CN103478509B - 一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在对虾饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在对虾饲料中的应用，属于农业领域中的水产养殖技术领域和生物技术领域。以保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌fmb-50为菌种，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液；发酵液经微滤去除菌体或经膜过滤和纳滤，加入玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得所述的抗菌物质饲料添加剂抗菌效价为40000～50000IU或250000IU/g。本发明利用解淀粉芽孢杆菌fmb-50为原料发酵生产抗菌物质，可大规模工业化生产，生产周期短，生产成本大大降低，用于对虾饲料中，可以降低死亡率,提高对虾的饲料利用率、促进对虾非专一性免疫反应和提高能量代谢水平。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在对虾饲料中的应用

技术领域

本发明属于农业领域中的水产养殖技术领域和生物技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在对虾饲料中的应用。

背景技术

水产养殖业在生产和加工过程使用抗生素，主要是预防（预防剂）和治疗（治疗药）细菌病。饲料中添加抗生素可以防治水产疾病、促进水产产量增加和节约饲料。但是，经常使用抗生素会在养殖环境中的菌群中形成耐药性，一旦致病力强的细菌对人畜共用的抗生素获得了耐药性，人类感染后，有可能本来有效的抗生素疗效会减小甚至无效。另外，残留在水产品中的抗生素进入人体，直接影响人类的健康。

食品和饲料在美国属于同一管理范围，适用于同一部法律。丹麦政府为了保证食品安全，制定了饲料生产中禁止使用抗生素的规定；2006年欧盟已禁止在动物饲养中使用抗生素作为饲料促进剂。随着人民生活水平的提高，对动物产品的需求量越来越大，对绿色食品的呼声越来越高。我国的一些农副产品由于农药、抗生素等药物残留，重金属含量等技术指标超过欧盟及主要进口国的质量标准，被拒收、扣留和终止合同等。近年来, 动物产品中的抗生素药物残留问题越来越受到人们的重视，我国已严格限制将某些抗生素作为保健和促生长剂用于饲料。2002年，农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》公告， 农业部最近表示，为提升消费者对畜牧产品的信赖，拟计划全面禁止在动物饲料中添加抗生素。我国是水产养殖生产大国，但水产品的出口常常遇到抗生素残留而导致出口被拒，影响了我国的对外贸易。这表明传统抗生素必将逐渐淡出历史舞台，寻找安全高效的抗生素替代品就显得十分重要，鉴于抗生素的不利影响，开发通过调整动物胃肠道平衡而达到促进生长、维持动物健康、无毒副作用的绿色饲料添加剂已成为人们研究的热点。特别是在我国未来养殖业的发展中，政府将进一步加大对饲料、兽药与畜产品卫生安全的监管力度，积极推动发展绿色养殖业。因此，应用现代高科技手段研究和开发安全、高效、环保的抗菌添加剂，保障动物和人类自身的健康与安全，才能使我国由养殖生产大国成为养殖生产强国，实现养殖业的现代化。而目前针对养殖业，市场上可用于替代抗生素类饲料添加剂几乎处于空白状态。

本发明即是针对上述问题，开发一种基于解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌物质的水产饲料添加剂。抗菌肽(Antibacterial Peptides)是生物体产生的一种具有抗菌作用的多肽类分子,一般分子量比较小，通常小于5kD, 是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。迄今为止,已在许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽。这些抗菌物质不仅有广谱抗细菌能力，而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。此外，还具有稳定性好、水溶性好、抗菌机理独特、对高等动物正常细胞无害等特点，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。国外对抗菌肽已有较多研究，在动物生产实际中也已开始应用，其作为饲料添加剂的使用效果已被实验证实，并已形成一定的市场需求。但动物源抗菌物质的抗菌谱窄，通常只能抑制革兰氏阳性菌，限制了在饲料中的大规模使用。芽孢杆菌来源的抗菌脂肽是抗菌脂肽家族中的重要一员，它能特异性杀死竞争菌而对宿主本身无害，其种类包括环形肽、糖肽和脂肽，如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素等。水产养殖动物终身生活在养殖水环境中，养殖水体、水产动物体表和肠道内均有大量微生物，这种体内外的微生态环境对水产养殖动物健康均有直接或间接的影响。同时，由于不同类型的动物体内外微生物环境不同，因此，对于抗菌饲料添加剂的需求也不同。例如适用于哺乳动物的抗菌饲料添加剂，未必适用于水产动物，而水产动物由于物种的不同，使用的饲料添加剂也有可能有很大不同。

