CN101868728A - 改进的fret探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了尤其是肿瘤特异性融合蛋白和蛋白相互作用的检测。提供了至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针具有染料，其中所述染料合在一起允许能量转移，每种探针另外具有允许所述至少第一种和第二种探针并置的反应性基团，其中所述反应性基团是寡核苷酸，其中所述第一种探针的反应性基团不与所述第二种探针的反应性基团直接反应。

Description

改进的FRET探针及其应用
本发明涉及了尤其是肿瘤特异性融合蛋白和蛋白相互作用的检测。更具体来说，本发明涉及在单细胞水平上指示融合蛋白和/或相互作用蛋白的存在的技术。
恶性肿瘤的诊断和分类，通常是基于特异性蛋白分子或蛋白分子组的检测，以及主要是DNA水平或RNA水平上的致癌基因畸变的检测[1]。当前在正常和恶性细胞中的基因组学和蛋白质组学研究，极大地扩展了关于基因表达和遗传畸变的信息。这导致发现了多重新的蛋白网络，它们调控细胞-细胞相互作用、细胞活化、信号传导途径、增殖、分化、凋亡以及许多其它正常和异常的细胞功能。阐明这些蛋白网络，需要特异性检测个体蛋白分子的真实共定位。
恶性肿瘤的分类具体来说是基于细胞谱系和分化特征，以及特异性染色体畸变的存在。许多这样的染色体畸变产生融合基因，即一个基因的上游部分与另一个基因的下游部分连接的异常连接基因，反之亦然[2-5]。这些融合基因被转录成融合基因转录本，并翻译成融合蛋白(图1)，融合蛋白据推测在肿瘤发生过程中发挥了重要作用。到目前为止，在白血病、淋巴瘤和实体肿瘤中已经描述了上百种不同类型的融合基因。示例性的融合蛋白列于表1中。
因此，在单细胞水平上可靠地检测这些肿瘤特异性融合蛋白，将是迈向癌症患者的诊断和分类的重大步骤，并且可用于监测治疗过程中恶性细胞的消失，作为所施加的治疗方案的有效性的度量。
表1、恶性肿瘤中融合蛋白的例子3，它们可以通过FRET技术，使用用于差异标记抗体的接近和稳定并置的核苷酸接头***进行检测。
Figure GPA00001140082700021
一开始，科学家们试图通过针对融合蛋白的融合表位制造抗体，以产生融合蛋白特异性抗体。这种方法很少成功，并且即使获得了特异性抗体，它们一般也不能用于荧光显微术或流式细胞术[6-8]。例如，针对BCR-ABL p190融合蛋白的ER-FP1抗体在Western印迹中工作良好，但在对人类BCR-ABL阳性白血病的显微镜研究中没有成功[6，7]。
尽管出现了这些初始问题，但通过使用针对融合蛋白的一部分的捕获抗体和针对蛋白的另一部分的标记检测抗体，融合蛋白的特异性检测已变为可能。在这样的***中，捕获抗体结合到固体层上，例如浸渍片(dipstick)、ELISA板或可以通过流式细胞术分析的珠子上[9]。尽管简明并且易于执行，但这些***使用细胞裂解液，因此不允许在单细胞水平上检测细胞内融合蛋白。
两种不同膜结合蛋白和/或细胞内蛋白之间的紧密相互作用，或融合蛋白的存在，可以通过使用结合或连接了适合于荧光共振能量转移(FRET)的荧光染料的抗体来进行研究。FRET技术是基于两种不同荧光染料(具有不同的激发波长)的并置，其中一种荧光染料产生的发射光激发了另一种荧光染料(图2)。如果第二种荧光染料的发射光可以通过流式细胞术检测，这就允许在单细胞水平上简易高速地分析蛋白网络和检测融合蛋白。使用例如共聚焦激光扫描显微术，有可能评估相互作用的蛋白和融合蛋白的精确亚细胞定位。
两种结合了FRET荧光染料的抗体的近似共定位，对于所需的光能量转移来说并不充分。需要待检测蛋白的真正共定位，以便发生与两种不同抗体连接的荧光染料的靠近并置(
Figure GPA00001140082700031
但是
Figure GPA00001140082700032
Figure GPA00001140082700033
Figure GPA00001140082700034
)，这对于有效的光能量转移来说是必需的。
以前，我们描述了FRET技术可用于使用特异性设计的探针组，在细胞中检测融合蛋白的存在(WO2004/042398)或检测蛋白相互作用(WO2004/042404)。根据WO2004/042398和WO2004/042404，每种探针具有染料，其中所述染料合在一起允许进行FRET，并且至少一种探针具有反应性基团。添加能够与反应性基团结合的“桥接”试剂，允许第一和第二种探针的并置，使得在FRET染料之间能量转移的可能性增加。例如，WO2004/042398公开了针对A-B融合蛋白的片段A和B的A和B抗体探针组，其中A和B标记有不同的FRET染料并且其中A和B具有能够结合(链)亲和素桥接物质的生物素反应性基团。在向反应性基团添加桥接物质后，通过反应性基团调节了抗体探针的空间组织。这允许连接到探针上的个体FRET染料进入彼此之间允许FRET发生的距离之内，即彼此之间在大约80-100埃以内。尽管WO2004/042398和WO2004/042404的探针和方法通常产生令人满意的结果，但本发明人力图进一步改进这种概念。具体来说，本发明的目标是增加用于检测融合蛋白和相互作用蛋白的基于FRET的方法的灵敏度。
