BRPI0814459B1 - Método para produzir um vírion parvoviral recombinante em uma célula de inseto, e, construção de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

CÉLULA DE INSETO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRION PARVOVIRAL RECOMBINANTE EM UMA CÉLULA DE INSETO, E, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO A presente invenção diz respeito á produção de proteínas em células de inseto por meio das quais as sequências codificadas são usados em vetores baculovirais. Em particular, a invenção diz respeito á produção de vetores parvovirais que podem ser usados na terapia genética e para melhora na expressão das proteínas rep virais que aumenta a produtividade de vetores parvovirais.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se relaciona aos campos da medicina, biologia molecular e terapia genética. A invenção diz respeito à produção de proteínas em células de inseto por meio das quais as sequências codificadoras repetidas são usadas em vetores baculovirais. Em particular a invenção diz respeito à produção de vetores parvovirais que podem ser usados na terapia genética e para a melhora na expressão das proteínas rep virais que aumenta a produtividade de vetores parvovirais.

Fundamentos da invenção

[002] O sistema de expressão de baculovírus é bem conhecido para seu uso como clonagem eucariótica e vetor de expressão (King, L. A., and R. D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system", Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., et al., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman.). As vantagens do sistema de expressão de baculovírus são, entre outras, que as proteínas expressadas são quase sempre solúveis, corretamente dobradas e biologicamente ativas. As vantagens adicionais incluem níveis de expressão de proteína altos, produção mais rápida, adequabilidade para a expressão de proteínas grandes e adequabilidade para a produção em grande escala. Entretanto, na produção em grande escala ou contínua de proteínas heterólogas usando-se o sistema de expressão de baculovírus em biorreatores de inseto, a instabilidade dos níveis de produção, também conhecida como efeito de passagem, é um obstáculo principal. Este efeito ocorre, pelo menos em parte, devido à recombinação entre sequências homólogas repetidas no DNA baculoviral.

[003] O sistema de expressão de baculovírus também foi usado de maneira bem sucedida para a produção de vetores virais adeno-associados recombinantes (AAV) (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; US 6.723.551 e US 20040197895). O AAV pode ser considerado como um dos vetores virais mais promissores para a terapia genética humana. O AAV tem a capacidade de infectar eficazmente células humanas divisores bem como não divisoras, o genoma viral AAV integra em um local cromossômico simples no genoma das células hospedeiras e, de maneira mais importante, ainda que o AAV esteja presente em muitos seres humanos, este nunca foi associado com qualquer doença. Em vista destas vantagens, o vírus adeno- associado recombinante (rAAV) está sendo avaliado em ensaios clínicos de terapia genética contra hemofilia B, melanoma maligno, fibrose cística, hiperlipoproteinemia tipo I e outras doenças.

[004] Para superar os problemas com sistemas de produções de mamífero para AAV Urabe et al. (2002, supra) desenvolveram um sistema de produção de AAV em células de inseto. Para a produção de AAV em células de inseto, algumas modificações foram necessárias a fim de atingir a estequiometria correta das três proteínas capsídicas AAV (VP1, VP2 e VP3), que conta com uma combinação de uso alternado de dois locais que aceitam união e a utilização subótima de um códon de iniciação ACG para VP2 que não é precisamente reproduzido pelas células de inseto. Para imitar a estequiometria correta das proteínas capsídicas em células de inseto Urabe et al. (2002, supra) utilizaram uma construção que é transcrita em um mensageiro policistrônico simples que é capaz de expressar todas as três proteínas VP sem requerer a união e em que o códon iniciador mais a montante é substituído pelo códon iniciador subótimo ACG. O WO2007/046703 ainda divulga a melhora da infectividade de vetores rAAV produzidos de baculovírus com base na produção pela otimização da estequiometria de proteínas capsídicas de AAV como produzido em células de inseto.

[005] Para a expressão das proteínas AAV Rep no sistema de expressão de célula de inseto AAV como inicialmente desenvolvido por Urabe et al. (2002, supra), uma construção de baculovírus recombinante é usada abrigando duas unidades de expressão de Rep independentes (uma para Rep78 e uma para Rep52), cada uma sob o controle do promotor de célula de inseto separada, os promotores ΔIE1 e PolH, respectivamente.

[006] Entretanto, Kohlbrenner et al. (2005, Mol. Ther. 12: 1217-25; WO 2005/072364) relataram que a construção de baculovírus par a expressão das duas proteínas Rep, como usado por Urabe et al., sofre de uma instabilidade inerente. Dividindo-se a orientação palindrômica dos dois genes Rep no vetor original de Urabe e projetando-se dois vetores de baculovírus separados para a expressão de Rep52 e Rep78, Kohlbrenner et al. (2005, supra) aumentou a estabilidade de passagem do vetor. Entretanto, a despeito da expressão consistente de Rep78 e Rep52 das duas construções de baculovírus-Rep independentes em células de inseto por pelo menos 5 passagens, o rendimento de vetor rAAV é de 5 a 10 dobras menor em comparação com a construção de baculovírus-Rep original por Urabe et al. (2002, supra).

[007] No WO2007/148971, os presentes inventores melhoraram significantemente a estabilidade da produção de vetor rAAV em células de inseto usando-se uma sequência codificadora para proteínas Rep78 e Rep52 em que um códon iniciador subótimo é usado para a proteína Rep78 que é parcialmente saltado (“skipped”) pelos ribossomos de varredura para permitir que a iniciação de tradução ainda ocorra no códon de iniciação da proteína Rep52.

[008] Entretanto, existe uma necessidade quanto a melhoras adicionais na produção em grande escala (comercial) de proteínas homólogas, incluindo vetores rAAV, em células de inseto. Desta maneira, é um objetivo da presente invenção fornecer meio e métodos que permitem produção de rendimento estável e alto (escala grande) de proteínas heterólogas e vetores parvovirais.

Descrição da Invenção Definições

[009] Como usado neste, o termo "operacionalmente ligadas" refere- se a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou polipeptídeo) em uma relação funcional. Um ácido nucleico é "operacionalmente ligado" quando este é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma sequência regulatória de transcrição está operacionalmente ligada a uma sequência codificadora se esta afetar a transcrição da sequência codificadora. Operacionalmente ligadas significa que as sequências de DNA estando ligadas são tipicamente contíguas e, quando necessário unir duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na estrutura de leitura.

[0010] "Sequência de controle de expressão" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que regula a expressão da sequência de nucleotídeo à qual esta está operacionalmente ligada. Uma sequência de controle de expressão é "operacionalmente ligada" a uma sequência de nucleotídeo quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e/ou a tradução da sequência de nucleotídeo. Desta maneira, uma sequência de controle de expressão pode incluir promotores, intensificadores, locais de entrada de ribossomo interno (IRES), terminadores de transcrição, um códon de partida na frente de um gene que codifica a proteína, união de sinal para íntrons e códons de interrupção. O termo "sequência de controle de expressão" é pretendido incluir, em um mínimo, uma sequência cuja presença é projetada para influenciar a expressão e também pode incluir componentes vantajosos adicionais. Por exemplo, sequências líder e sequências parceiras de fusão são sequências de controle de expressão. O termo também pode incluir o projeto da sequência de ácido nucleico tal que os códons de iniciação potencial indesejáveis em e fora da estrutura, sejam removidos da sequência. Isto também pode incluir o projeto da sequência de ácido nucleico, tal que os locais de união potenciais indesejáveis sejam removidos. Insto inclui sequência ou sequências de poliadenilação (pA) que direcionam a adição de uma cauda de poliA, isto é, uma série de resíduos de adenina na extremidade 3' de um mRNA, as sequências referidas como sequências de poliA. Isto também pode ser projetado para intensificar a estabilidade de mRNA. As sequências de controle de expressão que afetam a estabilidade de transcrição e tradução, por exemplo, promotores, bem como sequências que afetam a tradução, por exemplo, sequências de Kozak, são conhecidas em células de inseto. As sequências de controle de expressão podem ser de tal natureza a fim de modular a sequência de nucleotídeo à qual estas estão operacionalmente ligadas tal que os níveis de expressão inferiores ou níveis de expressão mais altos sejam atingidos.

[0011] Como usado neste, o termo "promotor" ou "sequência reguladora de transcrição" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de uma ou mais sequências codificadoras e está localizado a montante com respeito à direção de transcrição do local de iniciação de transcrição da sequência codificadora e é estruturalmente identificado pela presença de um local de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, locais de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo mas não limitado aos locais de ligação de fator de transcrição, locais de ligação de proteína repressora e ativadora e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica para atuar direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um "promotor constitutivo" é um promotor que é ativo na maioria dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor "indutível" é um promotor que é regulado fisiologicamente ou por desenvolvimento, por exemplo, pela aplicação de um indutor químico. Um promotor "específico de tecido" é apenas ativo em tipos específicos de tecidos ou células.

[0012] Os termos "substancialmente idênticos", "identidade substancial" ou "essencialmente similar" ou "similaridade essencial" significa que dois peptídeos ou duas sequências de nucleotídeo, quando otimamente alinhado, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando-se parâmetros default, compartilham pelo menos uma certa porcentagem de identidade de sequência como definido em qualquer lugar neste. O GAP usa o algoritmo de alinhamento global Needleman and Wunsch para alinhar duas seqüências em seu comprimento total, maximizando o número de comparações e minimizando o número e fendas. Em geral, os parâmetros default GAP são usados, com uma penalidade de criação de fenda = 50 (nucleotídeos) / 8 (proteínas) e penalidade de extensão de fenda = 3 (nucleotídeos) / 2 (proteínas). Para os nucleotídeos, a matriz de registro default usada é nwsgapdna e para proteínas a matriz de registro é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Está claro que quando as sequências de RNA são ditas serem essencialmente similares ou terem um certo grau de identidade de sequência com sequências de DNA, timina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA. Os alinhamentos e os registros de sequência para a porcentagem de identidade de identidade de sequência podem ser determinados usando-se programas de computador, tais como o GCG Wisconsin Package, Versão 10.3, disponível da Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA ou o software de fonte aberta Emboss for Windows (versão corrente 2.7.1-07). Alternativamente, a similaridade ou identidade percentuais podem ser determinadas pela pesquisa contra os bancos de dados, tais como FASTA, BLAST, etc.

