CN101868547A

CN101868547A - 包含具有差别密码子偏性的重复编码序列的杆状病毒载体

Info

Publication number: CN101868547A
Application number: CN200880108079A
Authority: CN
Inventors: A·C·贝克; W·T·J·M·C·赫尔门斯
Original assignee: Amsterdam Molecular Therapeutics AMT BV
Current assignee: Uniqure IP BV
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: US20190203183A1; PT2173888T; US20100261254A1; WO2009014445A3; KR101597695B1; US20140186926A1; HUE029744T2; DK3093345T3; EA022169B1; JP2014239686A; MX2010000944A; IL203535A; WO2009014445A2; CA2694406A1; EP3561063A1; JP5634262B2; US11306291B2; BRPI0814459A2; EP3093345B8; PL3093345T3

Abstract

本发明涉及在杆状病毒载体中使用了重复编码序列的昆虫细胞中的蛋白生产。具体地，本发明涉及可用于基因治疗的细小病毒载体的生产并涉及增加细小病毒载体生产力的病毒rep蛋白的表达的提高。

Description

包含具有差别密码子偏性的重复编码序列的杆状病毒载体

技术领域

本发明涉及医学、分子生物学和基因治疗领域。本发明涉及在杆状病毒载体中使用了重复编码序列的昆虫细胞中的蛋白生产。具体地，本发明涉及可用于基因治疗的细小病毒载体的生产并涉及增加细小病毒载体生产力的病毒rep蛋白的表达的提高。

背景技术

杆状病毒表达***因其作为真核克隆和表达载体的应用而众所周知(King，L.A.，and R.D.Possee，1992，“The baculovirus expressionsystem”，Chapman and Hall，United Kingdom；O’Reilly，D.R.，etal.，1992.Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual.New York：W.H.Freeman.)。杆状病毒表达***的优点包括所表达蛋白几乎总是可溶的、正确折叠的和具有生物学活性的等。其他优点包括蛋白表达水平高、生产更快、适于表达大分子量蛋白以及适于大规模生产。然而，在使用昆虫细胞生物反应器中的杆状病毒表达***大规模或连续生产异源蛋白时，生产水平的不稳定——也称为传代效应(passage effect)——是一个主要障碍。此效应至少部分是由杆状病毒DNA中的重复同源序列之间的重组造成的。

杆状病毒表达***也已被成功地用于生产重组腺相关病毒(AAV)载体(Urabe et al.，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943；US 6,723,551和US 20040197895)。AAV可能被认为是用于人类基因治疗的最有前途的病毒载体之一。AAV具有有效感染人类***细胞和非***细胞的能力，AAV病毒基因组整合到宿主细胞基因组的单一染色***点上，并且最重要的是，尽管AAV存在于许多人类中，但其从未与任何疾病有关。鉴于这些优点，重组腺相关病毒(rAAV)正在对血友病B、恶性黑素瘤、囊性纤维化、I型高脂蛋白血症和其他疾病的基因治疗临床试验中被评价。

为克服哺乳动物AAV生产***的问题，Urabe et al.(2002，见上文)开发出了一种昆虫细胞中的AAV生产***。为在昆虫细胞中产生AAV，必须进行某些修饰以获得三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的正确化学计量比，这倚赖于将交替使用两个剪接受***点和次优利用不能被昆虫细胞精确复制的VP2的ACG起始密码子相结合。为模仿昆虫细胞中衣壳蛋白的正确化学计量比，Urabe et al.(2002，见上文)使用一种构建体，所述构建体转录成一个不需剪接就能表达全部三种VP蛋白的单一多顺反子信使并且最上游起始密码子替换为次优起始密码子ACG。WO2007/046703公开了，通过最优化在昆虫细胞中生产的AAV衣壳蛋白的化学计量比，进一步提高了基于杆状病毒生产的rAAV载体的感染性的生产力。

为在最初由Urabe et al.(2002，见上文)开发的AAV昆虫细胞表达***中表达AAV Rep蛋白，使用一种含有两个独立Rep表达单元(一个用于Rep78，一个用于Rep57)的重组杆状病毒构建体，其中所述两个表达单元每个分别在独立的昆虫细胞启动子即ΔIE1和PolH启动子的控制下。

然而，Kohlbrenner et al.(2005，Mol.Ther.12：1217-25；WO2005/072364)报道了Urabe et al.所用的用于表达两种Rep蛋白的杆状病毒构建体存在固有的不稳定性。通过打断Urabe的原始载体中的两个Rep基因的回文方向和设计用于表达Rep52和Rep78的两种独立的杆状病毒载体，Kohlbrenner et a l.(2005，见上文)增加了所述载体的传代稳定性。然而，尽管两个独立的杆状病毒-Rep构建体的Rep78和Rep52稳定表达至少超过5代，rAAV载体的产量仍然比Urabe et al.(2002，见上文)设计的原始杆状病毒-Rep构建体低5-10倍。

在WO2007/148971中，本发明人通过使用Rep78和Rep52蛋白的单一编码序列显著地提高了昆虫细胞中rAAV载体生产的稳定性，在所述序列中对Rep78蛋白使用了一个次优起始密码子，该密码子被扫描核糖体部分跳过以使翻译起始也可发生在更下游的Rep52蛋白的起始密码子上。

然而，在昆虫细胞中包括rAAV载体在内的异源蛋白的大规模(商业)生产上仍然需要进一步提高。因此，本发明的目标是提供允许异源蛋白和细小病毒载体稳定和高产量(大规模)生产的手段和方法。

发明内容

定义

本文中所用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件在一种功能关系上的连接。当一段核酸被置于与另一段核酸序列具有一种功能关系的位置时，它就是“可操作地连接”的。例如，如果一段转录调控序列影响一段编码序列的转录，则它就与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着，相连接的DNA序列通常是连续的，并在有必要将两段蛋白编码区域连接起来时，所述相连接的DNA序列是连续的且在阅读框中。

“表达控制序列”是指一段调控与之可操作地相连的一段核苷酸序列表达的核酸序列。当一段表达控制序列控制和调控一段核苷酸序列的转录和/或翻译时，所述表达控制序列就与所述核苷酸序列“可操作地连接”。因此，一段表达控制序列可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”在最低限度上意图包括一段为了影响表达而存在的序列，也可包括其他有利组件。例如，前导序列和融合伙伴序列(fusion partner sequence)是表达控制序列。该术语还可包括将框内外不想要的可能的起始密码子从所述序列中除去的核酸序列设计。其还可包括将不想要的可能的剪接位点除去的核酸序列设计。其包括指导添加polyA尾的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，所述polyA尾即位于mRNA的3’末端的一串腺嘌呤残基，该序列被称为polyA序列。其还可被设计成可增加mRNA的稳定性。已知昆虫细胞中存在影响转录和翻译稳定性的表达控制序列如启动子以及实现翻译的序列如Kozak序列。表达控制序列具有调节与之可操作地连接的核苷酸序列从而降低或提高表达水平的性质。

本文所用的术语“启动子”或“转录调控序列”是指这样一段核酸片段，所述核酸片段具有控制一种或多种编码序列的转录的作用，它位于所述编码序列的转录起始位点的转录方向上游，并且可通过存在的DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列来进行结构性识别，所述其他DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的可直接或间接起到调控启动子转录量作用的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是一种在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“可诱导”启动子为例如通过使用化学诱导物来进行生理或发育调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定的组织或细胞类型中具有活性。

术语“基本上同一”、“基本同一”或“基本上相似”或“基本相似”意为，当两个肽序列或两个核苷酸序列在例如用缺省参数通过GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时，它们至少共有某一百分比的序列同一性，所述序列同一性如说明书其他部分所定义。GAP采用Needleman和Wunsch全序列比对算法对两个全长序列进行比对，并使匹配数最大，使空位数最小。通常采用GAP缺省参数，其空位生成罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及空位延长罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。针对核苷酸，采用的缺省计分矩阵为nwsgapdna，针对蛋白质采用的缺省计分矩阵为Blosum62(Henikoff& Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。当RNA序列被认为与DNA序列基本类似或具有一定程度的序列同一性时，可认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)相当于RNA序列中的尿嘧啶(U)，这一点已经很清楚。可以利用计算机程序通过序列比对和计分来确定序列同一性百分比，所述计算机程序例如GCG Wisconsin Package，版本10.3(购自Accelrys Inc.，9685 ScrantonRoad，San Diego，CA 92121-3752USA)或Windows开放源码软件Emboss(现行版本2.7.1-07)。或者，还可通过检索数据库例如FASTA、BLAST等来确定相似性或同一性百分比。

本发明编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列也可由它们在温和杂交条件下或优选地在严格的杂交条件下分别与SEQ ID NO.1-4的核苷酸序列杂交的能力定义。严格杂交条件在本文中被定义为允许至少约25个，优选地约50、75或100个核苷酸，最优选地约200或更多核苷酸的核酸序列在约65℃下在含有约1M盐的溶液优选6xSSC中，或在任何其他具有类似离子强度的溶液中杂交，并在65℃下在含有约0.1M或更少的盐的溶液优选0.2xSSC中，或在任何其他具有类似离子强度的溶液中洗涤的条件。优选地，所述杂交过夜进行，即至少10个小时，并且优选地洗涤进行至少1个小时并至少更换两次洗涤溶液。这些条件通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列进行特异性杂交。

温和杂交条件在本文中被定义为允许至少约50个，优选地约200或更多核苷酸的核酸序列在约45℃下在含有约1M盐的溶液优选6xSSC中，或在任何其他具有类似离子强度的溶液中杂交，并在室温下在含有约1M盐的溶液优选6xSSC中，或在任何其他具有类似离子强度的溶液中洗涤的条件。优选地，所述杂交过夜进行，即至少10个小时，并且优选地洗涤进行至少1个小时并至少更换两次洗涤溶液。这些条件通常允许具有最多至50％序列同一性的序列进行特异性杂交。本领域技术人员能够改变这些杂交条件以特异性地识别同一性在50％和90％之间变动的序列。

具体实施方式

本发明的某些方面涉及动物细小病毒，特别是依赖病毒如感染性人或猿AAV，以及它们的组分(如动物细小病毒基因组)用作用于在哺乳动物细胞中引入和/或表达核酸的载体的应用。具体地，本发明涉及这些细小病毒载体在昆虫细胞中生产时生产力的提高。

所述细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。所述细小病毒亚科的成员在本文中称为细小病毒并包括依赖病毒属。如可从它们的属名推断的，所述依赖病毒的成员是独特的，因为它们通常需要与在细胞培养中产生感染的辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染。依赖病毒属包括AAV，其通常感染人类(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(例如血清型1和4)，还包括感染其他温血动物(例如牛、犬、马和羊腺相关病毒)的相关病毒。Kenneth I.Berns，″Parvoviridae：TheViruses and Their Replication，″Chapter 69 in Fields Virology(3dEd.1996)描述了有关细小病毒和细小病毒科的其他成员的其他信息。为方便起见，本发明以AAV进行进一步例释和描述。然而，应理解，本发明不限于AAV，而是可同样地应用于其他细小病毒。

