CN101903037A - 施用偶合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗宿主动物以消除致病细胞的方法。所述方法包括如下步骤：向所述宿主动物施用半抗原-载体偶合物；向所述宿主动物施用TH-1偏向佐剂；并且向所述宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被施用。本发明还涉及相同的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶10至约1∶1。

Description

施用偶合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35编专利法第119(e)条要求在2007年11月15日提交的美国临时申请序列第61/003，212号、在2007年11月16日提交的第60/988,621号、在2007年11月28日提交的第60/990,815号和在2008年4月10日提交的第61/043,833号的权益，其中每个申请都通过引用被并入本文。
发明领域
本发明涉及施用用于治疗由致病细胞(pathogenic cells)所致的疾病状态的配体偶合物(conjugate)的方法。更特别地，将定向的配体-免疫原偶合物施用于患病宿主以治疗疾病例如癌症、炎症以及由活化的免疫细胞所致的其他疾病。
发明背景和简述
哺乳动物免疫***提供识别和消除肿瘤细胞和其他致病细胞的手段。虽然免疫***通常提供坚强的防线，但是仍有许多情况下癌细胞和其他致病细胞避开了宿主免疫应答并保持了并发的宿主病原性。已经开发了化疗剂和放射疗法以消除复制的癌细胞。然而，大多数(如果不是所有的话)当前可得的化疗剂和放射疗法方案具有不利的副作用，因为它们不仅破坏癌细胞，而且它们还影响正常宿主细胞例如造血***的细胞。此外，可发生对化疗剂的抵抗。癌细胞产生对化疗剂的抵抗的能力以及当前可得的抗癌药物的不利副作用强调了对于开发具有特异性和减少的宿主毒性的新的定向疗法的需要。
本文所述的方法涉及通过增加宿主免疫***对致病细胞群体的识别和应答来消除宿主中的此类细胞群体。实际上，增加了致病细胞的抗原性以增强内源性免疫应答介导的致病细胞消除。该方法包括施用配体-免疫原偶合物，其中所述配体能够在体内特异性结合至独一无二地表达、优先表达或过量表达配体结合部分的致病细胞群体，而且配体偶合的免疫原能够引发抗体产生或者能够被宿主动物中内源性或共同施用的外源性抗体所识别。免疫***介导的致病细胞消除是由免疫原偶合的配体与受体、转运蛋白(transporter)或由致病细胞所独一无二地表达、过量表达或优先表达的其他表面呈递蛋白的结合指导的。由致病细胞所独一无二地表达、过量表达或优先表达的表面呈递蛋白是不存在或少量存在于非致病细胞上的受体，其提供选择性消除致病细胞的手段。至少一种另外的治疗因子例如免疫***刺激剂、细胞杀伤剂、肿瘤穿透增强剂、化疗剂或细胞毒性免疫细胞可被共同施用于宿主细胞以增强治疗效力。
在一个实施方案中，提供了治疗宿主动物以消除致病细胞的方法。所述方法包括如下步骤：向宿主动物施用半抗原-载体偶合物；向宿主动物施用TH-1偏向佐剂(TH-1 biasing adjuvant)，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶10至约1∶1；并且向宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物在施用半抗原-载体偶合物的第一周或者稍晚时间被施用，其中所述稍晚时间是在完成使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期之前。在另外的实施方案中，致病细胞是癌细胞，致病细胞是活化的免疫细胞，或者所述活化的免疫细胞是巨噬细胞或单核细胞。在另一个实施方案中，配体-半抗原偶合物是在施用半抗原-载体偶合物的第一、第二、第三或第四周被施用的。
在又其他的实施方案中，配体是结合维生素受体的配体，所述配体选自由叶酸和其他结合叶酸(folate)受体的配体所组成的组，所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基γ-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物，所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基α-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物，或者所述配体是能够结合至受体的小有机分子，并且其中所述受体在所述致病细胞群体的表面上被优先表达、独一无二地表达或过量表达。在其他方面，半抗原是具有少于20,000道尔顿的分子量的有机分子，并且/或者所述有机分子选自由荧光素、硝基苯基(nitrophenyl)和多硝基苯基(polynitrophenyl)所组成的组。
在其他说明性的方面，该方法还包括向宿主动物施用免疫刺激剂的步骤，所述免疫刺激剂是细胞因子，所述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合，或者所述细胞因子包括与IFN-γ或IFN-α联合的IL-2、IL-12、IL-15或其组合。在其他实施方案中，以多次注射施用配体-半抗原偶合物的组合物，半抗原-载体偶合物的施用包括接种(vaccination)，并且/或者半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶8至约1∶1、约1∶6至约1∶1、约1∶4至约------1∶1、约1∶3至约1∶1，或者是约1∶3或约1∶2.5。
在另一个说明性的实施方案中，佐剂是皂树皂甙，佐剂是修饰的皂甙佐剂，载体是钥孔
Figure BPA00001160465800031
形血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，或者半抗原-载体偶合物具有下式：
Figure BPA00001160465800032
其中KLH是钥孔
Figure BPA00001160465800033
形血蓝蛋白，而且配体-半抗原偶合物具有下式：
Figure BPA00001160465800034
或其药学上可接受的盐。
在上述任一个实施方案中，提供了治疗宿主动物以消除致病细胞的方法，其中所述方法包括如下步骤：向宿主动物施用半抗原-载体偶合物，向宿主动物施用TH-1偏向佐剂，并且向宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物在用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被施用。
附图简述
图1显示测定结果，其中测量了使用叶酸-FITC的早期或晚期给药时注射了Bis-EDA-FITC和叶酸-FITC的小鼠的直肠温度。使用1μg剂量的KLH-FITC对小鼠预先免疫。
图2显示使用叶酸-FITC的早期或晚期时给药注射了Bis-EDA-FITC和叶酸-FITC的小鼠的直肠温度。使用35μg剂量的KLH-FITC对小鼠预先免疫。