发明内容

技术问题

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供淀粉芽孢杆菌来源的一种抗菌物质饲料添加剂。

本发明的另一目的是提供该抗菌物质饲料添加剂的制备方法。

本发明的又一目的是提供该抗菌物质饲料添加剂的应用。

技术方案

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)抗菌物质饲料添加剂的制备方法，包含以下步骤：

以保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌fmb-50为菌种，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液；发酵液经微滤去除菌体，加入10%-15%（g/100ml）玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得所述的抗菌物质饲料添加剂，所述的抗菌物质饲料添加剂抗菌效价为40000~50000 IU/g；或者发酵液经微滤去除菌体后，再经10KD的膜超滤和纳滤，加入10%-15%玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得所述的抗菌物质饲料添加剂；所述的抗菌物质饲料添加剂抗菌效价为250000 IU/g左右；其中，所述的种子培养和扩大培养的培养基为：葡萄糖3.5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L，pH7.0；115℃高压蒸汽灭菌30min；所述的发酵生产使用的液体发酵培养基为：麦芽浸粉 1g/L ,黄豆粉 15g/L ,CaCO₃ 6.68g/L，FeSO₄ 0.4g/L ,MgCl₂ 2g/L，初始pH 7.0；发酵生产中按体积比 2~5%接种解淀粉芽孢杆菌fmb-50（CGMCC No.6249），1000 L发酵罐液体深层发酵36～40 h，发酵工艺参数为：温度33～37℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m³/h，罐压0.10~0.12 Mpa，pH7.0。

按照所述的制备方法制备得到的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂在制备鱼或虾饲料中的应用；优选在制备虾饲料中的应用，进一步优选在制备凡纳滨对虾饲料中的应用。

在凡纳滨对虾饲料中添加含抗菌物质的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂，添加量为每公斤饲料中添加200000～400000IU抗菌物质。

有益效果:

1. 本发明中的微生物抗菌物质和动物源抗菌物质相比，具有广谱高效抗菌的优势。

2. 本发明利用保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌fmb-50为原料发酵生产抗菌物质脂，可大规模工业化生产，生产周期短，生产成本大大降低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，是克服抗菌物质实际应用技术瓶颈的最佳途径。

3. 本发明解淀粉芽孢杆菌抗菌物质添加剂用于凡纳滨对虾饲料中，可以降低死亡率,提高凡纳滨对虾的饲料利用率、促进凡纳滨对虾非专一性免疫反应和提高能量代谢水平。

4. 将本发明添加剂添加于凡纳滨对虾复合饲料中，不使用抗生素，也能较好地促进生长和调节免疫，对取代饲料抗生素添加和保障食品的安全具有重要意义。

生物保藏

Fmb-50为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，2013年 6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.6249。

具体实施方式

实施例1

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）fmb-50是Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4经N⁺离子诱变选育的高产突变株和亚硝基胍诱变获得的高产突变株等经原生质体融合选育获得的高产抗菌脂肽的菌株，命名为fmb-50。B. amyloliquefaciensfmb-50 以玉米粉为碳源能获得最高的抗菌脂肽产量，其产量是亲本菌株ES-2-4的3.4倍。[姚树林，陆兆新等，Taguchi 法优化B. amyloliquefaciens fmb-50 产surfactin 工业发酵培养基, 北京化工大学学报，2012,39（4）：77-83]。以fmb-50的原始菌B. amyloliquefaciensES-2-4、 B. subtilis 168和 B. subtilis fmbJ（所述菌株均为公知公用，见黄现青等，枯草芽孢杆菌fmbJ产脂肽抑制点青霉效果及其桃防腐试验，2008，农业工程学报；孙力军等，培养基对解淀粉芽孢杆菌 ES-2 菌株产抗菌脂肽的影响，2008，中国农业科学；中国科学院上海生物化学研究所遗传工程组，应用转化方法从枯草杆菌168中选育高产α-淀粉酶产生菌，1979，生物化学与生物物理学报）在同样的发酵条件发酵，分别取100ml的发酵液，经离心除菌体、酸沉，沉淀物用甲醇溶解，得到抗菌物质，然后对表1的菌株进行抗菌实验。采用TSA（胰蛋白胨大豆琼脂培养基）培养基37℃培养副溶血弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌和无乳链球菌，在琼脂平板上打5mm孔在空中加入上述抗菌物质50μL，24h后测定抑菌直径（表1）。