所有已知AAV血清型的基因组结构都非常相似。AAV的基因组是长度小于约5000核苷酸(nt)的线状单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)位于独特的编码非结构复制(Rep)蛋白和结构蛋白(VP)的编码核苷酸序列的侧翼。所述VP蛋白(VP1、VP2和VP3)构成衣壳。末端的145nt是自身互补和有序的从而可形成一个能量上稳定的形成T形发夹的分子内双链。这些发夹结构的功能是病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在wtAAV感染哺乳动物细胞后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子表达，所表达的两种Rep蛋白都在该病毒基因组的复制中起作用。该Rep ORF中的剪接事件实际上导致四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已证明，编码Rep78和Rep52的未剪接的mRNA在哺乳动物细胞中足以产生AAV载体。在昆虫细胞中Rep78和Rep52蛋白也足以产生AAV载体。

本文的“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)是指包含一个或多个侧翼为细小病毒或AAV反转末端重复序列(ITR)的目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体。当这种rAAV载体存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，可被复制并包装到感染性病毒粒子中。当rAAV载***于更大的核酸构建中时(如在染色体中或在另一个载体如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒中)，则所述rAAV载体通常被称为在AAV包装功能和必要辅助功能的存在下可通过复制和衣壳化被“拯救”的“前载体”。

本发明的第一方面涉及一种昆虫细胞。所述昆虫细胞至少包含编码第一氨基酸序列的第一核苷酸序列和编码第二氨基酸序列的第二核苷酸序列。优选地，所述第一和第二氨基酸序列都包含一段在所述第一和第二氨基酸序列之间具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的至少50、80、100、200、300、350或398个氨基酸的共同氨基酸序列。相比之下，在所述第一和第二氨基酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列(分别存在于所述第一和第二核苷酸序列中)具有小于95％、90％、89％、88.4％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或55％的同一性。

通常所述第一和第二氨基酸序列对所述昆虫细胞是异源的。优选地，所述第一和第二氨基酸序列中的共同氨基酸序列的至少一个是天然存在的氨基酸序列。更优选地，所述第一和第二氨基酸序列的至少一个是天然存在的氨基酸序列。最优选地，所述第一和第二氨基酸序列都是天然氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列相对在所述第二核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改进的对所述昆虫细胞的密码子使用偏性。应理解，当本文提到对昆虫细胞的密码子使用偏性时，其包括对杆状病毒感染的昆虫细胞的密码子使用偏性，具体地包括对苜蓿银纹夜蛾(autographacalifornica)多核多角体病毒(AcMNPV)感染细胞的密码子使用偏性。编码所述共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的密码子使用优选地被适应于或优化为所述昆虫宿主细胞的密码子使用。编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列对所述宿主细胞的密码子使用的适应可表示为密码子适应指数(CAI)。优选地，所述密码子使用适于含有所述第一和第二核苷酸序列的昆虫细胞。通常所述细胞为灰翅夜蛾属(Spodoptera)细胞，更优选地为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。因此所述密码子使用优选地适于草地贪夜蛾或苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)感染细胞。密码子适应指数在本文中被定义为一个基因的密码子使用相对高表达基因的密码子使用的相对适应度的量度。每个密码子的相对适应度(w)是每个密码子的使用对相同氨基酸的最丰密码子的使用的比值。CAI指数被定义为这些相对适应度值的几何平均值。不包括非同义密码子和终止密码子(依赖于遗传密码)。CAI值介于0到1之间，此值越高表明最丰密码子的比例越大(参见Sharp and Li，1987，Nucleic Acids Research 15：1281-1295；另见：Kim et al.，Gene.1997，199：293-301；zur Megede et al.，Journal of Virology，2000，74：2628-2635)。在优选的昆虫细胞中，在所述第一和第二核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的CAI之间的差值至少为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8。此外，优选地，在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的CAI为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。

在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的优选核苷酸序列是其中至少50％、75％、90％、95％、98％或99％的，优选地全部的不常见密码子或少见密码子被如表1或表2所示的编码相同氨基酸的常见密码子替换的编码序列。常见密码子在本文中被理解为如表1所示在高表达的草地贪夜蛾基因中或如表2所示在苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒感染细胞的高表达基因中编码每个具体氨基酸残基使用频率最高的密码子。常见密码子和少见密码子以外的全部密码子都是“不常见密码子”。所述不常见密码子包括“次最常见密码子”，其是指在表1或表2中频率不是最高的密码子。优选地，在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列具有至少25、50、100、200或300个全部均为常见密码子的密码子的连续延伸。通过WO 2004/059556所述的方法和通过如WO 2006/015789所述改变所述编码序列的CpG含量，所述编码序列可进一步被调整适于在昆虫宿主细胞中提高表达。应理解，这些进一步的适应可导致，在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子不都是常见密码子。

在所述昆虫细胞的一个优选实施方案中，在所述第一核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的全部密码子为依照表1或2(的任一个)的常见密码子。更优选地，在这样一个昆虫细胞中，在所述第二核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的全部密码子为依照表1或2(的任一个)的次最常见密码子，其中应理解如果所述第一核苷酸序列中的常见密码子依照表1，那么所述第二核苷酸序列中的次最常见密码子也依照表1，或者，如果所述第一核苷酸序列中的常见密码子依照表2，那么所述第二核苷酸序列中的次最常见密码子也依照表2。

密码子优化可基于如可在密码子使用数据库(参见如http://www.kazusa.or.jp/codon/)中找到的草地贪夜蛾生物体的密码子使用进行。合适的用于密码子优化的计算机程序是本领域技术人员可获得的(参见如Jayaraj et al.，2005，Nucl.Acids Res.33(9)：3011-3016；以及在互联网上)。或者，所述优化可使用相同的密码子使用数据库手工完成。

在本发明的昆虫细胞的一个实施方案中，在所述第二核苷酸序列中编码共同氨基酸序列的核苷酸序列的至少50％、60％、80％、90％或100％的密码子相对所述第一核苷酸序列中相应的密码子被改变以使所述第二核苷酸序列中的AT或GC含量最大化。

因此，在本发明一个优选的实施方案中，通过以下一种或多种方法使编码共同氨基酸序列的第一和第二核苷酸序列之间的核苷酸序列差异最大化(即，使核苷酸同一性最小化)：a)改变编码共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的密码子偏性；b)改变编码共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的密码子偏性；c)改变编码共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的GC含量；和d)改变编码共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的GC含量；

一个优选的本发明昆虫细胞的实施方案涉及在本发明昆虫细胞中产生细小病毒蛋白。具体地，在产生重组细小病毒载体，更优选地产生重组动物细小病毒载体，最优选地产生重组AAV载体的情况下，在所述昆虫细胞中产生所述细小病毒蛋白。因此，在此优选的本发明昆虫细胞的实施方案中，所述第一核苷酸序列编码细小病毒Rep52或40蛋白的氨基酸序列，所述第二核苷酸序列编码细小病毒Rep78或68蛋白的氨基酸序列。然而，应理解，本发明明确包括所述第一核苷酸序列编码细小病毒Rep78或68蛋白的氨基酸序列和所述第二核苷酸序列编码细小病毒Rep52或40蛋白的氨基酸序列的实施方案。为方便起见，在实施方案中，我们使用编码细小病毒Rep52或40蛋白的核苷酸序列作为第一核苷酸序列，使用编码细小病毒Rep78或68蛋白的核苷酸序列作为第二核苷酸序列，然而本发明明确包括这些实施方案的相反情形。由所述第一和第二核苷酸序列编码的共同氨基酸序列包括细小病毒Rep52或40蛋白的至少从第二个氨基酸到C末端最后一个氨基酸的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。优选地，所述共同氨基酸序列包括细小病毒Rep52或40蛋白的第一个氨基酸到C末端最后一个氨基酸或由这些氨基酸组成。所述细小病毒共同氨基酸序列之间的氨基酸同一性如上面对共同氨基酸序列所定义。优选地，在所述昆虫细胞中，所述细小病毒Rep蛋白是腺相关病毒(AAV)Rep蛋白。更优选地，所述第一和第二核苷酸序列编码的细小病毒Rep蛋白为相同的血清型。

编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列在本文中是指编码对于昆虫细胞中细小病毒载体的产生而言所需的且和足够的非结构性Rep蛋白如Rep78或Rep68蛋白和Rep52或Rep40蛋白的核苷酸序列。所述动物细小病毒核苷酸序列优选地来自依赖病毒，更优选地来自人或猿腺相关病毒(AAV)，最优选地来自通常感染人类(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(如血清型1和4)的AAV。一个编码动物细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的实例为SEQ ID No.7，其示出了编码Rep蛋白的血清型2 AAV的基因组序列的一部分。Rep78编码序列包括核苷酸11-1876，Rep52编码序列包括核苷酸683-1876，也分别在SEQ ID No.1和5中示出。应理解，所述Rep78和Rep52蛋白的确切分子量，以及翻译起始密码子的确切位置在不同细小病毒之间可不同。然而，本领域技术人员应知晓如何确认AAV-2以外的细小病毒的核苷酸序列的相应位置，

因此，编码细小病毒Rep52蛋白的(第一)核苷酸序列也可被定义为如下核苷酸序列：

a)其编码一个包括与SEQ ID NO.6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、88％、89％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；

b)其与SEQ ID NO.1-5和10的任一个的核苷酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性；

c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；

d)由于遗传密码的简并性，序列与(c)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。

编码细小病毒Rep78蛋白的(第二)核苷酸序列也可如是被定义为如下核苷酸序列：

a)其编码一个包括与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、88％、89％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；

b)其与SEQ ID NO.7的11-1876位的核苷酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性；

c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；

优选地，核苷酸序列编码对于昆虫细胞中的细小病毒载体的生产而言所需的且足够的动物细小病毒Rep蛋白。

为在昆虫细胞中的正确表达，如上定义的第一和第二编码核苷酸序列包括如野生型细小病毒序列的多种改造，通过应用公知的遗传工程技术例如在Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A LaboratoryManual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York.中描述的技术而实现。本领域技术人员知晓能够增加被编码蛋白产量的编码区的多种其他改造。这些改造都在本发明的范围之内。

在本发明的昆虫细胞中，所述第一和第二核苷酸序列优选地为一种核酸构建体的一部分。所述昆虫细胞可包含两种独立的核酸构建体，分别用于所述第一和第二核苷酸序列；或者所述昆虫细胞可包含既含有所述第一核苷酸序列又含有所述第二核苷酸序列的单一类型核酸构建体。