图3显示使用叶酸-FITC的早期或晚期给药时的叶酸定向的免疫疗法对于具有乳腺肿瘤植入物的小鼠的存活的作用。使用35μg剂量的KLH-FITC对小鼠预先免疫。
图4显示叶酸-FITC的示例性结构。
图5显示KLH-FITC的示例性结构。
图6显示KLH-FITC与叶酸-FITC相对比的给药方案。
图7显示示例性的给药简图。图A：在第23天静脉内施用单剂的EC17。
图B：在第8-12、15-19和22天用EC17的多次皮下给药对小鼠脱敏。
图8显示被免疫的小鼠中抗FITC IgE抗体的产生。
图9显示被免疫的豚鼠中的过敏反应测定。
发明详述
提供了对患有癌症或由活化的免疫细胞如巨噬细胞或单核细胞所致的疾病状态的宿主的治疗性治疗方法。该方法通过标记抗原性的致病细胞以导致宿主免疫***对它们的识别和消除从而导致免疫应答介导的致病细胞消除的增强。该方法利用能够高亲结合至癌细胞或其他致病细胞例如活化的免疫细胞的配体-免疫原偶合物。所述配体-免疫原偶合物装饰致病细胞以使它们显示抗原性，并被宿主自身的免疫***或被例如共同施用的抗体消除。该方法还可利用组合疗法，其通过使用配体-免疫原偶合物和能够刺激内源性免疫应答的另外的治疗因子(例如，免疫刺激剂，如细胞因子)而实现。
本文所述方法被用来在含有致病细胞群体的宿主动物中增强内源性免疫应答介导的致病细胞群体消除。本发明适用于导致各种病状例如癌症和炎症的致病细胞群体。在各方面，致病细胞群体可以是致瘤性的癌细胞群体，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，或者它可以是非致瘤性的。在其他实施方案中，癌细胞群体可自发地或通过例如存在于宿主动物种系中的突变或体细胞突变等过程产生，或者它可被化学、病毒或放射诱导。在其他说明性的实施方案中，该方法可被用来治疗癌症例如癌、肉瘤、淋巴瘤、Hodgekin氏疾病、黑素瘤、间皮瘤、Burkitt氏淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤。在各种其他实施方案中，癌细胞群体可包括但不限于口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子***、子宫癌、乳腺癌、睾丸癌、***癌、直肠癌、肾癌、肝癌和肺癌。
本文所述方法可被用于人类临床医学和兽医应用。在各种说明性的方面，含有致病细胞群体并用配体-免疫原偶合物治疗的宿主动物可以是人(例如人类患者)，或者在兽医应用的情况下可以是实验室的、农用的、家养的或野生的动物。
在各种说明性的实施方案中，可通过肠胃外例如皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内将配体-免疫原偶合物施用于宿主动物。在其他实施方案中，可通过其他医学上有用的过程将偶合物施用于宿主动物，并且可使用任何有效的剂量和适合的治疗剂型，包括延长释放剂型。说明性地，本文所述方法可与肿瘤的手术移除、放射疗法、化疗或生物疗法例如其他免疫疗法联合使用，所述其他免疫疗法包括但不限于单克隆抗体疗法，使用免疫调节剂的治疗，免疫效应细胞的过继性转移，使用造血生长因子、细胞因子和接种的治疗。
根据本文所述的方法，可从多种多样的配体和免疫原中选择配体-免疫原偶合物。所述配体可由于致病细胞上可用于配体结合的所述配体的受体的优先表达而能够特异性结合宿主动物中的致病细胞。在各种示例性的实施方案中，可接受的配体包括叶酸、叶酸类似物和其他结合叶酸受体的分子，其他维生素，由文库筛选鉴定的肽配体，肿瘤特异性肽，肿瘤特异性适体，肿瘤特异性糖类，肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体，抗体Fab或scFv(即单链可变区)片段或转移癌细胞上特别表达的或可独特地接近的其他蛋白，衍生自组合文库的小有机分子，生长因子例如EGF、FGF、胰岛素和***、以及同源多肽、生长抑素及其类似物，转铁蛋白，脂蛋白复合物，胆汁盐，选择蛋白，类固醇激素，含Arg-Gly-Asp的肽，类视黄醇，各种半乳凝素，γ-阿片样受体配体，缩胆囊素A受体配体，血管紧张素AT1或AT2受体的特异性配体，过氧化物酶体增殖物激活的受体γ配体以及特异性结合优先表达在肿瘤细胞或活化的免疫细胞表面的受体的其他分子，或者任何这些分子的片段。如本文所用，“结合叶酸受体的配体”包括能够高亲结合叶酸受体的任何配体，其包括结合叶酸受体的类似物和衍生物。
在各种实施方案中，结合叶酸受体的配体可以是叶酸、叶酸类似物或另外的结合叶酸受体的分子。可被使用的叶酸类似物包括亚叶酸、蝶酰多谷氨酸(pteropolyglutamic acid)和结合叶酸受体的蝶啶例如四氢蝶啶、二氢叶酸、四氢叶酸和它们的脱氮和双脱氮类似物。术语“脱氮”和“双脱氮”类似物是指用一个碳原子取代天然存在的叶酸结构中一个或两个氮原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮类似物。双脱氮类似物包括例如1，5-双脱氮、5，10-双脱氮、8，10-双脱氮和5，8-双脱氮类似物。前述叶酸类似物通常被称作“叶酸类物质(folates)”，这反映了它们结合叶酸受体的能力。其他结合叶酸受体的类似物包括氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基-羟基叶酸、脱氮类似物例如1-脱氮甲蝶呤或3-脱氮甲蝶呤和3′，5′-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。还可使用任何其他结合叶酸受体的类似物或衍生物例如在美国专利第2,816,110、5,140,104、5,552,545或6,335,434号中所述的那些，其通过引用并入本文。可以使用本领域众所周知的任何叶酸类似物或衍生物例如在Westerhof等人，Mol.Pharm.48：459-471(1995)中所述的那些，其通过引用并入本文。
结合至叶酸受体的另外的说明性叶酸类似物(即结合叶酸受体的配体)被描述在美国专利申请公布第2005/0227985和2004/0242582号中，其公开通过引用并入本文。说明性地，这种叶酸类似物具有通用式，其中(*)表示另外的二价连接基团的连接点：
Figure BPA00001160465800071
其中X和Y各自独立地选自由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5所组成的组；
U、V和W表示各自独立地选自由-(R6a)C＝、N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-所组成的组的二价部分；Q选自由C和CH所组成的组；T选自由S、O、N和-C＝C-所组成的组；
A1和A2各自独立地选自由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12烯基和C1-C12烯氧基(alkyeneoxy)所组成的组，其中Z是氧或硫；
R1选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所组成的组；
R6和R7各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6和R7合起来形成羰基；R6a和R7a各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者R6a和R7a合起来形成羰基；
