CN101245348B - 一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪生产性状分子标记的克隆及其应用。本发明克隆得到如序列表SEQ ID NO：3所示的与猪生产性状相关的基因片段，其中在SEQ ID NO：3的第190bp处有一个T190-C190的碱基突变，导致Eco130 I-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记、引物的制备方法以及利用本发明克隆的分子标记进行猪生产性状关联分析的方法。本发明为猪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记。

Description

一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用，该分子标记与PNLIPRP2基因有关，利用本发明克隆的分子标记对猪与生产性状进行关联分析。

背景技术

养猪业是我国肉类产品来源的重要支撑产业，在我国畜牧业和国民经济中有着举足轻重的地位。猪的分子遗传育种在近年来取得了很大的进展，许多影响猪生长性状、胴体性状与肉质性状的新基因被分离克隆，为现代分子生物技术应用于猪育种提供了分子遗传基础。由肥胖而带来的心血管疾病严重影响人类的健康，人们越来越关注肉类食品的脂肪含量，因此猪的育种目标由脂肪型向瘦肉型转变。所以分离克隆影响猪的重要经济性状的新基因，为加速猪新品种的选育、加快我国养猪业的发展具有及其重要的意义。

目前，将现代分子生物学与常规育种方法结合所应用最多的领域是标记辅助选择(MAS)与标记辅助导入(MAI)，它们都是借助分子标记选择某一座位基因来改变该座位基因频率的过程。近几年来，分子标记有了迅猛的发展，已经从第一代的限制性片段长度多态性标记和第二代的微卫星多态性标记发展到第三代新型分子标记一单核苷酸多态性(SNP)。SNP是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的***、缺失等。在特定群体中，某一种碱基即某一等位基因出现于特定位置的概率要大于1％，此位点才能称之为SNP位点，否则只能称为突变位点。根据SNP在基因组内的位置可以人为地划分为三种形式：第一种是基因编码区的功能突变，主要分布于基因编码区(cordingregion)，故又称之为cSNP；另外两种是遍布于基因组的大量单碱基变异，包括基因周边SNP(perigenicSNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)。

在SNP检测技术上，一般常用的比较成熟的具有代表性的方法如下：1.RFLP.限制性内切酶是一类能识别DNA序列上的特异位点(通常为4～6bp的反向重复序列)，并在特异位点处切割的DNA酶类。对于一条DNA分子来说会产生特定大小和数目的酶切片段。基因的突变会产生或消除某些酶切位点，从而改变酶切片段的大小和数目，这些酶切片段可以通过电泳方法检测出来。因此RFLP只适于检测酶切位点处的SNPs，对于酶切位点以外的SNPs则无法检测。2.SSCP.一定条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的。由于基因突变，DNA分子单链的构像就会发生变化，从而在电场中具有不同的迁移率，因此可以通过电泳方法检测出来。SSCP的简单易行，仪器要求低，但“差异灵敏度”较低。另外，DNA单链在一定温度下可能有多种热温定性相近的构型，那么电泳时同一条DNA分子就可能产生多个条带，而且DNA构像对温度的改变非常敏感，所以还需要用别的方法对其进行矫正。

随着SNP技术的研究的深入，SNP已经成为进行猪基因与基因组分析的一个重要研究手段，为猪重要经济性状QTL位点的定位与优良性状的选育提供了强有力的工具，目前已经广泛应用于猪分子育种领域。对于猪胴体和肉质性状的候选基因，目前已有多例报道。激素敏感脂肪酸(HSL)是动物体内脂肪分解的关键酶，Harbitz等(1999)对8个梅山×大白祖代群体进行了HSL基因多态性分析表明：第7内含子1167处有一个Alu多态性位点，第8外显子存在G→T的碱基变异，它引起谷氨酸→天冬氨酸的变化。***2(IGF2)基因是影响猪瘦肉量的主要候选基因。Knoll等(2000)确定了IGF2基因内含子2中G→A的突变产生了NciI酶切位点。氟烷敏感基因(Hal)是影响猪肉质的主效基因，Fujii等(1991)发现的Hal主要候选基因I型兰尼定受体基因(RYR I)存在18处SNPs，其中第1843位突变(C→T)导致蛋白受体第615位的Arg变为Cys，是导致猪应激敏感综合征(PSS)的原因。猪肌内脂肪(IMF)基因影响肉质的嫩度、风味和多汁性，心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因主要在心脏、骨骼肌细胞和乳腺细胞表达，可作为影响IMF含量的候选基因，曹红鹤等(2002)在猪H-FABP基因内发现了3个SNPs：5′上游区第1324位点T→C突变，第2内含子1811位点C→G突变，1970位点T→C突变，它们引起了三个变异酶切位点。