通过认识到寡核苷酸部分高度适合于将FRET荧光染料带到接近并且稳定的并置位置，从而使FRET可以极大的效率发生，该目标得以实现。寡核苷酸的小的尺寸允许在并置的染料之间仅有最小的间隔。此外，互补寡核苷酸序列可以被设计成获得高度特异和强的分子间相互作用。因此。本发明人鉴定出寡核苷酸(例如DNA或PNA或LNA分子)作为出色的反应性基团和桥接物质以介导和/或增加染料标记的探针的接近并置。
因此，本发明提供了至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针具有染料，其中所述染料合在一起允许能量转移，每种探针又具有允许所述至少第一种和第二种探针并置的反应性基团，其中所述反应性基团是寡核苷酸，并且其中所述第一种探针的寡核苷酸反应性基团不与所述第二种探针的寡核苷酸反应性基团直接反应。为了避免由探针之间不想要的自身结合产生的假阳性信号，后者是必需的。
本发明潜在的原理示意性显示在图3中。第一种分子探针(抗体A)具有FRET染料X并具有至少一个反应性基团，所述反应性基团包含寡核苷酸(核苷酸A)，或由其构成。反应性基团能够特异性结合桥接物质(核苷酸C)，所述桥接物质包含一部分与核苷酸A的至少一个片段的序列互补的核苷酸序列，或由其构成。核苷酸C也与具有FRET染料Y的第二种分子探针(抗体B)的反应性基团(核苷酸B)的至少一部分序列互补。染料X和Y一起形成FRET对。只有当第一和第二种探针分子彼此紧密邻近时(例如它们如图中显示结合到融合蛋白A-B上邻近的表位上，或结合到相互作用的分子上的表位上)，寡核苷酸反应性基团(核苷酸A和B)才充分接近到一起，以便桥接物质(核苷酸C)结合第一和第二种探针的反应性基团。这种相互作用将减少并稳定两种探针结合的染料之间的距离，使得FRET信号可以被检测到。
FRET能量转移效率与供体染料和受体染料之间的距离的六次幂成反比。如本文所公开，寡核苷酸接头***的寡核苷酸反应性基团和桥接物质的非常小的尺寸，允许染料非常近地接近(例如在10埃之内)，产生了与使用WO2004/042398或WO2004/042404中公开的蛋白质反应性基团和桥接物质相比，强得多的荧光信号。此外，反应性基团与桥接物质的互补序列之间、而不是反应性基团自身之间的碱基对识别，提供了高度特异性。
在这种使用三种寡核苷酸分子作为稳定化接头***的FRET方法中，典型地，首先将细胞用至少两种各带有寡核苷酸反应性基团的探针进行细胞内标记，然后进行(严格)洗涤，随后与特异性设计的桥接寡核苷酸温育，以获得两种反应性抗体的紧密和稳定的连接。在优选实施方案中，每种探针具有多个反应性基团，例如各与桥接寡核苷酸具有反应性的2-6寡核苷酸。所述单个探针上存在的反应性基团可以彼此相同或不同。
在本文中使用时，表述“反应性基团寡核苷酸”和“寡核苷酸反应性基团”可以互换使用，除非明确指明不是这样。此外，“桥接寡核苷酸”和“寡核苷酸桥接物质”是指同样的实体。
本文中使用的术语“寡核苷酸”是指连接成长链的一段核酸或核酸类似物。取决于尤其是核酸或核酸类似物的本质，寡核苷酸的总长度可以不同。在一个实施方案中，寡核苷酸由连接成长链的一段5-50、优选10-30个核酸或核酸类似物构成。核酸是例如含有含氮碱基(DNA中为A、G、T或C；RNA中为A、G、U或C)，带电荷磷酸酯部分以及糖部分(DNA中是脱氧核糖，RNA中是核糖)的核苷酸。
对于结合探针的寡核苷酸(即反应性基团)来说，适合的长度包括由至少8个核酸残基，优选为10-18个核酸或类似物构成的寡核苷酸。相应探针上的寡核苷酸反应性基团的长度可以不同或相同。在一个实施方案中，它们具有相同的长度，例如10-15、优选10-12个核酸或类似物。桥接寡核苷酸一般比反应性基团寡核苷酸更长。在一个实施方案中，桥接或接头寡核苷酸由15-40个，例如18-30个，例如从大约20到大约25个核酸或其类似物构成。
在优选实施方案中，寡核苷酸是肽核酸(PNA)寡聚物。PNA与DNA或RNA类似，但是其“骨架”组成不同。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖骨架，而PNA的骨架由肽键相连的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单位构成。各种不同嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。典型情况下，PNAs的描述类似肽，N-端在第一个(左侧)位置，C-端在右侧。
