CN101899438B - 一种扩增人类egfr基因的多重pcr引物及其设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物及其设计方法，所述设计方法包括以下步骤：步骤1：利用引物设计软件设计人类EGFR基因的引物库；步骤2：对引物库中的引物进行筛选；步骤3：判断所保留引物的竞争优劣状态，竞争状态劣引物，进行步骤4；判断为竞争状态优引物，进行步骤5；步骤4：再次筛选竞争状态劣的引物；步骤5：利用tem-PCR方法对竞争状态优引物进行扩增；步骤6：去除扩增引物中的冗余引物，获得多重PCR引物。本发明解决现有引物的设计方法中存在片段丢失、扩增效率低、扩增体系复杂的技术问题，具有减少多重PCR体系中片断丢失的现象，资源最优化利用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及人类表皮生长因子EGFR(Epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的多重PCR领域，具体涉及一种人类EGFR基因的多重PCR引物及其方法。
背景技术
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，尽管手术和化疗技术不断提高，但晚期肺癌患者的预后仍然很差。近年来随着分子技术的提高，产生了针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强，能特异的杀伤肿瘤细胞，效果显著。其中以表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点的分子靶向治疗酪癌氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌治疗中日渐突出，这类靶向药物称作酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinases inhibitor，TKI)，其中吉非替尼(Gefitibib，商品名为Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib，商品名为Tarceva)治疗已在多个国家广泛推广。然而在Gefitibib和Erlotinib的临床试验和治疗中，仅有一部分NSCLC人群对药物有反应。研究中发现对药物敏感的患者中几乎都存在EGFR基因的体细胞突变，因此对突变的研究日益重视。以EGFR受体酪氨酸激酶为靶点抗肿瘤药物已经成为晚期肺癌治疗的一种新选择，且研究显示女性、不吸烟、腺癌、亚洲患者EGFR基因突变率高，因此分子靶向依赖性和对病人的个体化治疗是优化肺癌分子治疗的中心，因此对患者的EGFR基因测序和基因突变的检测是选择合理化疗的关键，避免对患者使用无效的强力药物和昂贵的试验性治疗。由于EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。近年来大量研究发现一些肺癌病人EGFR基因的编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与吉非替尼和埃罗替尼等药物的临床疗效有关，即与药物反应性有关，原因可能是因为这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。这些靶向药物虽然对某些人群疗效非常，但是价格昂贵，如果病人不携带有EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，是临床非小细胞肺癌诊断治疗的一个重要辅助工具，可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使病人最大限度地受益，同时可以避免不合理用药所造成的病人医疗费用增加和社会医疗资源浪费，减少不必要治疗的时效损失以及经济损失，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变成为人们垦待解决的问题。EGFR基因突变与Gefitinib临床疗效有一定的相关性，EGFR突变型的疾病进展时间和总体生存率等指标均显著优于野生型，提示突变型患者经药物治疗的预后较好，揭示EGFR基因突变是影响预后的主要因素。EGFR基因位于7号染色体短臂7p12-14区，由28个外显子组成。其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，迄今为止发现的EGFR基因突变＞90％位于外显子19-21。绝大多数(85.9％)EGFR基因突变发生在外显子19和21，其中超过一半(55.8％)基因突变发生在外显子19，44.2％为外显子21基因突变。外显子19碱基缺失，主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变，外显子21的点突变主要是第851位密码子出现T-G转换。因此只要将18-21exon全部扩增出来，就可以为EGFR基因上任何一个与治疗非小细胞肺癌相关突变的检测提供模板。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。一个反应常有25-35个循环，一个循环包含3个步骤，首先使模板DNA双链在94-95℃变性为单链，然后在较低温度下，使引物与模板结合，接着在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA互补链。可看作生物体外的特殊DNA复制。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。因此，利用能扩增每种靶序列的引物集，就可通过单次PCR扩增多个靶序列。多重PCR最先是在1988就被Chamberlain所提出，在这短短22个年头之内，它已经在DNA检测的多个领域得到成功的应用。具体包括：检测基因突变、缺失等多态，定量试验(realtimePCR)，反转录PCR。Henegariu在1997年设计出了多重PCR步步优化协议，指导怎样多重PCR的反应体系。但是多重PCR最大的问题还是存在于引物的设计上。和一般PCR相比较，多重PCR在同一PCR反应管内同时扩增出EGFR的所有药物代谢相关基因片段(EFGR 18exon、19exon、20exon、21exon)，一次性完成模板的扩增，为下游基因分型检测服务。多重PCR的***性主要体现在它能够根据需求一次性扩增出所有的相关基因。在本发明中，4个外显子已经覆盖了EGFR的所有药物代谢相关基因；在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息；检测所有的位点只需要一个的量即可，这样可以大量节约宝贵的样本，实现微量检测。由于多重PCR的引物设计要求总体上跟一般PCR的引物是一致的。如，引物本身不能有稳定二级结构(发夹和二聚体)，引物之间也不能有稳定的二级结构等等。但是多重PCR要将两对以上的引物放在一起，并且扩增出所有的目的片段，这对引物又提出了更高的要求，对引物之间的相互作用要求更加严格。这不是一个“1+1＝2”的问题，经常是“1+1＜2”。因为经常是扩增目的片段的各引物单独扩增的时候都能很好的工作，扩增出条带清晰的目的片段，但是混在一起的时候就出现条带丢失现象。各引物之间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致片段丢失。更有甚者，引物相互作用产生严重的引物二聚体，根本扩增不出一条目的片段。
徐定邦于2004年发明了“一种万能引物的PCR方法及其反应液和在多重PCR中的应用”，专利号为：02160387.1。他将多重PCR的引物设计为：以一对3’区域与模板互补的前导引物，和一对与前导引物5’区域相同的万能引物在同一PCR反应中进行扩增。这样可以解决扩增效率受到引物与模板结合效率影响的问题，可以应用于多重PCR引物的设计。但是，该技术方案在通用引物和前导引物的选择上面都是高Tm值，可能只适合于他所扩增的目的基因——人激动球蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。反应体系也比较复杂，多重PCR体系中包括：一对3‘区域与模板互补的前导引物和一对与前导引物5’区域相同的万能引物。虽然对多重PCR的结果有所提高，但是万能引物的存在性的必要性很有待讨论。
而申请人Jian Han于2006年又在上述专利的基础上发明了一种更好的多重PCR方法——“The Templex PCR”(复杂-PCR，tem-PCR)。其原理如图1所示。图1(A)：为了提高PCR在初始循环中扩增目的基因片段的效率，tem-PCR设计了基因特异性的槽式引物。图1中引物全称为：上游外侧引物(Fo，forwardout)；上游内侧引物(Fi，forward in)；下游内侧引物(Ri，reverse in)；下游外侧引物(Ro，reverse out)；上游通用引物(FS，forward SuperPrimer)；下游通用引物(RS，reverse SuperPrimer)。
参考文献：
1、Jian Han，David C.Swan，Sharon J.Smith，et al.Simultaneous Amplification and Identification of 25 HumanPapillomavirus Types with Templex Technology[J].JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2006，44(11)：4157-4162.
