CN101904498B - 紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素d含量的方法 - Google Patents

紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素d含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法，a、配制培养基：以碳源、氮源、矿质元素等制备液体培养基，将配制好的培养基灭菌；b、向上述培养基中接种冬虫夏草菌，摇瓶培养，获得液体冬虫夏草菌种；c、向上述培养基中接种冬虫夏草菌种，在一定条件下摇瓶培养，取出发酵液；d、选用UV-B紫外光源，功率14-60W，波长为280～325nm，将冬虫夏草菌发酵液倒在大培养皿中，将紫外光源安放在距离培养皿的正上方，对得到的发酵液进行照射，照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品。本发明工艺简单，操作方便，可广泛用于儿童佝偻病、妇女缺钙、老年人骨质疏松症的预防和治疗。

Description

紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法
技术领域
本发明涉及补钙食品与医药产品，更具体地说是涉及一种紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法，具体方法是通过紫外光源照射液态发酵冬虫夏草菌，使细胞内麦角固醇光转化为维生素D2，可用于制备预防和治疗儿童、妇女缺钙；老人骨质疏松等各种病症的药品或保健食品中的应用。 
背景技术
中国专利公开了一种“冬虫夏草生物活性多维强化剂的制备方法”(申请号为03106294.6)的专利。利用药用真菌冬虫夏草菌为生物载体，经液态发酵可将无机钙转化成生物大分子螯合态的活性钙。产品含多种维生素、菌体免疫蛋白和菌体多糖，具有免疫调节功能，从根本上提高了钙的利用率。其缺陷是仅仅考虑了补钙，没有考虑促进机体对钙的吸收。补钙产品如果同时补充维生素D，补钙效果比单纯补充钙要好。已有确切的研究证明充足的维生素D不仅可以促进机体对钙的吸收率，而且可以降低心脏病、肥胖病、糖尿病、关节炎甚至癌症的发生。虽然食用药用真菌是天然食物中维生素D的重要来源，但其含量远不能满足人体对维生素D的需求。目前市场上钙强化剂中的维生素D也是人为添加进去以辅助钙吸收，不具有生物同源性和平衡性。麦角固醇是一种植物甾醇，该物质是维生素D的前体，国内目前仅用于维生素D的工业生产。真菌细胞中含有丰富的麦角固醇，新加坡科学家近年研究发现，用紫外线照射生长中或刚采摘的新鲜蘑菇，能使蘑菇中产生大量维生素D2(Food Chemistry Volume 95，Issue 4，April 2006，Pages 638-643)。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法，本发明工艺简单，操作方便，可广泛用于儿童佝偻病、妇女缺钙、老年人骨质疏松症的预防和治疗。它是在以液态发酵冬虫夏草菌为载体进行钙强化的同时，用紫外光源对发酵菌液进行照射，通过控制照射温度和照射时间，使细胞内的麦角固醇最大限度的转化为维生素D2，补钙的同时补充维生素D，以达到促进机体钙吸收的目的。通过维生素D的促进，机体可以极大的提高对钙的吸 收率和利用率。 
为了实现上述任务，本发明采用以下解决方案： 
冬虫夏草生物活性钙强化剂使无机钙转化成大分子螯合态的生物活性钙，提高了钙在机体的利用率，同时凭借冬虫夏草中含有的氨基酸，多糖，甾醇，维生素和微量元素发挥药理活性，补钙的同时增强机体免疫力，调节消化***和呼吸***功能，抗衰老，抗肿瘤，同时具有保健功能和药物治疗作用。 
维生素D是钙的调节剂，它通过促进钙结合蛋白的生成来促进小肠和肾对钙的吸收和重吸收。除此之外，维生素D还能降低心脏病、免疫缺陷病、糖尿病、关节炎和某些癌症的发病率。正常人皮肤中含有7-脱氢胆固醇，受日光中紫外线的照射即转变为维生素D3，植物中含有麦角固醇，不能被人体吸收，但经紫外线照射转变为维生素D2才能被人类吸收。 
本发明通过实验证实紫外光照射对对液态发酵冬虫夏草菌细胞内麦角固醇的转化能力，一种紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法，其步骤是： 
a、配制如下培养基：碳源包含2～8％(重量/体积百分比)的糖类如葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是淀粉类如谷类淀粉、玉米粉、红薯粉的一种或六种以下任意组成；氮源包括1～4％(重量/体积百分比)的酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉、玉米浆的一种或五种以下任意组成；碳、氮比为10∶1～40∶1；每100ml培养基中添加矿质元素如下： 
蛋白胨                        0.5-2.0g 
葡萄糖                        2.0-10.0g 
酵母粉                        0.1-1.0g 
KH2PO4                        0.05-0.5g 
MgSO4                         0.02-0.2g 