本发明的另一方面涉及含有分别编码第一和第二氨基酸序列的第一和/或第二核苷酸序列的核酸构建体，所述第一和第二氨基酸序列含有如上定义的共同氨基酸序列。优选地，所述构建体中的第一和/或第二核苷酸序列编码如上定义的细小病毒Rep蛋白。优选地，在所述构建体中，编码所述第一和第二氨基酸序列的核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。这些表达控制序列应至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。本领域技术人员知晓的在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实施本发明。以下参考文献描述了昆虫细胞中的分子工程和多肽表达的方法，例如Summers and Smith.1986.A Manual of Methods forBaculovirus Vectors and Insect Culture Procedures，TexasAgricultural Experimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.；Luckow.1991.In Prokop et al.，Cloning and Express ion ofHeterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors′Recombinant DNA Technology and Applications，97-152；King，L.A.and R.D.Possee，1992，The baculovirus expression system，Chapmanand Hall，United Kingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，New York；W.H.Freeman and Richardson，C.D.，1995，BaculovirusExpression Protocols，Methods in Molecular Biology，volume 39；US4,745,051；US2003148506和WO 03/074714。用于转录本发明的第一和第二核苷酸序列的合适的启动子包括例如多角体(PolH)、p10、p35、IE-1或ΔIE-1启动子和上述参考文献中描述的其他启动子。因为已知在哺乳动物细胞中Rep78相对于与Rep52的更低丰度表达有利于高载体产量(Liet al.，1997，J Virol.71：5236-43；Grimm et al.，1998，Hum GeneTher.9，2745-2760)，因此优选地使用一个较用于Rep52或40蛋白表达的启动子弱的启动子用于驱动Rep78或68蛋白的表达。例如，可使用较强的多角体(PolH)启动子用于Rep52或40蛋白的表达，可选择比PolH启动子弱很多的ΔIE1启动子用于驱动Rep78或68蛋白的表达。优选地，使用杆状病毒表达，在昆虫细胞中分别用于Rep52或40蛋白和Rep78或68蛋白的启动子的选择使得可优选地在感染后约20-40小时，更优选地在感染后约30-40小时，所述昆虫细胞中Rep78/68与Rep52/40的摩尔比介于1∶10至10∶1、1∶5至5∶1或1∶3至3∶1之间。Rep78和Rep52的摩尔比可通过免疫印迹确定，优选地使用识别Rep78/68和Rep52/40的共同表位的单克隆抗体，或使用如鼠抗Rep抗体(303.9，Progen，Germany；1∶50稀释)。

优选地，用于在昆虫细胞中表达本发明第一和第二核苷酸序列的核酸构建体是一种昆虫细胞相容载体。一种“昆虫细胞相容载体”或“载体”被理解为一种能够生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。生物载体的实例包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。只要与昆虫细胞相容，任何载体都可被使用。所述载体可整合到所述昆虫细胞基因组中但所述载体也可为游离的。所述载体在所述昆虫细胞中并不需永久存在，也包括瞬时游离载体。可通过任何已知的方法例如通过所述细胞的化学处理、电穿孔或感染引入所述载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是一种杆状病毒、一种病毒载体或一种质粒。在一个更优选的实施方案中，所述载体是一种杆状病毒，即所述构建体是一种杆状病毒载体。上面引用的关于昆虫细胞的分子工程的参考文献描述了杆状病毒载体和它们的应用方法。

本发明的核酸构建体还可在编码所述第一和/或第二氨基酸序列的核苷酸序列的起始密码子的上游含有一个表达控制序列，其包含SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列。与SEQ.IDNO：9的核苷酸序列具有基本同一性并会帮助增加所述第一和/或第二氨基酸序列的表达的序列为，例如，与SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％同一性的序列。

所述昆虫细胞可为适于异源蛋白生产的任何细胞。优选地，所述昆虫细胞允许杆状病毒载体的复制并可被维持培养。更优选地，所述昆虫细胞还可允许重组细小病毒载体包括rAAV载体的复制。例如，所用细胞系可来自草地贪夜蛾、果蝇(Drosophila)细胞系，或蚊细胞系，如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易被杆状病毒感染的昆虫种类的细胞，包括如Se301，SeIZD2109，SeUCR1，Sf9，Sf900+，Sf21，BTI-TN-5B1-4，MG-1，Tn368，HzAm1，Ha2302，Hz2E5，High Five(Invitrogen，CA，USA)和

(US 6,103,526；Protein Sciences Corp.，CT，USA)。

根据本发明的一种优选的昆虫细胞是一种用于重组细小病毒载体生产的昆虫细胞。该昆虫细胞，除上述“第一”和“第二”核苷酸序列或包含所述第一和第二核苷酸序列的核酸构建体之外，还含有：

a)含有至少一个细小病毒反向末端重复(ITR)核苷酸序列的第三核酸序列；和

b)含有细小病毒Cap蛋白编码序列的第四核苷酸序列，所述编码序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。

在本发明的上下文中，“至少一个细小病毒ITR核苷酸序列”被理解意为一个回文序列，其含有大部分互补、对称排列的也称为“A”、“B”和“C”区的序列。所述ITR的功能为复制起点——一个在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为反式作用复制蛋白如Rep78(或Rep68)的识别位点，所述反式作用复制蛋白识别所述回文结构和所述回文结构内部的特异序列。所述ITR序列对称性的一个例外是所述ITR的“D”区。它是独特的(在一个ITR内无互补序列)。单链DNA的切开发生在A区和D区之间的结合处。它是新DNA合成起始的区域。D区通常位于所述回文结构的一侧并为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒通常含有两个ITR序列。然而，可以设计一种ITR使结合位点在A区和D区的两条链上对称分布，所述回文结构的每侧各一个。因此在双链环形DNA模板(如质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制在两个方向上进行，且单一ITR序列足以进行环形载体的细小病毒复制。因此，一个ITR核苷酸序列可用于本发明的上下文中。然而，优选地使用两个或其他偶数个规则的ITR。最优选地，使用两个ITR序列。一种优选的细小病毒ITR是AAV ITR。出于安全原因，可能希望构建一种在第二种AAV的存在下在最初引入细胞后不能再繁殖的重组细小病毒(rAAV)载体。通过使用如US2003148506所述的具有嵌合ITR的rAAV可提供这种在受体中限制不希望的载体繁殖的安全机制。

在生产重组细小病毒(rAAV)载体的昆虫细胞中使用的核酸构建体的数量在本发明中不受限制。例如，可使用1、2、3、4、5或更多种独立构建体来依照本发明的方法在昆虫细胞中生产rAAV。如果使用了5种构建体，那么一种构建体编码AAV VP 1，另一种构建体编码AAV VP 2，再一种构建体编码AAV VP 3，又一种构建体编码如上定义的Rep蛋白，最后一种构建体含有至少一个AAV ITR。如果使用的构建体少于5种，那么所述构建体可包含至少一个AAV ITR与VP1、VP2、VP3和Rep蛋白编码序列的各种组合。

优选地使用2、3或4种构建体。如果使用两种构建体，所述昆虫细胞优选地含有：(a)如上定义的用于Rep蛋白表达的第一核酸构建体，该构建体还含有如上面(b)所定义的第四核苷酸序列(含有与至少一个用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的细小病毒Cap蛋白编码序列；另见下文)；和(B)含有如上面(a)定义的第三核苷酸序列的第三核酸构建体(含有至少一个细小病毒/AAV ITR核苷酸序列)。如果使用三种构建体，优选地使用与两种构建体时所用的结构相同的结构，除了使用独立的构建体用于衣壳蛋白表达和Rep蛋白表达。如果使用四种构建体，优选地使用与三种构建体时所用的结构相同的结构，除了使用独立的构建体用于Rep78/68蛋白表达和Rep52/40蛋白表达。每种构建体中的序列相互之间可为任意次序。例如，如果一个构建体含有ITR和一个含有编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF，则VP ORF可以位于该构建体上使得ITR序列之间的DNA复制时，VP ORF被复制或不被复制的位置。再例如，Rep编码序列和/或含有编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可以任意次序位于构建体上。应理解，同样地，所述第三、第四和其他核酸构建体优选地是昆虫细胞相容的载体，优选为如上所述的杆状病毒载体。或者，在本发明的昆虫细胞中，第一核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列以及任选的其他核苷酸序列中的一个或多个可稳定地整合到昆虫细胞的基因组中。本领域的技术人员知晓如何将核苷酸序列稳定地导入昆虫基因组中，以及如何识别在基因组中存在这种核苷酸序列的细胞。可通过例如使用含有与昆虫基因组的区域高度同源的核苷酸序列的载体来帮助整合到基因组中。将核苷酸序列引入基因组的另一种方法是使用特殊序列，如转座子。

本发明中，含有细小病毒衣壳(Cap)蛋白编码序列的第四核苷酸序列在本文中被理解为含有编码三种细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的每一种的序列。含有衣壳蛋白编码序列的第四核苷酸序列可以多种形式存在。例如可使用分别针对衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的每一种的编码序列，其中每种编码序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。然而，更优选地，第四核苷酸序列含有编码全部三种动物细小病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的单一开放阅读框，其中衣壳蛋白VP1翻译的起始密码子是非ATG的次优起始密码子，例如如Urabe et al.(2002，见上文)和WO2007/046703中所述。VP1衣壳蛋白的次优起始密码子可选自ACG、TTG、CTG和GTG，其中CTG和GTG是最优选的。用于衣壳蛋白表达的第四核苷酸序列还可含有如WO2007/046703所述的一种或多种修饰。

技术人员知晓对VP编码区的能够增加VP和病毒粒子的产量或产生其他所需效果多种其他修饰，所述其他所需效果例如为改变向性或减少病毒粒子的抗原性。这些修饰都在本发明的范围之内。优选地，本发明编码细小病毒衣壳蛋白的核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接，所述表达控制序列应至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。这类控制序列和用于在昆虫宿主细胞中表达细小病毒衣壳蛋白的其他技术和材料(如载体)已经在上面Rep蛋白部分描述过。

在本发明的一个优选的实施方案中，存在于本发明昆虫细胞中的第三核苷酸序列，即含有至少一个细小病毒(AAV)ITR的序列，还含有至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，其中优选地，所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列整合到在昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体的基因组中。优选地，至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列是用于在哺乳动物细胞中表达的序列。优选地，所述第三核苷酸序列含有两个细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列，且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于两个细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列之间。优选地，如果编码目的基因产物的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)位于两个规则ITR之间或位于经改造的具有两个D区的ITR的任一侧时，那么它会整合到在昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体中。