表1 芽孢杆菌对水产病原菌的抑制效果（抑菌圈mm）            

          nd:未见抑菌圈

以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） fmb-50，种子培养基扩大培养；种子培养基：葡萄糖3.5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L、水1000ml，pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min，经10-16h培养进入对数生长期，接种到发酵罐。液体发酵培养基：发酵培养基：麦芽浸粉 1g/L ,黄豆粉 15g/L ,CaCO₃ 6.68g/L，MnSO₄ 0.4g/L ,MgCl₂ 2g/L，初始pH 7.0；体积比 2~5%接种，1000 L发酵罐液体深层发酵36~40 h，发酵工艺参数为：温度33～37℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m³/h，罐压0.10~0.12 Mpa，pH7.0。发酵液采用孔径为0.1μm的微孔滤膜微滤去除菌体，以去除菌体以后的发酵液上清为基准，加入10-15%（g/100ml）玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得抗菌物质添加剂。以E. coli为测定菌株，Nisin为抗菌物质基准，采用牛津杯法测定抗菌物质的效价，干燥产品抗菌效价为40000 IU/g左右。

采用膜过滤设备（江苏久吾高科技股份有限公司）对发酵液处理，获得抗菌物质的组分。具体操作如下：第一步用陶瓷微滤膜除去发酵液中解淀粉芽孢杆菌菌体和大于0.1μm的杂质，同时加10L清水洗涤微滤的截留部分, 洗涤液再经过微滤, 合并两次微滤滤液。第二步用超滤膜（10 KDa的超滤膜）除去微滤滤液中分子量大于10 KDa的可溶性杂质, 同上加10L清水洗涤超滤截留部分 洗涤液再经过超滤, 收集两次超滤滤液。然后，将超滤滤液经纳滤膜（<200Da）除去小分子量的可溶性杂质和大部分水分，收集含有抗菌物质的组分。加入适量的玉米淀粉或多孔淀粉, 喷雾干燥, 得到高活性的抗菌物质添加剂粉末。以E. coli为测定菌株，Nisin为抗菌物质基准，采用牛津杯法测定抗菌物质的效价，抗菌活性达到大约250000IU/g干粉左右。

实施例2

将活化好的致病菌副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、无乳链球菌（所述菌株均为公知公用，见陈吉祥等，致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测，2005，中国水产科学；翟秀梅等，副溶血弧菌对南美白对虾生理生化指标的影响，2007，上海水产大学学报；鄢庆枇等，不同环境条件对溶藻弧菌粘附大黄鱼肠粘液的影响，2006，水产学报；吴颖瑞等，153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性研究，西北农林科技大学学报，2013）分别接到TSB（胰蛋白胨大豆液体培养基）中，36±1℃培养4~6 h，用TSB培养基调整细菌OD₆₀₀值，至细菌浓度为1×10⁸，经100倍稀释后备用（1×10⁶）。鱼血清制备：市场购买约2斤重红笛鲷活鱼，从脊椎动脉抽血，3000 rpm 离心5 min后取上清，4℃冷藏备用。

取40000IU/g抗菌物质添加剂（实施例1第一种方法制备）2 g，分别倍比稀释，然后依次取50μL加入96微孔板1~11孔中，第12孔不加抗菌物质。然后在1~12孔中分别加入细菌10μL（每孔终浓度1×10⁵ CFU），40 μL稀释液（蒸馏水、海水、生理盐水、2%氯化钠或鱼血清），第12孔为对照，补加50μL的稀释液代替抗菌物质添加剂，每孔总体积为100μL。将上述加样后酶标版放入无菌空盒中，置于培养箱中，28℃培养24 h。然后用酶标仪测定各微孔OD₆₀₀值，结果见表1。

表1. 解淀粉芽孢杆菌抗菌物质添加剂对几种海产鱼类致病菌的最低抑菌浓度

由表1可见，淀粉芽孢杆菌抗菌物质对海水鱼类常见致病菌副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、无乳链球菌都有较好的抗菌作用。对海水中致病性哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和无乳链球菌等抗性MIC₅₀分别达到25 μg/kg、30μg /kg、35μg /kg、38μg /kg （表1）。

解淀粉芽孢杆菌抗菌物质在鱼血清中对致病性哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和无乳链球菌的抗菌性作用更强，MIC₅₀分别达18、28、30、30μg /kg，说明芽孢杆菌抗菌物质在血清中能更好地发挥抗菌作用。

解淀粉芽孢杆菌抗菌物质在海水中仍然保持较高抗菌活性，而蒸馏水中活性显著低于其它组，表明一定浓度的盐溶液有利于保持抗菌物质的活性。

实施例3

挑选外观正常，体质健壮，尾均体质量为1. 02 ±0.10 g的凡纳滨对虾作为试验用虾。以鱼粉、豆粕、花生粕和啤酒酵母为蛋白源，鱼油和豆油(1∶1) 为脂肪源，面粉为碳源，并添加适当的矿物质和维生素等作为凡纳滨对虾复合饲料（表2）。按照每公斤复合饲料中添加6g（A组）、8g（B组）、10g（C组）所述的抗菌物质饲料添加剂(实施例1中第一种方法制备，效价40000 IU/g)，不加抗菌物质的CK组（附表2）。每个处理设3个重复，每个玻璃钢桶放养凡纳滨对虾30尾，玻璃钢桶水容量为0. 3 m³ 。水温为(27. 5 ±1. 5) ℃，海水比重为1. 012 ±0. 002，养殖试验持续6周。试验用虾先暂养7天后，称初始体质量，然后平均分组，采用定量投喂。投喂量初期按虾体重的10 %，后期按8 %投喂。投喂时间分别为06 :00、10 :00、15 :00、19 :00 和23 :00时，早6点和晚19点的投喂量较多，占日投喂量的70 %。称终末体质量前24 小时停止投喂。