2、Han J.Molecular Differential Diagnoses of Infectious Diseases：Is the Future Now？[A].AdvancedTechnologies in Diagnostic Microbiology.Advanced Technologies in Diagnostic Microbiology[C].New York.Springer Publishing Company，2006：472-504.
3、John Brunstein，Eva Thomas.Direct Screening of Clinical Specimens for Multiple Respiratory PathogensUsing the Genaco Respiratory Panels 1 and 2[J].Diagn Mol Pathol.2006，15(3)：169-173.
4、Haijing Li，Melinda A.McCormac，R.Wray Estes，et al.Simultaneous Detection and High-ThroughputIdentification of a panel of RNA viruses Causing Respiratory Tract Infections.[J].Journal of ClinicalMicrobiology.2007，45(7)：2105-2109.
5、Shumei Zou，Jian Han，Leying Wen，et al.Human Influenza A Virus(H5N1)Detection by a Novel MultiplexPCR Typing Method[J].Journal of Clinical Microbiology.2007，45(6)：1889-1892.
图1(B)不同的引物在tem-PCR的三个阶段分别发挥着不同的作用。tem-PCR第一步是富集阶段，采用低浓度的基因特异性引物用足够长的时间寻找模板。每个目的片段的扩增情况，取决于实际上哪些引物被使用。一共可能存在四种扩增产物：Fo/Ro，Fi/Ro，Fi/Ri，和Fo/Ri。富集阶段一般需要10个循环。tem-PCR第二步是标记阶段，在这时退火温度提高到72℃，只有40个碱基左右的的内侧引物(Fi和Ri)能够起作用。经过10个循环之后，标记阶段的最后阶段，所有的PCR产物都被标记上通用引物序列。最后，tem-PCR的第三步是扩增阶段，高浓度的通用引物在这一步发挥着主要的作用，用来快速扩增带标记的序列。
tem-PCR除了像徐定邦一样有一对3’区域与模板互补的前导引物(也就相当于图1中的Fi、Ri)和一对与前导引物5’区域相同的万能引物(也就相当于图1的Fs、Rs)之外，还在前导引物(Fi、Ri)配对区域之外侧存在一对槽式引物(也就是上图的Fo、Ro)。这样每扩增一个基因片段就需要4条跟模板配对的引物以及一对通用引物。这4条引物就有4种情况两两组合(Fo/Ro，Fi/Ro，Fi/Ri，Fo/Ri)成上下游引物扩增出包含所需的目的基因片段。相比于徐定邦的单独情况，该设计大大增加了扩增出目的基因的概率，并且减少片段丢失的可能性。尤其适合于大量未知目的片段的多重PCR扩增。但是tem-PCR体系复杂，体系中存在大量冗余引物；4条引物(Fi，Ri，Fo，Ro)两个组合成上下游引物，在理论上虽然有4种情况出现，但是实际上可能只有占优势的一对引物发生作用；成本高，检测每个位点的所需引物是一般PCR的两倍。另外，Jian Han说Fi，Ri，Fo，Ro的溶度要尽量低，减少背景信号的影响，但是到底应该低到什么程度不清楚；反应体系中存在着太多的各种引物，对下游的基因分型、定量等实验不利。总的来说，tem-PCR法和徐定邦的方法不适合少量基因片段的多重PCR。
发明内容
为了解决扩增人类EGFR基因的多重PCR的引物的设计方法中存在片段丢失、扩增效率低、扩增体系复杂的技术问题，本发明提供一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物及其设计方法。
本发明的技术解决方案：
一种扩增人类EGFR基因的多重PCR的引物，所述引物的序列为：
一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，该方法包括以下步骤：
步骤1】利用引物设计软件设计人类EGFR基因的引物库，所述引物库所包含引物的碱基数为20-24个、引物的熔解温度Tm为56-63℃、引物的GC％为40％-60％；
步骤2】对引物库中的引物进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物；
步骤3】判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较：当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优引物，进行步骤5】；
步骤4】再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2】，对所保留的引物按照步骤3】进行再次判断；
步骤5】利用tem-PCR方法对竞争状态优引物进行扩增：所述tem-PCR方法的富集阶段的退火温度为60-65℃，标记阶段为94℃变性、72℃退火延伸的两步PCR，扩增阶段的退火温度为50-60℃；
步骤6】去除扩增引物中的冗余引物，获得多重PCR引物。
上述步骤1】中所用的引物设计软件为primer3.0、primer5.0或oligo6.0。
上述步骤2】采用软件AutoDimer对引物库中的引物进行筛选。也就是通过软件primer3.0获得的引物之间不能有重叠区域，以最大限度降低引物二聚体形成的可能性。
上述步骤5】中所述富集阶段的退火温度为63℃；所述扩增阶段的退火温度为52℃。
上述步骤2】中保留的不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为22或23。
上述步骤1】中引物库中引物的熔解温度Tm为60℃。
上述步骤6】中去除更换后引物中的冗余引物包括以下步骤：
6.1】首先把外侧引物浓度降低逐渐降低直至为零；
6.2】再次去掉tem-PCR中的通用引物；
6.3】将tem-PCR程序修改为一般PCR程序，获得最终结果。
本发明具有以下优点：