[0013] As sequências de nucleotídeo que codificam proteínas Rep parvovirais da invenção também podem ser definidas por sua capacidade de hibridizar-se com as sequências de nucleotídeo da SEQ ID N° 1 a 4, respectivamente, sob condições de hibridização moderada ou, preferivelmente estringente. As condições de hibridização estringente são definidas aqui como condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize em uma temperatura de cerca de 65° C em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo força iônica comparável e lavagem a 65° C em uma solução que compreende cerca de 0,1 M de sal ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente, a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições permitirão tipicamente, a hibridização específica de sequências tendo cerca de 90 % ou mais identidade de sequência.

[0014] As condições moderadas são definidas aqui como condições que permitem que as sequências de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizam em uma temperatura de cerca de 45° C em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável e lavagem em temperatura ambiente em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições permitirão usualmente a hibridização específica de sequências tendo até 50 % de identidade de sequência. A pessoa habilitada na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização a fim de identificar especificamente as sequências que variam em identidade entre 50 % e 90 %.

Descrição Detalhada da Invenção

[0015] Em alguns aspectos a presente invenção diz respeito ao uso de parvovírus animal, em particular dependovírus, tal como AAV humano ou símio infeccioso e os seus componentes (por exemplo, um genoma de parvovírus animal) para o uso como vetores para a introdução e/ou expressão de ácidos nucleicos em células de mamíferos. Em particular, a invenção diz respeito à melhoras na produtividade de ais vetores parvovirais quando produzidos em células de inseto.

[0016] Os vírus da família Parvoviridae são vírus animais de DNA pequeno. A família Parvoviridae pode ser dividida entre suas sub-famílias: a Parvovirinae, que infecta vertebrados e a Densovirinae, que infecta insetos. Os membros da subfamília Parvovirinae são referidos aqui como os parvovírus e incluem o gênero Dependovirus. Como pode ser deduzido a partir do nome do seu gênero, os membros da Dependovírus são únicos requerindo usualmente a coinfecção com um vírus auxiliar tal como adenovírus ou hérpes vírus para a infecção produtiva na cultura celular. O gênero Dependovirus inclui AAV, que normalmente infecta seres humanos (por exemplo, sorotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 e 6) ou primatas (por exemplo, sorotipos 1 e 4) e vírus relacionados que infectam outros animais de sangue quente (por exemplo, vírus adeno-associados de bovinos, caninos, equinos e ovinos). Informação adicional sobre parvovírus e outros membros dos Parvoviridae é descrita em Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (3° Ed. 1996). Para conveniência, a presente invenção ainda é exemplificada e descrita neste por referência ao AAV. Entretanto, é entendido que a invenção não é limitada a AAV mas pode ser igualmente aplicada a outros parvovírus.

[0017] A organização genômica de todos os sorotipos de AAV conhecidos é muito similar. O genoma de AAV é uma molécula de DNA de filamento simples linear que é menor do que cerca de 5.000 nucleotídeos (nt) de comprimento. As repetições de terminal invertidas (ITRs) flanqueiam as sequências de nucleotídeo codificadoras únicas para as proteínas de replicação não estruturais (Rep) e as proteínas estruturais (VP). As proteínas VP (VP1, -2 e -3) formam o capsídeo. O 145 nt terminal é auto-complementar e é organizado de modo que o duplex intramolecular energeticamente estável que forma um grampo de cabelo de forma T pode ser formado. Estas estruturas de grampo de cabelo funcionam como uma origem para a replicação de DNA viral, que serve como iniciadores para o complexo de DNA polimerase celular. Seguindo a infecção wtAAV em células de mamífero, os genes Rep (isto é, Rep78 e Rep52) são expressados a partir do promotor P5 e do promotor P19, respectivamente e ambas as proteínas Rep têm uma função na replicação do genoma viral. Um evento de união no Rep ORF resulta na expressão realmente quatro proteínas Rep (isto é, Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40). Entretanto, foi mostrado que o mRNA não unido, que codifica as proteínas Rep78 e Rep52, em células de mamífero são suficientes para a produção do vetor AAV. Também, em células de inseto as proteínas Rep78 e Rep52 são suficientes para a produção de vetor AAV.

[0018] Um "vetor parvoviral recombinante ou AAV" (ou "vetor rAAV") aqui, refere-se a um vetor que compreende uma ou mais poli- sequências de nucleotídeo de interesse, genes de interesse ou "transgenes" que são flanqueados por sequências de repetição terminais invertidas parvovirais ou AAV (ITRs). Tais vetores rAAV podem ser replicados e embalados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira de inseto que está expressando produtos de gene rep e cap de AAV (isto é proteínas Rep e Cap de AAV). Quando um vetor rAAV é incorporado em uma construção de ácido nucleico maior (por exemplo, em um cromossomo ou em um outro vetor, tal como um plasmídeo ou baculovírus usado para clonagem ou transfecção), então o vetor rAAV é tipicamente referido como um "pró-vetor" que pode ser “resgatado” por replicação e encapsidação na presença de funções de empacotamento de AAV e funções auxiliares necessárias.

[0019] Em um primeiro aspecto a invenção diz respeito a uma célula de inseto. A célula de inseto compreende pelo menos uma primeira sequência de nucleotídeo que codifica uma primeira sequência de aminoácido e a uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica uma segunda sequência de aminoácido. Preferivelmente, a primeira e a segunda sequências de aminoácidos cada uma compreendendo uma sequência de aminoácido comum de pelo menos 50, 80, 100, 200, 300, 350 ou 398 aminoácidos com pelo menos 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100 % de identidade de aminoácido entre a primeira e a segunda sequências de aminoácidos. Em contraste, as sequências de nucleotídeo que codificam a sequência de aminoácido comuns na primeira e na segunda sequências de aminoácidos (como presente na primeira e na segunda sequências de nucleotídeos, respectivamente) são menos do que 95, 90, 89, 88,4, 85, 80, 75, 70, 65, 60 ou 55 % idênticas.

[0020] Usualmente, a primeira e a segunda sequências de aminoácidos serão heterólogas a uma célula de inseto. Preferivelmente pelo menos uma das sequências de aminoácidos comuns na primeira e na segunda sequências de aminoácidos é uma sequência de aminoácido de ocorrência natural. Mais preferivelmente, pelo menos uma da primeira e da segunda sequências de aminoácidos é sequência de aminoácidos de ocorrência natural. Mais preferivelmente, tanto a primeira quanto a segunda sequências de aminoácidos são sequências de aminoácido de ocorrência natural.

[0021] Em uma forma de realização preferida, a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo tem um códon otimizado para a célula de inseto em comparação com a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo. É entendido aqui que quando referência é feita ao viés de uso de códon em uma célula de inseto, isto inclui o viés de uso de códon para uma célula de inseto infectada com baculovírus, incluindo, em particular, viés de uso de códon para uma célula infectada com nucleopoliedrovírus múltiplo de Autographa californica (AcMNPV). O uso de códon da primeira sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum preferivelmente é adaptado ou otimizado ao uso de códon da célula hospedeira de inseto. A adaptatividade de uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum ao uso de códon da célula hospedeira pode ser expressada como o índice de adaptação de códon (CAI). Preferivelmente, o uso de códon é adaptado a uma célula de inseto em que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeo estão presentes. Usualmente esta será uma célula do gênero Spodoptera, mais preferivelmente uma célula de Spodoptera frugiperda. O uso de códon é, desta maneira, preferivelmente a Spodoptera frugiperda ou a uma célula infectada com nucleopoliedrovírus de Autographa californica (AcMNPV). Um índice de adaptação de códon é definido aqui como uma medição da adaptatividade relativa do uso de códon de um gene com relação ao uso de códon de genes altamente expressados. A adaptatividade relativa (w) de cada códon é a razão de uso de cada códon, para aquela do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como o meio geométrico de valores de adaptatividade relativos. Os códons não sinônimos e os códons de terminação (dependente do código genético) são excluídos. A faixa de valores CAI varia de 0 a 1, com valores mais altos indicando uma proporção mais alta dos códons mais abundantes (ver Sharp and Li , 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; ver também: Kim et al., Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede et al., Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635). Em uma célula de inseto preferida, a diferença em CAI entre a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira e na segunda sequências de nucleotídeo pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8. Preferivelmente, além disso o CAI da sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo é pelo menos 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.

[0022] Uma sequência de nucleotídeo preferida que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo é uma sequência codificadora em que pelo menos 50, 75, 90, 95, 98 ou 99 % e preferivelmente todos os códons não comuns ou códons menos comuns são substituídos por um códon comum que codifica o mesmo aminoácido como resumido na Tabela 1 ou na Tabela 2. Um códon comum é entendido aqui ser o códon mais frequentemente usado que codifica cada resíduo de aminoácido particular em genes de Spodoptera frugiperda altamente expressados como mostrado na Tabela 1 ou em genes altamente expressados, células infectadas com Autographa californica MNPV como mostrado na Tabela 2. Todos os outros códons que não os códons comuns e códons menos comuns são "códons não comuns". Os códons não comuns incluem "o segundo códon mais frequente", que são entendidos como códons tendo o mesmo, mas com frequência mais alta na Tabela 1 ou Tabela 2. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo estiramento contínuo de pelo menos 25, 50, 100, 200 ou 300 códons, todos os quais são códons comuns. A sequência codificadora ainda pode ser adaptada para a expressão melhorada na célula hospedeira de inseto pelos métodos descritos no WO 2004/059556 e pela modificação do teor de CpG da sequência codificadora como descrito no WO 2006/015789. É entendido que tais adaptações adicionais podem fazer com que nem todos os códons em uma sequência de nucleotídeo codifiquem quanto à sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo são códons comuns.

