加T4溶菌酶组试验鱼的增重率和饵料系数显著优于对照组和添加鸡蛋清蛋白溶菌酶，较对照组和鸡蛋清蛋白溶菌酶组饵料系数分别下降了27.4％和9.7％。

Claims (7)

1.一种制备T4溶菌酶预混剂的方法，其特征是包括以下步骤：
A.从发酵液中分离提纯T4溶菌酶，发酵液经过板框过滤，膜浓缩，阳离子交换树脂精制纯化，喷雾干燥，制得原始酶粉；其喷雾干燥母液起始固含量为2-10％，优选8％；进风温度为80-180℃，优选90℃；出风温度为40-80℃，优选60℃；喷雾干燥溶菌酶粉含量为70％-90％，并过60-120目筛。
B.在上述T4溶菌酶酶粉中加入过80-120目筛的辅料，混合机高速混合均匀，制备成T4溶菌酶预混剂。
2.按权利要求1所述的制备T4溶菌酶预混剂的方法，其特征是所述的辅料包括玉米蛋白(添加量为200-500g/kg预混剂)，脱脂豆粕粉(添加量为200-500g/kg预混剂)，麸皮(添加量为200-500g/kg预混剂)，小麦次粉(添加量为200-500g/kg预混剂)，膨润土(添加量为10-100g/kg预混剂)，CaCO3(添加量为100-300g/kg预混剂)，沸石粉(添加量为50-200g/kg预混剂)。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的制备的T4溶菌酶预混剂，其特征是制备含量为1-10％的T4溶菌酶预混剂。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备的T4溶菌酶预混剂，其特征是制备含量优选为5％的T4溶菌酶预混剂。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的T4溶菌酶预混剂，其特征是其使用的对象为各种畜禽类及水产养殖类。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的T4溶菌酶预混剂，其特征是其使用的对象优选为仔猪，肉鸡。
7.根据权利要求6所述，T4溶菌酶在饲料中的添加量为50-500mg/kg饲料，其中在仔猪中添加量优先为180mg/kg饲料，在鸡中添加量优选为60mg/kg饲料，在淡水鱼类中添加量优先为75mg/kg饲料。
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