前人的研究表明，脂肪酶是水溶性的酶，能水解不能溶解的基质，例如甘油三酸酯，磷脂和胆固醇酯。因此，脂肪酶在脂类代谢和运输中重要作用，同时它和一些严重的疾病例如肥胖，糖尿病和脂肪沉滞性动脉硬化症等相关联。脂肪酶基因家族包括肝酯酶，脂蛋白脂肪酶，内皮脂肪酶，磷脂酶A1，胰脂肪酶和胰脂肪酶相关蛋白1、2。胰脂酶在体内占优势，胰脂肪酶发挥作用与胰脂肪酶相关蛋白1和2紧密相关。

有专家报道胰脂肪酶相关蛋白2(PNLIPRP2)与酶原颗粒膜相关，这预示着这种酶有可能促进膜结构和颗粒运输(M.J.Wishart et al 1993)。胰脂肪酶相关蛋白2在胰液中出现，它也参与肠内的脂解作用。当日粮脂肪含量达到4％时，为了促进脂肪沉积，避免血糖过多而引起糖尿病，TH鼠表现出(一种研究II-糖尿病的模型动物)选择性地减少PNLIPRP2的表达量(Brown et al 2005)。研究已证实胰脂肪酶相关蛋白2对鼠新生儿食物的三酸甘油酯消化起作用。不仅在鼠的小肠组织中能检测到胰脂肪酶相关蛋白2的mRNA，而且在肠上皮细胞和帕内特细胞内也能检测到。胰脂肪酶相关蛋白2在帕内特细胞内的出现说明了这个酶既有磷脂酶的活性，也有抗菌活性。

对猪的胰脂肪酶相关蛋白2基因的研究在DNA水平上较少，主要集中在蛋白质水平上，而对胰脂肪酶基因的多态性研究在人类上研究的较多。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对猪胰脂肪酶的部分内含子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它在猪的选种选育方面的功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆一种作为猪标记辅助选择的与生产性状(例如胴体性状与肉质性状)相关的分子标记，并将该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到与猪生产性状(例如胴体性状与肉质性状)相关基因PNLIPRP2的DNA片段，它的cDNA序列(包括全长CDS及部分3’-UTR和部分5’-UTR)如序列表SEQ ID NO：1所述。

同时本发明利用上述克隆的DNA片段克隆得到一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。所述的分子标记，其特征在于序列表SEQ ID NO：3所示序列的第190位碱基处有一个T190-C190的碱基突变，导致Eco130 I-RFLP多态性。

申请人制备了检测上述碱基突变的正、反向引物，该引物的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-TAGACAAGGCGGAGGATAGC-3’，

反向引物：5′-CGTGGGCATCTCTTACAGGC-3′。

制备上述分子标记的方法，按照以下步骤：

用人PNLIPRP2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计引物获得猪的编码区全长，根据与人PNLIPRP2基因的cDNA序列的比对结果大致得出猪PNLIPRP2基因的3、4外显子，在第3、4外显子上分别设计正反扩增引物，提取猪血液中的DNA，利用设计的引物PCR扩增猪PNLIPRP2基因的第三内含子、PCR产物回收，克隆，测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪生产性状相关基因PNLIPRP2部分cDNA序列(包含CDS全长及部分3’-UTR和部分5’-UTR)。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的第一头外来猪种“大白猪”(即为图3中的L1)PNLIPRP2基因包括第三内含子的核苷酸序列。

图1：本发明中猪PNLIPRP2基因第三内含子序列电泳图片，片段大小为1573bp(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中：M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。

图2：本发明中猪PNLIPRP2基因部分的扩增序列的电泳图谱(酶切片段)，片段大小为596bp(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中：M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。

图3：应用本发明的方法对2头“大白猪”和2头“梅山猪”包括第三内含子的核苷酸序列比对结果。图中M1、M2代表“梅山猪”，L1、L2代表“大白猪”。

图4：本发明中猪PNLIPRP2基因第三内含子的Eco130 I-RFLP的三种基因型(AA AB BB)电泳图谱。(琼脂糖胶浓度为2％)，图中：M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。