以FeSO4添加铁                 0.001～0.1g 
以ZnSO4添加锌                 0.001～0.1g 
以Na2SeO3添加硒               0.000001～0.0001g 
以CrCl3添加铬                 0.000001～0.0001g 
以CaCl2、CaNO3或CaCO3添加钙   0.01～1.0g 
VB1                           0.001-0.01g 
添加水溶化后定容至100ml； 
以每瓶100ml分装300ml三角瓶，120℃灭菌30分钟后冷却至30℃以下； 
b、向上述步骤a的培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)，在26～30℃条件下150rpm摇瓶培养80-120小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
c、向上述步骤a的培养基中接种2-10％体积的液体冬虫夏草菌种，在26～30℃条件下150rpm摇瓶培养60-120小时，取出发酵液； 
d、选用UV-B紫外灯管，功率14W，波长为280～325nm。将紫外灯管安放在超净工作台上方距离样品15cm处。室温为25℃时，将步骤c得到的培养好的冬虫夏草菌液倒在大培养皿中，厚度为1cm以内(由于紫外线的穿透力有限)，进行照射。照射时间为1h，照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品，测得菌体得率为：2％(2g冻干粉/100ml发酵液)。 
e、维生素D2的含量用高效液相色谱法测定(Drying Technology，2003，21，1093-1101.)，色谱条件：C18柱(250×4.6mm)；流动相：乙腈-甲醇(75∶25)；流速：1ml/min；检测波长：282nm。样品要先经过皂化处理，取冬虫夏草菌冻干粉1g，加抗坏血酸钠溶液(17.5g抗坏血酸溶于100ml 1M NaOH)4ml，乙醇50ml(95％)，50％KOH溶液10ml在85℃水浴皂化1h后，迅速冷却至室温(20-25℃，以下相同)，移入分液漏斗。加入去离子水15ml，乙醇15ml，用戊烷萃取三次(50ml、50ml、20ml)。保留有机层，用KOH-乙醇溶液(3％KOH，5％乙醇，固体试剂是重量/体积百分比，液体试剂是体积/体积百分比)50ml洗三次，再用去离子水洗至中性。将有机层移至圆底烧瓶，用旋转蒸发器在40℃下浓缩蒸干，迅速加5ml乙醇溶解。过0.45μm有机滤膜，取滤液20μl上高效液相进行分析。通过内标法和外标法定性分析维生素D2，通过峰面积进行量化计算样品中维生素D2含量。 
f、结果：冬虫夏草菌中维生素D2含量从照射前的43μg/g(冻干粉)提高到照射后的488μg/g(冻干粉)。 
上述结果说明：冬虫夏草菌丝体经UV-B紫外灯照射1小时后，细胞内维生素D2含量有显著提高。机理是紫外线照射使麦角固醇吸收紫外线的辐射通过光化反应先转化成维生素D的中间体，最后再转化成维生素D2。 
根据上述构思及实验结果，实现本发明目的采用如下技术方案： 
使用的微生物： 
生产药用成分的子囊菌纲麦角菌科虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)的各种菌种。它们既不是约束性的也不是排它性的。 
具体的菌株可以是： 
在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)菌株。上述菌种的有关性质可以参阅中国典型培养物保藏中心(CCTCC)菌种目录，本发明不再赘述。任何人可直接向该保藏中心购得该菌种。 
选用的光源： 
不同波长的照射光源对麦角固醇光转化影响不同。短于280nm的光易于生 成速甾醇，而长于284nm的光容易生成光甾醇。具体选用波长为280～325nm的UV-B紫外光源，能够减少副产物的产生，功率为14-60W，该类型紫外光源市场上均有销售。 
提高冬虫夏草生物活性钙强化剂中维生素D的步骤是： 
a、配制培养基：以碳源、氮源、矿质元素等制备液体培养基，每100ml培养基中添加下列成份(重量/体积百分比)： 
培养基中的碳源包含2～10％体积的糖类如葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是淀粉类如谷类淀粉、玉米粉、红薯粉的一种或六种以下组成； 
氮源包括1～4％体积的酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉、玉米浆的一种或五种以下任意组成； 
碳、氮比为10∶1～40∶1； 
矿质元素为钾、镁、磷、钠、硫等物质： 
KH2PO4                            0.05-0.5g 
MgSO4                             0.02-0.2g 
以FeSO4添加铁                     0.001～0.1g 
以ZnSO4添加锌                     0.001～0.1g 
以Na2SeO3添加硒                   0.000001～0.0001g 
以CrCl3添加铬                     0.000001～0.0001g 
以CaCl2、Ca(NO3)2或CaCO3添加钙    0.01～1.0g 
