CN104789677A - 循环肿瘤dna egfr检测技术及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂盒，包括如下步骤：步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。步骤2：样本处理与DNA的提取。步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。本发明采用了特异的MGB Blocker探针，EGFR特异探针和引物，可以检测循环肿瘤DNA中EGFR的突变；利用MGB Blocker阻滞了EGFR野生型基因组非特异性的扩增，提高了其灵敏度；可以在循环肿瘤DNA中检测EGFR的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂盒。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是人表皮生长因子受体(HER)家族成员，属于受体酪氨酸激酶家族，是原癌基因c-erbB1的表达产物。EGFR主要位于细胞膜，被EGF等配体激活后发生二聚化并引发细胞内段磷酸化，产生酪氨酸激酶活性，进一步激活下游信号通路(Pao W et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101:13306-11)，调节细胞生长、增殖等多种生理过程。EGFR下游信号通路主要有：Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/PDK1/Akt通路、PLC-γ通路、JAK/STAT通路等(Sun J M et al.Lung Cancer.2010；68:427-32)。
许多实体瘤均存在EGFR信号通路相关基因体细胞突变或表达异常，与肿瘤生长、侵袭和转移密切相关。EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗一直是国际肿瘤个体化医疗领域关注的焦点。
基于EGFR在肿瘤细胞中异常的特点，目前已开发出多种EGFR靶向药物。比如作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和埃克替尼(Icotinib)；作用于EGFR胞外域部分的单克隆抗体，如西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Vectibix)。
常用的EGFR-TKI包括吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，是目前非小 细胞肺癌患者最有效的靶向药物。但是，EGFR-TKI并非对所有的患者都有效。EGFR外显子18、19、21发生突变的患者、吉非替尼有效率可达80％，而野生型患者基本无效。EGFR突变是药物有效性的前提(Sequist L V et al.J Clin Oncol.2008；26:2442-9,Yang C H et al.J Clin Oncol.2008；26:2745-53,Suda K et al.J Thorac Oncol.2009；4:1-4,Costa D B et al,Clin Cancer Res.2008；14:7060-7)。但部分EGFR-TKI初始有效的患者后期会发生耐药、与EGFR外显子20发生突变密切相关。以非小细胞肺癌为例，EGFR外显子20突变发生率为1.6％，约占EGFR突变率的9％，50％的EGFR-TKI耐药由EGFR外显子20的p.T790M点突变所致(Suda K et al.J Thorac Oncol.2009；4:1-4,Costa D B et al,Clin Cancer Res.2008；14:7060-7,Gazdar A F.Oncogene.2009；28Suppl 1:S24-31.)。
EGFR突变和EGFR-TKI的治疗效果密切相关(Sequist L V et al.J Clin Oncol.2008；26:2442-9,Yang C H et al.J Clin Oncol.2008；26:2745-53,Suda K et al.J Thorac Oncol.2009；4:1-4,Costa D B et al,Clin Cancer Res.2008；14:7060-7,Gazdar A F.Oncogene.2009；28Suppl 1:S24-31.)，因此，EGFR的突变检测对于癌症的EGFR-TKI个体化治疗具有重要的意义。目前常用的EGFR突变检测有测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR以及NGS等。
目前，EGFR突变检测都是基于肿瘤组织样本的，这样存在两个问题，一，肿瘤组织大都来源于活检技术即穿刺和活检钳活检，这样会给病人带来极大的痛苦，是有创检测。二，对于某些晚期的病人，不能穿刺或者手术，病人样本就很难获取，因此就很难根据检测的结果对病人进行靶向用药。临床上迫切需要一种能够替代肿瘤组织的样本来对病人进行个性化指 导用药。
循环肿瘤DNA是指肿瘤患者外周血循环中存在较高水平的DNA。浸润性肿瘤患者外周血中DNA含量更高。这些DNA来源于肿瘤细胞，具有和肿瘤组织DNA拥有相似的遗传学和表观遗传学改变，与肿瘤的发生、发展和转移存在很大的关系，因此表现出其对肿瘤的早期诊断、鉴别、分期、预后和治疗检测方面具有重要意义(Bettegowda C et al.2014Sci.Transl Med 224:224ra24)。
循环肿瘤DNA虽然是一种很好的肿瘤组织替代样本，但是，由于循环肿瘤DNA含量稀少，检测循环肿瘤DNA需要极灵敏的技术。BEAMing扩增法的应用使得DNA检测技术灵敏度大大提高。2007年，该技术的开发者美国约翰霍普金斯大学的Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler对18名结直肠癌患者的循环肿瘤DNA进行了跟踪。研究显示，术后仍能检测到循环肿瘤DNA的患者，基本上都出现了复发，术后未检测到循环肿瘤DNA的患者，结直肠癌无复发，显示了循环肿瘤DNA良好地临床应用前景(Luis A et al.2012Nature 7404:537-540)。BEAMing技术的灵敏度高，可以达到0.1％-0.01％，是一种比较理想的循环肿瘤DNA检测技术(Frank D et al 2006Nature Method 551-559)。但是由于其操作复杂，仪器昂贵，不适用于大规模临床推广。数字PCR是近年来出现的另一种高灵敏度检测的技术，这种技术最高也能达到0.01％的灵敏度，但是这种技术极易产生假阳性的结果(Pinheiro LB et al.2012Anal Chem；84(2):1003–1011)。同样，高昂的设备和试剂价格、极高的实验操作要求也同样限制了其大规模推广。
发明内容
本发明的目的：提供一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂盒，灵敏度极高，平均达到0.1％-0.01％的水平，特别适合检测稀有突变；利用此稀有突变的检测方法，检测循环肿瘤DNA中EGFR的突变，并形成试剂盒，为广大的肿瘤患者服务。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。