具体实施方式

实施例1：

(一)PNLIPRP2基因CDS克隆及部分DNA序列扩增

(1)引物设计

用人PNLIPRP2基因mRNA(GenBank收录号：NM_005396)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用序列分析软件DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据与人PNLIPRP2基因mRNA的同源比对初步确定起始与终止密码子位置，设计引物克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所示的cDNA序列(包括CDS全长及部分3’-UTR和部分5’-UTR)；根据与人PNLIPRP2基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出猪PNLIPRP基因外显子的拼接位点，设计第三内含子的扩增引物，选取2头“大白猪”和2头“梅山猪”的DNA做模板，进行PCR扩增、回收、克隆、测序，获得如序列表SEQ ID NO：3(包括附图3中L2、M1、M2所示的序列，该附图中的L1序列已经包括在SEQ ID NO：3所示的序列中)所示的核苷酸序列。通过Cluster W比对发现存在4处SNP，其中190bp处的T/C碱基突变恰好能被内切酶Eco130I的识别。

扩增PNLIPRP2基因cDNA序列的引物如下所示：(分3段扩增)

第一段：为部分5′UTR，第1-4外显子和部分第5外显子

正向引物：5′ACATCCCGTGTGTGCTGAGG 3′，

反向引物：5′AGGCTGTGCCCGATGAGGTG 3′。

第二段：为部分3外显子，4-10外显子和部分11外显子

正向引物：5′TCATAGACAAGGGGGAGGATA3′，

反向引物：5′CCCAGTTCGGGGTGGAATAAG3′。

第三段：为部分6外显子，7-11外显子和部分3′UTR

正向引物：5′ACGGACTCTGCTCCCTTCAT3′，

反向引物：5′TTCAACGTCAAACCACTGGC3′。

扩增的包含PNLIPRP2基因第三内含子序列的引物如下所示：

正向引物：5′TGAGGCTTCAAACTTCCAAC3′，

反向引物：5′TCTCCAGTCCACACAGATGC3′。

检测T190-C190处碱基突变所用的引物序列如下所示：

正向引物：5’-TAGACAAGGCGGAGGATAGC-3’，

反向引物：5′-CGTGGGCATCTCTTACAGGC-3′。

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR扩增条件：25uL的反应体系中加入DNA模板1μL，10×PCR buffer 2.5μL，MgCl₂(25mM)2μL，dNTP(10mM)0.5μL，10mM引物前后各1μL，Taq酶1U，双蒸水16μL，PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性40s、退火温度见表1，退火时间45s；72℃延伸时间见表1，共35个循环，最后72℃延伸10min，25℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

        表1：扩增用途及退火温度和延伸时间

扩增范围	退火温度	延伸时间
			为部分5′UTR，第1-4外显子和部分第5外显子	60.5	30s
为部分3外显子，4-10外显子和部分11外显子	58.6	1min
			为部分6外显子，7-11外显子和部分3′UTR	61.5	50s

扩增范围	退火温度	延伸时间
			包含PNLIPRP2第三内含子的序列	57.6	1min30s
检测T190-C190处碱基突变的酶切片段	60.3	40s

PCR产物的纯化：具体操作步骤如下：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中加300μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，加入25μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化PCR产物与pMD18-T Vector(购自TaKaRa公司)连接，连接反应总体积是10μL，其中包括2×Rapid Ligation Bufer，2.5μL；Vector(50ng)，0.5μL；回收DNA，7-8μL。稍微弹打混合均匀，于16℃连接1h以上或者4℃连接过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：在灭菌的1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μL，用移液枪吸打均匀，冰浴30min；将离心管置于42℃的循环水浴中(勿震动)，热激90s后迅速冰浴2min；再往离心管中加入400μL LB培养液，在37℃摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min；离心，去除部分上清液，取100μL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37℃培养14-16小时，观察有无菌落长出；

阳性克隆子的鉴定及测序：

从平板上挑取转化好的菌斑接入含1mL LB的1.5mL离心管中并于37℃振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用原引物或M13(上海生物工程有限公司提供)测序的通用引物(退火温度58-60℃)进行PCR扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。

在本实施例中，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的cDNA序列长度为1573bp，包括CDS全长1416bp及部分3’-UTR和部分5’-UTR，(如序列表SEQ ID NO：1所示)；PCR得到的三内含子序列全长为1592bp，(如图1和序列表SEQ ID NO：3所示)，测序结果表明在该DNA序列的190bp处存在T190-C190突变。