L是本文所述的二价连接体；而且
n、p、r、s和t各自独立地是0或1。
在叶酸的这种结合叶酸受体的类似物的一个方面，当s是1时，t是0，而且当s是0时，t是1。在这种叶酸类似物的另一个方面，n和r都是1，而且连接体La是通过酰胺键在其α-氨基处共价连接于A2的天然存在的氨基酸。说明性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸以及类似氨基酸。
前述叶酸类似物和/或衍生物通常被称作“叶酸类物质”，这反映了它们结合叶酸受体的能力，而且当与外源性分子偶合时这种配体对于增强例如通过本文所述的叶酸介导的胞吞作用的跨膜转运是有效的。因此，如本文所用，将理解的是，术语“叶酸类物质”既具体地指用于形成偶合物的叶酸，或者可选地指能够结合叶酸(folate)或叶酸(folic acid)受体的叶酸类似物或其衍生物(即结合叶酸受体的配体)。
在另一个实施方案中，其他维生素可被用作配体。例如，可根据本文所述方法使用的维生素包括烟酸、泛酸、叶酸、核黄素、硫胺、生物素、维生素B12、维生素A、D、E和K、其他相关的维生素分子、其类似物和衍生物，以及其组合(参见美国专利第5,108,921、5,416,016和5,635,382号，其通过引用被并入本文)。
在一个说明性的方面，配体的结合位点可包括能够特异性结合受体的任何分子的受体，其中所述受体或其他蛋白被优先表达在致病细胞包括例如癌细胞或活化的免疫细胞的群体上。在各种实施方案中，结合位点可以是生长因子、维生素、肽包括阿片样肽、激素、抗体、糖类或小有机分子的受体，或者结合位点可以是肿瘤特异性抗原。在一个实施方案中，配体-免疫原偶合物的组合可被用来使使致病细胞的靶向最大化以通过宿主的免疫应答或通过共同施用的抗体进行消除。
在本文所述方法的各种实施方案中，可使用预先存在的免疫或构成先天免疫***的部分的免疫。在另一个实施方案中，针对免疫原的抗体可被施用于宿主动物以建立被动免疫。在说明性的方面，用于本发明的适合的免疫原包括已针对其发展预先存在的免疫的抗原或抗原性肽，其中所述预先存在的免疫是通过正常安排的接种或之前对媒介物的天然接触发展而来的，所述媒介物例如脊髓灰质炎病毒、破伤风、斑疹伤寒、风疹、麻疹、腮腺炎、百日咳、肺结核和流感抗原以及α-半乳糖基。在这种情况下，配体-免疫原偶合物将被用来重新指导对宿主动物中致病细胞的之前获得的体液或细胞免疫以消除外来细胞或致病生物体。在其他实施方案中，免疫原可以是宿主动物已经通过针对非天然抗原或半抗原(例如异硫氰酸荧光素、二硝基苯基或三硝基苯基)的免疫对其发展了全新的免疫的抗原或抗原性肽，以及存在针对其的先天免疫的抗原(例如超抗原和胞壁酰二肽)或者例如具有少于20,000道尔顿的分子量的小有机分子。如本文所用，“免疫原”是一种不是抗体的化合物，而且免疫原是医生在治疗方法中为了引发IgG或IgM抗体应答以导致治疗性应答而施用的化合物。
在各种说明性的方面，可利用本领域公认的形成偶合物的任何方法来将本发明的配体和免疫原偶合，所述方法包括将配体直接地或通过连接基团例如二价连接体间接地与免疫原形成共价键、离子键或氢键连接。例如，通常通过在配体与免疫原之间形成共价键来形成偶合物，所述共价键是通过在复合物相应成分上的酸、醛、羟基、氨基或肼撑之间形成酰胺、酯或亚氨基键而形成的。将配体连接至免疫原的方法被描述在PCT公布第WO2006/012527号中，其通过引用被并入本文。
另外，在各种实施方案中，进行了偶合物连接体部分的结构修饰。例如，可对偶合物连接体部分进行若干氨基酸取代，其包括但不限于天然存在的氨基酸以及从传统合成方法可得的那些。在一个方面，β、γ和较长链氨基酸可被用来替代一个或多个α氨基酸。在另一方面，可选择在这种分子中发现的手性中心的立体化学以形成完整分子的光学纯度的各种混合，或者仅仅是存在的手性中心的子集。在另一方面，包含在连接体内的肽链的长度可被缩短或加长，这是通过改变其中所包含的氨基酸数量或通过包括更多或更少的β、γ或较长链氨基酸。在另一方面，可以进行肽部分中氨基酸侧链的选择以增加或减少连接体部分特别的或者整个分子总体的相对亲水性。
相似地，本文所述连接体的其他化学片段的长度和形状可被修饰。在一个方面，连接体包括亚烃基链(alkylene chain)。所述亚烃基链长度可不同，或者可包括支链基团，或者可包括环状部分，其所述环状部分相对于亚烃基链可以是处于线性位置(in line)或螺旋位置(in spiro)。
在一个实施方案中，所述配体是叶酸、叶酸类似物或任何其他结合叶酸受体的分子，而且通过一种步骤将叶酸配体偶合至免疫原，所述步骤利用三氟乙酸酐通过蝶酰叠氮化物中间产物制备叶酸的γ-酯而导致叶酸配体的合成，所述叶酸配体只通过叶酸的谷氨酸基团的γ-羧基偶合至免疫原，其中γ-偶合物以高度亲和力结合叶酸受体，避免γ-偶合物和α-偶合物的混合物的形成。
在另一个实施方案中，可从其中γ-羧基被选择性地阻断的中间产物制备α-偶合物，α-偶合物形成而γ-羧基随后用本领域公认的有机合成方案和步骤解除阻断。
在本文所述的方法中，配体-免疫原偶合物增强内源性免疫应答介导的致病细胞消除。例如，内源性免疫应答可包括体液应答；细胞介导的免疫应答；以及对宿主动物是内源性的任何其他免疫应答，包括补体介导的细胞溶解，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，导致吞噬作用的抗体调理作用，导致凋亡、抗增殖或分化的信号转导的抗体结合之后的受体聚集以及递送的抗原/半抗原的直接免疫细胞识别。在各种方面，内源性免疫应答可包括例如B细胞、T细胞包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、中性粒细胞、LAK细胞以及类似细胞的免疫细胞类型的参与。
在一个实施方案中，体液应答可以是由如下步骤所诱发的应答：正常安排的接种，或者使用天然抗原或非天然抗原或半抗原(例如异硫氰酸荧光素、硝基苯基或多硝基苯基(例如二硝基苯基或三硝基苯基))的主动免疫，所述非天然抗原或半抗原诱发全新免疫。例如，主动免疫可包括在正常接种方案之外安排的诱发全新免疫的天然抗原、非天然抗原或半抗原的多次注射。根据本文所述的方法，所述天然抗原、非天然抗原或半抗原可与佐剂(在相同或不同溶液中)例如皂树皂甙佐剂(例如GPI-0100)或任何其他TH-1偏向佐剂联合施用。
在一个实施方案中，用半抗原-载体(例如KLH或BSA)偶合物和TH-1偏向佐剂对宿主预先免疫以引发对半抗原的预先存在的免疫。配体-半抗原偶合物然后被施用于宿主导致体液或细胞介导的免疫应答或二者，所述免疫应答针对结合至靶致病细胞的配体-半抗原偶合物。在一方面，用相同或不同溶液中的半抗原-载体偶合物和TH-1偏向佐剂联合将宿主预先免疫。在该实施方案中，TH-1偏向佐剂在随后施用配体-半抗原偶合物之后增强对半抗原的免疫应答。
可被使用的示例性的载体包括钥孔
Figure BPA00001160465800111
形血蓝蛋白(KLH)、疣鲍(Haliotis tuberculata)血蓝蛋白(HtH)、灭活的白喉毒素、灭活的破伤风类毒素、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的纯化的蛋白衍生物(PPD)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、g-球蛋白、甲状腺球蛋白、肽抗原和合成载体例如多聚-L-赖氨酸、树枝状聚合物和脂质体。