因此本文上面定义的第三核苷酸序列可含有一个编码至少一个在哺乳动物细胞中表达的“目的基因产物”的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。任何核苷酸序列都可被整合，以随后在用根据本发明产生的重组细小病毒(rAAV)载体转染的哺乳动物细胞中表达。可编码例如一个蛋白的核苷酸序列可表达出RNAi试剂，即能够进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RNA)。″siRNA″指小干扰RNA，它是对哺乳动物细胞无毒的短双链RNA(Elbashir et al.，2001，Nature 411：494-98；Caplenet al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47)。在一个优选的实施方案中，所述第三核苷酸序列可含有两个核苷酸序列，且每一个都编码一个在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。编码目的基因产物的两个核苷酸序列的每一个的位置都可使其可被整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。

在哺乳动物细胞中表达的目的产物可以是治疗用基因产物。治疗用基因产物可以是多肽或RNA分子(siRNA)或其他基因产物，所述其他基因产物在靶细胞中表达时可提供想要的治疗效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的细胞或补足基因缺陷(如导致酶活缺失的缺陷)。治疗用多肽基因产物的实例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL，优选为LPLS447X；参见WO 01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、视网膜色素变性GTP酶调节因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和细胞因子或白细胞介素例如IL-10、胆色素原脱氨酶(PBGD)和丙氨酸：乙醛酸转氨酶。

或者，或除此之外，作为第三基因产物，本文上面定义的第三核苷酸序列可含有编码用作标记蛋白的多肽的核苷酸序列，以测定细胞转化和表达。用于此目的的合适的标记蛋白为例如荧光蛋白GFP和选择性标记基因HSV胸苷激酶(用于HAT培养基上的选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于对潮霉素B的选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于对G418的选择)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于对甲氨蝶呤的选择)、CD20(低亲和性神经生长因子基因)。获得这些标记基因的来源和其使用方法见Sambrookand Russel(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rdedition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。另外，本文上面定义的第三核苷酸序列可含有编码可用作故障保险机制的多肽的核苷酸序列，在认为必要时，所述多肽使得可以用由本发明的重组细小病毒(rAAV)载体转导的细胞来治愈受试者。这种通常被称为***基因的核苷酸序列编码能够将前药转变为有毒物质的蛋白，所述有毒物质能够杀死表达所述蛋白的转基因细胞。这种***基因的合适的实例包括例如大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶基因或单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，在这些实例中，更昔洛韦可用作杀死受试者中转基因细胞的前药(参见例如Clair et al.，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849)。

在另一个实施方案中，一个目的基因产物可以是AAV蛋白。特别是Rep蛋白，如Rep78或Rep68，或其功能片段。编码Rep78和/或Rep68的核苷酸序列如果存在于本发明重组细小病毒(rAAV)载体的基因组中并在被所述载体转导的哺乳动物细胞中表达，则可使重组细小病毒(rAAV)载体整合到经转导的哺乳动物细胞的基因组中。Rep78和/或Rep68在rAAV转导或感染的哺乳动物细胞中的表达，可通过允许经所述重组细小病毒(rAAV)载体引入细胞的任何其他目的基因产物长期或永久地表达，而有利于所述载体的某些应用。

在本发明的重组细小病毒(rAAV)载体中，所述至少一个编码在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物的核苷酸序列，优选地与至少一个哺乳动物细胞相容的表达控制序列例如启动子可操作地连接。本领域已知许多这类启动子(见Sambrook and Russel，2001，见上文)。可使用在许多种细胞中广泛表达的组成型启动子，例如CMV启动子。然而，更优选的启动子是诱导型的、组织特异的、细胞种类特异的或细胞周期特异的。例如，对于肝脏特异性表达，启动子可选自α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、LPS(甲状腺素结合球蛋白)启动子、HCR-ApoCII杂交启动子、HCR-hAAT杂交启动子、与鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件结合的AAT启动子和载脂蛋白E启动子。其他实例包括用于肿瘤选择性——特别是神经细胞肿瘤选择性——表达的E2F启动子(Parr et al.，1997，Nat.Med.3：1145-9)或用于在单核血细胞中使用的IL-2启动子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med；185：2101-10)。

AAV能感染多种哺乳动物细胞。参见如Tratschin et al.(1985，Mol.Cell Biol.5：3251-3260)和Grimm et al.(1999，Hum.Gene Ther.10：2445-2450)。然而，人类滑膜成纤维细胞的AAV转导明显比类似的鼠细胞更有效(Jennings et al.，Arthritis Res，3：1，2001)，且AAV的细胞营养机能在各血清型中不同。参见如Davidson et al.(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：3428-3432)，该文献讨论了AAV2、AAV4和AAV5在哺乳动物CNS细胞向性和转导效率方面的不同。

可用于本发明以在昆虫细胞中生产重组AAV载体的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上有明显的同源性的基因组序列，提供一系列相同的遗传功能，产生在生理和功能上基本等价、并通过几乎相同的机制进行复制和装配的病毒粒子。对于各种AAV血清型的基因组序列和对基因组相似度的综述，参见如GenBank登陆号U89790；GenBank登陆号J01901；GenBank登陆号AF043303；GenBank登陆号AF085716；Chlorini et al.(1997，J.Vir.71：6823-33)；Srivastava et al.(1983，J.Vir.45：555-64)；Chloriniet al.(1999，J.Vir.73：1309-1319)；Rutledge et al.(1998，J.Vir.72：309-319)和Wu et al.(2000，J.Vir.74：8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本发明上下文中的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，用于本发明上下文中的AAV ITR序列源自AAV1、AAV2和/或AAV4。同样，Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，用于本发明上下文的编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的序列可选自已知的42种血清型中的任何血清型，更优选地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通过例如衣壳改组(capsid shuffling)技术和AAV衣壳文库获得的新开发的AAV样颗粒。

AAV Rep和ITR序列在大多数血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白有例如超过89％的同一性，AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间在基因组水平的总核苷酸序列的同一性为约82％(Bantel-Schaal etal.，1999，J.Virol.，73(2)：939-947)。另外，在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒方面，已知许多AAV血清型的Rep序列和ITR与其他血清型的相应序列是有效交叉互补的(即功能可替代的)。US2003148506报道了AAVRep和ITR序列与在昆虫细胞中的其他AAV Rep和ITR序列也是有效交叉互补的。

已知AAV VP蛋白决定AAV病毒粒子的细胞营养机能。不同AAV血清型的VP蛋白编码序列的保守性明显比Rep蛋白和基因的要低。Rep和ITR序列与其他血清型的相应序列交叉互补的能力可使得产生假型rAAV颗粒，该颗粒包含一种血清型(如AAV3)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(如AAV2)的Rep和/或ITR序列。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。

经修饰的“AAV”序列也可用于本发明的上下文中，如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种经修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9至少有约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如具有约75-99％核苷酸序列同一性的序列)的序列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAV ITR、Rep或VP序列。

尽管在许多方面AAV5与其他AAV血清型相似，但它与其他人类和猿AAV血清型的不同比其他已知的人类和猿血清型要大。因此，rAAV5在昆虫细胞中的生产与其他血清型的生产不同。当使用本发明的方法来生产rAAV5时，优选地，一种或多种构建体(总之在超过一种构建体的情况下)含有一个含有AAV5 ITR的核苷酸序列、一个含有AAV5 Rep编码序列的核苷酸序列(即含有AAV5 Rep78的核苷酸序列)。这种ITR和Rep序列可根据需要被修饰，以在昆虫细胞中有效生产rAAV5或假型rAAV5载体。例如可修饰Rep序列的起始密码子，可修饰或除去VP剪接位点，和/或可修饰VP1起始密码子和附近核苷酸，从而提高rAAV5载体在昆虫细胞中的生产。

本发明的另一方面涉及在昆虫细胞中生产重组细小病毒(rAAV)粒子(含有如上定义的重组细小病毒(rAAV)载体)的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：(a)在产生重组细小病毒(rAAV)载体的条件下培养如本文上面定义的昆虫细胞；和(b)回收所述重组细小病毒(rAAV)载体。在此，应理解以所述方法生产的重组细小病毒(rAAV)载体优选为一种感染性细小病毒或AAV病毒粒子，它含有重组细小病毒(rAAV)载体核酸。本领域熟知培养昆虫细胞的培养条件以及昆虫细胞培养中异源产物的生产，这些例如在上面引用的有关昆虫细胞分子工程学的参考文献中有所描述(也参见WO2007/046703)。

优选地，所述方法还包括使用抗AAV抗体(优选固定化抗体)对重组细小病毒(rAAV)载体(或含有所述载体的病毒粒子)进行亲和纯化的步骤。所述抗AAV抗体优选为单克隆抗体。一种特别合适的抗体是一种单链驼科动物(cameloid)抗体或其片段，可例如从骆驼或美洲驼获得(参见如Muyldermans，2001，Biotechnol.74：277-302)。用于AAV亲和纯化的抗体优选为一种与AAV衣壳蛋白上的表位特异结合的抗体，优选地，所述表位为在多于一种的AAV血清型的衣壳蛋白上存在的表位。例如，所述抗体可基于与AAV2衣壳的特异性结合产生或被选择，但同时它也可与AAV1、AAV3和AAV5衣壳特异性结合。

本发明的另一方面涉及一种含有如本文上面定义的第一和第二核苷酸序列的核酸构建体。

本发明的另一方面涉及在昆虫细胞中生产重组细小病毒(rAAV)粒子(含有如上定义的重组细小病毒(rAAV)载体)的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：(a)在产生重组细小病毒(rAAV)载体的条件下培养如本文上面定义的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞含有至少一种用于细小病毒Rep78/68和Rep52/40蛋白表达的核酸构建体(例如一种含有如本文上面定义的第一和第二核苷酸序列的核酸构建体)，还含有如本文上面定义的第三和第四核苷酸序列，并且其中所述用于细小病毒Rep78/68和Rep52/40蛋白表达的核酸构建体在所述昆虫细胞中产生的Rep52/40的表达水平以摩尔计高于Rep78/68的表达水平；和(b)回收所述重组细小病毒(rAAV)载体。优选地，在所述方法中所述昆虫细胞中Rep52/40与Rep78/68蛋白的摩尔比高于10∶1，优选地为至少11∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1或60∶1。所述昆虫细胞中Rep52/40与Rep78/68蛋白的摩尔比高于10∶1可有利地获得完整病毒粒子(即含有rAAV基因组)与空病毒粒子(参见如图8)的更佳比例。然而，Rep52/40与Rep78/68蛋白的摩尔比过高可导致由基因拷贝数量决定的所产生rAAV的滴度较低。因此，在一个实施方案中，Rep52/40与Rep78/68蛋白的摩尔比小于100∶1、80∶1、70∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1或20∶1。Rep78/68与Rep52/40蛋白的摩尔比可如WO2007/148971中所述通过免疫印迹确定，优选地使用一种识别Rep78/68和Rep52/40的共同表位的单克隆抗体，或使用WO2007/148971中所述的抗体。优选地，使用杆状病毒或类似的表达***，在感染后约20-40小时，更优选地在感染后约30-40小时获得如上所述的Rep52/40与Rep78/68蛋白的最小摩尔比。