(3)DNA序列同源性检索鉴定

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

(二)PCR-RFLP诊断方法建立

RFLP检测：将PCR产物5μL，10×Buffer 1μL，限制性内切酶Eco130I为0.3μL(3U)，加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用酶切引物扩增猪基因组DNA得到了596bp特异性扩增片段(详见图2)，附图3的序列分析结果表明在190bp处存在T190-C190突变，并导致Eco130I-RFLP多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中C是没有形成酶切位点的等位基因，T是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中AA型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有596bp一条DNA带)，BB型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现465bp和131bp两条DNA带)，AB为杂合型(电泳检测时出现596bp、465bp和131bp三条DNA带)。

(三)PCR-Eco130I-RFLP多态性在各猪种中的分布情况的检测的应用

利用PCR-Eco130I-RFLP检测了5个猪种：其中属于中国地方血缘的猪种分别是八眉猪，淮南猪，梅山猪，属于外来猪例如欧美血缘的猪种分别是长白猪和大白猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表2所示，结果显示在中国地方猪种中等位基因A和B所占比例差别较大，淮南猪以B等位基因占优势，梅山猪均为A等位基因。而在国外猪种中A和B等位基因比例差别不大。

        表2：几个猪品种中PNLIPRP2基因190位点多态性的基因型和基因频率

实施例2：

用于统计分析的试验材料包括2003和2004年两批大白×梅山F₂代总共223头猪，所分析的性状主要为胴体性状和肉质性状。胴体性状包括皮率，骨率，肥肉率，瘦肉率，瘦肥肉比例，胴体重，屠宰率，内脂率，至第一颈椎胴体长，至第一肋胸胴体长，6-7腰椎间背膘厚，肩部背膘厚，胸腰椎间背膘厚，臀部背膘厚，眼肌高，眼肌宽，眼肌面积。肉质性状包括背最长肌pH，股二头肌pH，头半棘肌pH，失水率，系水力，背最长肌色值，股二头肌色值，背最长肌大理石纹，股二头肌大理石纹，肌内脂肪，肌内水分。

申请人采用采用SAS统计软件(SAS Institute Inc，Version 8.0)glm程序进行单标记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+S_k+Y_l(+b_ijklX_ijkl)+e_ijkl

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应；S_k、Y_l、F_j为固定效应，分别为性别、年度、家系效应，b_ijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，生长不考虑协变量；e_ijkl为残差效应。

基因型检测结果表明：在所检测的223头大白×梅山F₂代个体中，AA基因型95头，AB基因型107头，BB基因型21头。不同基因型与胴体性状的统计结果总结于表3。不同基因型与肉质性状的统计结果总结于表4。

        表3：Eco130 I-RFLP基因型与胴体性状的统计分析表

注：以上数值为最小二乘均值±标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值，其上标*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

由表3可以看出，PNLIPRP2基因型与6-7腰椎间背膘厚呈相关显著。在基因效应方面，瘦肉率加性效应达到显著水平，瘦肥肉比例显性效应达到显著水平。AA基因型个体6-7腰椎间背膘厚显著低于BB基因型个体，在育种中如果选择AA基因型的个体可能在一定程度上改善胴体性状。

表4：Eco130 I-RFLP基因型与肉质性状的统计分析表

注：以上数值为最小二乘均值±标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值，其上标*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

由表4可以看出，失水率、系水力、背最长肌色值在不同基因型间的差异达到显著水平，且在基因效应方面均以显性作用为主。AA基因型的个体比AB基因型的个体具有更低的失水率、更高的系水力。因此在育种中选择AA基因型的个体能改善肉质性状。

                    序列表

Claims (4)

1.一种与猪生产性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，在序列表SEQ ID NO：3所示序列的第190位碱基处有一个T190-C190的碱基突变，导致Eco130I-RFLP多态性。

2.如权利要求1所述的一种与猪生产性状相关的分子标记的引物，所述的引物的DNA序列如下所示：

正向：5’-TAGACAAGGCGGAGGATAGC-3’，

反向：5′-CGTGGGCATCTCTTACAGGC-3′。

3.一种制备与猪生产性状相关的分子标记方法，其特征按照以下步骤：

用人PNLIPRP2基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签；然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计引物获得猪的编码区全长，根据与人PNLIPRP2基因的cDNA序列的比对结果大致得出猪PNLIPRP2基因的3、4外显子，在第3、4外显子上分别设计正反向扩增引物，提取猪血液中的DNA，利用设计的引物PCR扩增猪PNLIPRP2基因的第三内含子、PCR产物回收，克隆，测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。

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