1、本发明在扩增人类EGFR基因的多重PCR的引物的设计方法中，引入对引物的竞争优劣状态的判断步骤，得到竞争优的引物，减少多重PCR体系中片断丢失的现象，资源最优化利用。
2、本发明提供一种扩增人类EGFR基因的多重PCR的引物，同时扩增出EGFR基因的18-21四个外显子，提高扩增效率，降低成本。扩增后多重PCR的产物便于下游检测能够指导临床个体化用药的基因突变。
3、本发明在扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法中加入了去除扩增引物中的冗余引物，获得多重PCR引物这一步骤，将现有的tem-PCR的三步程序优化到最简单的一步PCR程序，并且引物从最终的18条优化到8条，程序简单、节约成本。
4、本发明将多重PCR反应时间用快速反应酶缩短至20分钟，即可快速为下游的基因检测提供高质量模板。
附图说明
图1为本发明最初所依据的韩建的tem-PCR的原理示意图；
图2为本发明18exon in、18exon out单独扩增时的温度梯度图；
图3为本发明19exon in、19exon out单独扩增时的温度梯度图；
图4为本发明20exon in、20exon out单独扩增时的温度梯度图；
图5为本发明21exon in、21exon out单独扩增时的温度梯度图；
图6为本发明用四个外显子60℃的四条内侧片段做混合模板摸索Fs和Rs的退火温度图；
图7为本发明摸索体系中内外侧引物及通用引物比例图；
图8为本发明18exon和19exon所有引物不同温度下扩增效率比较图；
图9为本发明20exon和21exon所有引物不同温度下扩增效率比较图；
图10为本发明四个外显子所有引物不同温度下扩增效率比较图；
图11为本发明鉴定条带大小图；
图12为本发明对18exon新引物温度梯度摸索图；
图13为本发明换新引物后四个外显子全部引物温度梯度摸索图；
图14为本发明重新摸索tem-PCR通用引物与内外侧引物比例图；
图15为本发明进一步优化tem-PCR条件图；
图16为本发明简单方法扩增四个外显子图；
图17为本发明优化引物浓度图；
图18为本发明利用快速PCR扩增酶优化图；
图19为本发明最终优化的实验效果图。
具体实施方式
用于多重PCR的一组引物应该能特异性结合靶序列，并且不应相互干扰，从而扩增足够量的靶序列。多重PCR能同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样本。由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因而技术难度增大。一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复实验，建立适宜的反应体系和反应条件。大量的实验表明，多重PCR的主要技术问题在于引物的设计，组合和浓度优化。目前的研究在对多重PCR的引物优化主要从两个方面进行：一方面是对引物的设计进行序列间的比对，减少引物之间的互补和配对几率；另一方面是在实验中对各位点引物的浓度条件进行摸索，调整各组引物的相对浓度，以达到各位点平衡而高效的扩增。通常需要非常仔细的引物设计以及多轮筛选后才能建立一个有效的多重PCR程序。多重PCR中经常遇到的问题是不同目标片段之间的扩增不均衡，甚至在多重体系中的某些片段根本没有任何有效扩增，同时其重现性较差。对于一个成功的多重PCR程序来说，需要考虑以下一些因素，具体包括引物的使用浓度、PCR缓冲液的浓度、镁离子浓度和dNTP浓度之间的平衡、PCR循环中各步的温度、模板DNA以及TaqDNA聚合酶的用量。PCR中的退火温度与缓冲液体系的最优组合对于保证多重PCR的特异性非常有必要，镁离子浓度和dNTP浓度之间需要保持一定的比例，同时引物浓度的调整也是非常有必要的。因此，对每一种引物的终浓度的确定就成为了多重PCR体系建立中的关键因素。为了避免引物之间以及引物和非特异性模板之间的可能的交叉互补，需要对引物进行详细的设计和分析。在理想的情况下，多重PCR中的所有的引物对均有相同的扩增效率，不同的引物的相同的扩增效率可以通过在设计时保证各自的退火的一直来实现(控制引物的长度在18-28bp以及GC含量在45-60％，并且不同的引物之间以及引物自身均无较高的同源性。通常的情况下多重PCR中的每套引物的浓度是通过经验来实现的。现有的多重PCR是采用多对与目标模板碱基序列相匹配的引物对同时加入一个PCR反应管中实现多重扩增的，整个PCR扩增过程中始终利用与原始模板互补的引物，事实上，每对引物各自与模板配对然后延伸，各个PCR互不关联，由于引物自身结构、与模板结合效率以及引物浓度在反应全程的变化在各对引物对之间差异较大，各个PCR的扩增效率也无法一致，甚至会产生某些“弱势PCR”被“强势PCR”所掩盖的缺陷，无法产生足够的产物。因此，为了利用诸如DNA芯片等快速分析人的表皮生长因子EGFR基因，需要开发一组用于通过多重PCR扩增人类EGFR基因的引物。
本发明根据tem-PCR(The Templex PCR)进行引物设计，在实验优化中寻找到本发明的简便多重PCR。具体方法如下：
(1)利用引物设计软件设计出一个引物库：
利用在线引物设计软件primer3.0设计一个引物库。设计时所选择的参数为：引物的Tm最优为60℃，最小57℃，最大63℃；长度最佳22，最短19，最长27；GC％为40％～60％；其他为***默认值。
具体的引物序列为：
| 引物扩增位置编号 | 具体序列 |
| exon 18 up1 | acatttgtccttccaaatgagc |
| exon 18 up2 | atttgtccttccaaatgagctg |
| exon 18 up3 | gaggtgacccttgtctctgtgt |
| exon 18 up4 | agagaaggcgtacatttgtcct |
| exon 18 up5 | ctgaggtgacccttgtctctgt |
| exon 18 up6 | ggtgacccttgtctctgtgttc |
| exon 18 up7 | ctgaggtgacccttgtctctg |
| exon 18 up8 | gacccttgtctctgtgttcttg |
| exon 18 down1 | tacagcttgcaaggactctgg |
| exon 18 down2 | tatacagcttgcaaggactctgg |
| exon 18 down3 | ggaaatatacagcttgcaaggac |
| exon 18 down4 | acagcttgcaaggactctgg |
