JP7496667B2 - 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年4月21日出願の米国仮出願第62/325,817号に対して利益および優先権を主張する。同出願第62/325,817号はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一部である配列表は、コンピュータ可読形式と、ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列を含む書面での配列表とを含む。コンピュータ可読形式で記録された配列表情報は、書面での配列表と同一である。配列表の主題は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
最初のアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介遺伝子治療薬の承認を得て、AAVベクターを大規模に製造する技術への要望が高まっている(Yla-Herttuala,S., Mol.Ther.20,1831-1832,2012)。現在、AAVを生成するためのいくつかの技術がある。従来の方法は、三重または二重のプラスミドによるHEK293細胞または他の哺乳動物細胞株のトランスフェクションを利用している。この方法はAAVの収率が低く、それが接着細胞を必要とするためにスケールアップが難しい(Xiao,X., Li,J.& Samulski,R.J., J.Virol.72,2224-2232,1998)。AAVを生成するための別の方法は、哺乳動物細胞を感染させるために単純ヘルペス(Herpes Simplex)ウイルス(HSV)を利用する。この方法は、HSV種を十分に生成する上での困難によって妨げられ、AAV生産性も低い(Booth,M.J.,ら,Gene Ther. 11,829-837,2004)。
hr1:ATCGATGATT GACCCCAACA AAAGATTTAT AATTAATCAT AATCACGAAC AACAACAAGT CAATGAAACA AATAAACAAG TTGTCGATAA AACATTCATA AATGACACAG CAACATACAA TTCTTGCATA ATAAAAATTT AAATGACATC ATATTTGAGA ATAACAAATG ACATTATCCC TCGATTGTGT TTTACAAGTA GAATTCTACC CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATT TGTATAATGA CATCATCCCC TGATTGTGTT TTACAAGTAG AATTCTATCC GTAAAGCGAG TTCAGTTTTG AAAACAAATG AGTCATACCT AAACACGTTA ATAATCTTCT GATATCAGCT TATGACTCAA GTTATGAGCC GTGTGCAAAA CATGAGATAA GTTTATGACA TCATCCACTG ATCGTGCGTT ACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCCAGTT CGGTTATGAG CCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA CTCATACTTG ATTGTGTTTT ACGCGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCGAGTT CGGTTATGAG CCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA GTCATAATTA ATCGTGCGTT ACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCGAGTT GAAGGATCAT ATTTAGTTGC GTTTATGAGA TAAGATTGAA AAGCGTGTAA AATGTTTCCC GCGCTTGGCA CAACTATTTA CAATGCGGCC AAGTTATAAA AGATTCTAAT CTGATATGTT TTAAAACACC TTTGCGGCCC GAGTTGTTTG CGTACGTGAC TAGCGAAGAA GATGTGTGGA CCGCAGAACA GATAGTAAAA CAAAACCCTA GTATTGGAGC AATAATCGAT(配列番号1)
hr2:TGAGCAAAAC ACAACCGGCA AATTCTCGGC GGCCGTTTGG GAATGCGGAA TAATTGCCAT ATGTAAATGA TGTCATCGGT TCTAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACG TGTAAAACAT AATCAAGAGA TGATGTCATT TGTTTTTCAA AACTGAACTC AAGAAATGAT GTCATTTGTT TTTCAAAACT GAACTGGCTT TACGAGTAGA ATTCTACTTG TAAAACACAA TCGAGAGATG ATGTCATATT TTGCACACGG CTCTAATTAA ACTCGCTTTA CGAGTAAAAT TCTACTTGTA ACGCATGATC AAGGGATGAT GTCATTGGAT GAGTCATTTG TTTTTCAAAA CTAAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACT TGTAAAACAC AATCAAGGGA TGATGTCATT ATACAAATGA TGTCATTTGT TTTTCAAAAC TAAACTCGCT TTACGGGTAG AATTCTACTT GTAAAACAGC AACTCGAGGG ATGATGTCAT CCTTTACTCG ATGATTATAA ACGTGTTTAT GTATGACTCA TTTGTTTTTC AAAACTAAAC TCGCTTTACG AGTAGAATTC TACTTGTAAC GCACGATCAA GGGATGATGT CATTTATTTG TGCAAAGCTC GATGTCATCT TTTGCACACG ATTATAAACA CAATCCAAAT AATGACTCAT TTGTTTTCAA AACTGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCAAGG GATGATGTCA TTTTCAAAAT GATGTCATTT GTTTTTCAAA ACTAAACTCG CTTTACGAGT AGAATTCTAC TTGTAAAACA CAATCAAGGG ATGATGTCAT TTTAAAAATG ATCATTTGTT TTTCAAAACT AAACTCGCTT TACGAGTAGA ATTCTACGTG TAAAACACAA TCAAGGGATG ATGTCATTTA CTAAATAAAA TAATTATTTA AATAAAACTG TTTTTTATTG TCAAATACAC ATTGATTCAC(配列番号2)