步骤2：样本处理与DNA的提取。
步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤2中，提取的所述的样本适用于病人血浆中的循环肿瘤DNA或石蜡切片组织。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系包括：
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤1中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为1，温度为95℃，反应时间为10分钟。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为95℃，反应时间为15秒钟。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为62℃，反应时间为45秒钟。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为95℃，反应时间为10秒钟。
上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为60℃，反应时间为1分钟。
一种利用上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术进行检测的试剂盒，其中，通过所述的试剂盒提取循环肿瘤的DNA样本。
本发明采用了特异的MGB Blocker探针，EGFR特异探针和引物，可以检测循环肿瘤DNA中EGFR的突变；利用MGB Blocker阻滞了EGFR野生型基因组非特异性的扩增，提高了其灵敏度；可以在循环肿瘤DNA中检测EGFR的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
附图说明
图1是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的MGB blocker封闭L858野生型位点检测图。
图2是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的没有MGB blocker封闭L858野生型位点检测图。
图3是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的MGB blocker封闭后L858R位点灵敏度检测图。
图4是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的循环肿瘤DNA EGFR临床样本E19缺失检测图。
图5是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的循环肿瘤DNA EGFR临床样本L858R突变检测图。
图6是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的循环肿瘤DNA EGFR临床样本T790M检测图。
图7是本发明循环肿瘤DNA EGFR检测技术的循环肿瘤DNA EGFR临床样本L861Q突变检测。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的实施例。
请参见附图1至附图7所示，一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。
根据COSMIC数据库公布的人类EGFR基因序列为野生型序列，针对EGFR29种突变类型来设计特异引物和探针。通过设计特异性的封闭探针和 反应体系优化，实现高灵敏度的检测，EGFR29个突变位点见附表1。
针对选定的EGFR29个突变位点，应用primer 5.0引物设计软件设计出引物和多条封闭探针以及检测探针，引物和探针序列如附表2所示。
步骤2：样本处理与DNA的提取。
步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。
在所述的步骤2中，提取的所述的样本适用于病人血浆中的循环肿瘤DNA，对于一般的肿瘤组织如石蜡切片组织也是适用的。血浆中循环肿瘤DNA提取采用上海医脉赛科技有限公司的循环肿瘤DNA提取试剂盒提取。
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系包括：
在所述的步骤1中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为1，温度为95℃，反应时间为10分钟。
在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为95℃，反应时间为15秒钟。
在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为62℃，反应时间为45秒钟。
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为95℃，反应时间为10秒钟。
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为60℃，反应时间为1分钟。
一种利用上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术进行检测的试剂盒，通过所述的试剂盒提取循环肿瘤的DNA样本。
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值(可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线)和阈值线(Threshold值，可手动调整至baseline之上)。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct＝突变孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。突变孔Ct值是指样本突变检测孔(mix1～mix7)对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本mix8对应的Ct值。一个样本可能同时含有2个或多个突变类型，则该样本应有对应的2个或多个△Ct值。
结果判读如下：Ct≤32，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct≤8，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct＞8，判定结果：突变阴性。
本发明利用MGB封闭EGFR野生型基因组，特异扩增EGFR突变基因位点，MGB是DNA双螺旋小沟结合物(minor groove binder)，能够特异的结合到DNA双螺旋的小沟区域，增加DNA双螺旋的退火温度(Kumar S et al. 1998Nucleic Acids Research；3:831-838)。但是，如果是MGB结合的DNA发生了突变，那么MGB就不能增加DNA双螺旋的退火温度(Kutyavin IV et al.2000ic Acids Research；2:655-661)，为此，利用MGB作为锁扣，利用EGFR野生型基因组和突变体基因组的不同，特异性的设计封闭EGFR野生型基因组探针，结合突变体特异的引物设计，能够将EGFR稀有突变体基因型从大量的野生型基因组中富集出来。