| exon 18 down5 | acactggagtttcccaaacact |
| exon 18 down6 | ttcccaaacactcagtgaaaca |
| exon 18 down7 | tcccaaacactcagtgaaacaa |
| exon 18 down8 | aaacactggagtttcccaaaca |
| exon 18 down9 | cccaaacactcagtgaaacaaa |
| exon 18 down10 | acactggagtttcccaaacact |
| exon 18 down11 | ctgtgaattggtctcacaggac |
| exon 18 down12 | cctttggtctgtgaattggtct |
| exon19 up1 | tgccagttaacgtcttccttct |
| exon19 up2 | tcacaattgccagttaacgtct |
| exon19 up3 | gccagttaacgtcttccttctc |
| exon19 up4 | atgaaatgatccacacggactt |
| exon19 up5 | tgccagttaacgtcttccttct |
| exon19 up6 | tcacaattgccagttaacgtct |
| exon19 up7 | gccagttaacgtcttccttctc |
| exon19 up8 | ttgccagttaacgtcttccttc |
| exon19 up9 | tgccagttaacgtcttccttct |
| exon19 up10 | tcacaattgccagttaacgtct |
| exon19 up11 | gccagttaacgtcttccttctc |
| exon19 up12 | ttgccagttaacgtcttccttc |
| exon19 down1 | acacagcaaagcagaaactcac |
| exon19 down2 | agctgccagacatgagaaaag |
| exon19 down3 | ccacacagcaaagcagaaact |
| exon19 down4 | cacacagcaaagcagaaactca |
| exon19 down5 | atgaaatgatccacacggactt |
| exon19 down6 | agctgccagacatgagaaaag |
| exon19 down7 | tgccagttaacgtcttccttct |
| exon19 down8 | acacagcaaagcagaaactcac |
| exon20 up1 | taaacgtccctgtgctaggtct |
| exon20 up2 | tgactccgactcctcctttatc |
| exon20 up3 | ctcctttatccaatgtgctcct |
| exon20 up4 | ctcctcctttatccaatgtgct |
| exon20 up5 | taaacgtccctgtgctaggtct |
| exon20 up6 | ctaggtcttttgcaggcacag |
| exon20 up7 | cctgtgctaggtcttttgcag |
| exon20 up8 | acgtccctgtgctaggtcttt |
| exon20 up9 | gcattcatgcgtcttcacct |
| exon20 up10 | atcgcattcatgcgtcttc |
| exon20 up11 | gcattcatgcgtcttcacc |
| exon20 up12 | catgcgtcttcacctggaa |
| exon20 down1 | catggcaaactcttgctatcc |
| exon20 down2 | atatccccatggcaaactctt |
| exon20 down3 | ccgtatctcccttccctgatta |
| exon20 down4 | cttatctcccctccccgtatct |
| exon20 down5 | tgactccgactcctcctttatc |
| exon20 down6 | atatccccatggcaaactctt |
| exon20 down7 | taaacgtccctgtgctaggtct |
| exon20 down8 | ccgtatctcccttccctgatta |
| exon21 up1 | acagcagggtcttctctgtttc |
| exon21 up2 | gagcttcttcccatgatgatct |
| exon21 up3 | gcttcttcccatgatgatctgt |
| exon21 up4 | cacagcagggtcttctctgttt |
| exon21 down1 | gaaaatgctggctgacctaaag |
| exon21 down2 | tgacctaaagccacctccttac |
| exon21 down3 | ctgacctaaagccacctcctt |
| exon21 down4 | ctgacctaaagccacctccttac |
| exon21 down5 | gaaaatgctggctgacctaaag |
| exon21 down6 | tgacctaaagccacctccttac |
| exon21 down7 | aagcagctctggctcacactac |
| exon21 down8 | agcagctctggctcacactac |
(2)对引物库中的引物经过筛选
从每个外显子(exon)的上游(up)和下游(down)引物中各挑出两条引物。为了减少引物在寻找模板时相互竞争，所挑引物在模板上首先不能有重叠区域，利用AutoDimer分析，确保所筛选引物之间没有引物二聚体。初步筛选的具体引物序列如下表：
注：以上表中的大写字母表示另外外接的通用臂，其选自参考文献(AtakanAydin，Mohammad R.Toliat，Sylvia 
，Christian Becker，PeterNürnberg.New universal primers facilitate Pyrosequencing.Electrophoresis，2006：27，394-397)
(3)利用tem-PCR方法设计试验验证所筛选出的引物