存在多种手段用于增加Rep52/40蛋白相对于Rep78/68蛋白的相对表达水平。当使用既用于Rep52/40又用于Rep78/68蛋白的表达的单一转录单元时，Rep52/40和Rep78/68蛋白的编码序列可进行如下改变以在昆虫细胞中获得Rep52/40∶Rep78/68蛋白高于10∶1的摩尔比：

a)可将Rep78/68蛋白的翻译起始密码子变为如WO2007/148971中所述的次优起始密码子和/或其次优背景；

b)优选地通过核苷酸序列中的同类编码突变分别除去Rep52/40和Rep78/68基因的翻译起始位点之间的一个或多个或全部(9个)ATG。这是在例如如实施例3和SEQ ID NO：11中所述的pVD189 Rep编码序列中实现的；

c)依照鳞翅目昆虫细胞中有效翻译起始的最优起始背景5′-N N N N NN A U G A a/c/g N-3′，优化Rep52/40蛋白的翻译起始密码子的背景(如Chang et al.，1999，Virology259：369-383中所述)。

d)在Rep52/40蛋白的起始密码子的上游引入一段含有SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列的表达控制序列；

e)改进用于在昆虫细胞中表达的编码Rep52/40蛋白的编码序列部分的密码子使用偏性(如上所述)；和

f)改变Rep52/40和Rep78/68蛋白的翻译起始位点之间的编码序列部分的密码子使用，从而使其较不适于昆虫中的表达(如上所述)。本发明包括a)到f)的组合，并且优选地，a)与b)到f)中的至少一项组合。

或者，并且/或者除此之外，一个第二转录单元可用于Rep52/40蛋白的表达。从此第二转录单元实现的Rep52/40蛋白表达可通过以下一个或多个步骤提高：

a)对Rep52/40转录单元使用一个比Rep78/68单元的启动子更强的启动子(见下文)；

b)增加Rep52/40转录单元相对Rep78/68转录单元的拷贝数量；

c)改进用于在昆虫细胞中表达的编码Rep52/40蛋白的编码序列部分的密码子使用偏性(如上所述；例如SEQ ID NO：2或10)；

d)依照鳞翅目昆虫细胞中有效翻译起始的最优起始背景5′-N N N N NN A U G A a/c/g N-3′，优化Rep52/40蛋白的翻译起始密码子的背景(如Chang et al.，supra中所述)；和

e)在Rep52/40蛋白的起始密码子的上游引入一段含有SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列的表达控制序列。

其中两个独立转录单元用于Rep78/68和Rep 52/40蛋白表达的构建体的一个实例为如本文中实施例2和3中所述的pVD183构建体。本发明的另一个方面是用于产生重组细小病毒粒子(并且在所述昆虫细胞中产生的Rep52/40的表达水平以摩尔计高于Rep78/68的表达水平)的方法的核酸构建体。

应理解，以所述方法产生的重组细小病毒(rAAV)载体优选地是一种含有重组细小病毒(rAAV)载体核酸的感染性细小病毒或AAV病毒粒子。培养昆虫细胞的培养条件以及昆虫细胞培养中异源产物的产生在本领域广为人知，并且在例如上面引用的关于昆虫细胞分子工程学的参考文献中有所描述(也参见WO2007/046703)。优选地，所述方法还包括如上所述使用抗AAV抗体对重组细小病毒(rAAV)载体(或含有所述载体的病毒粒子)进行亲和纯化的步骤。

用于本发明的与第二启动子一样强或比第二启动子强的第一启动子可被定义如下。所述启动子的强度可通过在用于本发明方法的条件下获得的表达确定。在一个优选的实施方案中，所述第一启动子或第二启动子选自PolH启动子、p10启动子、碱性蛋白启动子、一种诱导型启动子或ΔE1启动子或E1启动子，或任何其他晚期或极晚期杆状病毒基因启动子。更优选地，所述第一启动子选自PolH启动子、p10启动子、碱性蛋白启动子，且其中所述第二启动子为ΔE1启动子或E1启动子，或任何其他早期或晚期杆状病毒基因启动子。优选地，本发明核酸构建体中的第一启动子为p10启动子，第二启动子为PolH启动子或4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子，第二启动子为PolH启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为p10、ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为p10启动子，第二启动子为ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为PolH启动子。最优选地，本发明核酸构建体中的第一启动子为Po1H启动子，第二启动子为ΔE1启动子。

“增强子元件”或“增强子”意图定义一段增强启动子活性(即增加所述启动子下游序列的转录速率)的序列，与启动子不同，增强子并不具有启动子活性，并且通常可不依赖于其相对启动子的位置(即启动子的上游或下游)而起作用。增强子元件在本领域中为公知的。可用于本发明的增强子元件(或其部分)的非限制性实例包括杆状病毒增强子和在昆虫细胞中发现的增强子元件。优选地，所述增强子元件在细胞中使与启动子可操作地连接的基因的mRNA表达与不存在所述增强子元件时该基因的mRNA表达相比增加至少25％，更优选地至少50％，再更优选地至少100％，最优选地至少200％。mRNA表达可通过例如定量RT-PCR测定。

本文优选地使用一种增强子元件以增强细小病毒Rep蛋白的表达。因此，在另一个优选的实施方案中，所述第一表达盒包含至少一个杆状病毒增强子元件和/或至少一个蜕皮激素应答元件。优选地所述增强子元件选自hr1、hr2、hr3、hr4和hr5。

在本说明书及其权利要求中，动词“含有”及其各种形式是以其非限制性的含义表示包括该词之后的项目，但并不排除未专门提到的项目。另外，用“一”或“一个”(不定冠词″a″或″an″)提及的要素不排除存在多个该要素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个该要素。因此“一”或“一个”(不定冠词″a″或″an″)通常是指“至少一个”。

本说明书中引用的全部专利和参考文献都以引用的方式全文纳入本文中。

给出以下实施例只是出于说明的目的，而并非意图以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1：pVD183的遗传物理图。

图2：在杆状病毒Bac.FBDSLR构建体(Urabe et al.，2002，Hum GeneTher.13(16)：1935-43)的不同世代获取的杆状病毒样品中ORF 1629基因和Rep基因的基因组拷贝的比例。基因组拷贝通过QPCR测量。

图3：在本发明的pVD183构建体的不同世代获取的杆状病毒样品中ORF 1629基因和Rep基因的基因组拷贝的比例。基因组拷贝通过QPCR测量。

图4：BacVD183的rAAV的生产。产量的下降是由存在的杆状病毒量的下降导致的。

图5：对Bac.VD183的各世代进行的ORF QPCR。

图6：Bac.VD183的若干世代的Rep表达的免疫印迹。“88”标识Bac.VD88构建体，其在WO2007/148971中被称为REP-ACG/PSC，在本文中用作对照。Rep表达的量与Bac.VD183的浓度有关。

图7：使用针对Rep蛋白的三种不同构建体：VD88、VD183和VD189进行的rAAV1生产中的粗细胞团(CLB)的Q-PCR。5∶1∶1是指生产中所用的不同杆状病毒的比例，5指Bac.VD88、Bac.VD183或Bac.VD189，第一个1指Bac.VD84(含有AAV1衣壳基因)，第二个1指含有ITR构建体的杆状病毒Bac.VD43。

图8：在对AAV衣壳特异的Llama柱中纯化三种不同的rAAV1生产中的CLB，并在纯化批次中测量基因组拷贝和总rAAV粒子。总rAAV粒子除以Q-PCR数得出此处提到的总∶全比例。5∶1∶1是指生产中所用的不同杆状病毒的比例，5指Bac.VD88、Bac.VD183或Bac.VD189，第一个1指Bac.VD84(含有AAV1衣壳基因)，第二个1指含有ITR构建体的杆状病毒Bac.VD43。

图9：Rep免疫印迹。在Bac.VD88或Bac.VD189杆状病毒的若干世代获取样品，并进行免疫印迹。对于Bac.VD189，Rep52的量始终高于Rep78的量。

图10：Rep免疫印迹。在Bac.VD183杆状病毒的若干世代的扩增中获取样品，并进行Rep免疫印迹。Bac.VD183的Rep52相对Rep78的量比Bac.VD189和Bac.VD88的高得多。

实施例

1.实施例1

1.1.材料和方法

1.1.1杆状病毒质粒构建

pFBDSLR(Urabe et al.，2002，见上文)是一种含有针对AAV2 Rep78和Rep52蛋白的2个独立表达盒的pFastBacDual表达载体(Invitrogen)，其中Rep52蛋白的表达是由polH启动子驱动的，Rep78蛋白的表达是由ΔIE启动子驱动的。将此构建体亚克隆到一种与GeneXpress BaculoKIT(Protein Sciences Corporation)相容的质粒pPSC10中。

将Rep52表达盒中的野生型Rep52编码序列替换为SEQ ID NO.2的密码子优化的Rep52编码序列以生成pPSC10Rep-52CD。

将pPSC10Rep-52CD的Rep78表达盒中的野生型Rep52编码序列替换为SEQ ID NO.3的AT优化的Rep52编码序列以生成pPSC10Rep-52CD/78AT。

将pPSC10Rep-52CD的Rep78表达盒中的野生型Rep52编码序列替换为SEQ ID NO.4的GC优化的Rep52编码序列以生成pPSC10Rep-52CD/78GC。

1.1.2重组杆状病毒生产

使用GeneXpress BaculoKIT(Protein Sciences Corporation)生产源自苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒。转染如下进行：在一个圆底14ml试管中将200μl GRACE培养基与6μlCellfectine(Invitrogen)混合，并在一个Eppendorf管中将200μlGRACE培养基与50μl病毒DNA(Protein Sciences)和2μg转移质粒(REP)混合。将Eppendorf管中的内容物加入上述试管并小心混合。室温培育30分钟之后将1,300μl GRACE加入至转染混合物中。用GRACE培养基清洗T25培养瓶中的昆虫细胞，并将转染混合物逐滴加至细胞层。在28℃培育6小时后，小心加入添加补充有10％FBS的SF900II血清，并将T25培养瓶置于28℃温箱中5天，然后收获重组杆状病毒。