实施例1：
运用于本发明体系检测质粒，实验用质粒模板(以L858R为例，利用上述荧光PCR检测EGFR突变的方法如下：
(1)质粒的处理与提取：
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid kid，DP116)的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl(10mM,pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl(10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度＝(C质量浓度X6.02X1023)/MWDNA依次稀释突变体质粒母液至106、104、102、100个拷贝数/微升，野生型质粒为106个拷贝数/微升。
(2)以L858位点野生型质粒为模板，验证MGB blocker的有效性，反应体系如下：
反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
得到如下结果：当不加L858RBlocker时，发现非特异性扩增非常严重，而加入L858R的特意封闭探针以后，非特异性扩增消失，显示L858R MGB blocker可以很好的封闭野生型基因组的非特异性扩增(附图1)。
(3)将野生型质粒和突变体质粒以106:106，106:104，106:102，106:0的比例混合，验证此扩增体系的灵敏度，加入L858R特异封闭探针后，特异引物和检测探针后进行Q-PCR扩增，具体反应体系如下：
反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
得到如下结果：加入封闭探针后，在野生型质粒106个拷贝的背景下，单个突变体拷贝可以被检测出来，显示灵敏度可以达到10-6(附图2)，没有非特异性扩增，显示良好地专一性。
实施例2：
运用本发明检测临床样本，检测129名EGFR肿瘤组织突变阳性的晚期肺腺癌病人循环肿瘤DNA中EGFR突变情况。其中男性75例，女性54例，年龄为37-74岁，平均年龄55岁，中位年龄52岁。所有人EGFR组织检测均呈阳性，突变类型见附表一，抽取病人5ml外周血，进行循环肿瘤DNA EGFR检测，检测结果与组织检测结果相比较，具体实施步骤下：
(1)循环肿瘤DNA的提取
采用上海医脉赛科技有限公司的循环肿瘤DNA提取试剂盒提取病人循环肿瘤DNA，具体步骤如下：
A、血浆样品至2ml离心管中，加入蛋白消化液A、蛋白酶K、37oC恒温孵30min。
B、加入核酸结合液、DNA提取磁珠，混合后加入SolutionER，置于旋转混和仪，温和混匀25min。
C、用磁分离架吸附磁珠1min,弃上清。
D、加入洗涤液I洗涤磁珠两次。
E、加入洗涤液II洗涤磁珠两次。
F、吸附磁珠,弃上清后静置3-6min。
G、加入洗脱液，置于室温，混和均匀洗脱5min。
H、磁场吸附磁珠，回收含基因组DNA的洗脱液。
I、通过微量DNA定量对样品中获得的DNA含量进行定量测定。
B、将上述获得的循环肿瘤DNA作为模板，用于EGFR突变检测，具体反应体系如下：
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值(可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线)和阈值线(Threshold值，可手动调整至baseline之上)。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct＝突变孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。突变孔Ct值是指样本突变检测孔(mix1～mix7)对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本mix8对应的Ct值。一个样本可能同时含有2个或多个突变类型，则该样本应有对应的2个或多个△Ct值。
结果判读如下：Ct≤32，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct≤8，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct＞8，判定结果：突变阴性。
结果如下：
检测结果表明，所检测129例EGFR肿瘤组织突变阳性的晚期病人，其循环肿瘤DNA检测结果和组织检测相符，突变类型相符，证明本方法以及所有本方法衍生出的EGFR检测试剂盒可以满足临床需求，替代肿瘤组织检测。
附表一：EGFR 18、19、20、21四个外显子29种突变类型
附表二：突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针
附表三：循环肿瘤DNA EGFR检测试剂盒组分
附表四：循环肿瘤DNA EGFR检测与ARMS-PCR组织检测对比
综上所述，本发明采用了特异的MGB Blocker探针，EGFR特异探针和 引物，可以检测循环肿瘤DNA中EGFR的突变；利用MGB Blocker阻滞了EGFR野生型基因组非特异性的扩增，提高了其灵敏度；可以在循环肿瘤DNA中检测EGFR的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针；
步骤2：样本处理与DNA的提取；
步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤2中，提取的所述的样本适用于病人血浆中的循环肿瘤DNA或石蜡切片组织。
3.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系包括：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤1中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为1，温度为95℃，反应时间为10分钟。
5.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为95℃，反应时间为15秒钟。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤2中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为2，温度为62℃，反应时间为45秒钟。
7.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为95℃，反应时间为10秒钟。
8.根据权利要求1所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系的反应条件为：循环数为40，温度为60℃，反应时间为1分钟。
9.一种利用权利要求1-8所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术进行检测的试剂盒，其特征在于：通过所述的试剂盒提取循环肿瘤的DNA样本。
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