核酸类似物PNA已知不天然存在于地球上的现存生命中，但是它可以人工合成。它已经用于某些生物学研究和医学治疗领域中。近年来，合成的肽核酸寡聚物已用于分子生物学程序、诊断分析和反义疗法中。因为PNA的骨架不含带电荷的磷酸酯基团，由于没有静电排斥，PNA/DNA链之间的结合比DNA/DNA链之间更强。早期使用同型嘧啶链(只由一种重复的嘧啶碱基构成的链)的实验显示，6个碱基的胸腺嘧啶PNA/腺嘌呤DNA双螺旋的Tm(“解链”温度)是31℃，与此相比，等价的6个碱基的DNA/DNA双链体在低于10℃的温度下变性。混合碱基PNA分子在碱基对识别方面是DNA分子的真正模拟物。
PNA寡聚物也显示出与互补DNAs结合的更高的特异性，其中PNA/DNA碱基错配比DNA/DNA双链体中类似的错配更不稳定。这种结合强度和特异性也适用于PNA/RNA双链体。PNAs不容易被核酸酶或蛋白酶识别，使它们对酶降解具有抗性。PNAs也在宽pH范围内稳定。最后，它们不带电荷的本性使得它们较容易穿过细胞膜，这可以进一步提高它们在本发明中涉及完整细胞中融合蛋白的检测的价值。在一种情况下，由大约10到16个，例如12-15个PNA单位构成的PNA寡核苷酸被用作反应性基团寡核苷酸，任选与20-30个PNA单位构成的桥接寡核苷酸组合。在具体情况下，结合探针的PNA序列各自由10-12个与20-25个、例如21个PNA单位构成的桥接寡核苷酸互补的PNA单位构成。
在另一个实施方案中，寡核苷酸包含锁核酸(LNATM)。LNA是新型核酸类似物，含有2’-O、4’-C亚甲基桥。这种以3’-内构象锁住的桥，限制了呋喃核糖环的柔性，将结构锁定成刚性的双环形式，赋予了增强的杂交性能和杰出的生物学稳定性。
正如本技术领域的专业人员所理解的，对于反应性基团和桥接物质来说，可以使用核酸寡聚物类型(例如DNA、RNA、LNA和PNA)的各种不同组合。反应性基团与桥接物质之间特异的、高亲和性相互作用，可以通过同源双链体(例如DNA/DNA，PNA/PNA)或异源双链体(例如DNA/PNA)的形成来实现。在一个实施方案中，本发明的探针组包含至少第一种和第二种探针，每种探针具有不同的寡核苷酸作为反应性基团，其中所述核酸寡聚物是脱氧核糖核苷酸寡聚物(DNA)。这些DNA反应性基团可以被不同类型的桥接物质成簇，例如DNA(同源双链体)或PNA(异源双链体)桥接物质。可选地，反应性基团包含核糖核苷酸序列(RNA)，其可以被RNA(同源双链体)或PNA(异源双链体)桥接物质识别和结合。也可能在至少第一种探针的桥接物质与反应性基团之间使用同源双链体，在桥接物质与至少第二种探针之间使用异源双链体。例如，探针A具有PNA反应性基团，探针B具有DNA或RNA反应性基团，这两种基团都能够被PNA桥接物质成簇。
桥接寡核苷酸与所述任何一种寡核苷酸反应性基团之间的互补性范围或程度可以变化，只要它允许特异稳定的结合就行。在一个实施方案中，在反应性基团和桥接物质之间，在一段至少5个、优选至少7个连续的核酸或类似物上存在互补性(即碱基配对)。正如所了解的，第一种探针的寡核苷酸反应性基团不与第二种探针的寡核苷酸反应性基团直接反应，以避免探针的自身结合以及在连接的染料之间发生过早的能量转移。这对于确保FRET信号真实地反映并置的探针，是重要的。
在一个实施方案中，桥接物质包含与第一种寡核苷酸反应性基团的至少一部分互补的第一种序列，以及与第二种寡核苷酸反应性基团的至少一部分互补的第二种序列，其中第一和第二种序列被至少一种核酸或类似物分隔开。例如，它们相隔几个，例如1-10个，例如2、3、4或5个核酸。间隔1-3个是优选的。在另一个实施方案中，互补序列相隔一个或多个氨基酸残基，优选1-2个小氨基酸残基例如甘氨酸残基。
但是，与第一种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分互补的序列，没有间隔而直接在侧翼带有与第二种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分互补的序列，也是可能的。优选，桥接寡核苷酸的两个末端被设计成参与与寡核苷酸反应性基团的结合，以便不存在单链“游离末端”。
此外，寡核苷酸序列应该选择成使得它们不与将在其中检测融合蛋白的细胞的内源核苷酸序列发生交叉反应。因此，当设计任何用于实践本发明的序列的时候，与内源(例如人类)DNA和/或RNA序列的互补性应该被最小化或甚至完全避免，以便阻止不想要的寡核苷酸的阻断或清除。