hr3:ACGCGTAGAA TTCTACTTGT AAAGCAAGTT AAAATAAGCC GTGTGCAAAA ATGACATCAG ACAAATGACA TCATCTACCT ATCATGATCA TGTTAATAAT CATGTTTTAA AATGACATCA GCTTATGACT AATAATTGAT CGTGCGTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAA AGCGAGTTTA GTTTTGAAAA CAAATGAGTC ATCATTAAAC ATGTTAATAA TCGTGTATAA AGGATGACAT CATCCACTAA TCGTGCGTTA CAAGTAGAAT TCTACTCGTA AAGCGAGTTC GGTTTTGAAA AACAAATGAC ATCATTTCTT GATTGTGTTT TACACGTAGA ATTCTACTCG TAAAGTATGT TCAGTTTAAA AAACAAATGA CATCATTTTA CAGATGACAT CATTTCTTGA TTATGTTTTA CAAGTAGAAT TCTACTCGTA AAGCGAGTTT AGTTTTAAAA AACAAATGAC ATCATCTCTT GATTATGTTT TACAAGTAGA ATTCTACTCG TAAAGCGAGT TTAGTTTTGA AAAACAAATG ACATCATCTC TTGATTATGT TTTACAAGTA GAATTCTACT CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATC CCTTGATCAT GCGTTACAAG TAGAATTCTA CTCGTAAAGC GAGTTGAATT TTGATTACAA TATT(配列番号3)
hr4左:ATGCATATAA TTGTGTACAA AATATGACTC ATTAATCGAT CGTGCGTTAC AAGTAGAATT CTACTGGTAA AGCAAGTTCG GTTGTGAGCC GTGTGCAAAA CATGACATCA TAACTAATCA TGTTTATAAT CATGTGCAAA ATATGACATC ATCCGACGAT TGTGTTTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAA AGCGAGTTTA AAAATTTTGT GACGTCAATG AAACAACGTG TAATATTTTT TACAATATTT AAGTGAAACA TTATGACTTC CAATAATTTT GTGGATGTGG ATACGTTTGC AAGACAATTG ATTACAGATA AATGTAGTGC TCTAATCGAA AGATGCGGAT CTGTTGCCGG CAAACATTTT AGAGATTAGT AGAGAAAGGC CAGAGACAAG TATTTTGAGG TGCCAACTCA AAAAAACTAT GAATACATTA AAAAATTATT TTTACGAACA AAATATATGG ACGATTCGAT AGATTATAAA GATTTTAACA GACGCATCCT ATTGATAGTT TTTAAATTCG CTTTAAACAA GAGCACCAAC TACTTTCCAT CGTACTAAAG AGATCATCGA GGTGGCCATT AAACGTTTAA ACAAAATTAA CCCCGATTTA AAGAGTTCTC CGCGCAATGC TTCAGCATTA CAAATGAATG TTTGGAAAAT CTAGA(配列番号4)
hr4右:AACTGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACTTGT AAAACACAAT CAAGAAATGA TGTCATTTTT GTACGTGATT ATAAACATGT TTAAACATGG TACATTGAAC TTAATTTTTG CAAGTTGATA AACTAGATTA ATGTATGACT CATTTGTTTG TGCAAGTTGA TAAACGTGAT TAATATATGA CTCATATGTT TGTGCAAAAA TGGTGTCATC GTACAAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCGAGG GATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATTT GTTTTTTCAA AACCGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCGAGG GATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATCG TACAAACTCG CTTTACGAGT AGAATTCTAG TAAAACAC(配列番号5)
