CN101906422B - Lgals9基因作为猪初生重性状相关的分子标记及制备方法与应用 - Google Patents
Lgals9基因作为猪初生重性状相关的分子标记及制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与初生重性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由LGALS9基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在序列表SEQ ID NO：1的第195bp处有一个A195-C195的碱基突变，导致BtsC I-RFLP多态性。本发明还公开了扩增LGALS9基因3’-UTR区部分序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
Description
技术领域
本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关的分子标记的克隆及应用。本发明的分子标记与LGALS9基因有关。
背景技术
猪是重要的经济动物，猪肉由于其肉嫩味美长期以来广受消费者的青睐，是我国人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，如何提高生产性能、降低生产成本成了猪育种工作者的工作重点之一。
分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。
猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，与猪出生后的生长速度及育成率有着不可分割的密切联系。最近有很多文献报道了初生重对生长速度的影响，李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[J].2006.18)研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等(Beaulieu AD等，Impact of piglet birth weight，birth order and litter size on subsequentgrowth performance，carcass quality，muscle composition and eating quality of pork[J].J Anim Sci.2010)研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56％(高建国.二花脸猪初生重对生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24(1)：26)。此外，科学家发现体重越轻的新生儿，其长大后患II型糖尿病、心血管疾病和高血压的风险越大，今年四月的一篇研究报道首次证明这一现象与基因的变异有关(Freathy RM等，Variants in ADCY5 and near CCNL1 are associated with fetal growth and birthweight[J].Nat Genet，2010，42(5)：430-435)。因此，对猪初生重相关基因的克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。
凝集素半乳糖蛋白家族是一类含有碳水化合物识别区域(carbohydrate recognition domain，CRD)能与β半乳糖结合的蛋白质。功能包括细胞外功能如与细胞表面和细胞外基质糖蛋白、糖脂的互作以及细胞内功能如与细胞质和核蛋白的互作。参与细胞粘附、增殖、凋亡、趋化、炎性反应以及T细胞死亡等调控多种生物学过程(Zick Y等，Role of galectin-8 as a modulator of cell adhesion and cell growth[J].Glycoconj J，2004，19：517-526；Lahm H等，Tumor galectinology：insights into the complex network of a family ofendogenous lectins[J].Glycoconj J，2004，20：227-238；Friedrichs J等，Contributions of galectin-3 and-9 toepithelial cell adhesion analysed by single cell force spectroscopy[J].J Biol Chem，2007，282：29375-29383)。半乳糖蛋白因子9(LGALS9)是该蛋白家族的一个成员，属于随机重复亚家族，在氨基端和羧基端分别含有一个碳水化合物识别区域，从而结合两种不同的糖类，两种识别区域通过一个接头蛋白连接起来(WadaI等，Identification and characterization of galectin-9，a novel β-galactoside-binding mammalian lectin[J].J BiolChem，1997，272：6078-6086)。近期研究表明，LGALS9是新的子宫内膜中晚期分泌相和蜕膜的标记基因(Popovici RM等，Galectin-9：a new endometrial epithelial marker for the mid-and late-secretory and decidualphases in humans[J].J Clin Endocrinol Metab，2005，90(11)：6170-6176)。人***分泌相子宫内膜和早期妊娠的蜕膜中，LGALS9只在上皮细胞表达，尤其是腺上皮和腔上皮表达量很高，而在基质细胞和免疫细胞不表达(Shimizu Y等，Expression and localization of galectin-9 in the human uterodome[J].Endocr J，2008，55(5)：879-887)。由于半乳糖蛋白家族能与细胞粘附分子如层粘连蛋白和纤连蛋白结合，因此LGALS9基因被认为与子宫内膜的容受性有关，可能是结合子宫内膜上皮细胞和囊胚细胞的中间蛋白，在胚胎附植中可能发挥重要作用(Gray CA等，Discovery and characterization of an epithelial-specific galectin in theendometrium that forms crystals in the trophectoderm[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：7982-7987)。而胚胎附植的早晚与初生重有一定的关系，因此本研究拟探讨LGALS9基因与初生重的关系。
发明内容
本发明的目的在于从LGALS9基因中克隆一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关的分子标记，其制备方法与在猪标记辅助选择关联分析上的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人从报道基因LGALS9克隆得到与猪初生重性状相关基因的部分DNA片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1和附图2所述。在序列表SEQ ID NO：1的第195bp处有一个A195-C195的碱基突变，导致BtscI-RFLP多态性。这个碱基突变位于LGALS9基因3’-UTR中。
本发明所述的分子标记的制备方法是：
用猪STS序列(GenBank收录号：BV726873)为模板设计引物；提取基因组DNA，设计引物，该引物的DNA序列如下所示：正向5’GACATCCAGCTGACGCACG 3’，反向5’GCTGGTGGCTTGGGACTAGG 3’。
PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：1所示的第195位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪初生重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表SEQ ID N0：1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因LGALS9的部分DNA序列，序列全长为375bp，在该序列的的第195bp处有一个A195-C195的碱基突变。