[0023] Em uma forma de realização preferida da célula de inseto, todos os códons em uma sequência de nucleotídeo que codifica para a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo são códons comuns de acordo com (uma das) Tabelas 1 ou 2. Mais preferivelmente em uma tal célula de inseto, todos os códons em uma sequência de nucleotídeo que codificam a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo são os segundos códons mais frequentes de acordo com (uma das) Tabelas 1 ou 2, por meio das quais é entendido que se na primeira sequência de nucleotídeo os códons comuns estão de acordo com a Tabela 1, os segundos códons mais frequentes na segunda sequência de nucleotídeo também estão de acordo com a Tabela 1, ou que se na primeira sequência de nucleotídeo os códons comuns estão de acordo com a Tabela 2, os segundos códons mais frequentes na segunda sequência de nucleotídeo também estão de acordo com a Tabela 2.

[0024] A otimização de códon pode ser realizada na base do uso de códon do organismo Spodoptera frugiperda como pode ser observado em um banco de dados de uso de códon (ver, por exemplo, http://www.kazusa.or.jp/codon/). Os programas de computador adequados para a otimização de códon estão disponíveis para a pessoa habilitada (ver, por exemplo, Jayaraj et al., 2005, Nucl. Acids Res. 33(9):3011-3016 e na internet). Alternativamente, as otimizações podem ser realizadas manualmente, usando-se os mesmos bancos de dados de uso de códon.

[0025] Em uma forma de realização da célula de inseto da invenção, pelo menos 50, 60, 80, 90 ou 100 % dos códons em uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo são alterados em comparação com o códon correspondente na primeira sequência de nucleotídeo para maximizar o teor de AT ou CG da segunda sequência de nucleotídeo.

[0026] Desta maneira, em uma forma de realização preferida da invenção, a diferença na sequência de nucleotídeo entre a primeira e a segunda sequências de nucleotídeo que codificam quanto às sequências de aminoácidos comuns é maximizada (isto é, a identidade de nucleotídeo é minimizada) por um ou mais de: a) mudança do viés de códon da primeira sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum; b) mudança do viés de códon da segunda sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum; c) mudança do teor de GC da primeira sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum e d) mudança do teor de GC da segunda sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum.

[0027] Uma forma de realização preferida da invenção da célula de inseto diz respeito à produção de parvoviral proteínas na célula de insetos da invenção. Em particular, as proteínas parvovirais são produzidas em células de inseto no contexto de produzir vetores parvovirais recombinantes, mais preferivelmente, os vetores parvovirais recombinantes animais e mais preferivelmente vetores AAV recombinantes. Portanto, nesta forma de realização preferida das células de inseto da invenção, a primeira sequência de nucleotídeo codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral e a segunda sequência de nucleotídeo codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína Rep78 ou 68 parvoviral. É entendido, entretanto que as formas de realização em que a primeira sequência de nucleotídeo codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína Rep78 ou 68 parvoviral e a segunda sequência de nucleotídeo codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral são expressamente incluídas na invenção. Para conveniência nas formas de realização deveríamos usar a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral como a primeira sequência de nucleotídeo e a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína Rep78 ou 68 parvoviral como a segunda sequência de nucleotídeo mas o reverso destas formas de realização está expressamente incluído na invenção. A sequência de aminoácido comum codificada pela primeira e pela segunda sequências de nucleotídeos compreende ou consiste das sequências de aminoácido pelo menos do segundo aminoácido até o aminoácido mais a C terminal de uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral. Preferivelmente as sequências de aminoácidos comuns compreendem ou consistem do primeiro aminoácido até o aminoácido mais a C terminal de uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral. As identidades de aminoácido entre a sequência de aminoácido parvoviral comum são como definidos acima para as sequências de aminoácido comuns. Preferivelmente, na célula de inseto, as proteínas Rep parvovirais são proteínas Rep de vírus adeno-associado (AAV). Mais preferivelmente, as proteínas Rep parvovirais codificados na primeira e na segunda sequências de nucleotídeos são do mesmo sorotipo.

[0028] A sequência de nucleotídeo codificando as proteínas Rep parvovirais, é entendida aqui como a sequência de nucleotídeo que codifica as proteínas Rep não estruturais que são requeridas e suficientes para a produção de vetor parvoviral em células de inseto tais como Rep78 ou Rep68 e as proteínas Rep52 ou Rep40. A sequência de nucleotídeo de parvovírus animal preferivelmente é de um dependovírus, mais preferivelmente de um vírus adeno-associado humano ou símio (AAV) e mais preferivelmente de um AAV que infecta normalmente seres humanos (por exemplo, sorotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 e 6) ou primatas (por exemplo, sorotipos 1 e 4). Um exemplo da sequência de nucleotídeo que codifica proteínas Rep de parvovírus animal é dado na SEQ ID N° 7, que descreve uma parte do genoma da sequência de AAV sorotipo-2 que codifica as proteínas Rep. A sequência codificadora de Rep78 compreende nucleotídeos 11 a 1876 e a sequência codificadora Rep52 compreende nucleotídeos 683 a 1876, também descrito separadamente na SEQ ID N° 1 e 5. É entendido que os pesos moleculares exatos das proteínas Rep78 e Rep52, bem como as posições exatas dos códons de início de tradução podem diferir entre os parvovírus diferentes. Entretanto, a pessoa habilitada conhecerá como identificar a posição correspondente na sequência de nucleotídeo de outros parvovírus que não AAV-2.

[0029] Uma (primeira) sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína Rep52 parvoviral também pode, desta maneira, ser definida como a sequência de nucleotídeo: a) que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 6; b) que tem pelo menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID N° 1 a 5 e 10; c) o filamento complementar que hibridiza quanto a uma sequência de molécula de ácido nucleico de (a) ou (b); d) sequências de nucleotídeo, cuja sequência difere da sequência de uma molécula de ácido nucleico de (c) devido à degeneração do código genético.

[0030] Uma (segunda) sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína Rep78 parvoviral, desta maneira, também pode ser definido como uma sequência de nucleotídeo: a) que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 8; b) que tem pelo menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo das posições 11 a 1876 da SEQ ID N° 7; c) o filamento complementar que hibridiza a uma sequência de molécula de ácido nucleico de (a) ou (b); d) sequências de nucleotídeo, cuja sequência difere da sequência de uma molécula de ácido nucleico de (c) devido à degeneração do código genético. Preferivelmente, a sequência de nucleotídeo codifica proteínas Rep de parvovírus animal que são requeridas e suficientes para a produção do vetor parvoviral em células de inseto.

[0031] As várias modificações da primeira e segunda sequências de nucleotídeo codificadoras como definido acima, incluindo, por exemplo, as sequências parvovirais do tipo selvagem, para a expressão apropriada em células de inseto é atingida pela aplicação de técnicas de engenharia genética bem conhecidas, tal como descrito em Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3° edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Várias modificações adicionais de regiões codificadoras são conhecidas pelo écnico habilitado que pode aumentar o rendimento das proteínas codificadas. Estas modificações estão dentro do escopo da presente invenção.

[0032] Em células de inseto da invenção, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são preferivelmente parte de uma construção de ácido nucleico. A célula de inseto pode compreender duas construções de ácido nucleico separadas, uma para cada uma da primeira e a segunda sequências de nucleotídeos ou a célula de inseto pode compreender um tipo simples de construção de ácido nucleico que compreende tanto a primeira quanto a segunda sequências de nucleotídeo.

[0033] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma construção de ácido nucleico que compreende uma primeira e/ou uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica a primeira e a segunda sequência de aminoácido, respectivamente, que compreende uma sequência de aminoácido comum como definido acima. Preferivelmente, a primeira e/ou a segunda sequências de nucleotídeo na construção codificam proteínas Rep parvovirais como definido acima. Preferivelmente, na construção, a sequência de nucleotídeo que codifica a primeira e a segunda sequências de aminoácidos são operacionalmente ligadas às sequências de controle e expressão para a expressão em uma célula de inseto. Estas sequências de controle de expressão incluirão pelo menos um promotor que é ativo em células de inseto. As técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica para expressar genes estranhos em células hospedeiras de insetos podem ser usadas para praticar a invenção. A metodologia para a engenharia molecular e expressão de polipeptídeos em células de inseto é descrito, por exemplo, em Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. Em Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes em insect cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W. H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4.745.051; US2003148506 e WO 03/074714. Os promotores adequados para a transcrição da primeira e da segunda sequências de nucleotídeos da invenção incluem por exemplo, o poliédron (PolH), promotores p10, p35, IE-1 ou AIE-1 e ainda promotores descritos nas referências acima. Visto que é conhecido que, em células de mamíferos, uma expressão menos abundante de Rep78 em comparação com Rep52 favorece os rendimentos de vetor altos (Li et al., 1997, J Virol. 71: 5236-43; Grimm et al., 1998, Hum Gene Ther. 9, 2745-2760), preferivelmente um promotor mais fraco é usado para conduzir a expressão da proteína Rep78 ou 68 do que o promotor usado para a expressão da proteína Rep52 or 40. Por exemplo, o promotor poliédron mais forte pode ser usado para a expressão da proteína Rep52 ou 40, o promotor AIE1, um promotor muito mais fraco do que o promotor PolH, pode ser escolhido para conduzir a expressão da proteína Rep78 ou 68. Preferivelmente, a escolha de promotores para a proteína Rep52 ou 40 e proteína Rep78 ou 68, respectivamente, ocorre tal que em uma célula de inseto a fim de produzir em uma célula de inseto uma razão molar de Rep78/68 a Rep52/40 na faixa de 1:10 a 10:1, 1:5 a 5:1 ou 1:3 a 3:1, preferivelmente em torno de 20 a 40 horas pós infecção, mais preferivelmente em torno de 30 a 40 horas pós infecção, usando-se uma expressão de baculovírus. A razão molar da Rep78 e Rep52 pode ser determinada por meio de Western blotting, preferivelmente usando-se um anticorpo monoclonal que reconhece um epítopo comum tanto de Rep78/68 quanto de Rep52/40 ou usando-se, por exemplo, anticorpo anti-Rep de camundongo (303.9, Progen, Germany; diluição 1:50).