1.2结果

将新设计的pPSC10Rep-52CD、pPSC10Rep-52CD/78AT和pPSC10Rep-52CD/78GC pPSC10Rep的表现与Urabe et al.(2002，见上文)的原始Rep构建体pFBDSLR进行比较。所有四种构建体都进行连续传代直至第5代。使用第2、3、4和5代Rep构建体分别结合第2、3、4和5代的在AAV ITR’s之间含有报告基因的哺乳动物表达盒的杆状病毒(AAV-LPL)和含有AAV1-Cap的昆虫细胞表达盒的杆状病毒(AAV-cap)，进行重组AAV1生产实验。WO2007/046703中描述了此处使用的AAV-LPL和AAV-Cap重组杆状病毒。用QPCR测定AAV1-LPL的产量。Urabe et al.，2002设计的原始杆状病毒(原始REP/Bac-to-Bac)的AAV产量在5次传代中迅速下降。然而，具有pPSC10Rep-52CD、pPSC10Rep-52CD/78AT和pPSC10Rep-52CD/78GC的REP表达单元的杆状病毒可在至少5代中获得稳定的AAV产量。因此，只有用含有pPSC10Rep-52CD、pPSC10Rep-52CD/78AT和pPSC10Rep-52CD/78GC构建体的杆状病毒才能在若干代(如2-5)中获得可重现的AAV-LPL产量。

2.实施例2

前人已描述过，含有针对AAV Rep78和Rep52蛋白的2个独立表达盒的杆状病毒表达载体在杆状病毒中是遗传不稳定的(参见例如WO2007/148971和Kohlbrenner et al.，2005，Mol Ther.12(6)：1217-25)。现在我们开始只对Rep52编码序列而不对Rep78编码序列应用密码子使用优化(苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)的密码子使用)从而将足够的改变引入Rep52和Rep78编码序列原先相同的部分之间以减少重组事件。我们现在证明的确就是如此。

2.1克隆

一种含有Protein Sciences Corporation的质粒pPSC10中的原始双rep表达盒的质粒pVD42被改造。pVD42含有如在原始pFBDSLR构建体(Urabe et al.，2002，Hum Gene Ther.13(16)：1935-43)中的由ΔE1启动子驱动的rep78基因和由PolH启动子驱动的rep52基因。pVD42中的rep52编码序列被替换为合成rep52编码序列，所述合成rep52编码序列中的密码子使用被调整适于苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)的密码子使用(参见表2和http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝46015)这种AcMNPV密码子优化的AAV2 rep52编码序列示于SEQ ID NO：10中。获得的含有由PolH启动子驱动的AcMNPV密码子优化的AAV2 rep52编码序列和由ΔE1启动子驱动的野生型AAV2 rep78编码序列的质粒pVD183的遗传图示于图1。

2.2结果

我们制备了pVD183质粒的重组杆状病毒克隆，并将所述杆状病毒传代10次以分析它的遗传稳定性。我们通过对所述杆状病毒的基因组和Rep52基因的QPCR，通过免疫印迹，以及通过所述杆状病毒的rAAV生产效率分析了所述构建体的遗传稳定性。同时将原始Bac.VD42杆状病毒传代至第7代用于比较。WO2007/148971中(称为原始REP/Bac-to-Bac)也提到了关于Bac.VD42(或Bac.FBDSLR)稳定性的早些时候的数据。

2.2.1QPCR

用对杆状病毒基因组的QPCR测量稳定性。一种对杆状病毒复制必需的和用于通过在pVD183和来自Protein Sciences的杆状病毒骨架之间的ORF1629和ORF603处的重组从pVD183生产BacVD183的基因的拷贝数。用QPCR测量ORF 1629(ORF)，并同样用QPCR测量所述Rep基因的拷贝数。这两种基因之间的比例应在所述杆状病毒的后续传代中保持不变。图2示出了Bac.FBDSLR极不稳定以用于比较。图3显示Bac.VD183明显更加稳定。我们注意到QPCR所用的2对引物的效率不一定相等，因此可获得不等于1的比例。然而，稳定性的一个更重要的标识是该比例应在多个世代中保持相对稳定。Bac.FBDSLR的第3代已经不够理想，因为该比例为约0.25并且只会变得更差。Bac.VD183也从约0.3开始，但在该比例附近波动，表明情况稳定。杆状病毒基因组中的缺失导致杆状病毒比具有全长基因组的杆状病毒生长得更快，因此当发生缺失时，那些克隆的生长会超过其他克隆。QPCR方法中的变动可导致图3中所示的波动。

2.2.2rAAV生产

图4示出了稳定Bac.VD183构建体的rAAV生产。较高世代的产量下降是由rAAV生产中所用的杆状病毒量的下降导致的(参见图5)。图5示出了对Bac.VD183的ORF的QPCR，这与样品中存在的杆状病毒的量直接相关。rAAV生产中所用的杆状病毒的量与所生产的rAAV的量相关。

2.2.3Rep免疫印迹

图6示出了用免疫印迹分析的在Bac.VD183的各世代中rep蛋白的表达。

3.实施例3

测定了Rep52表达水平对两个rAAV生产参数的影响。具体地，Rep52与Rep78的表达水平相比的相对表达水平影响1)以每ml粗细胞团的基因组拷贝(gc/mL CLB)表示的rAAV生产水平；和2)总rAAV病毒粒子与全rAAV病毒粒子(全rAAV病毒粒子是含有rAAV基因组拷贝的病毒粒子)的比例。对三种不同的rAAV Rep构建体比较这些参数，所述每种构建体都产生不同的Rep52表达水平并产生Rep52和rep78水平之间的不同比例。所述三种构建体为pVD88(在WO2007/148971中称为REP-ACG/PSC)、pVD183(在本文上面的实施例2中被描述)和pVD189(见下文)。

3.1pVD189的构建

通过除去Rep78和Rep52基因的翻译起始位点之间的9ATG序列，并将Rep78的ACG翻译起始密码子变为CTG来重新设计pVD88构建体。参见下面的序列。Baseclear(Leiden，The Netherlands)合成了所述新基因并将其克隆到pVD88中替换原有的Rep基因以获得pVD189。pVD189中的Rep编码序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11中。

3.2rAAV的生产

制备带有所述VD88、VD183和VD189构建体的杆状病毒，并且将这些构建体用于rAAV1的生产。通过粗细胞团(CLB)的Q-PCR测量比较rAAV生产中的VD88、VD183和VD189构建体以选出更好的rAAV生产(基因组拷贝)。图7示出了产生最低量Rep52(图9)的标准Rep构建体VD88在CLB中测得的产量约为4×10¹⁰GC/ml。产生稍高的Rep 52量(图9)的VD189的rAAV产量在CLB中测得约为9.5×10¹⁰GC/ml。产生明显更高的Rep 52量(图10)的VD183的rAAV产量在CLB中测得约为6×10¹⁰GC/ml。

一个很重要的质量参数是rAAV批次的总∶全比例。图8示出了用VD183构建体获得的总(病毒粒子)∶全(病毒粒子)的最佳比例，该VD183构建体与图9中的Bac.VD189和Bac.VD88相比具有最高的Rep52量：Rep78量。

3.2其他构建体

本发明还构建和检测了以下构建体，它们构成本发明的一部分：

构建体启动子(s) 起始密码子和编码序列

1)VD88 PolH ACG-78------------ATG-52------------*

2)VD189 PolH CTG-78---atg被除去-----ATG-52------------*

3)VD183 ΔE1 ATG-78---------------------------------*+

PolH ATG-52---SEQ ID NO：10-----------*

4)VD196 PolH CTG-78---------------ATG-52------------*

5)VD197 PolH ACG-78---atg被除去-----ATG-52------------*

6)VD197/52 P10 ACG-78---atg被除去-----ATG-52------------*+

PolH ATG-52---SEQ ID NO：10-----------*

7)VD189/52 P10 CTG-78---atg被除去-----ATG-52-----------*+

PolH ATG-52---SEQ ID NO：10-----------*

8)VD183/10 p10 ATG-78--------------------------------*+

PolH ATG-52---SEQ ID NO：10-----------*

9)VD197/52cd PolH ACG-78---atg被除去-----ATG-52-SEQ ID NO：10*

1、2、4、5、8和9具有1个用于表达Rep 78和52蛋白的转录单元。

3、6和7具有2个用于表达Rep 78和52蛋白的转录单元。

在rAAV生产中对于不同构建体的rep 78和rep 52蛋白的量和比例的粗略估计(rep78∶rep52)：

78 52

1)1 ∶1

2)1.5 ∶2

3)1 ∶20

4)5 ∶0.25

5)1 ∶5

6)0.5 ∶30

7)0.75∶30

8)5 ∶20

9)1 ∶10

表1.基于127个编码序列(33098个密码子)的草地贪夜蛾的密码子频率

编码GC比例50.58％，首字母GC比例53.42％，第二字母GC比例39.40％，第三字母GC比例58.93％

表2.基于277个编码序列(77487个密码子)的苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)的密码子使用表

编码GC比例41.86％，首字母GC比例43.60％，第二字母GC比例32.68％，第三字母GC比例49.29％

序列表

<110>阿姆斯特丹分子治疗股份有限公司

<120>包含具有差别密码子偏性的重复编码序列的杆状病毒载体

<130>P6016639PCT

<150>EP 07113257.5

<151>2007-07-26

<150>US 60/952,081

<151>2007-07-26

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>misc_feature

<223>野生型

<400>1

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194

<210>2

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>misc_feature

<223>sf9优化的

<400>2

atggagctgg tgggttggct ggtggacaag ggtatcacct ccgagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cttcctacat ctccttcaac gctgcttcca actcccgttc ccagatcaag 120