3.1计算出初步筛选引物在tem-PCR富集阶段四种扩增产物大小
在前面我们讨论了tem-PCR的四条位点专一性引物的不同组合可能产生四种扩增产物：Fo/Ro，Fi/Ro，Fi/Ri，和Fo/Ri。要鉴定出实际上发生那种组合，必须根据引物在模板中的位置以及所加通用引物序列的长度分别计算出每种情况下的扩增片度长度。通过3％琼脂糖电泳结果判断扩增产物的长度，再通过PCR扩增产物片段的长度判断所对应的引物对是否被扩增：在电泳图中，若存在引物对组合所对应的PCR扩增产物片段的长度，则该引物对被扩增；若不存在，则没有扩增。
计算结果如下：
| 18exon | 19exon | 20exon | 21exon | |
| Fo/Ro(out) | 490bp | 441bp | 582bp | 396bp |
| Fi/Ro | 386bp | 225bp | 466bp | 384bp |
| Fi/Ri(in) | 324bp | 191bp | 409bp | 237bp |
| Fo/Ri | 425bp | 407bp | 523bp | 249bp |
3.2确定tem-PCR富集阶段的退火温度
虽然在设计引物的时候，设定的每条引物的Tm值都差不多为60℃(上下不超过1℃)，但是软件计算的Tm值和实际都存在误差，需要实验进一步验证，从而寻找出最佳的做PCR时的退火延伸温度。但是，没有必要摸索3.1中的所有四种组合情况，只需要摸索Fo/Ro产生的exon out和Fi/Ri产生的exon in这两种情况就足够验证四条位点专一性的引物了。
下面是用温度梯度PCR分别摸索各对引物的最适退火温度：
PCR实验法案如下：
每管15ul反应体系为：g.DNA 60ng；Fi-Ri/Fo-Ro终浓度400nM；2×TaqPCR Mastermix：7.5ul；ddH2O：4.8ul。
PCR的反应程序为：预变性94℃3min；然后94℃30s，50-72℃温度梯度40s，72℃50s，共35个循环；最后72℃5min。
3％琼脂胶电泳(以下的PCR产物都是通过这种方法鉴定的)结果参见图2-5所示。
根据这图2-5重新整理为如下表格：
| Ta℃体系 | 50 | 50.6 | 51.7 | 53.5 | 56 | 59.2 | 62.9 | 66 | 68.5 | 70.2 | 71.5 | 72 |
| 18i | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 18o | √ | √ | √ | |||||||||
| 19i | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | |
| 19o | √ | √ | √ | √ | ||||||||
| 20i | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 20o | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||||||
| 21i | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||||
| 21o | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
注：Ta为在做温度梯度PCR时每管的中在退火阶段的退火温度(annealingtemperature，Ta)。上表中√表示，在电泳图中条带清晰且无非特异条带。
从上表中可以清楚看出PCR时的退火温度(Ta)在56-63℃之内时，所有的片段能够扩增出来，并且条带清晰。从而可以确定tem-PCR的第一步富集阶段退火温度范围就是56-63℃，结合图2-5可以得出63℃为最优退火温度(Ta)。
3.3确定tem-PCR第三步扩增阶段的最佳退火温度；
tem-PCR第三步扩增阶段就是通用引物在起作用，我们通过如用60℃的四个in片段做混合模板的方法来确定通用引物Fs和Rs做PCR时的退火温度。
详细实验方法为：
200ul反应总体系(每管15ul分装)：18-21四个in片段PCR产物混合液：1ul；Fs-Rs(100uM)：各1ul；2×Taq PCR Mastermix：100ul；ddH2O：97ul；
PCR反应程序为：
94℃预变性3min，然后94℃30s，44-65℃温度梯度40s，72℃40s35个循环，最后72℃5min。
实验结果如图6，可以看出，在52℃时非特异条带最少。因此，确定tem-PCR第三步的退火温度为52℃
3.4采用各种内外侧引物及通用引物比例实现tem-PCR
由于，tem-PCR中只是要求Fi，Fo，Ri和Ro的引物浓度尽量低，但是到底低多少我们不知道。只能通过实验自己摸索出来。摸索体系中内外侧引物及通用引物比例，具体方法如下：
每管50ul反体系包括：g.DNA 120ng；内侧引物混合物：2ul(12.5uM/1.25uM/0.125uM/12.5nM/1.25nM)；外侧引物混合物：2ul(12.5uM/1.25uM/0.125uM/12.5nM/1.25nM)；Fs-Rs(10uM)：各2ul；2×Taq PCR Mastermix：25ul；ddH2O：12ul。
PCR程序为：
(i)94℃预变性3min，(ii)富集阶段(94℃30s，60℃90s，72℃60s，共10个循环)，(iii)标记阶段(94℃30s，72℃90s，共10个循环)，(iv)扩增阶段(94℃20s，52℃40s，72℃50s，共35个循环)，(v)延伸阶段(72℃3min)。
实验结果为图7摸索体系中内外侧引物及通用引物比例。如图7中从左到右的泳道中的内外侧引物与通用引物比例依次为：M(Marker)，1∶1.25，1∶12.5，1∶125，1∶1250，1∶12500。但是，从图7中我们可以看出，18exon不管在那个泳道中都没有目的片段(386bp)出现，tem-PCR实验失败，必须要分析原因。
(4)对选出的引物进行更换
4.1.分析失败原因：
在上面的实验中，我们发现18exon在多重PCR中丢失片段。其原因具体分析如下：
4.1.1.对各外显子所有引物不同温度下扩增效率进行比较：
每一个目的基因在tem-PCR的第一步富集阶段可能会有四种目的片段被扩增出来，但是到底实际上是那个被扩增出来呢？
如果在一个管子中把扩增一个基因的所有相关引物都等量加进去(比如，18exon，就将18exon Fi、Fo、Ri、Ro、Fs和Rs引物都加入)，我们就能够通过观察实际扩增出来的片段确定到底哪对引物占优势，使得所对应的片段被扩增出来。