[0034] Preferivelmente, a construção de ácido nucleico para a expressão da primeira e da segunda sequências de nucleotídeo da invenção em células de inseto é um vetor compatível com a célula de inseto. Um "vetor compatível com célula de inseto" ou "vetor" é entendido ser uma molécula de ácido nucleico capas de transformação ou transfecção produtivas de um inseto ou célula de inseto. Os vetores biológicos exemplares incluem plasmídeos, moléculas de ácido nucleico exemplares e vírus recombinantes. Qualquer vetor pode ser utilizado contanto que este seja compatível com a célula de inseto. O vetor pode integrar no genoma das células de inseto mas o vetor também pode ser epissomal. A presença do vetor em uma célula de inseto necessita ser permanente e os vetores epissomais transitórios também estão incluídos. Os vetores podem ser introduzidos por quaisquer meios conhecidos, por exemplo, pelo tratamento químico das células, eletroporação ou infecção. Em uma forma de realização preferida, o vetor é um baculovírus, um vetor viral ou um plasmídeo. Em uma forma de realização mais preferida, o vetor é um baculovírus, isto é, a construção é um vetor baculoviral. Os vetores baculovirais e os métodos para o seu uso são descritos nas referências citadas acima na engenharia molecular das células de inseto.

[0035] As construções de ácido nucleico da invenção ainda podem compreender uma sequência de controle de expressão que compreende uma sequência de nove nucleotídeos da SEQ ID N°: 9 ou uma sequência de nucleotídeo substancialmente homóloga à SEQ ID N°: 9, a montante dos códons de iniciação da sequência de nucleotídeo que codifica a primeira e/ou a segunda sequências de aminoácido. Uma sequência com identidade substancial à sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 9 e que auxilia no aumento da expressão da primeira e/ou segunda sequências de aminoácidos é, por exemplo, uma sequência que tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de identidade à sequência de nove nucleotídeo da SEQ ID N°: 9.

[0036] A célula de inseto pode ser qualquer célula que é adequada para a produção de proteínas heterólogas. Preferivelmente, a célula de inseto permite a replicação de vetores baculovirais e pode ser mantida na cultura. Mais preferivelmente a célula de inseto também permite a replicação de vetores parvovirais recombinantes, incluindo vetores rAAV. Por exemplo, a linha celular usada pode ser de linhas celulares de Spodoptera frugiperda, Drosophila ou linhas celulares de mosquito, por exemplo, linhas celulares derivadas de Aedes albopictus. As células de inseto ou as linhas celulares preferidas são células de espécies de mosquito que são suscetíveis à infecção de baculovírus, incluindo, por exemplo, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, 51900+, Sf2l, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAml, Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, USA) e expresSF+® (US 6,103,526; Protein Sciences Corp., CT, USA).

[0037] Uma célula de inseto preferida de acordo com a invenção é uma célula de inseto para a produção de vetores parvovirais recombinantes. A célula de inseto ainda compreende, além do descrito acima a "primeira" e a "segunda" sequências de nucleotídeo ou uma construção de ácidos nucleicos da primeira e a segunda sequências de nucleotídeos: a) uma terceira sequência de nucleotídeo que compreende pelo menos uma sequência de repetição de terminal invertido parvoviral (ITR) e b) uma quarta sequência de nucleotídeo que compreende sequências codificadoras de proteína Cap parvoviral operacionalmente ligadas às sequências de controle e expressão para a expressão em uma célula de inseto.

[0038] No contexto da invenção "pelo menos uma sequência de nucleotídeo parvoviral ITR" é pretendido significar uma sequência palindrômica, que compreende a maioria das sequências simetricamente dispostas complementares, também referidas como regiões "A," "B" e "C". As funções de ITR como uma origem de replicação, um local tendo um papel "cis" na replicação, isto é, sendo um local de reconhecimento para proteínas de replicação de atuação trans, tais como por exemplo, Rep 78 (ou Rep68) que reconhece o palíndromo e sequências específicas internas ao palíndromo. Uma exceção à simetria da sequência ITR é a região "D" do ITR. Esta é única (não tendo um complemento dentro de um ITR). O corte de DNA de filamento duplo ocorre na junção entre as regiões A e D. esta é a região onde a nova síntese de DNA inicia-se. A região D normalmente acomoda-se em um lado do palíndromo e fornece direcionalidade à etapa de replicação de ácido nucleico. Uma replicação de parvovírus em uma célula de mamífero tipicamente tem duas sequências de ITR. Entretanto, é possível projetar um ITR de modo que os locais de ligação que estejam em ambos os filamentos das regiões A e regiões D estejam localizado de maneira simétrica, um de cada lado do palíndromo. Em um padrão de DNA circular de filamento duplo (por exemplo, um plasmídeo), a replicação de ácido nucleico auxiliada por Rep78 ou Rep68 então procedeu em ambas as direções em um ITR é suficiente para a replicação parvoviral de um vetor circular. Desta maneira, uma sequência de nucleotídeo ITR pode ser usada no contexto da presente invenção. Preferivelmente, entretanto, dois ou outros números de ITRs regulares são usados. Mais preferivelmente, duas sequências de ITR são usadas. Um ITR parvoviral preferido é um AAV ITR. Por razões de segurança pode ser desejável construir um vetor parvoviral recombinante (rAAV) que é incapaz de ainda propagar-se após a introdução inicial e uma célula na presença de um segundo AAV. Um tal mecanismo de segurança para limitar a propagação de vetor indesejada em um receptor pode ser fornecido usando-se rAAV com um ITR quimérico como descrito em US2003148506.

[0039] O número de construções de ácido nucleico em uma célula de inseto para a produção do vetor parvoviral recombinante (rAAV) não é limitante na invenção. Por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais construções separadas podem ser utilizadas para a produção de rAAV em células de inseto de acordo com os métodos da presente invenção. Se cinco construções forem utilizadas, uma construção codifica AAV VP 1, uma outra construção codifica AAV VP2, ainda, uma outra construção codifica AAV VP3, ainda, uma outra construção codifica a proteína Rep como definido acima e uma construção final compreende pelo menos um AAV ITR. Se menos do que cinco construções foram usadas, as construções podem compreender várias combinações do pelo menos um AAV ITR e o VP1, VP2, VP3 e as sequências que codificam a proteína Rep.

[0040] Preferivelmente, duas, três ou quatro construções são usadas. Se duas construções forem usadas, preferivelmente, a célula de inseto compreende: (A) uma primeira construção de ácido nucleico para a expressão das proteínas Rep como definido acima, cuja construção ainda compreende as quatro sequências de nucleotídeo como definido em (b) acima (que compreende sequências codificadoras de proteína Cap parvoviral operacionalmente ligadas a pelo menos uma sequência de controle de expressão para a expressão em uma célula de inseto; ver também abaixo) e (B) uma terceira construção de ácido nucleico que compreende a terceira sequência de nucleotídeo como definido em (a) acima (que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo parvoviral/AAV ITR). Se três construções forem usadas, preferivelmente, a mesma configuração como usado para as duas construções é usado exceto separando-se as construções são usadas para a expressão das proteínas capsídicas e para a expressão das proteínas Rep. Se quatro construções forem usadas, preferivelmente, a mesma configuração como usada para as três construções é usada exceto que as construções separadas são usadas para a expressão das proteínas Rep78/68 e para a expressão das proteínas Rep 52/40. As sequências em cada construção podem estar em qualquer ordem com relação um ao outro. Por exemplo, se uma construção compreender ITRs e um ORF que compreende sequências de nucleotídeo que codificam proteínas capsídicas VP, o VP ORF pode estar localizado na construção, tal que tal que, na replicação DNA entre sequências ITR, o VP ORF é replicado ou não replicado. Para um outro exemplo, as sequências codificadoras de Rep e/ou o ORF que compreende sequências de nucleotídeo que codificam proteínas capsídicas VP podem estar em qualquer ordem em uma construção. Também é entendido que a terceira, quarta e outras construções de ácido nucleico preferivelmente são um vetor compatível com célula de insetos, preferivelmente vetores baculovirais como descrito acima. Alternativamente, em uma célula de inseto da invenção, uma ou mais da primeira sequência de nucleotídeo, terceira sequência de nucleotídeo, quarta sequência de nucleotídeo e quinta sequência de nucleotídeo e ainda sequências de nucleotídeo opcionais podem ser estavelmente integradas no genoma da célula de inseto. Uma pessoa de habilidade comum na técnica conhece como introduzir estavelmente a sequência de nucleotídeo no genoma do inseto e como identificar uma célula tendo uma tal sequência de nucleotídeo no genoma. A incorporação no genoma pode ser auxiliada, por exemplo, pelo uso de um vetor que compreende sequências de nucleotídeo altamente homólogas às regiões de genoma de inseto. O uso de sequências específicas, tais como transposons, é uma outra maneira de introduzir uma sequência de nucleotídeo em um genoma.