在一个实施方案中，第一种探针例如经接头具有由序列5’-CGATTC TAT G-3’构成的反应性基团寡核苷酸，第二种探针也例如经接头具有包含序列5’-TGT ACC TTG A-3’的反应性基团寡核苷酸。该探针组可以有利地与含有序列5’-TCA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATCG-3’或由其构成的桥接寡核苷酸组合使用。但是，专业技术人员将会理解，本发明可以使用任何序列组来实践，它可以是允许在桥接物质和相应的探针之间具有足够结合强度和结合特异性的DNA、RNA、PNA或其任何组合。
分子探针能够通过其所谓的结合结构域与目标生物学分子特异性结合。在通过结合结构域将至少第一种和第二种探针与目标分子结合后，反应性基团被用于调节并置。在探针与目标分子结合后，寡核苷酸反应性基团仍保持可用于调节并置探针的空间组织。在一个实施方案中，所述目标分子是蛋白，优选为融合蛋白，更优选为致癌性融合蛋白。特别优选的是第一和第二种分子探针的探针组，其中每个探针能够识别并结合到位于所述融合蛋白的融合区域的相反一侧上的结合位点(表位)。当然，当使用其中每个探针与目标分子的不同表位(例如在融合蛋白的融合区域的C-和N-末端一侧的表位)结合的探针组时，所述不同表位应该不以分子间或分子内的方式彼此相互作用，因为这将明显地干扰探针结合。因此，探针组中的不同探针能够结合不同的、基本上不相互作用的表位。如果探针识别彼此之间短距离内的结合位点(表位)，理论上说，仅仅探针与融合蛋白或与相互作用分子的结合就能在染料之间产生能量转移。但是，通过使用桥接物质将并置的反应性基团“成簇”，可以调节染料的空间组织，使得能量转移的可能性极大地增加了。
本发明还提供了含有本发明的探针组的诊断试剂盒。在优选实施方案中，试剂盒另外含有寡核苷酸桥接物质，它具有与第一种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分互补的序列，并且其与第二种探针的寡核苷酸的至少一部分互补。例如，通过检测肿瘤特异性融合蛋白阳性细胞，这样的试剂盒可用于恶性肿瘤细胞、例如白血病细胞的监测和定量。本文提供的诊断测试试剂盒可用于在诊断时以及治疗期间或之后评估所施加的癌症治疗方案的有效性。
另一方面涉及一种方法，其使用探针组，在疾病的诊断和/或分类中，以及在疾病治疗之前、期间和之后检测融合蛋白或相互作用(蛋白质)分子的存在，以评估所述疗法的有效性。
还提供了生产本发明的探针组的方法，包括将每种探针与寡核苷酸反应性基团接触，以便在所述探针和所述反应性基团之间形成结合物，以及纯化所述结合物。反应性基团寡核苷酸可以直接或间接，例如通过间隔或接头部分与探针相连。此外，FRET染料可以直接或间接，例如通过反应性基团与探针相连。在优选实施方案中，探针包含至少一个寡核苷酸反应性基团，该反应性基团具有FRET染料(参见图3B)。寡核苷酸反应性基团可以直接或间接与探针相连。反应性基团可以在与探针结合之前或之后具有FRET染料。
在本发明的优选实施方案中，探针组包含染料-寡核苷酸结合的至少两种抗体组，每种抗体能够识别位于融合蛋白的融合区域的相反一侧上的、或不同的相互作用分子例如蛋白复合物中的蛋白上的结合位点。适合的抗体包括常规的(多克隆或单克隆抗体)或合成的抗体，或功能上与其等价的结合片段，例如Fab′、Fab、单链Fv片段、双抗体(单链Fv二体)等。例如，嵌合的融合蛋白A-B可以使用染料结合的探针组，例如抗A抗体和抗B抗体，通过FRET进行检测。在优选实施方案中，将样品与两种抗体接触，一种针对融合蛋白的A结构域，另一种针对B结构域，以检测细胞样品中A-B融合蛋白的存在。一种抗体标记(优选通过其反应性基团)有FRET供体染料，另一种标记有FRET受体染料。只有当A结构域与B结构域紧密接近时，例如当二者作为同一蛋白分子的部分时，两种抗体才变得足够靠近在一起(“并置”)，以允许供体/受体对诱导可检测的FRET荧光信号。
在本文中，术语“反应性基团”是指允许调节FRET染料的空间组织，以便能量转移发生的可能性增加和/或能量转移效率增加的部分。空间组织是指染料之间的距离以及它们的相对取向。调节空间组织包括调整和稳定染料的空间组织。能量转移发生的主要条件之一是供体和受体分子必须紧密接近，典型为10-在优选实施方案中，反应性基团允许将所述染料并置在彼此之间
Figure GPA00001140082700102
的距离之内，更优选彼此之间在
Figure GPA00001140082700103
之内，但是最优选彼此之间在的距离之内。