试验设计为：
每管15ul反应体系包括：g.DNA(24ng/ul)：1.5ul；Fi-Ri(10uM)：各0.6ul；Fo-Ro(10uM)：各0.6ul；Fs-Rs(10uM)：各0.6ul；2×Taq PCRMastermix：7.5ul；ddH2O：2.4ul。
PCR程序：
94℃预变性3min，然后94℃30s，44-65℃温度梯度40s，72℃40s35个循环，最后72℃5min。
试验结果为：图8(18和19exon所有引物不同温度下扩增效率比较)和图9(20和21exon所有引物不同温度下扩增效率比较)。
另外，还做了将tem-PCR所有的引物都等量(10uM)加入进行温度梯度PCR，实验结果如图10(四个外显子所有引物不同温度下扩增效率比较)。
从图8～图10很难直观发现各个片段的大小差异，需重新跑胶确定这些片段的大小。为了解决这个问题，我将3.2中目的片段大小确定的PCR产物混合当成自制的Marker，重新跑电泳结果为图11(鉴定条带大小)。从图11中，就可以看出：18exon只有Fi/Ro和Fi/Ri被扩增出来，19exon也只有Fi/Ro和Fi/Ri被扩增出来，20exon只有Fi/Ri被扩增出来，21exon只有Fi/Ro和Fi/Ri被扩增出来。
综上我们得出一个判断tem-PCR引物是否扩增的方法，包括以下步骤：
1】将引物等量加入至同一个PCR管中进行PCR扩增反应；
2】通过电泳判断步骤1】中PCR扩增产物片段的长度；
3】通过PCR扩增产物片段的长度判断所对应的引物对是否被扩增：在电泳图中，若存在引物对组合所对应的PCR扩增产物片段的长度，则该引物对被扩增；若不存在，则没有被扩增。
每个外显子单独扩增的时候都会有Fi/Ri也就是in片段被扩增出来，但是当所有的引物都放到一起的时候，18exon in就丢失掉了。这到底是为什么呢？必须从引物序列中寻找根本原因。
4.1.2对引物序列分析比较：
要分析18exon丢失问题，应该从引物序列的本质属性出发。18-21exon的各个4条引物从GC％、Tm值、长度比较如下表：
对上表进行分析：由于我初步筛选的引物的碱基数只有21和22两种情况，能够在多重PCR体系中被扩增出来的19、20、21exon存在以下两种情况，第一，内侧引物的碱基数比外侧引物引物多1个碱基(比如19Ri为22个碱基而19Ro为21个碱基；20Ri 22，20Ro 21；21Ri 22，21Ro 21)，该片度能够被扩增；第二，内、外侧引物的碱基数都为22，但是内侧引物的GC％高于外侧引物(范围也在10％之内)，该片度能够被扩增。总之可能这两方面因素能够导致内侧引物结合模板的能力优势于外侧引物，进而保证在扩增多重PCR片度时不会有片度丢失。而18Ri的GC％比17Ro的低了4％，将导致内侧引物在结合模板的时候占劣势。
4.2.重新更换引物结果：
按照刚才的分析结果，重新从引物库中挑选出新的18exon Ri和Ro。其序列如下表：
注：18new Ri：长度23，GC％47.83；扩增出18exon in片段的长度为：281bp。18new Ro：长度22，GC％40.91；扩增出18exon out片段的长度变为：408bp。
(5)对更换后的引物进行再次试验：
5.1对18exon新引物温度梯度摸索：
每管15ul反应体系包括：g.DNA(24ng/ul)：1.5ul；Fi-Ri/Fo-Ro(10uM)：各0.6ul；2×Taq PCR Mastermix：7.5ul；ddH2O：4.8ul。
PCR反应程序为：
94℃预变性3min，然后94℃30s，50-72℃温度梯度40s，72℃40s共35个循环，最后72℃5min。
结果见图12-图13。图12为对新引物扩增出18exon in和18exonout的温度梯度摸索。图13B为将扩增18exon的相关引物(18exon Fi、Ri、Fo、Ro、Fs和Rs)等量加入的竞争扩增结果；图13A为将所有引物等量加入的竞争扩增结果。
从图13A可以看出，更换新引物之后，所有引物竞争不再会导致18exon的丢失，证明更换引物成功。并且可以看出新引物在60℃和63℃退火延伸都有很好的效果。
5.2重新tem-PCR试验：
每管15ul反应体系包括：g.DNA(24ng/ul)：1.5ul；Fi/Ri(各种稀释好浓度)：各0.6ul；Fo/Ro(各种稀释好浓度)：各0.6ul；Fs-Rs(10uM)：各0.6ul；2×Taq PCR Mastermix：7.5ul；ddH2O：up to 15ul。
PCR反应程序为：
(i)94℃预变性3min，(ii)富集阶段(94℃30s，60℃90s，72℃60s，共10个循环)，(iii)标记阶段(94℃30s，72℃90s，共10个循环)，(iv)扩增阶段(94℃20s，52℃40s，72℃50s，共35个循环)，(v)延伸阶段(72℃3min)。
结果参见图14(重新摸索tem-PCR通用引物与内外侧引物比例所示)。在图14中从左到右的泳道的情况及引物的量如下表：
从图14中可以得出以下结论：
在第4泳道中有微弱的4个条带出现，再次说明成功更改18exon新引物。如何才能提高条带的清晰度，增加PCR的效率呢？再次观察以前的各对引物温度梯度图，发现在63℃时，普遍比60℃好，因此考虑将第一步扩增由旧引物的60℃变为新引物的63℃再次实验。同时条带微弱，最大的可能性就是在标记阶段没有产生足够的带标记的产物用于以后的大批量扩增，因此考虑将标记阶段的循环数增加，同时相应的减少扩增阶段循环数。
5.3.进一步优化tem-PCR
每管50ul反体系：g.DNA(24ng/ul)：5ul；内侧引物混合物：1.6ul×(1.25uM/0.125uM/12.5nM)；外侧引物混合物：1.6ul×(1.25uM/0.125uM/12.5nM/1.25nM/0.125nM)；Fs-Rs(10uM)：各2ul；2×Taq PCR Mastermix：25ul；ddH2O：12.8ul。
PCR程序为(富集阶段退火温度提高，标记阶段循环数增加，延伸阶段循环数减少)：
(i)94℃预变性3min，(ii)富集阶段(94℃30s，63℃90s，72℃60s，共10个循环)，(iii)标记阶段(94℃30s，72℃90s，共15个循环)，(iv)扩增阶段(94℃20s，52℃40s，72℃50s，共30个循环)，(v)延伸阶段(72℃3min)。
实验结果如图15(进一步优化tem-PCR条件)。在图15从左到右的泳道的情况及引物的量如下表：