VB1                               0.001-0.01g 
添加水溶化后定容至100ml； 
将配制好的培养基灭菌，120℃灭菌30分钟后冷却至30℃以下； 
b、向上述步骤a的培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)，在26～30℃条件下100-150rpm摇瓶培养80-120小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
c、向上述步骤a的培养基中接种2～10％体积的液体冬虫夏草菌种，在26～30℃条件下100-150rpm摇瓶培养60-120小时，取出发酵液； 
d、选用UV-B紫外光源，功率14-60W，波长为280～325nm。将冬虫夏草菌发酵液倒在大培养皿中，由于紫外线的穿透力有限，菌液厚度为0.2～2cm，将紫外光源安放在距离培养皿的正上方10～30cm处，在15-30℃的室温下，对步骤(c)得到的发酵液进行照射，照射时间确定在20min～60min。照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品。 
上述方法得到的冬虫夏草生物活性钙强化剂，维生素D含量为10～50mg/100g，达到强化前的十倍以上。 
产品可以以饮料、口服液、咀嚼片、糖果、胶囊或其它剂型用于制备治疗和 预防儿童佝偻病，儿童缺钙；妇女缺钙；老人免疫力衰退、骨质疏松等各种病症的药品或保健食品中的应用。 
每100g强化剂产品中含有其他组分(重量份)： 
菌体蛋白质            15.0～45.0 
总糖(包括菌体多糖)    2.0～10.0 
碳水化合物            20.0～40.0 
总脂                  2.0～10.0 
矿物质                10.0～25.0 
水分                  2.0～10.0 
钙                    1.0～30.0 
铁                    0.05～5.0 
锌                    0.05～5.0 
硒                    0.00005～0.005 
铬                    0.00005～0.005 
维生素A               0.001～0.04 
维生素B1              0.02～0.1 
维生素B2              0.02～0.1 
维生素B5              0.2～0.8 
维生素B6              0.01～0.2 
维生素B1              20.0005～0.001 
维生素C               0.5～5.0 
维生素E               0.00001～0.0001 
叶酸                  0.0001～0.005。 
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 
生产工艺简单，利用冬虫夏草菌含有丰富维生素D前体的特性，采用廉价的紫外光源，使其在细胞内转化为维生素D2，配以生物大分子螯合态的钙，有利于提高产品的生物利用度，实现了真正意义上的生物活性钙和维生素D。再加上冬虫夏草特有的免疫调节药理活性，使产品具备了多重功效，可广泛用于制备治疗和预防儿童佝偻病，儿童缺钙；妇女缺钙；老人免疫力衰退、骨质疏松等各种病症的药品或保健食品中的应用。钙的吸收率达到61.2-78.7％，利用率达到42.3-55.5％。 
具体实施方式
实施例1： 
采用的菌种：CCTCC AF99009的冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)菌株。 
a、配制液体培养基，每100ml培养基中添加下列成份(重量/体积百分比)： 
蔗糖                   3.0g 
玉米粉                 3.0g 
黄豆粉                 1.5g 
酵母粉                 0.1g 
KH2PO4                 0.05g 
MgSO4                  0.02g 
以FeSO4添加铁          0.01g 
以ZnSO4添加锌          0.01g 
以Na2SeO3添加硒        0.00002g 
以CrCl3添加铬          0.00002g 
以CaCO3添加钙          0.2g 
VB1                    0.002g 
添加水溶化后定容至100ml； 
120℃灭菌30分钟后冷却至30℃； 
b、向上述步骤a的培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)，在26～30℃条件下120rpm摇瓶培养100小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
c、向上述步骤a的培养基中接种3％体积的液体冬虫夏草菌种，在26℃条件下120rpm摇瓶培养80小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