在本文中，术语“染料”是指取代基，它与另一种染料协力，可用于能量转移分析，例如FRET分析。正如前面提到的，FRET通常是基于都是荧光性的供体和受体染料之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明使用的探针组，其中至少一种所述染料是荧光染料。但是，非荧光受体也可以使用，FRET通过供体荧光的淬灭来检测。正如所述，通过监测供体荧光因并置探针所致的减少来检测FRET，通常不如检测受体荧光的增加灵敏。因此，在优选实施方案中，使用了至少两种荧光标记的探针来检测融合蛋白，正如在详细描述中例举的。优选的荧光染料的例子是适合通过常规的流式细胞术进行分析的，包括荧光素标记物，例如5-(和6)-羧基荧光素，5-或6-羧基荧光素，6-(荧光素)-5-(和6)-羧酰胺己酸和荧光素异硫氰酸酯，AlexaFluorTM染料例如AlexaFluor488TM或AlexaFluor 594TM，花青染料例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy7，任选被取代的香豆素，R-藻红蛋白，别藻蓝蛋白，德克萨斯红(Texas Red)和普林斯顿红(Princeston Red)，以及R-藻红蛋白与例如Cy5或德克萨斯红的结合物，以及藻胆蛋白成员。其他的有用染料是量子点染料，它能够获得几乎无限的颜色组。关于适合于通过流式细胞术进行能量转移检测的供体/受体对的深入信息，可以在Szollosi等18中找到。荧光染料的优选组合包括在经典的串联结合物中使用的染料，也被称为双彩色(duochromes)19。在优选实施方案中，探针具有可用于LightCycler技术的染料组，例如荧光素与LCRed640TM或LCRed705TM的组合。
本文还提供了用于在细胞中检测融合蛋白存在的方法，使用了至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域的相反一侧上的结合位点(通过其结合结构域)，每种探针还具有染料，其中所述染料合在一起允许能量转移，至少一种探针具有允许调节所述至少第一和所述第二种探针的并置、以便增加所述染料之间能量转移的可能性的寡核苷酸反应性基团，方法包括提供探针组，提供含有细胞的样品，将所述样品与所述探针在允许所述探针在所述融合蛋白上并置的条件下相接触，移除任何未结合的和非特异性结合的探针，以及通过FRET检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
在一个实施方案中，探针具有一个以上的寡核苷酸反应性基团，能够使所述探针与一种以上桥接物质相互作用。为探针提供一种以上反应性基团，理论上将增加所述探针与桥接物质之间相互作用的可能性。
接下来，本发明提供了用于在单细胞水平上检测融合蛋白的方法，使用了本发明的探针组，每种探针能够通过探针的结合结构域结合到位于所述融合蛋白的融合区域的相反一侧上的结合位点，即一种探针针对含有融合蛋白的N-末端片段的蛋白片段，另一种探针针对含有同一融合蛋白的C-末端片段的蛋白片段。融合蛋白包括任何种类的在融合基因转录和翻译后形成的蛋白质物质。融合基因包含一个或多个基因的一部分与另一个基因或从其衍生的部分的组合。融合蛋白可以是染色体易位、倒置或缺失的结果。在优选实施方案中，提供了用于检测肿瘤特异性融合蛋白的方法。融合蛋白可以是内源表达的蛋白，或者它可以是遗传工程的结果。可以容易地使用本发明的方法检测到的恶性肿瘤中的融合蛋白，包括但不限于表1中列出的。
使用所提出的本文公开的基于寡核苷酸的FRET方法，可以设想许多不同应用，例如：
-检测天然和致癌的融合蛋白：
-在几种白血病和实体肿瘤中出现的致癌融合蛋白
-通过基因片段的融合形成的T-细胞受体或B-细胞受体蛋白
-检测特异性T-细胞受体链的结合(例如带有Vγ9+链的Vδ2+)；
-研究蛋白复合物：蛋白复合物的所有组分都存在吗？组分连接得有多紧密？
-研究通过转录复合物(例如AML1/CBFβ核心结合因子转录复合物，它是正常造血的关键调节物)的基因调控；
-研究蛋白复合物引起的转录活化(例如β-联蛋白与Tcf-1的结合诱导Wnt-靶基因的转录)；
-检测蛋白-DNA或蛋白-RNA相互作用，用于研究参与转录或翻译的蛋白；
-通过针对参与同一个相互作用过程的不同细胞类型的抗体，评估细胞-细胞相互作用。
本文公开的方法对于应用于组织切片和涂片来说，具有几个优点：
-与其他免疫组织化学染色平行应用
-与信号分割FISH(split-signal FISH)组合：在DNA水平(融合基因)和蛋白水平(融合蛋白)上检测致癌事件。
极为实用的是注意到本方法不需要破坏细胞完整性，例如制备细胞裂解液，来检测细胞内融合蛋白或分子复合物的存在。保留细胞的形态完整，允许在单细胞水平上进行分析，例如通过流式细胞术或荧光显微镜。通过流式细胞术检测FRET信号，提供了在异源群体中执行特定个体细胞的快速、多参数分析的能力。流式细胞术的主要优点在于它直接给出定量数据，并且它非常快速(结果可以在几小时内获得)。
本发明中提供的方法允许在单细胞水平上检测融合蛋白或相互作用分子。可以对包含细胞的样品进行处理，以获得材料的通透化和形态的保留。优选的处理是固定和保持细胞基质和细胞内蛋白的形态学完整，并能够使探针例如抗体最有效程度地穿透。