hr5:TTGAAAATTT ATTGCCTAAT ATTATTTTTG TCAGTTCGTT GTCATTTATT AATTTGGATG ATGTCCATTT GTTTTTAAAA TTGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACG CGTAAAACAC AATCAAGTAT GAGTCATAAG CTGATGTCAT GTTTTGCACA CGGCTCATAA CCGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACT TGTAACGCAC GATCGAGTGG ATGATGGTCA TTTGTTTTTC AAATCGAGAT GATGTCATGT TTTGCACACG GGCTCATAAA CTGCTTTACG AGTAGAATTC TACGTGTAAC GCACGATCGA TTGATGAGTC ATTTGTTTTG CAATATGATA TCATACAATA TGACTCATTT GTTTTTCAAA ACCGAACTTG ATTTACGGGT AGAATTCTAC TCGTAAAGCA CAATCAAAAA GATGATGTCA TTTGTTTTTC AAAACTGAAC TCTCGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACGTGT AAAACACAAT CAAGAAATGA TGTCATTTGT TATAAAAATA AAAGCTGATG TCATGTTTTG CACATGGCTC ATAACTAAAC TCGCTTTACG GGTAGAATTC TACGCGTAAA ACATGATTGA TAATTAAATA ATTCATTTGC AAAGCTATAC GTTAAATCAA ACGGACGTTA TGGAATTGTA TAATATTAAA TATGCAATTG ATCCAACAAA TAAAATTATA ATAGAGCAAG TCGAC(配列番号6)
1.バキュロウイルスベクターであって、
AAV Cap発現カセット、AAV Rep発現カセット、およびAAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、バキュロウイルスベクター。
2.5’から3’への順に、Cap発現カセット、Rep発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、態様1に記載のベクター。
3.5’から3’への順に、Rep発現カセット、Cap発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、態様1に記載のベクター。
4.5’から3’への順に、Cap発現カセット、バキュロウイルス相同領域(hr)、およびRep発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
5.5’から3’への順に、Rep発現カセット、バキュロウイルス相同領域(hr)、およびCap発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
6.5’から3’ への順に、バキュロウイルス相同領域(hr)、Cap発現カセット、およびRep発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
7.5’から3’への順に、バキュロウイルス相同領域(hr)、Rep発現カセット、およびCap発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
8.hr領域がRep発現カセットとCap発現カセットとの間にあり、かつRep発現カセットとCap発現カセットとが頭-頭(5’-5’)配向にある、態様1に記載のベクター。
9.バキュロウイルス相同領域がhr2配列である、態様1~9のいずれか1態様に記載のベクター。
10.ベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、態様1~9のいずれか1態様に記載のベクター。
11.細胞を含む昆虫細胞株であって、態様1~10のいずれか1態様に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
12.細胞が第2のベクターをさらに含み、上記第2のベクターがAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含む、態様11に記載の昆虫細胞株。
13.in vitroでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、態様11または態様12に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
14.細胞をインキュベートすることが細胞を継代培養することを含み、および継代7でのAAV生成収率がAAV Cap発現カッセットと、AAV Rep発現カセットとを含むがバキュロウイルスhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも2倍大きい、態様13に記載の方法。
15.AAV Cap発現カセットを含むバキュロウイルスの継代7での力価が総バキュロウイルス力価(総バキュロウイルスについてはgp64のqPCRによって、AAVについてはCapのqPCRによって測定される)の21.5%を上回る、態様13に記載の方法。
16.in vitroでAAVを増殖させる方法であって、昆虫細胞の培養物を用意すること、この昆虫細胞を態様1~10のいずれか1態様に記載のバキュロウイルスベクターで感染することまたはトランスフェクトすること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
17.昆虫細胞由来のAAVの継代7での収率がhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞由来のAAVの継代7での収率よりも少なくとも50%大きい、態様16に記載の方法。
18.バキュロウイルスhrを含む細胞由来のAAVの継代7での収率がhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む細胞由来のAAVの収率よりも少なくとも20%大きい、態様16に記載の方法。
19.バキュロウイルスベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、態様16に記載の方法。
20.in vitroでAAVを生成する方法であって、態様1~10のいずれか1態様に記載のベクター、およびAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