d、将步骤c得到的冬虫夏草发酵液倒入大培养皿，厚度为0.5cm，在15℃的室温下，用功率14W的UV-B紫外光源(波长为280～325nm)照射，照射距离为15cm，照射时间为20min。照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品，产品中维生素D含量达到13mg/100g。 
测定产品中其他物质含量，每100g钙强化剂中含有下列组分(重量份组成)： 
表1.一般分析 
成分                      ±25％ 
蛋白质                    15 
总糖(包括菌体多糖)        6 
总脂                      4 
碳水化合物                30 
矿物质                    20 
水分                      6 
表2.矿物质 
成分                      ±25％ 
钙                        10 
铁                        0.5 
锌                        0.4 
硒                        0.001 
铬                        0.001 
表3.维生素 
成分                      ±25％) 
维生素A                   0.02 
维生素B1                  0.075 
维生素B2                  0.08 
维生素B5                  1.0 
维生素B6                  0.1 
维生素B12                 0.0008 
维生素C                   2.0 
维生素E                   0.00008 
叶酸                      0.003 
实施例2：产品中维生素D含量达到35mg/100g 
采用的菌种：CCTCC AF99009的冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)菌株。 
a、配制液体培养基：每100ml培养基中添加下列成份(重量/体积百分比)： 
蔗糖                      4.0g 
玉米粉                    4.0g 
黄豆粉                    2.0g 
酵母粉                    0.2g 
KH2PO4                    0.1g 
MgSO4                     0.02g 
以FeSO4添加铁             0.01g 
以ZnSO4添加锌             0.01g 
以Na2SeO3添加硒           0.00002g 
以CrCl3添加铬             0.00002g 
以CaCl2添加钙             0.3g 
VB1                       0.003g 
添加水溶化后定容至100ml； 
120℃灭菌30分钟后冷却至30℃； 
b、向上述步骤a的培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)，在30℃条件下150rpm摇瓶培养100小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
c、向上述步骤a的培养基中加入5％体积的液体冬虫夏草菌种；在30℃条件下通气搅拌培养100小时，获得冬虫夏草发酵液； 
d、将步骤c得到的冬虫夏草发酵液倒入大培养皿，厚度为1.0cm，在25℃的室温下，用功率30W的UV-B紫外光源(波长为280～325nm)照射，照射距离为20cm，照射时间为40min。照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品，产品中维生素D含量达到33mg/100g。 
测定产品中其他物质含量，每100g钙强化剂中含有下列组分(重量份组成)： 
表1.一般分析 
成分                  ±25％ 
蛋白质                20 
总糖(包括菌体多糖)    7 
总脂                  4 
碳水化合物            30 
矿物质                20 
水分                  6 
表2.矿物质 
成分                  ±25％ 
钙                    15 
铁                    0.5 
锌                    0.4 
硒                    0.001 
铬                    0.001 
表3.维生素 
成分                  ±25％) 
维生素A               0.02 
维生素B1              0.075 
维生素B2              0.08 
维生素B5              1.0 
维生素B6              0.1 
维生素B12             0.0008 