从图15可以看出，优化之后的确是对tem-PCR的扩增效率有所提高。上面各种引物梯度的泳道中，只有泳道1、泳道4、泳道7、泳道10四个目的条带都出现了，并且呈现逐渐增强的趋势。而这些泳道中的Fi/Ri引物浓度都是400pM×1/10，Fo/Ro引物的浓度逐渐降低，甚至没有。从结果可以看出，Fo/Ro没有的时候正是这些各种比例中最好的。因此，可以大胆地提出，没有必要使用外侧引物Fo/Ro，外侧引物的存在，在这里反而影响最佳的多重PCR效果。
(6)去除更换后引物中的冗余引物
冗余引物是在tem-PCR扩增体系中没有发挥主要作用的引物。因为tem-PCR体系中的4条位点专一性引物(Fi，Ri，Fo，Ro)两个组合成上下游引物在理论上虽然有4种情况出现，但是实际上可能只有占优势的一对引物发生作用，这将导致冗余。另外，通用引物也似乎没有必要。
6.1初步实验
从5.3的结果可以看出，没有必要使用外侧引物，那么就没有必要再使用tem-PCR的程序了，甚至没有必要使用通用引物。因此，在图15中的泳道13中还存在着另外一个只有全部exon的内侧Fi/Ri的初步简化实验。
该实验的PCR体系为：(共50uL)g.DNA(24ng/ul)：5ul(120ng)；内侧引物混合物1.6ul(12.5uM)；2×Taq PCR Mastermix：25ul；ddH2O：补到50uL。
PCR程序，当时考虑内侧引物都是加入了标记的长片段，有较高的退火温度，可以采用两步法PCR。具体程序为：94℃预变性3min，然后94℃30s，72℃50s，共35个循环，最后72℃5min。
从图15的泳道13可以看出，最上面的长片段不够清晰。可能是两步法PCR程序不适合这里。因此需要进一步优化PCR程序
6.2进一步优化PCR程序
上面的程序没有很好的扩增出长片段，可能是引物两步法的退火延伸温度太高了，部分引物不能很好地跟模板结合。因此，在上面的PCR程序中增加一个63℃的退火延伸循环，让引物充分跟模板结合。
每管50ul反体系包括：g.DNA(24ng/ul)：5ul；内侧引物混合物Fi/Ri(12.5uM)：1.6ul；2×Taq PCR Mastermix：25ul；ddH2O：16.4ul。
PCR程序为：
94℃预变性3min；然后94℃20s，63℃40s，72℃50s共10个循环；然后94℃20s，72℃90s，共25个循环；最后72℃3min，4℃ever。
图16(简单方法扩增四个外显子)为本次实验结果。图16的左边为本次实验上样，右边是自制Marker。从图中可以看出，虽然，还存在引物二聚体问题，但是4个片段可以清晰看出，证明光加8条引物完全可以将4个外显子扩增出来。
6.3优化引物浓度
上面的实验结果中都存在大量的引物二聚体，可能是引物浓度太高，可以相应地减少引物。实验设计如下：
每管50ul反体系包括：g-DNA 120ng；内侧引物混合物Pi(20uM/10uM/5uM/1uM)1.6ul；2×Taq mastermix：25ul；补水至50uL。
PCR程序跟6.2一样。
实验结果如图17(优化引物浓度)，从第2泳道至5泳道逐渐减低引物浓度(20uM，10uM，5uM，1uM)。但是随着引物浓度的降低，虽然引物二聚体减少了，但是有目的最小片段的丢失。因此，我们反应体系的引物浓度不需要再减少了。
6.4更进一步优化PCR程序
上面6.3中的PCR程序依然显得比较复杂，更进一步优化为普通PCR程序是不是能够有更好的结果呢？
在本次实验的反应体系同于6.3。PCR程序设计为：94℃预变3min；94℃20s，63℃40s，72℃50s共35个循环；最后72℃3min，4℃ever。
实验结果如图17从左边数的第1泳道。可以看出，这个程序的扩增效果是最佳的。
6.5.采用Fast PCR Master Mix缩短多重PCR总反应时间；
上面所做的所有实验所用到的酶都是用天根的普通Taq mastermix，扩增的完成一个多重PCR实验至少也需要两个半小时。为了缩短时间采用TaKaRa高效SapphireAmp Fast PCR Master Mix。SapphireAmpTM Fast PCR Master Mix是适合于快速PCR(延伸速度为10秒/kbp)反应的各种试剂(酶、Buffer、dNTPMixture等)的2倍浓度的预混型制品，DNA Polymerase使用了性能良好的HotStart酶。使用Fast PCR Master Mix能够有效地缩短多重PCR总反应时间，实现快速扩增。
具体实验方法如下：
每管25ul反应体系包括：g-DNA 120ng；内侧引物混合物Fi-Ri终浓度为400nM；2×Fast PCR mastermix：12.5ul；用水补足至25ul。
PCR程序共设计了三个：
程序一为：94℃预变性1min；98℃5s，63℃5s，72℃5s共35个循环；最后72℃3min，4℃ever。
程序二为：94℃预变性3min；94℃5s，63℃5s，72℃10s共35个循环；最后72℃3min，4℃ever
程序三为：94℃预变性1min；94℃5s，55℃5s，72℃5s共35个循环；最后72℃3min，4℃ever
实验结果如图18利用快速PCR的酶，从左向右依次试验上面的程序一至程序三。其中第二泳道条带效果最好，是我们利用快速PCR的酶的最终的实验方案。
(7)获得多重PCR最佳引物以及使用方法
本发明针对EGFR基因只要扩增出18、19、20、21外显子就能检测几乎所有药物代谢相关突变的特点，用目前最少的引物，最简单的程序，最经济的手段设计出如下的8条引物实现EGFR的多重PCR。
7.1、普通2×Taq mastermix法：PCR反应液配制
2×Taq PCR Master Mix 25μL
模板DNA*(human genomic DNA) XμL
8条引物混合物(各12.5μM) 1.6μL
灭菌ddH2O Up to 50μL
50μLPCR反应体系中模板DNA推荐用量120ng。
PCR反应条件为
94℃ 3min
72℃ 3min
4℃ ∞
7.2、高效Sapphire Amp Fast PCR Master Mix法
PCR反应液配制为：
SapphireAmp Fast PCR Master Mix 25μL
模板DNA*(human genomic DNA) XμL
8条引物混合物(各12.5μM) 1.6μL
灭菌ddH2O Up to 50μL
50μLPCR反应体系中模板DNA推荐用量为120ng。
PCR反应条件为：