21.in vitroで昆虫細胞においてAAVを生成するためのRep結合エレメント(RBE)を含まないバキュロウイルスベクターであって、AAV Cap発現カセット、AAV Rep発現カセット、およびAAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、バキュロウイルスベクター。
ハスモンヨトウ(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞、キンウワバ(Trichoplusia ni)細胞およびEstima acrea細胞を、Corningストレージボトル中の100単位/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシン(Mediatech)を補充したESF921培地(Expression Systems)中で、28℃で培養した。細胞密度が8×106細胞/mLに達したならば、細胞を維持のために1:4に分けた。
hr2配列をバキュロウイルスゲノムからPCR増幅し、プラスミドV053-pFBD-inRepOpt-inCap8中にクローン化して、V059-pFBD-inRepOpt-hr2-inCap8を作製した。kozak配列を組み入れるために、プラスミドV059をBstZ171とAgelで切断してBstZ171-Agelフラグメントを除去し、BstZ171-AgelフラグメントをV150-pFB-inCap8-inRep-kozakからのVP1開始コドンの上流のkozak配列と置き換えて、hr2がRep発現カセットとCap発現カセットとの間に位置するV277-pFB-inCap8-hr2-inRep-kozakを作製した。hr2配列をRep発現カセットのポリA配列の後の別の部位に挿入するために、hr2配列を、V277からのプライマー3205F(5’-GCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGT-3’配列番号7)および3206R(5’-GGCCTACGTAGTTTTACACGTAGAATTCTACTCGT-3’配列番号8)でPCR増幅した。pcプロモーター配列を、V150からのプライマー3065F(5’-ATTTGACTTGGTCAGGGCCG-3’配列番号9)および3204R(5’-GAATTCTACTCGTAAAGCCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG-3’配列番号10)で増幅した。これらのhr2およびpcプロモーターPCRフラグメントを、プライマー3065Fおよび3206Rでの2回目のPCR反応によって結合した。結合したPCRフラグメントを、BsrGIおよびSnaBIで消化し、V150、V212、V195、V188、およびV146のBsrGI部位およびSnaBI部位にライゲートして、それぞれ、V288-pFB-inCap8-inRep-hr2、V289-pFB-inCap9-inRep-hr2、V290-pFB-inCap6-inRep-hr2、V291-pFB-inCap1-inRep-hr2、およびV295-pFB-inCap5-inRep-hr2を作製した。hr配列挿入を有するプラスミドの例を、図1~6に図示する。
均質クローンを得るために、生成した組換えバキュロウイルスをプラーク精製した。手短に言うと、Sf9細胞を、2mLのESF921培地中で1.5e+6細胞/ウェルの細胞密度で6ウェルプレート上に播種し、28℃で30分間、インキュベートした。バキュロウイルスを、1mL容量で10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、および10-7にそれぞれ希釈した。インキュベーション終了時に、培地をウェルから除去し、250μLの各希釈液を添加して、28℃で1時間、Sf9細胞を感染した。インキュベーション終了時に、3mLの1%のアガロースオーバーレイ(42℃まで冷却)をウェルに添加した。アガロースが凝固すると、2mLのESF921培地を各ウェルに添加し、プレートを28℃で5~7日間インキュベートした。十分に形成されたプラークを選び、継代のために昆虫細胞を感染するのに用いた。
組換えバキュロウイルスとAAVの力価を決定するために、qPCR法を用いた。1プラーク形成単位(pfu)がウイルスの約20ゲノムコピーを含むことが、経験的に決定された。手短に言うと、収集したウイルスをqPCR希釈緩衝液中で希釈し、95℃に30分間加熱してウイルス粒子を破壊した。処理したウイルス試料を次いで、既知の標準とともにCHROMO4(商標)システム(Bio-Rad Laboratories inc.,Hercules,CA)中でアッセイした。Ct値をpfuに変換し、これを用いて、バキュロウイルス継代培養とAAV生成を誘導した。
組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞を感染させ、AAVベクターを生成した。手短に言うと、hr2配列を有するまたは有しないRep遺伝子およびCap遺伝子を含有する10moiの組換えバキュロウイルスを、AAV ITRに隣接されるGFPマーカー遺伝子を含有する5moiの組換えバキュロウイルスとともに28℃で3日間同時感染させた。細胞ペレットを、3000rpmで10分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理によってSf9溶解緩衝液(50mMのTris-HCl、pH7.8、50mMのNaCl、2mMのMgCl2、1%のSarkosyl、1%のTriton X-100および140単位/mLのベンゾナーゼ)中で溶解した。細胞破壊片を、8000rpmで20分間の遠心分離によって除去した。透明溶解液を、次のようにAAV生産性の定量のために用いた:溶解液を、qPCR希釈緩衝液で希釈し、混入しているDNAを、デオキシリボヌクレアーゼI酵素と37℃で1時間インキュベートすることによって破壊した。デオキシリボヌクレアーゼI酵素を、100mMのEDTAの存在下で、95℃で30分間、加熱することによって不活性化した。処理したAAV試料をさらに希釈し、Chromo4 qPCR装置でアッセイした。Ct値を、AAVベクターゲノムコピーに変換した。