在使用半抗原的实施方案中，半抗原通常被偶合至载体以形成半抗原-载体偶合物。可使用上述任何方法偶合半抗原和载体。例如，可使用本领域公认的形成复合物的方法来将载体(例如KLH或BSA)偶合至半抗原，所述方法包括将载体直接地或通过连接基团例如二价连接体间接地与半抗原形成共价键、离子键或氢键连接。通常通过形成共价键来形成半抗原-载体偶合物，所述共价键通过在偶合物相应成分上的酸、醛、羟基、氨基或肼撑之间形成酰胺、酯或亚氨基键而形成。在使用连接体的实施方案中，连接体通常包含约1至约30个碳原子，更通常地约2至约20个碳原子。通常使用较低分子量的连接体(即具有约20至约500近似分子量的那些)。在另一个实施方案中，连接体可包括将载体与半抗原缔合的间接手段(means)，例如通过中间连接体、间隔臂或桥分子的连接。
在使用半抗原-载体偶合物(参见例如图5)的实施方案中，半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比可以是从约1∶10至约1∶1、约1∶8至约1∶1、约1∶6至约1∶1、约1∶4至约1∶1、约1∶3至约1∶1，或者可以是约1∶3或约1∶2.5。在使用半抗原-载体偶合物的其他说明性的方面，半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的摩尔比可以是从1.0×10-3至约6×10-5。
在一个实施方案中，可以使用将免疫应答偏向于TH1应答的佐剂。可通过免疫球蛋白同种型分布分析在小鼠中测量佐剂诱导的TH1偏向免疫。将免疫应答偏向于TH1应答的佐剂是相对于IgG1抗体水平优先增加小鼠中IgG2a抗体水平的佐剂。≥1的抗原特异性IgG2a/IgG1比可表示TH1样抗体亚类模式。然而，根据本发明，增加抗原特异性抗体产生并且同时将小鼠中相对的IgG2a/IgG1比增加至约≥0.3的任何佐剂将免疫应答驱使向TH1偏向的免疫应答。在各种方面，这种佐剂可包括皂甙佐剂(例如皂树皂甙，包括脂修饰的皂树皂甙佐剂)、CpG、3-脱酰单磷酰脂质A(MPL)、卡介苗(BCG)、双茎-环免疫调节寡脱氧核糖核苷酸(d-SLIM)、热灭活的流产布鲁氏菌(Brucella abortus)(HKBA)、热灭活的母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)(SRL172)、灭活的牛痘病毒、环磷酰胺、促乳素、沙利度胺(thalidomide)、actimid、revimid以及类似佐剂。皂甙佐剂以及它们制备和使用的方法详细描述在美国专利第5,057,540、5,273,965、5,443,829、5,508,310、5,583,112、5,650,398、5,977,081、6,080,725、6,231,859和6,262,029号中，其通过引用被并入本文。
在另一个实施方案中，体液应答可由先天免疫产生，在先天免疫中宿主动物具有天然预先存在的免疫例如对α-半乳糖基的免疫。在另一个说明性的方面，可通过向宿主动物施用抗体来建立被动免疫，所述抗体例如从血清收集的天然抗体，或所述抗体可能是或可能不是遗传工程改造的抗体的单克隆抗体，包括人源化抗体。发展被动免疫的特定量的抗体试剂的利用和其中被动施用的抗体针对免疫原的配体-免疫原偶合物的使用将提供被用于患者预先存在的对其他潜在抗原的抗体效价在治疗上是无用的情况中的标准试剂组的优势。在一个实施方案中，被动施用的抗体可以与配体-免疫原偶合物“共同施用”，而且共同施用被定义为在施用配体-免疫原偶合物之前、同时或之后的抗体施用。
通过将配体-免疫原偶合物优先结合至肿瘤细胞或其他致病细胞而将预先存在的抗体、诱导的抗体或被动施用的抗体重新定向于这些入侵细胞。说明性地，可通过补体介导的溶解、ADCC、抗体依赖性吞噬作用或受体的抗体聚集来消除致病细胞。细胞毒性步骤还可包括其它类型的免疫应答例如细胞介导的免疫，以及当被吸引的抗原呈递细胞吞噬不想要的细胞和将天然肿瘤抗原呈递至免疫***以消除带有抗原的细胞或生物体时产生的第二应答。如本文所用，术语“消除的(eliminated)”和“消除(eliminating)”在提及疾病状态时是指减少或消除疾病状态的症状或者防止疾病进展或复发。如本文所用，术语表达配体受体的免疫细胞群体的“消除(elimination)”和“灭活(deactivation)”是指该细胞群体被杀死或者完全地或部分地灭活，其减少被治疗疾病状态特征性的免疫细胞介导的发病。
在一个说明性的方面，含有治疗因子的至少一种另外的组合物可与上面详述的方法学一起被施用于宿主以增强内源性免疫应答介导的致病细胞消除，或者可施用多于一种另外的治疗因子。所述治疗因子可选自能够刺激内源性免疫应答的化合物、化疗剂或能够补足施用的配体-免疫原复合物的效力的其他治疗因子。在该实施方案中，另外的治疗因子能够刺激内源性免疫应答例如细胞因子或免疫细胞生长因子例如白细胞介素1-18、干细胞因子、碱性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配体、HILDA、MIP-1α、TGF-β、TGF-α、M-CSF、IFN-γ、IFN-α、IFN--β、可溶性CD23、LIF及其组合。
在一个实施方案中，例如，治疗有效量的IL-2，例如每日多剂方案(multiple dose daily regimen)中从约5000IU/剂/日至约500,000IU/剂/日的量，和IFN-α，例如每日多剂方案中从约7500IU/剂/日至约150,000IU/剂/日的量，与叶酸-FITC(参见图4)一起使用以消除含有致病细胞的群体的宿主动物中的这种细胞。在另一方面，可以使用治疗有效量的IL-2，例如每日多剂方案中从约0.1MIU/m2/剂/日至约60MIU/m2/剂/日的量的IL-2，并且可以使用IFN-α，例如每日多剂方案中从约0.1MIU/m2/剂/日至约10MIU/m2/剂/日的量的IFN-α(MIU＝百万国际单位；m2＝普通人大概的体表面积)。在另一个实施方案中，以治疗有效量(例如分别地7MIU和3MIU)使用IL-2和IFN-α，并且在另一个实施方案中，以治疗有效量使用IL-15和IFN-γ。在一个可选的实施方案中，联合使用IL-2、IFN-γ或IFN-α和GM-CSF。在其他实施方案中，可以使用任何其他有效的细胞因子组合，包括其他自细胞介素和干扰素以及集落刺激因子的组合。
在其他说明性的实施方案中，适合用于本文所述方法的化疗剂，其本身是细胞毒性的并且可起作用以增强肿瘤渗透性或减少变应原性，包括肾上腺类皮质激素、烷化剂、抗雄激素剂、抗***剂、皮质类固醇、苯海拉明、雄激素、***、抗代谢剂例如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物和氨甲蝶呤、白消安、碳铂、氯恩巴锡(chlorambucil)、顺铂和其他铂化合物、他莫昔芬、红豆杉醇、环磷酰胺、植物碱、***、羟基脲、替尼泊甙、抗生素例如丝裂霉素C和博莱霉素、氮芥、亚硝基脲(nitrosurea)、长春新碱、长春花碱、炎症和促炎症剂、抗组胺剂以及本领域公认的任何其他化疗剂或减少变应原性的剂。