结果为如图19(多重PCR最终结果图)。这是3％的琼脂糖电泳图，从左向右各泳道分别为：样品、自制混合Marker、DL2000Marker。
所扩增出的片段从上到下片段依次：409bp 20exon；281bp 18exon；237bp21exon；191bp，19exon。
Claims (7)
1.一种扩增人类EGFR基因的多重PCR的引物，其特征在于：所述引物的序列为：
2.如权利要求1所述扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤1】利用引物设计软件设计人类EGFR基因的引物库，所述引物库所包含引物的碱基数为20-24个、引物的熔解温度Tm为56-63℃、引物的GC%为40%-60%；
步骤2】对引物库中的引物进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物；
步骤3】判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较：当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC%小于外侧引物的GC%，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优引物，进行步骤5】；
步骤4】再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2】，对所保留的引物按照步骤3】进行再次判断；
步骤5】利用tem-PCR方法对竞争状态优引物进行扩增：所述tem-PCR方法的富集阶段的退火温度为60-65℃，标记阶段为94℃变性、72℃退火延伸的两步PCR，扩增阶段的退火温度为50-60℃；
步骤6】去除扩增引物中的冗余引物，获得多重PCR引物。
3.根据权利要求2所述的扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：所述步骤1】中所用的引物设计软件为primer3.0 、primer5.0或oligo6.0。
4.根据权利要求2或3所述的扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，所述步骤2】采用软件AutoDimer对引物库中的引物进行筛选。
5.根据权利要求4所述的扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：所述步骤5】中所述富集阶段的退火温度为63℃；所述扩增阶段的退火温度为52℃。
6.根据权利要求5所述的扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：所述步骤2】中保留的不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为22或23。
7.根据权利要求6扩增人类EGFR基因的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：所述步骤1】中引物库中引物的熔解温度Tm为60℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CHEN CHAO RAO WENBO JI JING ZHU JUANLI ZONG TINGYONG LI YING ZHU YAQING ZIJING ZHANG JIAN YANG SHASHA WANG HUIHUI ZHANG JINCHAO BIAN TING TO: CHEN CHAO RAO WENBO JI JING ZHU JUANLI ZONG TINGYONG LI YING ZHU YAQING ZI JING ZHANG JIAN YANG SHASHA WANG HUIHUI ZHANG JINCHAO BIAN TING ZHANG KAIYUAN |
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Owner name: SHAANXI BAIMEI GENE CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SHAANXI LIFEGEN CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 710069 Shaanxi city of Xi'an province Taibai Road No. 229 Patentee after: Shaanxi Baimei Gene Co., Ltd. Address before: 710069 Shaanxi city of Xi'an province Taibai Road No. 229 Patentee before: Shaanxi Beimei Gene Co., Ltd. |
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Owner name: SHAANXI BAIMEI MEDICAL EXAMINATION CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHAANXI BAIMEI GENE CO., LTD. Effective date: 20150827 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150827 Address after: 710116 Shaanxi city of Xi'an Province East Metro Symphony new West Ham Red Road and the southwest corner of a Keyuan Road cross port collaborative innovation R & D pilot Building No. 8 N402 Patentee after: Shaanxi Bai Mei Medical Inspection Co., Ltd. Address before: 710069 Shaanxi city of Xi'an province Taibai Road No. 229 Patentee before: Shaanxi Baimei Gene Co., Ltd. |