rep遺伝子およびcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを用いて3日間Sf9細胞を感染し、細胞ペレットを、3,000rpmで10分間の遠心分離により収集した。約2×106細胞を含む細胞ペレットを300μLのPBS緩衝液中に最初に再懸濁し、次いで100μLの4×LDS試料緩衝液とともにボルテックスして、細胞を溶解した。溶解物を95℃で5分間加熱し、次いで20秒間、超音波処理して、ゲノムDNAをせん断した。短時間の遠心分離の後、溶解物を次いで10%SDS-ゲル上にロードして、タンパク質を分離した。タンパク質を次いで、ゲルからニトロセルロース膜に移した。5%脱脂乳でのブロッキング後に、膜をrepタンパク質またはcapタンパク質に対する特異的抗体を用いて探索した。第1の抗体に対し西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合された第2の抗体を用いて、カラー・マトリックス反応によりrepタンパク質またはcapタンパク質を検出した。
本発明の教示は、いずれの特許請求の範囲または態様を限定することを意図しない実施例に記載の説明を含む。具体的に過去形で示されない限り、実施例は仮想例または実際例であり得る。以下の非限定例は、本発明の教示をさらに例示するために提供される。本開示の観点から、多くの変更が開示された特定の実施形態においてなされ、および本発明の教示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をさらに得られることを当業者は理解する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例はhr配列がAAV生成収率を高めることを例示する。
本実施例は、hr配列がAAV rep遺伝子とcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスの安定性を高めることを例示する。
本実施例は、hr配列がAAVrep遺伝子とcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルス(rBV)のAAV生産性を高めることを例示する。
本実施例は、AAV repとcapの発現が多数継代を通してrBV安定性と直接相関することを例示する。
Claims (11)
- プロモーターを含む人工イントロンを含む、AAV Cap発現カセット、
プロモーターを含む人工イントロンを含む、AAV Rep発現カセット、および
AAV Rep発現カセット、AAV Cap発現カセット、またはその両方の開始コドンから最大で4kbに位置するバキュロウイルス相同領域2(hr2)
を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)生成のためのバキュロウイルスベクターであって、
前記ベクターが、Rep結合エレメント(RBE)配列、RBE配列を含む末端逆位配列領域(ITR)、およびRBE配列を含むプロモーターを有さない、バキュロウイルスベクター。 - 前記hr2が前記Rep発現カセットと前記Cap発現カセットとの間にあり、かつ前記Rep発現カセットおよび前記Cap発現カセットが頭-頭(5’-5’)配向にある、請求項1に記載のベクター。
- 細胞を含む昆虫細胞株であって、請求項1または2に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
- 前記細胞が第2のベクターをさらに含み、前記第2のベクターがAAV末端逆位配列(ITR)に隣接される導入遺伝子を含む、請求項3に記載の昆虫細胞株。
- 請求項3または請求項4に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、in vitroでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、
前記細胞をインキュベートすることが前記細胞を少なくとも5継代継代培養することを含み、
前記バキュロウイルスベクターが、
プロモーターを含む人工イントロンを含む、AAV Cap発現カセット、
プロモーターを含む人工イントロンを含む、AAV Rep発現カセット、および
AAV Rep発現カセット、AAV Cap発現カセット、またはその両方の開始コドンから最大で4kbに位置するバキュロウイルス相同領域2(hr2)
を含み、前記ベクターが、Rep結合エレメント(RBE)を含まない、方法。 - 継代7でのAAV生成収率がAAV Cap発現カセットとAAV Rep発現カセットとを含むがバキュロウイルスhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも2倍大きい、請求項5に記載の方法。
- 前記AAV Cap発現カセットを含むバキュロウイルスの継代7での力価が総バキュロウイルス力価の21.5%を上回る、請求項5に記載の方法。
- in vitroでAAVを増殖させる方法であって、
昆虫細胞の培養物を用意すること、
前記昆虫細胞を請求項1または2に記載のバキュロウイルスベクターで感染するまたはトランスフェクトすること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、方法。 - 前記昆虫細胞からのAAVの継代7での収率が前記hr2を有しないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞からのAAVの継代7での収率よりも少なくとも50%大きい、請求項8に記載の方法。
- 前記バキュロウイルスhr2を含む細胞からのAAVの継代7での収率が前記hr2を有しないバキュロウイルスベクターを含む細胞からのAAVの収率よりも少なくとも20%大きい、請求項8に記載の方法。
- in vitroでAAVを生成する方法であって、請求項1または2に記載のベクター、およびAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
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