说明性地，致病细胞的消除可包括导致治疗应答的肿瘤团块或致病性免疫细胞的减少或消除。在肿瘤的情况下，所述消除可能是原发性肿瘤细胞或者已转移或在从原发性肿瘤解离的过程中的细胞的消除。在一个实施方案中，还提供通过任何治疗方法来防止肿瘤在被除去之后复发的预防性治疗，所述治疗方法包括肿瘤的手术去除、放射疗法、化疗或生物疗法。所述预防性治疗可以是使用配体-免疫原偶合物的初步治疗，例如以每日多剂方案的治疗，并且/或者可以是初步治疗之后几天或几月间隔后的另外一次治疗或一系列治疗。
在各种实施方案中，取决于宿主状况、受治疗的疾病状态、偶合物的分子量、施用途径和组织分布以及与其他治疗性治疗例如放射疗法共同使用的可能性，配体-免疫原偶合物的单一日剂量(unitary daily dosage)可显著不同。待施用于患者的有效量是基于体表面积、患者体重和医生评估的患者状况。在各种示例性的实施方案中，有效剂量可从约1ng/kg至约1mg/kg，从约1μg/kg至约500μg/kg，或从约100μg/kg至约400μg/kg(例如约300μg/kg)变动。
说明性地，取决于宿主状况、受治疗的疾病状态、偶合物的分子量、施用途径和组织分布以及与其他治疗性治疗例如放射疗法共同使用的可能性，佐剂和半抗原-载体偶合物的剂量可不同。待施用于患者的有效量是基于体表面积、患者体重和医生评估的患者状况。在一个说明性的方面，佐剂的有效剂量可从每剂约0.01μg至约100mg，或从每剂约100μg至约50mg，或从每剂约500μg至约10mg或从每剂约1mg至10mg变动。在一个实施方案中，半抗原-载体偶合物的有效剂量可从每剂约1μg至约100mg，或从每剂约10μg至约50mg，或从每剂约50μg至约10mg或从每剂约0.5mg至约5mg变动(例如每剂约3mg)。
可使用施用TH1偏向佐剂和半抗原-载体偶合物的任何有效方案。例如，可以以单剂施用TH1偏向佐剂和半抗原-载体偶合物，或者可将它们分开(即分成几次)并作为每日多剂方案来施用。此外，交错的方案例如每周一至五天可被用作每日治疗的替代。
在示例性的实施方案中，可以以单剂施用配体-免疫原偶合物和治疗因子，或者可将它们分开并作为每日多剂方案来施用。此外，交错的方案例如每周一至六天可被用作每日治疗的替代。在本发明一个实施方案中，用配体-免疫原偶合物和治疗因子的多重注射来治疗宿主以消除致病细胞群体。在一个实施方案中，用配体-免疫原偶合物对宿主注射多次(例如约2至多达约50次)，例如以12-72小时间隔或48-72小时间隔。可在初始注射之后以几天或几月的间隔将配体-免疫原偶合物的另外注射施用于患者，而且所述另外注射防止疾病的复发。可选地，配体-免疫原偶合物的初始注射可防止疾病复发。
在一个实施方案中，提供了治疗宿主动物以消除致病细胞的方法。所述方法包括如下步骤：向宿主动物施用半抗原-载体偶合物；向宿主动物施用TH-1偏向佐剂，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶10至约1∶1；并且向宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被启动。说明性地，该方法可被用来减少可表明过敏性应答的不利反应(例如疹、痒、脸红)的发生概率。如本文所用，“第一治疗周期”是指半抗原-载体偶合物的第一、第二、第三或第四周施用，不论半抗原-载体偶合物的施用在第一治疗周期中是否是连续的。
说明性地，在该实施方案中，致病细胞可以是癌细胞或活化的免疫细胞，例如巨噬细胞或单核细胞。在一个实施方案中，配体-半抗原偶合物的施用是在使用半抗原-载体偶合物的第一周治疗中被启动的。在另一个实施方案中，配体-半抗原偶合物的施用是在使用半抗原-载体偶合物的第二周治疗中被启动的。在其他实施方案中，配体-半抗原偶合物可在施用半抗原-载体偶合物的任何一周的开始被施用，只要配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期完成之前被启动。在各种实施方案中，其他治疗因子例如细胞因子可与配体-半抗原偶合物一起施用。在另一个实施方案中，配体-半抗原偶合物给药(例如0.3mg/kg(qd×5))可被分成几次，而且配体-半抗原偶合物可被作为每日剂量的分次剂量(例如0.3mg/kg剂量的60％、30％和10％)施用。
在各种说明性的实施方案中，半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶8至约1∶1、约1∶6至约1∶1、约1∶4至约1∶1、约1∶3至约1∶1，或者是约1∶3或约1∶2.5(例如每天1.2mg至3mg)。在一个实施方案中，半抗原-载体偶合物和佐剂可以在施用于患者约5分钟至约1小时内以重量比约1∶3或约1∶2.5或约1∶2混合以避免胶束形成。
在一个实施方案中，半抗载体偶合物具有式
Figure BPA00001160465800161
其中KLH是钥孔形血蓝蛋白，而且配体-半抗原偶合物具有式
Figure BPA00001160465800163
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，提供了治疗宿主动物以消除致病细胞的方法。所述方法包括如下步骤：向宿主动物施用半抗原-载体偶合物向宿主动物施用TH-1偏向佐剂，并且向宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中所述配体-半抗原偶合物在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被施用。在配体是叶酸或者叶酸类似物或衍生物的一个实施方案中，用99mTe放射标记的叶酸定向的螯合剂可被用来确定患者是否具有叶酸受体阳性肿瘤(参见美国专利申请公布第20040033195号，其通过引用被并入本文)。
说明性地，该方法可被用来减少可表明过敏性应答的不利反应(例如疹、痒、脸红)的发生概率。在各种方面，致病细胞可以是癌细胞或活化的免疫细胞，例如巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方案中，配体-半抗原偶合物的施用是在使用半抗原-载体偶合物的第一周治疗中被启动的。在另一个实施方案中，配体-半抗原偶合物的施用是在使用半抗原-载体偶合物的第二周治疗中被启动的。在其他实施方案中，配体-半抗原偶合物可在施用半抗原-载体偶合物的任何一周的开始被施用，只要配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期完成之前被启动。在各种实施方案中，其他治疗因子例如细胞因子可与配体-半抗原偶合物一起施用。在另一个实施方案中，配体-半抗原偶合物给药(例如0.3mg/kg(qd×5))可被分成几次，而且配体-半抗原偶合物可被作为每日剂量的分次剂量(例如0.3mg/kg剂量的60％、30％和10％)施用。在说明性的方面，可每周一次、TIW(每周三次)、每天一次或使用任何其他有用的给药时间表来施用半抗原-载体偶合物(在一个方面与佐剂例如GPI-0100联合)、配体-半抗原偶合物和治疗因子。
在该方法的一个实施方案中，半抗原-载体偶合物和佐剂可以在施用于患者约5分钟至约1小时内混合以避免胶束形成。在一个实施方案中，半抗原-载体偶合物具有式
其中KLH是钥孔
Figure BPA00001160465800181