[0041] Na invenção, a quarta sequência de nucleotídeo que compreende sequências codificadoras de proteína capsídica parvoviral (Cap) é entendida aqui compreender sequências que codificam cada uma das três proteínas capsídicas parvovirais, VP1, -2 e -3. As quatro sequências de nucleotídeo que compreendem as sequências codificadoras de proteína capsídica podem estar presentes em várias formas. Por exemplo, sequências codificadoras separadas para cada uma das proteínas capsídicas VP1, -2 e -3 podem ser usadas, por meio das quais cada sequência codificadora está operacionalmente ligada às sequências de controle e expressão para a expressão em uma célula de inseto. Mais preferivelmente, entretanto, a quarta sequência de nucleotídeo compreende uma estrutura de leitura aberta simples que codifica todas as três proteínas capsídicas parvovirais animais (AAV) VP1, VP2 e VP3, em que o códon de iniciação para a tradução da proteína capsídica VP1 é um códon de iniciação subótimo que não é ATG como por exemplo, como descrito por Urabe et al. (2002, supra) e no WO2007/046703. O códon de iniciação subótima para a proteína capsídica VP1 pode ser selecionada de ACG, TTG, CTG e GTG, da qual CTG e GTG são mais preferidos. A quarta sequência de nucleotídeo par a expressão das proteínas capsídicas ainda pode compreender, em uma ou mais modificações como descrito no WO2007/046703.

[0042] Várias modificações adicionais de regiões codificadoras de VP são conhecidas pelo técnico habilitado que pode aumentar o rendimento de VP e vírion ou ter outros efeitos desejados, tais como tropismo alterado ou reduzir a antigenicidade do vírion. Estas modificações estão dentro do escopo da presente invenção. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo da invenção que codifica as proteínas capsídicas parvovirais está operacionalmente ligada às sequências de controle e expressão para a expressão em uma célula de inseto, que, pelo menos, incluirá um promotor que é ativo em células de inseto. Tais sequências de controle e ainda técnicas e materiais (por exemplo, vetores) para a expressão de proteínas capsídicas parvovirais em células hospedeiras de inseto já são descritas acima para as proteínas Rep.

[0043] Em uma forma de realização preferida da invenção, a terceira sequência de nucleotídeo presente na célula de insetos da invenção, isto é, a sequência que compreende pelo menos um ITR parvoviral (AAV), ainda compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse, por meio das quais preferivelmente a pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse torna-se incorporada no genoma de um vetor parvoviral recombinante (rAAV) produzido na célula de inseto. Preferivelmente, pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse é uma sequência para a expressão em uma célula de mamífero. Preferivelmente, a terceira sequência de nucleotídeo compreende duas sequências ITR parvovirais (AAV) de nucleotídeo e em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse está localizada entre as duas sequências de nucleotídeo ITR parvoviral (AAV). Preferivelmente, a sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse (para a expressão na célula de mamífero) será incorporada no vetor parvoviral recombinante (rAAV) na célula de inseto se esta estiver localizada entre dois ITRs regulares ou está localizada de cada lado de um ITR projetado com duas regiões D.

[0044] A terceira sequência de nucleotídeo definida neste acima pode, desta maneira, compreender a sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos um "produto de gene de interesse" para a expressão em uma célula de mamífero, localizada tal que este será incorporado em um vetor parvoviral recombinante (rAAV) replicado em uma célula de inseto. Qualquer sequência de nucleotídeo pode ser incorporada para a expressão posterior em uma célula de mamífero transfectada com o vetor parvoviral recombinante (rAAV) produzido de acordo com a presente invenção. A sequência de nucleotídeo, por exemplo, pode codificar uma proteína que pode expressar um agente de RNAi, isto é, uma molécula de RNA que é capaz de interferência com o RNA tal como, por exemplo, um shRNA (hairpinRNA curto) ou um siRNA (RNA de interferência curto). "siRNA" significa um RNA de interferência pequeno que é um RNA de filamento duplo de comprimento curto que não são tóxicos em células de mamífero (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47). Em uma forma de realização preferida, a terceira sequência de nucleotídeo pode compreender duas sequências de nucleotídeo e cada um codifica um produto de gene de interesse para a expressão em uma célula de mamífero. Cada uma das duas sequências de nucleotídeo codifica um produto de interesse está localizado tal que será incorporada em um vetor parvoviral recombinante (rAAV) replicado na célula de inseto.

[0045] O produto de interesse para a expressão em uma célula de mamífero pode ser um produto de gene terapêutico. Um produto de gene terapêutico pode ser um polipeptídeo, ou uma molécula de RNA (siRNA) ou outro produto de gene que, quando expressado em uma célula alvo, fornece um efeito terapêutico desejado, tal como, por exemplo, separação de uma atividade indesejada, por exemplo, a separação de uma célula infectada ou a complementação de um defeito genético, por exemplo, causando uma deficiência em uma atividade enzimática. Os exemplos de produtos de gene de polipeptídeo terapêuticos incluem CFTR, Fator IX, Lipoproteína lipase (LPL, preferivelmente LPL S447X; ver WO 01/00220), Apolipoproteína A1, Uridina Difosfato Glucuronosiltransferase (UGT), Proteína de Interação Reguladora de GTPase de Retinite Pigmentosa (RP-GRIP) e citocinas ou interleucinas como por exemplo, IL-10, porfobilinogênio desaminase (PBGD) e alanina:glioxilato aminotransferase.

[0046] Alternativamente ou além disso, como um terceiro produto de gene, a terceira sequência de nucleotídeo definida anteriormente pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que serve como proteínas marcadoras para estimar a transformação e expressão celular. As proteínas marcadoras adequadas para este propósito são por exemplo, a proteína fluorescente GFP e os genes marcadores selecionáveis HSV timidina cinase (para a seleção em meio HAT), higromicina bacteriana B fosfotransferase (para a seleção em higromicina B), Tn5 aminoglicosídeo fosfotransferase (para a seleção em G418) e diidrofolate redutase (DHFR) (para a seleção em metotrexato), CD20, o gene do fator de crescimento de nervo de afinidade baixa. As fontes para obter estes genes marcadores e métodos para seu uso são fornecidos em Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3° edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Além disso, a terceira sequência de nucleotídeo definida anteriormente acima pode compreender a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que pode servir como um mecanismo falho-seguro que permite curar um paciente de células transduzidas com o vetor parvoviral recombinante (rAAV) da invenção, se considerado necessário. Uma tal sequência de nucleotídeo, frequentemente referida como gene suicida, codifica uma proteína que é capaz de converter um pró-medicamento em uma substância tóxica que é capaz de matar as células transgênicas em que a proteína é expressada. Os exemplos adequados de tais genes suicidas incluem por exemplo, o gene de citosina desaminase de E. coli ou um dos genes de timidina cinase de Vírus do Herpes Simples, Citomegalovírus e vírus Varicella-Zoster, caso no qual o ganciclovir pode ser usado como pró-medicamento para matar as células transgênicas no paciente (ver, por exemplo, Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849).

[0047] Em uma outra forma de realização, um dos produtos de gene de interesse pode ser uma proteína AAV. Em particular, uma proteína Rep, tal como Rep78 ou Rep68 ou um fragmento funcional desta. A sequência de nucleotídeo que codifica um Rep78 e/ou um Rep68, se presente no genoma de um vetor parvoviral recombinante (rAAV) da invenção e expressado em uma célula de mamífero transduzida com o vetor, permite a integração do vetor parvoviral recombinante (rAAV) no genoma da célula de mamífero transduzida. A expressão de Rep78 e/ou Rep68 em uma célula de mamífero transduzida ou infectada rAAV pode fornecer uma vantagem para certos usos do vetor parvoviral recombinante (rAAV), permitindo a expressão de longo período ou permanente de qualquer outro produto de gene de interesse introduzido na célula pelo vetor.

[0048] Nos vetores parvovirais recombinantes (rAAV) da invenção a pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse para a expressão em uma célula de mamífero, preferivelmente são operacionalmente ligadas a pelo menos uma sequência de controle de expressão compatível com a célula de mamífero, por exemplo, um promotor. Muitos tais promotores são conhecidos na técnica (ver Sambrook and Russel, 2001, supra). Os promotores constitutivos que são amplamente expressados em muitos tipos de células, tal como o promotor de CMV podem ser usados. Entretanto, mais preferidos serão os promotores que são indutíveis, específicos de tecido, específicos do tipo celular ou específicos do ciclo celular. Por exemplo, para a expressão específica de fígado, um promotor pode ser selecionado de um promotor α1-anti-tripsina (AAT), um promotor de globulina de ligação de hormônio de tireóide, um promotor de albumina, um promotor de LPS (globina de ligação de tiroxina), um promotor híbrido de HCR, um promotor híbrido de HCR-hAAT, um promotor de AAT combinado com o elemento intensificador de gene de albumina de camundongo (Ealb) e um promotor E de apolipoproteína. Outros exemplos incluem o promotor de E2F para a expressão seletiva de tumor e, em particular, seletiva de tumor de célula neurológica (Parr et al., 1997, Nat. Med. 3:1145-9) ou o promotor IL-2 para o uso em células sanguíneas mononucleares (Hagenbaugh et al., 1997, J Exp Med; 185: 2101-10).

[0049] O AAV é capaz de infectar diversas células de mamíferos. Ver, por exemplo, Tratschin et al. (1985, Mol. Cell Biol. 5:3251-3260) and Grimm et al. (1999, Hum. Gene Ther. 10:2445-2450). Entretanto, a transdução de AAV de fibroblastos sinoviais humanos é significantemente mais eficaz do que em células de murino similares, Jennings et al., Arthritis Res, 3:1 (2001) e a tropicidade celular de AAV difere entre os sorotipos. Ver, por exemplo, Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:34283432), que debate diferenças entre AAV2, AAV4 e AAV5 com respeito ao tropismo de célula do CNS de mamífero e eficiência de transdução.