添加6g/kg的A组养殖6周后的平均增重较CK组提高12.3 %；成活率比CK提高了7.5%；饲料效率比CK提高了14.5%。添加8g/kg的B组养殖6周后的平均增重较CK组提高21.3 %；成活率比CK提高了20.8%；饲料效率比CK提高了44.1%。添加10g/kg的C组养殖6周后的平均增重较CK组提高26.2 %；成活率比CK提高了13.8%；饲料效率比CK提高了39.2%。

每组取8~10尾对虾，用1 mL 注射器从心脏取血，置于Eppendorf 管中，在4 ℃冰箱中静置24 h 后离心，取上清液备用。超氧化物歧化酶活力（SOD）按邓碧玉等改良的连苯三酚自氧化法测定。酚氧化酶（PO）活力参照 Ashida以L-dopa 为底物比色的方法测定。血清ACP、AKP活性，采用南京建成生产的试验盒测定。采用管华诗的方法测定过氧化物酶( POD)和溶菌酶(LSZ)的活力。

添加6g/kg的试验A组与能量代谢和营养有关的碱性磷酸酶（AKP）比CK组提高了104%；与抗菌作用有关的溶菌酶（LSZ）比CK提高了37.4%；与甲壳动物的非专一性免疫反应有关酚氧化酶（PO）比CK组提高了113%；与抗氧化、抗病有关的超氧化物歧化酶（SOD）比CK组提高了24.1%；但是酸性磷酸酶（ACP）和过氧化物酶（POD）没有显著差异。

添加8g/kg的试验B组与能量代谢和营养有关的碱性磷酸酶（AKP）比CK组提高了158%；与抗菌作用有关的溶菌酶（LSZ）比CK提高了72.1%；与甲壳动物的非专一性免疫反应有关酚氧化酶（PO）比CK组提高了152%；与抗氧化、抗病有关的超氧化物歧化酶（SOD）比CK组提高了72.3%；但是酸性磷酸酶（ACP）和过氧化物酶（POD）没有显著差异。

试验C组与能量代谢和营养有关的碱性磷酸酶（AKP）比CK组提高了110%；与抗菌作用有关的溶菌酶（LSZ）比CK提高了79.5%；与甲壳动物的非专一性免疫反应有关酚氧化酶（PO）比CK组提高了138%；与抗氧化、抗病有关的超氧化物歧化酶（SOD）比CK组提高了25.8%；但是酸性磷酸酶（ACP）和过氧化物酶（POD）没有显著差异。

表2. 对虾试验饲料配方和试验设计

*表2中各原料单位为g。

Claims (5)

1.一种解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂的生产方法，其特征在于，包含以下步骤：

以保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)fmb-50为菌种，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液；发酵液经微滤去除菌体，加入10％-15％(w/v)玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得所述的抗菌物质饲料添加剂；或者发酵液经微滤去除菌体后，再经10KD的膜超滤和纳滤，加入10-15％(w/v)玉米淀粉或多孔淀粉吸附、喷雾干燥得所述的抗菌物质饲料添加剂；所述的抗菌物质饲料添加剂抗菌效价为40000～250000IU/g；其中，所述的种子培养和扩大培养的培养基为：葡萄糖3.5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L，pH7.0；所述的发酵生产使用的液体发酵培养基为：麦芽浸粉1g/L,黄豆粉15g/L,CaCO₃6.68g/L，FeSO₄0.4g/L,MgCl₂2g/L，初始pH 7.0；发酵生产中按体积比2～5％接种解淀粉芽孢杆菌fmb50，1000L发酵罐液体深层发酵36～40h，发酵工艺参数为：温度35～37℃，搅拌转速180r/min，通气量80m³/h，罐压0.10～0.12Mpa，pH7.0。

2.权利要求1所述的生产方法制备得到的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂。

3.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂在制备鱼或虾饲料中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的虾为凡纳滨对虾。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在凡纳滨对虾饲料中添加含抗菌物质的解淀粉芽孢杆菌抗菌物质饲料添加剂，添加量为每公斤饲料中添加200000～400000U抗菌物质。