形血蓝蛋白(偶合物被称作KLH-FITC)，而且配体-半抗原偶合物具有式
(偶合物被称作叶酸-FITC)或其药学上可接受的盐。
在各种实施方案中，可在配体-免疫原偶合物之前、之后或同时将治疗因子施用于宿主动物，并且治疗因子可作为含有所述偶合物的相同组合物的一部分或者作为不同于配体-免疫原偶合物的组合物的一部分来施用。可在本发明中使用含有治疗有效剂量的治疗因子的任何这种治疗组合物。在一个实施方案中，可以使用多于一种类型的配体-免疫原偶合物。例如，可以使用异硫氰酸荧光素和二硝基苯基二者对宿主动物进行预先免疫，并且随后以共同给药方案用连接至相同或不同配体的异硫氰酸荧光素和二硝基苯基处理宿主动物。
说明性地，配体-免疫原(例如半抗原)偶合物、治疗因子、佐剂和半抗原-载体偶合物可被肠胃外注射，而且这种注射可以是腹膜内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射或鞘内注射。在另一个实施方案中，可使用低速泵递送配体-免疫原(例如半抗原)偶合物、治疗因子、佐剂和半抗原-载体偶合物。肠胃外剂型的实例包括众所周知的药学上可接受的液态载体中活性剂的含水溶液，所述液态载体例如液态醇、二醇类(例如聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如5％)、酯、酰胺、无菌水、缓冲盐水(包括缓冲液如磷酸盐或醋酸盐；例如等渗盐水)。另外的示例性成分包括植物油、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、石蜡以及类似成分。在另一方面，肠胃外剂型可以是可重构的冻干产物形式，其包括配体-免疫原(例如半抗原)偶合物、治疗因子、佐剂或半抗原-载体偶合物的剂量。在各种方面，可使用增溶剂、局部麻醉剂(例如利多卡因)、赋形剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐和润滑剂。在一个方面，可施用本领域已知的若干延长释放剂型中的任何剂型，例如在美国专利第4,713,249、5,266,333和5,417,982号中描述的可生物降解的糖基质，其公开通过引用被并入本文。
实施例1
BALB/C小鼠中的温度分析
以1周的间隔将雌性Balb/c小鼠针对与100μg的GPI-0100一起配制的1μg(图1)或35μg(图2)的EC90(KLH-FITC；参见图5)免疫3次。双荧光素被加入EC17(叶酸-FITC；参见图4)组合物(1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的双荧光素)。加入双荧光素以增强组合物的变应原性。用1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的双荧光素经静脉内攻击小鼠。然后通过直肠探针监测小鼠体温的任何改变以检测任何明显的变应原性。
注射物的制备：在每次接种前新鲜制备EC90(KLH-FITC)/GPI-0100溶液以避免在储存中形成胶束。通过在PBS(pH 7.4)中将0.01mg/ml的EC90和1mg/ml的GPI-0100混合来制备1μg的EC90/GPI-0100注射物(图1)(每剂0.1ml提供了1μg的KLH-FITC和100μg的GPI-0100)。通过在PBS(pH 7.4)中将0.35mg/ml的EC90和1mg/ml的GPI-0100混合来制备35μg的EC90/GPI-0100注射物(图2)(每剂0.1ml提供了35μg的KLH-FITC和100μg的GPI-0100)。对于每5ml体积，通过混合0.244ml的EC17储备溶液和2.331ml的双荧光素储备溶液以及2.425ml的PBS(pH7.4)来制备掺杂了双荧光素的EC17注射物。对于IV或SC施用，每只～20g小鼠的0.1ml提供了1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的双荧光素。
接种：使用100μl的1μg或35μg的EC90/GPI-0100注射物在尾根部邻近位点(50μl/位点)经皮下对小鼠免疫。7和14天后，在小鼠背部或颈背部注射两次加强剂量。
掺杂了双荧光素的EC17注射物的早期给药：用1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的双荧光素在第7至11天、第14至18天和第21天处理小鼠。
掺杂了双荧光素的EC17注射物的晚期给药：在约第22天，用PBS或1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的双荧光素经静脉内攻击小鼠。使用专门为小鼠设计的直肠探针(RET-3，热电偶温度计)测量每只小鼠的体温。在为了IV注射而将每只动物预热(warm up)之前、临注射之前和攻击之后大约30分钟取得基线温度(根据需要的频率)。
结果：掺杂了双荧光素(350nmol/kg)的EC17(1500nmol/kg)导致了针对两种EC90给药而被免疫的小鼠温度的降低，但其中进行了用EC17+双荧光素的早期给药的除外。通过用受到双荧光素污染的EC17对小鼠早期给药，预防了指示对掺入的双荧光素的明显过敏性反应的应答。而且，当以1μg(导致EC90与GPI-0100的重量比为约1∶100)而非35μg(EC90与GPI-0100的重量比为约1∶2.5)施用时，EC90独自(不存在用EC17+双荧光素的攻击；即只加入了EC17并且在晚期给药方案中加入了EC17)导致小鼠温度降低。
实施例2
配体偶合物对于具有乳腺肿瘤植入物的小鼠的肿瘤体积的作用
测试了两种方案。在第一个方案中，在第1、15和29天以使用皂甙佐剂(例如GPI-0100；100μg/剂)的35μg/剂的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的钥孔
Figure BPA00001160465800201
形血蓝蛋白(KLH；参见图5)对六至八周大(～20-22克)的雌性Balb/c小鼠进行免疫。在第23天，用2.5×105个4T1c2细胞(乳腺肿瘤细胞系)对每个动物进行注射。然后允许癌症位点(locus)生长。在第42-60天，每天((qd×5)3；第42-46、49-53和56-60天)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或500nmol/kg的通过γ羧基连接的乙二胺桥(参见图4)偶合至叶酸的FITC对所有动物进行注射。在同一天用20,000U/剂的重组人IL-2对动物进行注射。在与用叶酸-FITC注射动物的相同周用IL-2以(TIW)3对动物进行注射。
在第二个方案中，在第1、和29天以使用皂甙佐剂(例如GPI-0100；100μg/剂)的35μg/剂的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的钥孔
Figure BPA00001160465800202
形血蓝蛋白(KLH)对六至八周大(～20-22克)的雌性Balb/c小鼠进行免疫。在第5天，用2.5×105个4T1c2细胞对每个动物进行注射。然后允许癌症位点生长。在第8-50天，每天((qd×5)6)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或500nmol/kg的通过γ羧基连接的乙二胺桥偶合至叶酸的FITC对所有动物进行注射。在第32-50天中的每天用20,000U/剂的重组人IL-2对动物进行注射。在与用叶酸-FITC注射动物的相同周用IL-2以(TIW)3对动物进行注射。