与例如基本上只能够用于检测细胞表面或细胞裂解液中融合蛋白或相互作用蛋白的存在的“捕获/检测”抗体方法不同，本方法允许通过免疫表型特征对存在于细胞混合物中的细胞亚组进行门控(gating)。因此，本文提供的方法允许在大量正常细胞的背景中检测稀少的恶性细胞群体。这对于检测低频率的融合阳性细胞是特别有利的，例如在治疗期间或之后检测微小残留疾病(MRD)以评估治疗效果的情况中是特别有利的。在优选实施方案中，提供的方法包括多参数流式细胞术，其鉴定和/或分离单细胞的，以在单细胞水平上检测融合蛋白的存在。为实践提供的方法所需的一切，是流式细胞术设备。重要的是，该程序可以在常规实验室中由普通专业技术人员执行。
在各种不同类型的癌症中已经描述了一百种以上不同的融合基因和融合蛋白。正如所述，提供的方法允许在单细胞水平上区分正常蛋白和畸变融合蛋白的存在。理论上，识别融合蛋白的两个不同结构域的两种抗体，可能通过结合来自于正常基因而不是融合基因的正常蛋白上的结构域，而引起背景染色。但是，在某些情况下，在靶细胞群体中，两种正常蛋白中只有一种达到了可检测的表达水平，正如通过细胞表面和/或细胞内标志物所确定的。此外，正常蛋白和融合蛋白通常在它们的细胞内表达样式上不同，经常导致不同的亚细胞定位。这意味着，两种不同正常蛋白的一致的共定位，不可能以显著水平发生。具体来说，在正常细胞中，充分产生FRET信号的一致并置的探针，即便存在的话，也将是很少的。
提供的方法包括提供含有细胞的样品，其中所述样品任选进行固定和通透化。样品可以包含从生物学样品获得的原代细胞。生物学样品可以是体液样品，包括血液、血浆、尿液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液。它也可以是组织样品、组织匀浆。样品包含培养的细胞，可以是培养的原代细胞，例如从***活检获得的肿瘤细胞。此外，样品可以包含来自已建立的实验室细胞系，例如K562、KASUMI-1、REH或CEM细胞系的培养细胞，它们可以从许多来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；在线目录见www.atcc.org)，或德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ；在线目录参见www.dsmz.de)。提供的方法适合于检测细胞中内源融合蛋白以及重组融合蛋白的存在。提供的方法也适合于检测细胞中重组蛋白和/或内源分子之间的相互作用。
为了分析含有细胞悬液的样品，优选情况下对样品进行处理，以获得材料形态的保持和通透化，以便确保目标分子与探针的足够的可接近性。处理的类型依赖于几种因素，例如依赖于使用的固定剂，固定的程度以及目标分子的类型和性质。固定可以使用固定剂例如甲醛进行。
对于在原代细胞中的检测来说，特别有利的是使用附加的标志物以确定目标靶细胞群体。传染性疾病中的许多重要生物学应用，MRD检测和监测，以及基因疗法，通常都需要从大量其他细胞的“背景”中分析和分离稀少细胞(例如造血干细胞/祖细胞)。在本发明的一个实施方案中，方法包括对样品的至少一种细胞标志物、例如细胞表面标志物或细胞内标志物进行染色，以便确定细胞混合物中的靶细胞群体，染色方法包括将所述样品与能够选择性结合所述标志物的化合物相接触。在优选实施方案中，这样的化合物直接加有荧光染料标签。适合的化合物包括荧光标记的抗体或功能上与其等价的结合片段。此外，可以使用能够选择性结合细胞标志物的化合物，它们可以使用染料结合的第二试剂(例如荧光标记的第二抗体)来检测。细胞标志物包含任何种类的可用于在细胞混合物中辨别细胞亚群体的细胞内或膜结合标志物。细胞混合物包含活细胞。它也包含通透化的和/或固定的细胞。细胞标志物可以是分化(CD)抗原簇。CD标志物是尤其在造血细胞上能够用单克隆抗体辨别的细胞表面分子。造血细胞包括胸腺细胞、树突状细胞、朗格汉斯(Langerhans′)细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红细胞、生殖中心B细胞、滤泡树突状细胞、浆细胞和骨髓细胞。例如，适合的细胞标志物包括CD1、CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD20、CD33、CD34和CD117。针对大量人类CD标志物的单克隆抗体可以从不同的供应商获得，例如从BD Biosciences或AncellImmunology Research Products，Bayport，USA获得。通常，可获得的抗体已直接与选择的荧光染料例如CD10-PE或CD19-FITC结合，这明显是实践本发明的方法的优选选择。