gctgctctgg acaacgctgg taagatcatg tccctgacca agaccgctcc tgactacctg 180

gtgggtcagc agcctgtgga ggacatctcc tccaaccgta tctacaagat cctggagctg 240

aacggttacg accctcagta cgctgcttcc gtgttcctgg gttgggctac caagaagttc 300

ggtaagcgta acaccatctg gctgttcggt cctgctacca ccggtaagac caacatcgct 360

gaggctatcg ctcacaccgt gcctttctac ggttgcgtga actggaccaa cgagaacttc 420

cctttcaacg actgcgtgga caagatggtg atctggtggg aggagggtaa gatgaccgct 480

aaggtggtgg agtccgctaa ggctatcctg ggtggttcca aggtgcgtgt ggaccagaag 540

tgcaagtcct ccgctcagat cgaccctacc cctgtgatcg tgacctccaa caccaacatg 600

tgcgctgtga tcgacggtaa ctccaccacc ttcgagcacc agcagcctct gcaggaccgt 660

atgttcaagt tcgagctgac ccgtcgtctg gaccacgact tcggtaaggt gaccaagcag 720

gaggtgaagg acttcttccg ttgggctaag gaccacgtgg tggaggtgga gcacgagttc 780

tacgtgaaga agggtggtgc taagaagcgt cctgctcctt ccgacgctga catctccgag 840

cctaagcgtg tgcgtgagtc cgtggctcag ccttccacct ccgacgctga ggcttccatc 900

aactacgctg accgttacca gaacaagtgc tcccgtcacg tgggtatgaa cctgatgctg 960

ttcccttgcc gtcagtgcga gcgtatgaac cagaactcca acatctgctt cacccacggt 1020

cagaaggact gcctggagtg cttccctgtg tccgagtccc agcctgtgtc cgtggtgaag 1080

aaggcttacc agaagctgtg ctacatccac cacatcatgg gtaaggtgcc tgacgcttgc 1140

accgcttgcg acctggtgaa cgtggacctg gacgactgca tcttcgagca gtaa 1194

<210>3

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>misc_feature

<223>AT优化的

<400>3

atggaattag taggatggtt agtagataaa ggaataacat cagaaaaaca atggatacaa 60

gaagatcaag catcatatat atcatttaat gcagcatcaa attcaagatc acaaataaaa 120

gcagcattag ataatgcagg aaaaataatg tcattaacaa aaacagcacc agattattta 180

gtaggacaac aaccagtaga agatatatca tcaaatagaa tatataaaat attagaatta 240

aatggatatg atccacaata tgcagcatca gtatttttag gatgggcaac aaaaaaattt 300

ggaaaaagaa atacaatatg gttatttgga ccagcaacaa caggaaaaac aaatatagca 360

gaagcaatag cacatacagt accattttat ggatgtgtaa attggacaaa tgaaaatttt 420

ccatttaatg attgtgtaga taaaatggta atatggtggg aagaaggaaa aatgacagca 480

aaagtagtag aatcagcaaa agcaatatta ggaggatcaa aagtaagagt agatcaaaaa 540

tgtaaatcat cagcacaaat agatccaaca ccagtaatag taacatcaaa tacaaatatg 600

tgtgcagtaa tagatggaaa ttcaacaaca tttgaacatc aacaaccatt acaagataga 660

atgtttaaat ttgaattaac aagaagatta gatcatgatt ttggaaaagt aacaaaacaa 720

gaagtaaaag atttttttag atgggcaaaa gatcatgtag tagaagtaga acatgaattt 780

tatgtaaaaa aaggaggagc aaaaaaaaga ccagcaccat cagatgcaga tatatcagaa 840

ccaaaaagag taagagaatc agtagcacaa ccatcaacat cagatgcaga agcatcaata 900

aattatgcag atagatatca aaataaatgt tcaagacatg taggaatgaa tttaatgtta 960

tttccatgta gacaatgtga aagaatgaat caaaattcaa atatatgttt tacacatgga 1020

caaaaagatt gtttagaatg ttttccagta tcagaatcac aaccagtatc agtagtaaaa 1080

aaagcatatc aaaaattatg ttatatacat catataatgg gaaaagtacc agatgcatgt 1140

acagcatgtg atttagtaaa tgtagattta gatgattgta tatttgaaca ataa 1194

<210>4

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1194)

<223>GC优化的

<400>4

atggagctgg tggggtggct ggtggacaag gggatcacga gcgagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cgagctacat cagcttcaac gcggcgagca acagccggag ccagatcaag 120

gcggcgctgg acaacgcggg gaagatcatg agcctgacga agacggcgcc ggactacctg 180

gtggggcagc agccggtgga ggacatcagc agcaaccgga tctacaagat cctggagctg 240

aacgggtacg acccgcagta cgcggcgagc gtgttcctgg ggtgggcgac gaagaagttc 300

gggaagcgga acacgatctg gctgttcggg ccggcgacga cggggaagac gaacatcgcg 360

gaggcgatcg cgcacacggt gccgttctac gggtgcgtga actggacgaa cgagaacttc 420

ccgttcaacg actgcgtgga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgacggcg 480

aaggtggtgg agagcgcgaa ggcgatcctg ggggggagca aggtgcgggtggaccagaag 540

tgcaagagca gcgcgcagat cgacccgacg ccggtgatcg tgacgagcaa cacgaacatg 600

tgcgcggtga tcgacgggaa cagcacgacg ttcgagcacc agcagccgct gcaggaccgg 660

atgttcaagt tcgagctgac gcggcggctg gaccacgact tcgggaaggt gacgaagcag 720

gaggtgaagg acttcttccg gtgggcgaag gaccacgtgg tggaggtgga gcacgagttc 780

tacgtgaaga aggggggggc gaagaagcgg ccggcgccga gcgacgcgga catcagcgag 840

ccgaagcggg tgcgggagag cgtggcgcag ccgagcacga gcgacgcgga ggcgagcatc 900

aactacgcgg accggtacca gaacaagtgc agccggcacg tggggatgaa cctgatgctg 960

ttcccgtgcc ggcagtgcga gcggatgaac cagaacagca acatctgctt cacgcacggg 1020

cagaaggact gcctggagtg cttcccggtg agcgagagcc agccggtgag cgtggtgaag 1080

aaggcgtacc agaagctgtg ctacatccac cacatcatgg ggaaggtgcc ggacgcgtgc 1140

acggcgtgcg acctggtgaa cgtggacctg gacgactgca tcttcgagca gtaa 1194

<210>5

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1194)

<223>Rep52

<400>5

atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc tcg gag aag 48

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc aat gcg gcc 96

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat gcg gga aag 144

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg ggc cag cag 192

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

ccc gtg gag gac att tcc agc aat cgg att tat aaa att ttg gaa cta 240

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg gga tgg gc 288

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg ttt ggg cct gca 336

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac act gtg ccc 384

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc ttc aac gac 432

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag atg acc gcc 480

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc aag gtg cgc 528

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg act ccc gtg 576

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac ggg aac tca 624

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg ttc aaa ttt 672

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc acc aag cag 720

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg gtt gag gtg 768

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa aga ccc gcc 816

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc gag tca gtt 864

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac tac gca gac 912

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

cgc tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat ctg atg ctg 960

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

305 310 315 320

ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca aat atc tgc 1008

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

325 330 335

ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc gtg tca gaa 1056

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

340 345 350

tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa ctg tgc tac 1104

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

355 360 365

att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act gcc tgc gat 1152

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

370 375 380

ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa taa 1194

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

385 390 395

<210>6

<211>397

<212>PRT

<213>腺相关病毒2

<400>6

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

305 310 315 320

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

325 330 335

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

340 345 350

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

355 360 365

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

370 375 380

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

385 390 395

<210>7

<211>1876

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>CDS

<222>(11)..(1876)

<223>Rep78

<400>7

cgcagccgcc atg ccg ggg ttt tac gag att gtg att aag gtc ccc agc 49

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser

1 5 10

gac ctt gac gag cat ctg ccc ggc att tct gac agc ttt gtg aac tgg 97

Asp Leu Asp Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp

15 20 25

gtg gcc gag aag gaa tgg gag ttg ccg cca gat tct gac atg gat ctg 145

Val Ala Glu Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu

30 35 40 45

aat ctg att gag cag gca ccc ctg acc gtg gcc gag aag ctg cag cgc 193

Asn Leu Ile Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg

50 55 60

gac ttt ctg acg gaa tgg cgc cgt gtg agt aag gcc ccg gag gcc ctt 241

Asp Phe Leu Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu

65 70 75

ttc ttt gtg caa ttt gag aag gga gag agc tac ttc cac atg cac gtg 289

Phe Phe Val Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val

80 85 90

ctc gtg gaa acc acc ggg gtg aaa tcc atg gtt ttg gga cgt ttc ctg 337

Leu Val Glu Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu

95 100 105

agt cag att cgc gaa aaa ctg att cag aga att tac cgc ggg atc gag 385

Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu

110 115 120 125

ccg act ttg cca aac tgg ttc gcg gtc aca aag acc aga aat ggc gcc 433

Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala

130 135 140

gga ggc ggg aac aag gtg gtg gat gag tgc tac atc ccc aat tac ttg 481

Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu

145 150 155

ctc ccc aaa acc cag cct gag ctc cag tgg gcg tgg act aat atg gaa 529

Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu

160 165 170

cag tat tta agc gcc tgt ttg aat ctc acg gag cgt aaa cgg ttg gtg 577

Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val

175 180 185

gcg cag cat ctg acg cac gtg tcg cag acg cag gag cag aac aaa gag 625

Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu

190 195 200 205

aat cag aat ccc aat tct gat gcg ccg gtg atc aga tca aaa act tca 673

Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser

210 215 220

gcc agg tac atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc 721

Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr

225 230 235

tcg gag aag cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc 769

Ser Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe

240 245 250

aat gcg gcc tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat 817

Asn Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn

255 260 265

gcg gga aag att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg 865

Ala Gly Lys Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val

270 275 280 285

ggc cag cag ccc gtg gag gac att tcc age aat cgg att tat aaa att 913

Gly Gln Gln Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile

290 295 300

ttg gaa cta aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg 961

Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu

305 310 315

gga tgg gcc acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg tt 1009

Gly Trp Ala Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe

320 325 330

ggg cct gca act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac 1057

Gly Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His

335 340 345

act gtg ccc ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc 1105

Thr Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro

350 355 360 365

ttc aac gac tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag 1153

Phe Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys

370 375 380

atg acc gcc aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc 1201

Met Thr Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser

385 390 395

aag gtg cgc gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg 1249

Lys Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro

400 405 410

act ccc gtg atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac 1297

Thr Pro Val Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp

415 420 425

ggg aac tca acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg 1345

Gly Asn Ser Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met

430 435 440 445

ttc aaa ttt gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc 1393

Phe Lys Phe Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val

450 455 460

acc aag cag gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg 1441

Thr Lys Gln Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val

465 470 475

gtt gag gtg gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa 1489

Val Glu Val Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys

480 485 490

aga ccc gcc ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc 1537

Arg Pro Ala Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg

495 500 505

gag tca gtt gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac 1585

Glu Ser Val Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Ash

510 515 520 525

tac gca gac agg tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat 1633

Tyr Ala Asp Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn

530 535 540

ctg atg ctg ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca 1681

Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser

545 550 555

aat atc tgc ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc 1729

Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro

560 565 570

gtg tca gaa tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa 1777

Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys

575 580 585

ctg tgc tac att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act 1825

Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr

590 595 600 605

gcc tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873

Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

610 615 620

taa 1876

<210>8

<211>621

<212>PRT

<213>腺相关病毒2

<400>8

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp

1 5 10 15

Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu

20 25 30

Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile

35 40 45

Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu

50 55 60

Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val

65 70 75 80

Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu

85 90 95

Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu

115 120 125

Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys

145 150 155 60

Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu

165 170 175

Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His

180 185 190

Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn

195 200 205

Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

225 230 235 240

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

245 250 255

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

260 265 270

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

275 280 285

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn ArgIle Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