图1：是本发明技术流程图。
图2：是本发明中猪LGALS9基因的DNA序列，图中突变位点用标有下划线的加粗斜体字显示，所述的引物序列用斜体加粗及阴影显示。
图3：是本发明中猪LGALS9基因3’-UTR区的BstcI-RFLP的三种基因型(AA AC CC)和基因组扩增电泳结果(P)，图中M：DNA分子量标准(DL50 ladder)。
图4：是本发明中猪LGALS9基因正向测序发现的A-C突变。
具体实施方式
实施例1：猪LGALS9基因部分DNA序列扩增
(1)引物设计：
以报道的猪STS序列(GenBank收录号：BV726873)为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier5.0，设计扩增LGALS9基因3’-UTR的引物，该引物对的DNA序列如下：
LGALS9：正向引物：5’GACATCCAGCTGACGCACG 3’，(对应于序列表SEQ ID N0：1的第1-19位)，
反向引物：5’GCTGGTGGCTTGGGACTAGG 3’(对应于序列表SEQ ID NO：1的第356-375位)；
该引物的DNA序列扩增片段长度为375bp。
(2)PCR扩增反应：
PCR反应：反应总体积为10μl，其中猪DNA模板0.5μl，双蒸水7.0μl，buffer 1μl，Mg2+ 0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(10U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)PCR产物的纯化和测序
PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自新长江生物科技(北京)有限公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl Gel-Shift结合缓冲液(GS Buffer)的比例加入GS缓冲液，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(DNA溶液)置于-20℃保存备用。
(4)DNA序列测定：序列测定由深圳华大基因科技有限公司完成，基因片段测正反两个反应。
实施例2：PCR-RFLP诊断方法建立
(1)PCR-RFLP引物序列(该引物也是扩增LGALS9基因3’-UTR的引物)，
LGALS9 SNP：正向5’GACATCCAGCTGACGCACG 3’，(对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-19位)，反向5’GCTGGTGGCTTGGGACTAGG 3’。(对应于序列表SEQ ID NO：1的第356-375位)；
该引物扩增片段长度为375bp。
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、61℃退火30s、72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)RFLP检测
PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物3μl，双蒸水5.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶BstcI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
用引物扩增猪基因组DNA得到了375bp特异性扩增片段，测序结果发现该片段在第195位发现一个A-C颠换，位于3’-UTR区(如图4所示)，造成一个BstcI酶切位点()，其中第197bp处为多态性酶切位点。酶切产生三种基因型，CC基因型只有375bp一条带，AA基因型有197bp和178bp两条带，杂合子AC基因型有375bp，197bp和178bp的三条带，如图3所述。
实施例3：本发明的分子标记在猪群中的多态性应用
利用PCR-BstcI-RFLP检测了广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的“长白猪”群(一种具有国外猪血缘的猪种)，猪群的基因型频率、基因频率、香农指数(Longuet-Higgins MS.On the Shannon-Weaverindex of diversity，in relation to the distribution of species in bird censuses[J].Theor PopulBiol，1971，2(3)：271-289)和χ2检验P值如表1所示，结果显示LGALS9基因各基因型在长白猪种均有分布，AA基因型数最少，AC基因型数最多，长白猪是C等位基因占优势；LGALS9基因的香农指数较高，达到0.973，说明该广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群的多样性较大；对该基因进行Hardy-Weinberg平衡定律适合性检验，结果表明：在长白猪群中LGALS9基因的基因型和基因频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。
表1本发明的PCR-BstcI-RFLP多态性在长白猪中的分布
实施例4：本发明的分子标记在猪繁殖性状标记性状关联分析中的应用
本实施例猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群，父母代及子一代全部进行了基因型检测，子代出生0天测定体重。
根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析LGALS9基因SNP位点的基因型效应及其与初生重性状的关系：
Y＝Xβ+Zγ+e
其中Y为初生重性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；γ为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version 8.0)软件中MIXEDMODELS程序进行数据处理与统计分析。
对猪LGALS9基因3’-UTR区BstcI-RFLP多态性位点与初生重性状进行关联分析，由表2可知：在341个个体中AA基因型有61个，AC基因型有153个，CC基因型有127个。不同基因型之间性状差异显著性的结果如表2所示，结果显示猪LGALS9基因3’-UTR区BstcI-RFLP多态性位点各基因型与长白猪初生重呈极显著关联，其P值为0.0063。通过最小二乘均数对AA、AC和CC基因型的个体进行两两比较，结果表明AC基因型个体的初生重显著高于AA型和CC型个体(P值分别为0.0422和0.0026)，但AA型和CC型个体初生重无显著差异(p＝0.6288)。
表2 猪LGALS9基因3’-UTR区A/C多态性位点基因型与初生重的关联分析结果
注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
Claims (4)
1.一种与猪初生重相关性状检测的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在序列表SEQ ID NO：1的第195bp处有一个A195-C195的碱基突变，导致BtscI-RFLP多态性。
2.一种检测如权利要求1所述的分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：
正向引物：5′-GACATCCAGCTGACGCACG-3′，
反向引物：5′-GCTGGTGGCTTGGGACTAGG-3′。
3.权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。
4.权利要求2所述引物对在猪标记辅助选择中的应用。
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