维生素C               3.0 
维生素E               0.00008 
叶酸                  0.003 
实施例3： 
采用的菌种：CCTCC AF99009的冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)菌株。 
a、配制液体培养基：每100ml培养基中添加下列成份(重量/体积百分比)： 
蔗糖                  6.0g 
玉米粉                4.0g 
黄豆粉                2.0g 
酵母粉                0.3g 
KH2PO4                0.1g 
MgSO4                 0.02g 
以FeSO4添加铁         0.01g 
以ZnSO4添加锌         0.01g 
以Na2SeO3添加硒       0.00002g 
以CrCl3添加铬         0.00002g 
以Ca(NO3)2添加钙      0.4g 
VB1                   0.003g 
添加水溶化后定容至100ml； 
120℃灭菌30分钟后冷却至30℃； 
b、向上述步骤a的培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)，在28℃条件下150rpm摇瓶培养120小时，获得液体冬虫夏草菌种； 
c、向上述步骤a的的培养基中加入8％体积的液体冬虫夏草菌种；在28℃条件下通气搅拌培养120小时，获得冬虫夏草发酵液； 
d、将步骤c得到的冬虫夏草发酵液倒入大培养皿，厚度为1.0cm，在30℃的室温下，用功率30W的UV-B紫外光源(波长为280～325nm)照射，照射距离为20cm，照射时间为60min。照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品，产品中维生素D含量达到48mg/100g。 
测定产品中其他物质含量，每100g钙强化剂中含有下列组分(重量份组成)： 
表1.一般分析 
成分                  ±25％ 
蛋白质                24 
总糖(包括菌体多糖)    8 
总脂                  4 
碳水化合物            30 
矿物质                20 
水分                  6 
表2.矿物质 
成分                  ±25％ 
钙                    18 
铁                    0.5 
锌                    0.4 
硒                    0.001 
铬                    0.001 
表3.维生素 
成分                  ±25％) 
维生素A               0.02 
维生素B1              0.075 
维生素B2              0.08 
维生素B5              1.0 
维生素B6              0.1 
维生素B12             0.0008 
维生素C               4.0 
维生素E               0.00008 
叶酸                  0.003 。

Claims (1)

1.一种紫外光照射提高冬虫夏草钙强化剂中维生素D含量的方法，其步骤是：
a、配制培养基：以碳源、氮源、矿质元素制备液体培养基，每100ml培养基中添加下列成份：培养基中的碳源为2～10％重量/体积百分比的葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是谷类淀粉、玉米粉、红薯粉的一种或六种以下组成；
氮源为1～4％重量/体积百分比的酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉、玉米浆的一种或五种以下组成；
碳、氮比为10∶1～40∶1；
矿质元素为钾、镁、磷、铁、锌、钠、硫、硒、铬、钙：
添加水溶化后定容至100ml；
将配制好的培养基灭菌，120℃灭菌30分钟后冷却至30℃以下；
b、向上述培养基中接种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC AF99009的冬虫夏草菌Cordyceps Sinensis，在26～30℃条件下100-150rpm摇瓶培养80-120小时，获得液体冬虫夏草菌种；
c、向上述步骤(a)的培养基中接种2～10％体积的液体冬虫夏草菌种，在26～30℃条件下100-150rpm摇瓶培养60-120小时，取出发酵液；
d、选用UV-B紫外光源，功率14-60W，波长为280～325nm，将冬虫夏草菌发酵液倒在大培养皿中，菌液厚度为0.2～2cm，将紫外光源安放在距离培养皿的正上方10～30cm处，在15-30℃的室温下，对步骤(c)得到的发酵液进行照射，照射时间确定在20min～60min，照射完毕将发酵液经浓缩、干燥，破壁粉碎成粉末状产品。
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