290 295 300

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

305 310 315 320

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

340 345 350

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

355 360 365

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

370 375 380

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

385 390 395 400

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

405 410 415

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

420 425 430

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

435 440 445

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

450 455 460

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

465 470 475 480

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

485 490 495

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

500 505 510

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

515 520 525

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

530 535 540

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

545 550 555 560

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

565 570 575

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

580 585 590

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

595 600 605

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

610 615 620

<210>9

<211>9

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<400>9

cctgttaag 9

<210>10

<211>1194

<212>DNA

<213>腺相关病毒2

<220>

<221>misc_feature

<223>AcMNPV优化的Rep 52编码序列

<400>10

atggaattgg tcggttggtt ggtggacaag ggtattacct cggagaagca atggatacaa 60

gaagatcaag cctcatacat ctcgtttaat gcggcatcca actcgcgtag ccaaatcaaa 120

gctgccttgg acaatgcggg caagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc aacccgtgga agacatttcc agcaatcgca tctataagat tttggagtta 240

aacggctacg atcctcaata tgcggcttcc gtatttttgg gctgggcgac gaaaaagttt 300

ggcaaaagaa acaccatttg gttgtttgga cctgcaacta cgggaaaaac aaacatagcg 360

gaggccatag cccacactgt acctttttat ggctgcgtta actggaccaa tgagaacttt 420

ccattcaacg actgtgtcga caagatggtt atttggtggg aggaaggcaa aatgaccgct 480

aaagtcgtgg agtcggccaa agcaatttta ggaggcagca aagtgcgcgt agaccagaaa 540

tgcaaaagct ctgcgcagat agacccgaca ccggtgatcg ttacaagcaa cacgaacatg 600

tgcgccgtga ttgacggtaa cagtacgaca ttcgaacacc aacaaccgtt gcaagaccga 660

atgttcaaat ttgaattgac gcgccgactg gatcatgatt ttggcaaggt aacaaaacaa 720

gaagtcaaag acttctttcg ttgggcaaag gatcacgttg ttgaagtgga acatgaattt 780

tacgtcaaaa aaggtggtgc taagaaaaga cccgccccga gtgatgcaga tataagtgag 840

cccaaacgag tgagagaatc ggttgcgcag ccaagcacgt cagatgcgga agcttcgata 900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg taggcatgaa cttaatgttg 960

tttccctgca gacaatgtga gagaatgaat cagaatagta atatctgttt cactcacggc 1020

cagaaagact gtttagaatg ctttccggtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtaaaa 1080

aaggcgtatc aaaaattatg ctatattcat catatcatgg gaaaagtgcc agacgcttgt 1140

actgcctgcg atctggttaa tgtggatttg gatgactgta tctttgaaca ataa 1194

<210>11

<211>1866

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>pVD189 Rep编码序列

<400>11

ctggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg agtgggagtt gccgccagat 120

tctgacttgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggagtg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac ttacacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccttag ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaacggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggacgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatttagaac agtatttaag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgacgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataa 1866

Claims

1.一种含有编码第一氨基酸序列的第一核苷酸序列和编码第二氨基酸序列的第二核苷酸序列的昆虫细胞，其中所述第一和第二氨基酸序列包含一段在所述第一和第二氨基酸序列之间具有至少90％氨基酸同一性的至少100个氨基酸的共同氨基酸序列，其中编码所述第一和第二氨基酸序列中的共同氨基酸序列的核苷酸序列的同一性小于90％，其中所述第一核苷酸序列编码细小病毒Rep52或40蛋白的氨基酸序列，所述第二核苷酸序列编码细小病毒Rep78或68蛋白的氨基酸序列，并且其中所述共同氨基酸序列包含细小病毒Rep52或40蛋白的从第二个氨基酸到C末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的昆虫细胞，其中所述第一和第二氨基酸序列中的共同氨基酸序列具有至少99％的氨基酸同一性，优选地具有100％的氨基酸同一性。

3.根据权利要求1或2的昆虫细胞，其中在所述第一核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列相对于在所述第二核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改进的对所述昆虫细胞的密码子使用偏性，或者其中在所述第二核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列相对于在所述第一核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改进的对所述昆虫细胞的密码子使用偏性。

4.根据权利要求3的昆虫细胞，其中在所述第一和第二核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列之间的密码子适应指数的差值至少为0.2。

5.根据前述权利要求任一项的昆虫细胞，其中在所述具有改进的密码子使用偏性的核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列包含至少25个全部为依照表1或表2的常见密码子的密码子连续延伸。

6.根据权利要求5的昆虫细胞，其中在所述具有改进的密码子使用偏性的核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列中的全部密码子都是符合表1或表2的常见密码子，并且其中优选地，在另一核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列中的全部密码子都是依照表1或表2的次最常见密码子。

7.根据权利要求1-5任一项的昆虫细胞，其中在所述第二核苷酸序列中编码所述共同氨基酸序列的核苷酸序列中的至少50％的密码子相对于所述第一核苷酸序列中相应的密码子被改变以使所述第二核苷酸序列中的AT或GC含量最大化。

8.根据前述权利要求任一项的昆虫细胞，其中所述第一和第二核苷酸序列是一个核酸构建体的一部分，其中所述第一和第二核苷酸序列每个都与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。

9.根据权利要求8的昆虫细胞，其中所述第一和第二核苷酸序列是单个核酸构建体的一部分。

10.根据前述权利要求任一项的昆虫细胞，其中所述细小病毒Rep蛋白是腺相关病毒(AAV)Rep蛋白。

11.根据权利要求10的昆虫细胞，其中所述第一和第二核苷酸序列编码的细小病毒Rep蛋白为相同的血清型。

12.根据权利要求1-11任一项的昆虫细胞，其中所述第一核苷酸序列编码一种细小病毒Rep52蛋白，并选自：

a)一段编码一种包含与SEQ ID NO.6的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

b)一段与SEQ ID NO.1-5和10的任一个的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列；

c)一段其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交的核苷酸序列；和

d)一段由于遗传密码的简并性而序列与(c)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列，

并且其中所述第二核苷酸序列编码一种细小病毒Rep78蛋白，并选自：

a)一段编码一种包含与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

b)一段与SEQ ID NO.7的11-1876位的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列；

c)一段其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交的核苷酸序列；

d)一段由于遗传密码的简并性而序列与(c)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。

13.根据权利要求1-12任一项的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞还包含：

a)一段含有至少一段细小病毒反向末端重复(ITR)核苷酸序列的第三核酸序列；和

b)一段含有与用于昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的细小病毒衣壳蛋白编码序列的第四核苷酸序列。

14.一种根据权利要求13的昆虫细胞，其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列的一个或多个是一个核酸构建体的一部分，所述核酸构建体是一种昆虫细胞相容的载体，优选地为一种杆状病毒载体。

15.根据权利要求13或14的昆虫细胞，其中所述第三核苷酸序列还含有至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，并且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列被整合到在昆虫细胞中产生的细小病毒载体的基因组中。

16.根据权利要求15的昆虫细胞，其中所述第三核苷酸序列含有两个细小病毒ITR核苷酸序列，且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于所述两个细小病毒ITR核苷酸序列之间。

17.根据权利要求13-16任一项的昆虫细胞，其中所述第一、第二序列、第三和第四核苷酸序列中的至少一个被稳定地整合到所述昆虫细胞的基因组中。

18.根据权利要求13-17任一项的昆虫细胞，其中所述细小病毒为AAV。

19.一种在昆虫细胞中生产重组细小病毒粒子的方法，包括以下步骤：

a)在产生重组细小病毒粒子的条件下培养如权利要求13-18任一项定义的昆虫细胞；和

b)回收所述重组细小病毒粒子。

20.根据权利要求19的方法，还包括使用一种固定化抗细小病毒抗体，优选一种单链驼科动物抗体或其片段亲和纯化所述病毒粒子的步骤。

21.根据权利要求19或20的方法，其中所述重组细小病毒粒子是重组AAV病毒粒子。

22.一种核酸构建体，所述核酸构建体含有如权利要求1-12任一项定义的第一和第二核苷酸序列。

23.一种在昆虫细胞中生产重组细小病毒粒子的方法，包括以下步骤：

a)在产生重组细小病毒(rAAV)载体的条件下培养一种昆虫细胞，其中所述昆虫细胞含有至少一种用于细小病毒Rep78或68蛋白和细小病毒Rep52或40蛋白表达的核酸构建体，并且还含有如权利要求13-18定义的第三和第四核苷酸序列，并且其中所述至少一种用于细小病毒Rep78或68蛋白和Rep52或40蛋白表达的核酸构建体在所述昆虫细胞中产生的Rep52或40蛋白与Rep78或68蛋白的摩尔比高于10∶1；和

b)回收所述重组细小病毒(rAAV)载体。

24.根据权利要求23的方法，其中所述用于细小病毒Rep78或68蛋白和Rep52或40蛋白表达的核酸构建体是一种含有既用于细小病毒Rep78或68蛋白表达又用于细小病毒Rep52或40蛋白表达的单一编码序列的核酸构建体，并且其中所述编码序列包含一个或多个以下特征：

a)用于细小病毒78或68蛋白翻译的起始密码子是一个可在昆虫细胞表达时实现部分外显子跳跃的起始密码子；

b)位于Rep78或68和Rep52或40蛋白的翻译起始位点之间的一个、多个或全部ATG序列被除去；

c)依照鳞翅目昆虫细胞中有效翻译起始的最优起始背景5′-N N N NN N A U G A a/c/g N-3′，优化Rep52或40蛋白的翻译起始密码子的背景；

d)一段包含SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列的表达控制序列存在于Rep52或40蛋白的起始密码子的上游；和

e)编码Rep52或40蛋白的编码序列部分相对于Rep78/68和Rep52/40蛋白的翻译起始位点之间的编码序列部分具有改进的对所述昆虫细胞的密码子使用偏性。

25.根据权利要求23或24的方法，其中所述昆虫细胞含有一个细小病毒Rep52或40蛋白的另外的编码序列，该序列与一个驱动所述编码序列在所述昆虫细胞中表达的启动子可操作地连接，并且其中细小病毒Rep52或40蛋白的编码序列包含一个或多个以下特征：

a)Rep52或40蛋白编码序列的启动子比Rep78或68蛋白编码序列的启动子更强；

b)Rep52或40蛋白编码序列的拷贝数比Rep78或68蛋白编码序列的拷贝数更高；

c)用于在昆虫细胞中表达的Rep52或40蛋白编码序列的密码子使用偏性得到改进；

d)依照鳞翅目昆虫细胞中有效翻译起始的最优起始背景5′-N N N NN N A U G A a/c/g N-3′，优化Rep52或40蛋白的翻译起始密码子的背景；

d)一段包含SEQ.ID NO：9的9核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列的表达控制序列，存在于Rep52或40蛋白的起始密码子的上游。