在优选实施方案中，提供了使用多参数流式细胞术/细胞分拣技术鉴定和/或分离稀少单细胞、以及通过目标融合蛋白的存在或不存在或通过相互作用分子的鉴定对这些细胞进一步进行表征的方法。这样的方法特别适合应用于免疫***发育、感染性疾病、癌症和基因疗法中的许多重要难题。典型情况下，在用探针组对细胞样品进行染色之前，按照标准程序将细胞用至少一种相关的染料结合的抗体进行标记，以便确定靶细胞群体。染料的选择应该优选，但不是排他地旨在除了FRET染料之外，使用两种或三种用于免疫分型的染料。例如本发明的FRET探针组，可以与另一种通过免疫表型特征来介导白细胞亚类门控的染料组合，所述特征例如用于精确确定骨髓中前体B细胞亚类的CD10、CD19和CD20，或用于确定胸腺细胞亚类的CD1、CD4和CD8，或用于鉴定干细胞/前体细胞群体的CD34和/或CD117。正如在本文的详细说明书中显示的，本发明提供了允许在非常小的细胞亚类中检测细胞内融合蛋白、即检测MRD的方法，这对于评估癌症治疗的有效性是必需的。
附图说明
图1、由基因A的上游(5′)部分和基因B的下游(3′)部分构成的融合基因的示意图。该A-B融合基因被转录成A-B mRNA，并翻译成A-B融合蛋白。
图2、荧光共振能量转移(FRET)原理的示意图，荧光染料X作为供体染料，Y作为受体染料。
A.如果X与Y之间的距离太大，受体染料Y将不被供体染料X的发射光激发。B.如果供体与受体染料之间的距离足够小(＜80埃，但优选＜50埃)，供体染料X的发射光将激发受体染料Y。
图3、描绘了使用寡核苷酸(例如DNA/PNA)分子紧密和稳定地连接两种抗体的示意图。当这两种抗体由于被结合到融合蛋白A-B的两个配偶体上而彼此紧密接近时，与寡核苷酸A和B二者部分互补的桥接物质寡核苷酸C，将减小和稳定两种荧光染料X与Y之间的距离，因此可以检测到FRET信号。A.供体和受体荧光染料直接结合到抗体探针上。B.供体和受体荧光染料结合到寡核苷酸反应性基团上。寡核苷酸反应性基团通过接头部分连接到抗体探针上。
图4、显示了在反应性基团寡核苷酸A、反应性基团寡核苷酸B、反应性基团寡核苷酸A和B的组合，或A和B与桥接寡核苷酸C的组合的情况下，检测到的荧光的结果。箭头指示了通过添加互补性桥接寡核苷酸C诱导的FRET信号。详细情况参见下面的实施例。
实施例
按照标准程序合成了下列寡核苷酸：
反应性基团寡核苷酸A：接头CGA TTC TAT G荧光素
反应性基团寡核苷酸B：Alexa-TGT ACC TTG A-接头
桥接寡核苷酸C：TCA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATC G
将10pmol不同寡核苷酸的PNA混合在200μL pH7.2的磷酸盐缓冲液中，并测量它们的荧光。当添加PNA寡核苷酸C时，杂交在5分钟内完成，结果参见图4。
仪器：Perkin Elmer LS 55
激发波长：荧光素：：485nm，Alexa 546：546nm。
激发狭缝5nm  发射狭缝10nm。
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序列表
<110>鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心
 
<120>改进的FRET探针及其应用
 
<130>SCT102252-60
 
<140>PCT/NL2008/050737
<141>2008-11-21
 
<150>US 61/004,112
<151>2007-11-21
 
<160>2
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>reactive group oligonucleotide A
 
<400>1
cgattctatg                                            10
 
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>reactive group oligonucleotide B
 
<400>2
tgtaccttga                                            10

Claims (19)

1.至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针具有染料，其中所述染料合在一起允许能量转移，每种探针另外具有允许所述至少第一种和第二种探针并置的反应性基团，其中所述反应性基团是寡核苷酸，并且其中所述第一种探针的寡核苷酸反应性基团不与所述第二种探针的寡核苷酸反应性基团直接反应。
2.权利要求1的探针组，其中所述第一种和第二种探针的寡核苷酸反应性基团独立地选自脱氧核糖核苷酸(DNA)寡聚体，核糖核苷酸(RNA)寡聚体，锁核酸