[0050] As sequências AAV que podem ser usadas na presente invenção para a produção de vetores de AAV recombinantes em células de inseto podem ser derivadas do genoma de qualquer sorotipo AAV. Em geral, os sorotipos AAV têm sequências genômicas de homologia significante no aminoácido e os níveis de ácido nucleico, forencem uma série idêntica de funções genéticas, produzem vírions que são essencialmente física e funcionalmente equivalentes e replicam e montam praticamente por mecanismo idênticos. Para a sequência genômica dos vários sorotipos AAV e uma visão geral das similaridades genômicas ver, por exemplo, número de Acessão GenBank U89790; número de Acessão GenBank J01901; número de Acessão GenBank AF043303; número de Acessão GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319) e Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Os sorotipos AAV 1, 2, 3, 4 e 5 são fonte preferida de sequências de nucleotídeo AAV para o uso no contexto da presente invenção. Preferivelmente, as sequências de AAV ITR para o suo no contexto da presente invenção são derivados de AAV1, AAV2 e/ou AAV4. Também, as sequências codificadoras Rep (Rep78/68 e Rep52/40) são preferivelmente derivadas de AAV1, AAV2 e/ou AAV4. As sequências codificam quanto às proteínas capsídicas VP1, VP2 e VP3 proteínas para o suo no contexto da presente invenção pode, entretanto, ser retirada de qualquer um dos 42 sorotipos conhecidos, mais preferivelmente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 ou AAV9 ou partícula semelhantes a AVV recentemente desenvolvidas obtidas por, por exemplo, técnias de mistura de capsídeos e bibliotecas de capsídeo AAV.

[0051] As sequências de Rep e ITR de AAV são particularmente conservadas entre mais sorotipos. As proteínas Rep78 de vários sorotipos AAV são, por exemplo, mais do que 89 % idênticas e a identidade de sequência total de nucleotídeo no nível de genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B e AAV6 está em torno de 82 % (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). Além disso, as sequências Rep e ITRs de muitos sorotipos AAV são conhecidas por cruzar-complementar eficazmente (isto é, substituir funcionalmente) as sequências correspondentes de outros sorotipos na produção de partículas de AAV em células de mamíferos. O US2003148506 relata que o as sequências AAV Rep e ITR também cruzam-complementam eficazmente outras sequências AAV Rep e ITR em células de inseto.

[0052] As proteínas AAV VP são conhecidas por determinar a tropicidade celular do vírion AAV. As sequências codificadoras de proteína VP são significanemente menos conservadas do que as proteínas Rep e genes entre sorotipos AAV diferentes. A capacidade de sequências Rep e ITR para cruzar-complementar sequências correspondentes de outros sorotipos permite a produção de partículas de rAAV pseudotipadas que compreende as proteínas capsídicas de um sorotipo (por exemplo, AAV3) e as sequências de Rep e/ou ITR de um outro sorotipo AAV (por exemplo, AAV2). Tais partículas de rAAV pseudotipadas são uma parte da presente invenção.

[0053] As sequências de "AAV" modificadas também podem ser usadas no contexto da presente invenção, por exemplo, para a produção de vetores rAAV em células de inseto. Tais sequências modificadas, por exemplo, incluem sequências tendo pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou mais nucleotídeos e/ou sequência de identidade de aminoácido (por exemplo, uma sequência tendo cerca de 75 a 99 % identidade da sequência de nucleotídeo) a um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 ou AAV9 ITR, Rep, ou VP pode ser usado no lugar do AAV ITR de tipo selvagem, Rep, ou sequências VP.

[0054] Apesar de similar a outros sorotipos AAV em muitos aspectos, AAV5 difere-se de outro sorotipo AAV humano e símio mais do que outro sorotipo conhecido humano ou símio. Em vista destes, a produção de rAAV5 pode diferenciar da produção de outros sorotipos em células de inseto. Onde os métodos invenção são utilizados para produzir rAAV5, é preferido que uma ou mais construções que compreendem, coletivamente no caso de mais do que uma construção, a sequência de nucleotídeo que compreende um AAV5 ITR, a sequência de nucleotídeo compreende uma sequência codificadora AAV5 Rep (isto é a sequência de nucleotídeo compreende um AAV5 Rep78). Tais sequências ITR e Rep pode ser modificado como desejado por obter a produção eficiente de rAAV5 ou pseudotipos de vetores rAAV5 em células de inseto. Por exemplo, o códon de partida das sequências Rep podem ser modificados, locais de união VP podem ser modificados ou eliminados, e/ou o códon de partida VP1 e nucleotídeos próximos podem ser modificados para melhorar uma produção de vetores rAAV5 em uma célula de inseto.

[0055] Em um outro aspecto a invenção diz respeito a um método para a produção de um vírion parvoviral recombinante (rAAV) (que compreende um vetor parvoviral recombinante (rAAV) como definido acima) em uma célula de inseto. Preferivelmente, o método compreende as etapas de: (a) cultura de uma célula de inseto como definido neste acima sob condições tais que o vetor parvoviral recombinante (rAAV) é produzido; e, (b) recuperação do vetor parvoviral recombinante (rAAV). É entendido neste que o vetor parvoviral recombinante (rAAV) produzido no método preferivelmente é um parvoviral infeccioso ou vírion AAV que compreende os ácidos nucleicos do vetor parvoviral recombinante (rAAV). As condições de desenvolvimento para as células de insetos em cultura, e produção de produtos heterólogos em células de inseto em cultura são bem conhecidos na técnica e descritos por exemplo nas referências citadas acima na engenharia molecular das células de insetos (ver também WO2007/046703).

[0056] Preferivelmente o método ainda compreende a etapa de purificação por afinidade do (vírions que compreendem o) vetor parvoviral recombinante (rAAV) usando um anticorpo anti-AAV, preferivelmente um anticorpo imobilizado. O anticorpo anti-AAV preferivelmente é um anticorpo monoclonal. Um anticorpo particularmente adequado é um anticorpo camelídeo de cadeia simples ou um fragmento destes como por exemplo obtidos a partir dos camelos ou lhamas (ver por exemplo Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302). O anticorpo para a purificação por afinidade de rAAV preferivelmente é um anticorpo que especificamente liga-se um epítopo em uma proteína de capsídeo AAV, por meio das quais preferivelmente o epítopo é um epítopo que está presente na proteína de capsídeo de mais do que um sorotipo AAV. Por exemplo o anticorpo pode ser crescido ou selecionado na base da ligação específica ao capsídeo AAV2 mas no mesmo período também pode especificamente ligar-se aos capsídeos AAV1, AAV3 e AAV5.

[0057] Já em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma construção de ácido nucleico que compreende uma primeira e a uma segunda sequência de nucleotídeo como definido neste definido acima.

[0058] Em um aspecto diferente uma invenção diz respeito a um método para a produção de um vírion parvoviral recombinante (rAAV) (que compreende um vetor parvoviral recombinante (rAAV) como definido acima) em uma célula de inseto. Preferivelmente, o método compreende as etapas de: (a) cultura de uma célula de inseto como definido neste acima sob condições tal que vetor parvoviral recombinante (rAAV) é produzido, em que a célula de inseto compreende pelo menos uma construção de ácido nucleico para a expressão de proteínas parvoviral Rep78/68 e Rep52/40 (tal como por exemplo a construção de ácido nucleico que compreende a primeira e a segunda sequência de nucleotídeos como definido neste acima) e ainda compreende uma terceira e uma quarta sequência de nucleotídeos como definido neste acima e em que a construção de ácidos nucleicos para a expressão de proteínas parvoviral Rep78/68 e Rep52/40 produz um nível de expressão Rep52/40 em uma célula de inseto que é mais alto do que o nível de expressão Rep78/68 em uma base molar; e, (b) recuperação do vetor parvoviral recombinante (rAAV). Preferivelmente no método a razão molar da proteína Rep52/40 a Rep78/68 em uma célula de inseto é mais alto do que 10:1, preferivelmente pelo menos 11:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 ou 60:1. Uma razão molar da proteína Rep52/40 a Rep78/68 em uma célula de inseto mais alta do que 10:1 vantajosamente resulta em uma razão maior de vírions totais (isto é que compreende um genoma rAAV) para esvaziar os vírions (ver por exemplo Figura 8). Entretanto, uma razão muito maior de proteína Rep52/40 a Rep78/68 pode resultar em um titulador inferior de rAAV produzido como determinado por diversas cópias dos genes. Em uma forma de realização portanto uma razão molar de proteína Rep52/40 a Rep78/68 é menor do que 100:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, ou 20:1. A razão molar da proteína Rep78/68 e Rep52/40 pode ser determinado por meios de Western blotting como descrito em WO2007/148971, preferivelmente usando um anticorpo monoclonal que reconhece um epítopo comum de tanto Rep78/68 quanto Rep52/40, ou uso do anticorpo descrito em WO2007/148971. Preferivelmente, as razões molares mínimas das proteínas Rep52/40 e Rep78/68 como indicado acima são atingidas a cerca de 20 a 40 horas pós-infecção, mais preferivelmente a cerca de 30 a 40 horas pós- infecção, usando um sistema de expressão similar ou baculovírus.