然后通过监测叶酸-FITC处理的小鼠与对照动物相比的作为时间的函数的肿瘤体积而评估该免疫疗法的效力。如图3中所示，用免疫疗法减小了小鼠的肿瘤体积，而且不论用来施用叶酸-FITC的给药方案(早期或晚期)如何，肿瘤体积是相似的。因此，使用叶酸-FITC的“早期给药方案”在减少肿瘤体积方面是有效的。
实施例3
KLH-FITC和叶酸-FITC的合成
如在Kennedy等人，Pharmaceutical Research，卷20(5)，2003和WO2006/101845中所述合成并纯化叶酸-FITC，每个参考文献通过引用被并入本文。EC17作为PBS(pH 7.4)中5.5mg/ml的冰冻溶液储存。EC90(KLH-FITC)固体(83％蛋白含量)具有～129μmol FITC/克KLH的标记比。在PBS(pH 7.4)中制备2.5mg/ml的储备溶液并用0.22μm的注射器式滤器过滤灭菌。使用与用于叶酸-FITC的方法相似的方法合成了KLH-FITC。
实施例4
给药方案
图6显示为了本文所述方法用于人以减少指示过敏反应的不利反应(例如疹、脸红、痒)的概率的示例性“早期给药方案”。V1至V10表明用EC90(KLH-FITC)的注射。显示了治疗周期中的各周，而且所述周期中的周的天被显示为D1、D8、D15等。周期被显示为C1、C2、C3等。显示了施用EC90(V1、V2等)、EC17(叶酸-FITC)和EC17+细胞因子的周、周期和天。图6中还包括了显示药物剂量和给药频率的表格。分别以1.2mg、3mg、0.3mg/kg、7MIU和3MIU施用了EC90、GPI-0100、EC17、IL-2和IFN-α。
实施例5
给药方案
另一个示例性的“早期给药方案”包括下述步骤。用99mTe放射标记的叶酸定向的螯合剂(IV(静脉内)施用0.1mg)被用来确定患者是否具有叶酸受体阳性肿瘤(参见美国专利申请公布第20040033195号，其通过引用被并入本文)。在第一治疗周期中4个连续周的每周(即每周一次)、在第二周期中2个连续周的每周并且每个另外周期一次地经皮下施用KLH-FITC(1.2mg，与佐剂GPI-0100联合)。在第一治疗周期中4个连续周的每周、在第二周期中2个连续周的每周并且每个另外周期一次地经皮下与KLH-FITC(GPI-0100是3.0mg)一起施用GPI-0100佐剂。在前两个治疗周期中4个连续周的每周5天(周一至周五)然后在每个另外周期中3个连续周的每周3天(周一、周三和周五)经皮下施用叶酸-FITC(0.3mg/kg)。在前2个治疗周期的4个连续周每周3次(周一、周三和周五)经皮下施用IL-2(7.0MIU)，然后在每个另外周期的3个连续周每周3次(周一、周三和周五)经皮下施用2.5MIU的IL-2。在前2个治疗周期的4个连续周每周3次(周一、周三和周五)经皮下施用IFN-α(3.0MIU)，然后在每个另外周期的3个连续周每周3次(周一、周三和周五)经皮下施用3.0MIU的IFN-α。
实施例6
针对与GPI-0100一起配制的EC90进行免疫的小鼠中的
自动全身性过敏反应测定
在第1、8和15天对雌性Balb/c小鼠免疫三次。在第23天将单剂的EC17经静脉内施用(图7，图a)。在第8-12、15-19和22天用EC17的多次皮下给药使小鼠脱敏(图7，图b)。在第23天，使用EC17照常经静脉内攻击小鼠。EC17攻击之后，使用直肠探针(RET-3，热电偶温度计)测量体温。在为了静脉内注射而将每只动物预热之前、紧挨着注射之前和攻击之后～30分钟取得基线温度(根据需要的频率)。当动物显示刺激后没有活动的休克征兆时(通常它们的体温降低-3℃或更低)，用CO2将它们安乐死。
实施例7
FITC免疫的小鼠中抗FITC的IgE抗体的产生
在第1、8和15天对雌性Balb/c小鼠(n＝3)进行针对各种剂量的EC90加上100μg的GPI-0100的免疫。在第29天，汇集来自每组的单个动物的等体积的血清。使用ELISA捕捉测定(capture ELISAassay)比较了抗FITC IgE抗体的相对水平(图8)。简言之，用大鼠抗小鼠IgE的捕捉性mAb涂布96孔板。在阻断非特异性结合之后，用FITC-抗血清接着是生物素酰化的BSA-FITC和链霉抗生素蛋白-辣根过氧化物酶与板孵化。
实施例8
针对EC90加上GPI-0100佐剂进行免疫的豚鼠中的
自动全身性过敏反应测定
在第1、8和15天用各种剂量的EC90加上0.5mg的GPI-0100对雄性和雌性豚鼠(每组每性别1只)免疫三次。在第22天施用(经皮下)单剂的测试品(EC17+/-Bis-FITC-eda)。在第8-12和15-19天用掺入了10％(摩尔)Bis-FITC-eda的EC17的多次给药使豚鼠脱敏。在第22天，使用相同的EC17/Bis-FITC-eda配方经皮下攻击这些小鼠。攻击之后，通常进行1.5-2小时的临床观察。当动物显示过敏性休克征兆时，将它们安乐死。在所有动物上进行完整的宏观的死后检查(图9)。结果显示，EC17的早期给药和KLH-FITC的剂量增加减少动物中的变应原性。

Claims (51)

1.一种治疗宿主动物以消除致病细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
向所述宿主动物施用半抗原-载体偶合物；
向所述宿主动物施用TH-1偏向佐剂，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶10至约1∶1；并且
向所述宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被启动。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述致病细胞是癌细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述致病细胞是活化的免疫细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述活化的免疫细胞是巨噬细胞或单核细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的治疗的第一或第二周或者在稍晚时间被启动，其中所述稍晚时间是在完成使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期之前。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体是结合维生素受体的配体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述配体选自由叶酸和其他结合叶酸受体的配体所组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基γ-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基α-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体是能够结合至受体的小有机分子，并且其中所述受体在所述致病细胞群体的表面上被优先表达、独一无二地表达或过量表达。