Figure FPA00001140082600011
和肽核酸(PNA)寡聚体，优选其中所述第一种和第二种探针的寡核苷酸反应性基团是LNA或PNA寡聚体。
3.权利要求1或2的探针组，其中染料与寡核苷酸反应性基团结合。
4.权利要求1到3任一项的探针组，其中每个所述探针具有多个反应性基团。
5.权利要求1到4任一项的探针组，其中所述探针是抗体或功能上与其等价的结合片段。
6.权利要求1到5任一项的探针组，其中所述染料的至少一种是荧光染料。
7.权利要求6的探针组，其中所述荧光染料选自荧光素异硫氰酸酯(FITC)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)，德克萨斯红(TR)，R-藻红蛋白(R-PE)，别藻蓝蛋白(APC)，藻胆蛋白成员，花青染料例如Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，Alexa Fluor染料，荧光素，LightCycler染料例如LCRed640或LCRed705，这些荧光染料的串联结合物，以及量子点染料。
8.提供权利要求1-7任一项的探针组的方法，包括将每种探针与适合的染料并与寡核苷酸反应性基团或其衍生物相接触，以在所述探针、所述染料和所述寡核苷酸之间形成结合物。
9.权利要求8的方法，包括将染料与寡核苷酸反应性基团结合。
10.用于检测细胞中融合蛋白的存在的方法，使用至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域相反一侧上的结合位点，方法包括下列步骤：
-提供权利要求1-7任一项的探针组；
-提供含有细胞的样品
-将所述样品与所述探针组接触，
-在允许所述探针在所述融合蛋白上并置的条件下
-将所述探针与桥接物质相接触，桥接物质含有能够特异性结合所述第一种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分和能够特异性结合所述第二种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分的核酸序列，以及
-通过FRET检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
11.权利要求10的方法，其中所述融合蛋白是肿瘤特异性融合蛋白。
12.用于在细胞中检测至少两种相互作用分子的方法，所述方法使用至少第一种和第二种分子探针的探针组，每种探针包含能够特异性结合不同的目标相互作用分子的结合结构域，方法包括下列步骤：
-提供权利要求1-7任一项的探针组，
-提供含有细胞的样品，
-将所述样品与所述探针组在允许所述探针在所述相互作用分子上并置的条件下相接触
-将所述探针与桥接物质相接触，桥接物质含有能够特异性结合所述第一种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分和能够特异性结合所述第二种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分的寡核苷酸序列，以及
-通过FRET检测所述探针的并置，以检测所述相互作用分子。
13.权利要求12的方法，其中至少一种所述分子是蛋白质物质、核酸、脂类分子或糖类。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中所述寡核苷酸反应性基团和桥接物质包括DNA、RNA、LNA或PNA序列，优选为LNA或PNA。
15.权利要求10到14任一项的方法，包括对所述样品的至少一种细胞标志物进行染色以确定靶细胞群，染色包括将所述样品与能够选择性结合所述细胞标志物的化合物相接触，其中所述细胞标志物优选为分化(CD)抗原簇。
16.权利要求10-15任一项的方法，包括在单细胞水平的FRET检测，优选使用流式细胞术。
17.含有权利要求1-7任一项的探针组的诊断试剂盒，优选另外包含桥接物质，桥接物质含有能够特异性结合所述第一种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分和能够特异性结合所述第二种探针的寡核苷酸反应性基团的至少一部分的寡核苷酸序列。
18.权利要求17的诊断试剂盒，其中所述桥接物质是DNA、RNA、LNA或PNA序列，优选其中寡核苷酸反应性基团和桥接物质都是LNA或PNA序列。
19.权利要求1到7任一项的探针组，权利要求10到16任一项的方法，或权利要求16或17的试剂盒，在疾病治疗之前、期间和之后对评估所述治疗的效果或对诊断和/或分类疾病的用途。
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