[0059] Vários meios existem para o aumento do nível de expressão relativo das proteínas Rep52/40 em comparação com aquele da proteína Rep78/68. No caso de uma unidade de transcrição simples para a expressão de proteínas tanto Rep78/68 quanto Rep52/40 é usado, a sequência codificadora das proteínas Rep78/68 e Rep52/40 podem ser adaptadas como seguem para obter uma razão molar da proteína Rep52/40 a Rep78/68 em uma célula de inseto mais alta do que 10:1: a) o códon de iniciação de tradução da proteína Rep78/68 pode ser trocado em um códon de iniciação subótimo e/ou contexto subótimo destes como descrito em WO2007/148971; b) eliminação de uma ou mais ou todas as sequências (9) ATG que ocorre entre as partidas de tradução dos genes Rep78/68 e Rep 52/40, respectivamente, preferivelmente pelas mudanças de isocodificação em uma sequência de nucleotídeo. Este é por exemplo atingido na sequência codificadora pVD189 Rep descrito no exemplo 3 e na SEQ ID N°: 11; c) otimização do contexto do códon de iniciação de tradução da proteína Rep52/40 de acordo com o ótimo contexto iniciador de 5'-N N N N N N A U G A a/c/g N-3' para a iniciação da tradução eficiente em células de lepidoptera (como descrito em Chang et al., 1999, Virology 259:369-383); d) pela incorporação de uma sequência de controle de expressão que compreende nove sequências de nucleotídeo da SEQ. ID N°: 9 ou uma sequência de nucleotídeo substancialmente homóloga a SEQ. ID N°: 9, a montante dos códons de iniciação da proteína Rep52/40; e) melhora do viés de uso de códon da parte da sequência codificadora que codifica para a proteína Rep52/40 para a expressão em células de inseto (como descritas acima) e, f) mudança do uso de códon da parte da sequência codificadora entre as partidas de tradução das proteínas Rep78/68 e Rep 52/40 de modo que este é menos adaptado a expressão em células de inseto (como descritas acima). Combinação de a) a f) são incluídas na invenção e em uma preferida a) é combinada com pelo menos um de b) a f).

[0060] Alternativamente, e/ou em adição a uma segunda unidade de transcrição pode ser usada para a expressão da proteína Rep52/40. a expressão da proteína Rep52/40 a partir desta segunda unidade de transcrição pode ser aumentada por um ou mais de a) uso de um promotor mais forte para a unidade de transcrição Rep52/40 em comparação com o promotor para a unidade Rep78/68 (ver abaixo); b) aumento do número de cópia da unidade de transcrição Rep52/40 em comparação com aquela da unidade Rep78/68; c) melhora do viés de uso de códon da sequência codificadora que codifica para a proteína Rep52/40 para a expressão em células de inseto (como descritas acima; por exemplo SEQ ID N°: 2 ou 10); d) otimização do contexto do códon de iniciação de tradução da proteína Rep52/40 de acordo com o ótimo contexto iniciador de 5'-N N N N N N A U G A a/c/g N-3' para a iniciação de tradução eficiente em células lepidopterano (como descrito em Chang et al., supra) e, e) pela incorporação de uma sequência de controle de expressão que compreende nove sequências de nucleotídeo da SEQ. ID N°: 9 ou uma sequência de nucleotídeo substancialmente homóloga a SEQ. ID N°: 9, a montante dos códons de iniciação da proteína Rep52/40.

[0061] Um exemplo de uma construção em que duas unidades de transcrição separadas são usadas para a expressão das proteínas Rep78/68 e Rep 52/40 é a construção pVD183 como descrito nos exemplos 2 e 3 neste. As construções de ácido nucleico para o uso no método pela produção de um vírion parvoviral recombinante (e que produz um nível de expressão Rep52/40 em uma célula de inseto que é mais alto do que o nível de expressão Rep78/68 em uma base molar) são um aspecto adicional da presente invenção.

[0062] É entendido neste que o vetor parvoviral recombinante (rAAV) produzido no método preferivelmente é um parvoviral infeccioso ou vírion AAV que compreende os ácidos nucleicos do vetor parvoviral recombinante (rAAV). As condições de desenvolvimento para as células de insetos em cultura, e produção de produtos heterólogos em células de inseto em cultura são bem conhecidos na técnica e descritos por exemplo nas referências citadas acima na engenharia molecular das células de insetos (ver também WO2007/046703). Preferivelmente o método ainda compreende a etapa de purificação por afinidade do (vírions que compreendem o) vetor parvoviral recombinante (rAAV) usando um anticorpo anti-AAV como descrito acima.

[0063] Um primeiro promotor sendo igualmente forte ou mais forte do que um segundo promotor para o uso na invenção pode ser definido como seguem. A força do promotor pode ser determinada pela expressão que é obtida sob condições que são usadas no método da invenção. Em uma forma de realização preferida, o primeiro promotor ou o segundo promotor é selecionado do grupo que consiste de um promotor Po1H, promotor p10, promotor de proteína básica, um promotor indutível ou um promotor delta E1 ou um promotor E1, ou qualquer outro promotor do gene de baculovírus tardio ou muito tardio. Mais preferivelmente, o primeiro promotor é selecionado do grupo que consiste de um promotor Po1H, promotor p10 ou promotor de proteína básica e em que um segundo promotor é um promotor delta E1 ou um promotor E1, ou qualquer outro promotor do gene do baculovíus precoce ou tardio. Preferivelmente, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor p10 e um segundo promotor é um promotor Po1H ou um promotor 4xHsp27 EcRE+mínimo Hsp70. Em uma outra forma de realização, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor 4xHsp27 EcRE+mínimo Hsp70 e um segundo promotor é um promotor Po1H. Já em uma outra forma de realização, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor Po1H e um segundo promotor é um p10, um promotor delta E1 ou um E1. Já em uma outra forma de realização, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor Po1H e um segundo promotor é um promotor delta E1 ou um E1. Já em uma outra forma de realização, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor p10 e um segundo promotor é um promotor delta E1 ou um E1. Já em uma outra forma de realização, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor Po1H e um segundo promotor é um promotor Po1H. Mais preferivelmente, o primeiro promotor na construção de ácido nucleico da invenção é um promotor Po1H e um segundo promotor é um promotor delta E1.

[0064] Um "elemento intensificador" ou "intensificador" é o meio para definir uma sequência que intensifica a atividade de um promotor (isto é aumenta a taxa de transcrição de uma sequência à jusante do promotor) que, como oposto a um promotor, não possui atividade promotora, e que pode usualmente a função sem consideração desta localização com relação ao promotor (isto é a montante, ou à jusante do promotor). Elementos intensificadores são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes dos elementos intensificadores (ou partes destes) que devem ser usados na presente invenção incluem intensificadores de baculovírus e elementos intensificadores observados nas células de inseto. É preferido que o elemento intensificador aumenta em uma célula da expressão mRNA de um gene, no qual o promotor é operacionalmente ligado, por pelo menos 25 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 100 %, e mais preferivelmente pelo menos 200 % em comparação com a expressão mRNA do gene na ausência do elemento intensificador. A expressão mRNA pode ser determinada por exemplo pela RT-PCR quantitativa.

[0065] Neste é preferido o uso de um elemento intensificador para intensificar a expressão da proteína Rep parvoviral. Deste modo, em uma forma de realização adicional preferida, o primeiro cassete de expressão compreende pelo menos um elemento intensificador do baculovírus e/ou pelo menos um elemento responsivo a ecdisona. Preferivelmente o elemento intensificador é selecionado do grupo que consiste de hr1, hr2, hr3, hr4 e hr5.

[0066] Neste documento e nestas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações é usado neste sentido não limitante significa que os itens seguintes da palavra são incluídos, mas itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade que mais do que um do elemento esteja presente, a não ser claramente no contexto requer que tenha um ou apenas um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma" deste modo usualmente significa "pelo menos um".

[0067] Todas as Patentes e referências de literatura citadas na presente especificação são neste incorporadas em sua totalidade.

[0068] Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para o propósito ilustrativo, e não são pretendidos limitar o escopo da presente invenção em qualquer maneira.

Descrição das Figuras

[0069] Figura 1 Mapa físico de pVDl83.

[0070] Figura 2 Razões das cópias do genoma do gene ORF 1629 e o gene Rep nas amostras de baculovírus retirados em passagens diferentes da construção de baculovírus Bac.FBDSLR (Urabe et al., 2002, Hum Gene Ther. 13(16):1935-43). As cópias genômicas foram medidas por QPCR.

[0071] Figura 3 Razões das cópias genômicas do gene ORF 1629 e o gene Rep nas amostras de baculovírus retiradas em passagens diferentes da construção do baculovírus pVD183 da invenção. As cópias genômicas foram medidas por QPCR.

[0072] Figura 4 Produção rAAV com BacVD183. A imersão na produção é causada por uma redução na quantidade do presente baculovírus.

[0073] Figura 5 ORF QPCR nas passagens de Bac.VD183.

[0074] Figura 6 Expressão Western blot Rep para diversas passagens de Bac.VD183. "88" indicam a construção Bac.VD88, que é referido como REP-ACG/PSC no WO2007/148971, que é usado neste como um controle. A quantidade da expressão Rep é relacionada à concentração de Bac.VD183.

[0075] Figura 7 Q-PCR no volume da célula bruta (CLB) a partir das produções rAAV1 usando três construções diferentes pelas proteínas Rep: VD88, VD183, e VD189. 5:1:1 refere-se a razão das baculovírus diferentes usadas na produção, 5 refere-se ao Bac.VD88, Bac.VD183, ou Bac.VD189, o primeiro 1 refere-se ao Bac.VD84 (contendo o gene de capsídeo AAV1) e a segunda 1 refere-se ao baculovírus contendo a construção ITR, Bac.VD43.

