CN105136761A - 一种检测量子点表面多肽数量的方法 - Google Patents

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滕一万
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李进晨
王车礼
杨丽
张晨澄
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Abstract

本发明涉及纳米生物技术领域，一种检测量子点表面多肽数量的方法，(1)设计一系列不同摩尔比的荧光染料标记的多肽与量子点，所述的多肽序列包括一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，绘制峰面积比—荧光染料标记的多肽与量子点摩尔比的标准曲线；(2)在待测样品中包括一个组氨酸标签，用荧光染料标记，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，根据步骤(1)得到的标准曲线确定待测样品的多肽数量。本发明提供的可用于识别量子点表面多肽数量的方法，操作简单，可重复性高。

Description

一种检测量子点表面多肽数量的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种检测量子点多肽数量的方法。
背景技术
量子点(QDs)作为一种新型荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、颜色可调、抗光漂白和荧光寿命长等优点。这些优点弥补了传统荧光探针的不足，逐渐使其在生物分析检测方面得到了广泛应用。水溶性量子点可与寡聚组氨酸多肽之间进行金属亲和性驱动自组装，即可将功能化的多肽或蛋白偶联到QDs表面。寡聚组氨酸和QD之间的相互作用迅速而稳定。并且，QD-寡聚组氨酸多肽偶联可通过QDs与寡聚组氨酸多肽之间的摩尔比控制。
目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的CdSe/ZnS量子点。通过使用含有巯基的小分子化合物对体系进行分散，可提高QDs的稳定性。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的多肽和蛋白质能够直接与QDs表面的Zn原子结合，实现偶联。并且，QD-寡聚组氨酸多肽偶联已广泛应用于纳米生物传感器的自组装。例如，抗体偶联QDs可用于抗原的检测，QDs与多肽偶联用于水解酶的检测等。尽管金属亲和驱动的QDs自组装已经有了广泛应用，但对于QD-寡聚组氨酸多肽偶联物仍缺乏详细的色谱分析。
另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。本实验通过设计一系列不同摩尔比的荧光染料标记的多肽与量子点组成生物探针，通过毛细管电泳的分析检测，计算出相应的峰面积之比，绘制标准曲线，从而实现量子点表面结合的多肽数量的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中不能检测量子点表面结合的多肽数量的不足，提供一种检测量子点表面多肽数量的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为，一种检测量子点表面多肽数量的方法，步骤如下：
(1)设计一系列不同摩尔比的荧光染料标记的多肽与量子点，所述的多肽序列包括一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，绘制峰面积比—荧光染料标记的多肽与量子点摩尔比的标准曲线；
(2)在待测样品中包括一个组氨酸标签，用荧光染料标记，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，根据步骤(1)得到的标准曲线确定待测样品的多肽数量。
进一步地，所述的量子点为含有Zn的量子点。
作为优选，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
作为优选，所述的量子点为水溶性量子点。
作为优选，所述的荧光染料应能与量子点发生FRET。
本发明所取得的有益效果是，本发明提供的可用于识别量子点表面多肽数量的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点—多肽复合物作为纳米荧光探针在生物分析领域的应用。
附图说明
图1是ATTO590-H6和QDs在毛细管内自组装的电泳图(黑，565nm，QDs供体检测通道；灰，625nm，ATTO590受体检测通道)，(a)QDs，(b)8:1(ATTO590-H6:QDs，下同)，(c)16:1，(d)64:1，(e)ATTO590-H6。
图2是S625/S565与摩尔比(ATTO590-H6/QDs)之间的关系图(标准曲线)。
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
荧光毛细管检测量子点表面多肽(DDDLVPRGSGP9G2H6)数量
1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs
将18mgGSH，5mgKOH，250μL甲醇混匀，取40μL混合溶液加入200μL脂溶性量子点中，振荡30min。振荡结束后，加入200μL1mMNaOH，脂溶性量子点即转移到水相中。取出上层量子点，加入1mL甲醇与30μLNaCl(30mg/mL)沉淀，溶于硼酸缓冲液(pH7.4，10mM)中。反复沉淀两次，最后溶于200μL硼缓冲液(pH7.4，10mM)中。
2、多肽合成与标记
多肽DDDLVPRGSGP9G2H6采用Fmoc固相合成法合成。用HBTU/HOBt(1:1)活化Fmoc保护的氨基酸，偶联30min；用碱性溶剂20％哌啶脱保护，暴露出氨基；采用HBTU和HOBt活化下一个氨基酸上的羧基，与树脂上的氨基偶联，形成肽键；重复上述步骤，反复循环添加氨基酸，直至合成完成。再用20％哌啶脱保护，暴露出氨基，用EDC/HOBt(1:1)活化ATTO-590的羧基，进行染料的标记。用切割试剂(TFA,乙二硫醇,水和TIS,94:2.5:2.5:1,v/v)将多肽从树脂上切割下来，然后经过冰***沉淀，离心收集沉淀，经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品，具有荧光标记的多肽(ATTO590-H6)。
3、量子点生物探针在毛细管内偶联与检测
将不同摩尔比的ATTO590-H6与QDs在毛细管内自组装，经过荧光毛细管电泳分析发现，随着ATTO590-H6与QDs摩尔比的增大，FRET逐渐增强(图1)。通过对不同摩尔比条件下的ATTO590-H6受体检测通道峰面积与QDs供体检测通道峰面积比(S625/S565)，绘制出标准曲线(图2)，得出标准曲线方程y＝0.04794x-0.1026。
4、检测量子点表面多肽数量
将待检测多肽与量子点混合，通过荧光毛细管电泳检测，其得到的峰面积之比S625/S565为0.281,通过标准曲线方程y＝0.04794x-0.1026得出该量子点表面结了的多肽数量为8。
实施例2
荧光毛细管检测量子点表面多肽(DDDLVPRGSGP9G2H6)数量
1—3步骤同实施例1。
4、检测量子点表面多肽数量
将待检测多肽与量子点混合，通过荧光毛细管电泳检测，其得到的峰面积之比S625/S565为2.198，通过标准曲线方程y＝0.04794x-0.1026得出该量子点表面结了的多肽数量为48。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (5)

1.一种检测量子点表面多肽数量的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)设计一系列不同摩尔比的荧光染料标记的多肽与量子点，所述的多肽序列包括一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，绘制峰面积比—荧光染料标记的多肽与量子点摩尔比的标准曲线；
(2)在待测样品中包括一个组氨酸标签，用荧光染料标记，与量子点自组装成量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比，根据步骤(1)得到的标准曲线确定待测样品的多肽数量。
2.根据权利要求1所述的检测量子点表面多肽数量的方法，其特征在于，所述的量子点为含有Zn的量子点。
3.根据权利要求1所述的检测量子点表面多肽数量的方法，其特征在于，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
4.根据权利要求1所述的检测量子点表面多肽数量的方法，其特征在于：所述的量子点为水溶性量子点。
5.根据权利要求1所述的检测量子点表面多肽数量的方法，其特征在于：所述的荧光染料与量子点之间能发生FRET。
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