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述半抗原是具有少于20,000道尔顿的分子量的有机分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述有机分子选自由荧光素、硝基苯基和多硝基苯基所组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚硝基苯基是二硝基苯基或三硝基苯基。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括向所述宿主动物施用免疫刺激剂的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述免疫刺激剂是细胞因子。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞因子包括与IFN-γ或IFN-α联合的IL-2、IL-12、IL-15或其组合。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体-半抗原偶合物的组合物以多次注射施用。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述半抗原-载体偶合物的施用包括接种。
20.根据权利要求1所述的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶8至约1∶1。
21.根据权利要求1所述的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-I偏向佐剂的重量比是从约1∶6至约1∶1。
22.根据权利要求1所述的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶4至约1∶1。
23.根据权利要求1所述的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是从约1∶3至约1∶1。
24.根据权利要求1所述的方法，其中半抗原-载体偶合物与TH-1偏向佐剂的重量比是约1∶3或约1∶2.5。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述佐剂是皂树皂甙佐剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述佐剂是修饰的皂甙佐剂
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是钥孔形血蓝蛋白。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述半抗原-载体偶合物有下
式：
其中KLH是钥孔形血蓝蛋白，而且所述配体-半抗原偶合物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
29.一种治疗宿主动物以消除致病细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
向所述宿主动物施用半抗原-载体偶合物；
向所述宿主动物施用TH-1偏向佐剂；并且
向所述宿主动物施用偶合至半抗原的配体，其中配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期中被启动。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述致病细胞是癌细胞。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述致病细胞是活化的免疫细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述活化的免疫细胞是巨噬细胞或单核细胞。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体-半抗原偶合物的施用在使用半抗原-载体偶合物的治疗的第一周或者在稍晚时间被启动，其中所述稍晚时间是在完成使用半抗原-载体偶合物的第一治疗周期之前。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体是结合维生素受体的配体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述配体选自由叶酸和其他结合叶酸受体的配体所组成的组。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基γ-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述配体是具有只通过配体的谷氨酰基α-羧基部分与所述半抗原共价连接的谷氨酰基部分的叶酸类似物。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体是能够结合至受体的小有机分子，并且其中所述受体在所述致病细胞群体的表面上被优先表达、独一无二地表达或过量表达。
39.根据权利要求29所述的方法，其中所述半抗原是具有少于20,000道尔顿的分子量的有机分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述有机分子是荧光素、硝基苯基或多硝基苯基。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多硝基苯基是二硝基苯基或三硝基苯基。
42.根据权利要求29所述的方法，还包括向宿主动物施用免疫刺激剂的步骤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述免疫刺激剂是细胞因子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞因子包括与IFN-γ或IFN-α联合的IL-2、IL-12、IL-15或其组合。
46.根据权利要求29所述的方法，其中所述配体-半抗原偶合物的组合物以多次注射施用。
47.根据权利要求29所述的方法，其中所述半抗原-载体偶合物的施用包括接种。
48.根据权利要求29所述的方法，其中所述佐剂是皂树皂甙佐剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述佐剂是的皂甙佐剂。
50.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体是钥孔形血蓝蛋白。
51.根据权利要求29所述的方法，其中所述半抗原-载体偶合物具有下式：
Figure FPA00001160465700052
其中KLH是钥孔
Figure FPA00001160465700053
形血蓝蛋白，而且所述配体-半抗原偶合物具有下式：
Figure FPA00001160465700054
或其药学上可接受的盐。
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