[0076] Figura 8 O CLB a partir das três produções rAAV 1 diferentes foram purificadas em uma coluna Llama específica por capsídeo AAV e nas bateladas purificadas das cópias genômicas e as partículas rAAV totais foram medidas. Dividindo as partículas rAAV totais pelos resultados do número Q- PCR no total: razão total mencionada neste. 5:1:1 refere-se a razão da Baculovírus diferente usado na produção, 5 refere-se ao Bac.VD88, Bac.VD183, ou Bac.VD189, o primeiro 1 refere-se ao Bac.VD84 (contendo o gene de capsídeo AAV1) e a segunda refere-se ao baculovírus contendo a construção ITR, Bac.VD43.

[0077] Figura 9 Amostras Rep western blot. foram retiradas em diversas passagens do baculovírus Bac.VD88 ou Bac.VD189 e um western blot foi realizado. A quantidade Rep52 relativa a quantidade Rep78 é consistentemente mais alto para o Bac.VD189.

[0078] Figura 10 Amostras Rep western blot. foram retiradas nas diversas passagens da amplificação do baculovírus Bac.VD183 e um Rep western blot foi realizado. A quantidade Rep52 relativa à quantidade Rep78 é mais alta para o Bac.VD183 então por Bac.VD189 e Bac.VD88.

Exemplos 1. Exemplo 1 1.1 . Materiais & Métodos 1.1.1 Construção de plasmídeo do baculovírus

[0079] O pFBDSLR (Urabe et al., 2002, supra) é um vetor de expressão pFastBacDual (Invitrogen) que compreende 2 cassetes de expressão separados para as proteínas AAV2 Rep78 e Rep52, por meio das quais a expressão das proteínas Rep52 é conduzido pelo promotor polH e expressão da proteína Rep78 a partir do promotor DIE. Esta construção foi subclonada ao pPSC10, um plasmídeo que é compatível com o GeneXpress BaculoKlT (Protein Sciences Corporation).

[0080] A sequência codificadora Rep52 de tipo selvagem no cassete de expressão Rep 52 é substituído com a sequência codificadora Rep52 otimizada por códon da SEQ ID N°. 2 para produzir pPSC1ORep-52CD.

[0081] A sequência codificadora Rep52 de tipo selvagem no cassete de expressão Rep78 de pPSClORep-52CD é substituída com a sequência codificadora Rep52 otimizada por AT da SEQ ID N°. 3 para produzir pPSClORep-52CD/78AT.

[0082] A sequência codificadora Rep52 de tipo selvagem no cassete de expressão Rep78 de pPSClORep-52CD é substituída com a sequência codificadora Rep52 otimizada por GC da SEQ ID N°. 4 para produzir pPSClORep-52CD/78GC.

1.1.2 Produção de baculovírus recombinante

[0083] O baculovírus recombinante derivado a partir de vírus de poliidrose nuclear múltiplo de Autographa californica (AcMNPV) são produzidos usando o GeneXpress BaculoKlT (Protein Sciences Corporation). A transfecção é realizada como seguem: em um tubo de 14 ml de fundo redondo, 200 μl de meio GRACE é misturado com 6 μl de cellfectina (Invitrogen), e em um tubo eppendorf, 200 μl meio GRACE é misturado com 50 μl de DNA viral (protein sciences) e 2 μg do plasmídeo de transferência (REP). Os conteúdos a partir do tubo eppendorf são adicionados ao tubo e misturado cuidadosamente. Após um período de incubação de 30 minutos em temperatura ambiente 1.300 μl GRACE é adicionado à mistura de transfecção. As células de inseto em um frasco T25 são lavadas com meio GRACE e a mistura de captura de transfecção é adicionada as gotas à camada celular. Após uma incubação de 6 horas a 28° C de soro SF900II suplementado com 10 % de FBS é adicionado cuidadosamente e o frasco T25 foi colocado em um forno a 28° C por 5 dias após que o baculovírus recombinante é coletado.

1.2 Resultados

[0084] O desempenho do pPSClORep-52CD, pPSClORep- 52CD/78AT e pPSClORep-52CD/78GC pPSClORep novamente projetado é comparado com as construções Rep originais pFBDSLR de Urabe et al. (2002, supra). Todas as quatro construções são seriamente passadas pela passagem 5. Os experimentos de produção AAV 1 recombinante são realizados usando a passagem 2, 3, 4, e construções 5 Rep em combinação com um baculovírus contendo um cassete de expressão de mamífero de um gene repórter entre AAV ITR's (AAV-LPL) e um baculovírus contendo uma célula do cassete de expressão para o AAVl-Cap (AAV-cap) respectivamente da passagem 2, 3, 4 e 5. Os baculovírus recombinantes AAV-LPL e AAV- Cap como usado neste são descritos em WO2007/046703. Os rendimentos da produção AAV1-LPL são determinados por QPCR. O baculovírus original projetado por Urabe et al., 2002 (original REP/Bac-to-Bac) resultados em uma diminuição rápida da produção AAV em 5 passagens. Entretanto, o baculovírus com as unidades de expressão REP de pPSClORep-52CD, pPSClORep-52CD/78AT e pPSClORep-52CD/78GC resultam na produção AAV estável em pelo menos 5 passagens. Portanto, os rendimentos da produção reproduzidos em diversas passagens AAV-LPL (por exemplo 2 a 5) são apenas obtidos usando baculovírus contendo o pPSC 1 ORep-52CD, pPSC 1 ORep-52CD/78AT e construções pPSC10Rep-52CD/78GC.

2. Exemplo 2

[0085] Este tem previamente sido descrito que os vetores de expressão contendo 2 cassetes de expressão separados para as proteínas AAV Rep78 e Rep52 são geneticamente instáveis no baculovírus (ver por exemplo WO2007/148971 and Kohlbrenner et al., 2005, Mol Ther. 12(6):1217-25). Temos agora apresentado para aplicar a otimização de uso do códon (com relação ao uso de códon do nucleopoliedrovírus múltiplo de Autographa californica (AcMNPV)) de apenas uma da sequência codificadora Rep52 e não a sequência codificadora Rep78 de modo como para introduzir as mudanças suficientes entre as partes previamente idênticas da sequência codificadora Rep52 e Rep78 para reduzir os eventos de recombinação. Mostramos agora que este é o caso de fato.

2.1 Clonagem

[0086] Um plasmídeo contendo os cassetes de expressão Rep duplos originais no plasmídeo pPSC10 Protein Sciences Corporation, pVD42 foi modificado. O pVD42 contém o gene rep78 conduzido pelo promotor delta E1, e o gene rep52 conduzido pelo promotor Po1H, como na construção original pFBDSLR (Urabe et al., 2002, Hum Gene Ther. 13(16):1935-43). A sequência codificadora rep52 no pVD42 foi substituído por uma sequência codificadora rep52 sintética do uso de códon de que foi adaptado ao uso do códon de nucleopoliedrovírus múltiplo de Autographa californica (AcMNPV) (ver Tabela 2; e http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=46015). Este códon AcMNPV otimizado pela sequência codificadora AAV2 rep52 é descrita na SEQ ID N°: 10. Um mapa físico do plasmídeo pVD183 resultante, que compreende o códon otimizado por AcMNPV da sequência codificadora AAV2 rep52 conduzido a partir do promotor Po1H e a sequência codificadora AAV2 rep78 de tipo selvagem conduzida a partir do promotor delta E1, é mostrado na Figura 1.

2.2 Resultados

[0087] Temos feito um baculovírus recombinante do plasmídeo pVD183 e o baculovírus submeteu a passagem 10 vezes para analisar sua estabilidade genética. Analisamos a estabilidade genética da construção por QPCR no genoma do baculovírus e o gene Rep52, por western blot, e pela eficiência de produção rAAV do baculovírus. No mesmo período o baculovírus original Bac.VD42 foi submetido a passagem 7 pela comparação. Os dados precoces a cerca da estabilidade de Bac.VD42 (ou Bac.FBDSLR) também são mencionados em WO2007/148971 (referido como o REP/Bac-to- Bac original).

2.2.1 QPCR

[0088] Estabilidade medida por QPCR nos genomas de baculovírus. O número de cópia de um gene que é essencial para a replicação de baculovírus e que é usado pela produção do BacVD183 a partir da recombinação pVD183 a ORF1629 e ORF603 entre o pVD183 e a cadeia principal do baculovírus a partir da Protein Sciences. ORF 1629 (ORF), foi medido por QPCR, e o número de cópia dos genes Rep também foi medido por QPCR. A razão entre estes 2 genes deve ficar o mesmo durante a passagem subsequente do baculovírus. A Figura 2 mostra a comparação que Bac.FBDSLR é antes instável. A Figura 3 mostra que Bac.VD183 é significantemente mais estável. Notamos que a eficiência dos 2 iniciadores apresentados usados no QPCR não é necessariamente igual, portanto uma razão diferente de 1 pode ser obtido. Um indicador mais importante da estabilidade é, entretanto, que a razão deve ficar relativamente constante durante as passagens múltiplas. A passagem 3 de Bac.FBDSLR já é subótimo, como a razão é em torno de 0,25 e apenas consegue o pior. Bac.VD183 também inicia em torno de 0,3 mas oscila em torno da razão, indicando que existe uma situação estável. As anulações nos resultados do genoma da cadeia principal em um baculovírus que desenvolve mais rápido então o baculovírus que tem um genoma de comprimento total, por esta razão quando uma anulação ocorre, aqueles clones superdesenvolverão os outros. As variações no método QPCR pode resultar nas oscilações vistas na Figura 3.

2.2.2 Produção rAAV

[0089] A Figura 4 mostra a produção de rAAV com a construção estável Bac.VD183. A imersão na produção em passagens diferentes é causada pela redução na quantidade de baculovírus usados na produção rAAV (ver Figura 5). A Figura 5 mostra o QPCR em ORF a partir do Bac.VD183, que está diretamente relacionado à quantidade de baculovírus presente na amostra. A quantidade de baculovírus usado na produção rAAV correlaciona com a quantidade de rAAV produzido.

2.2.3 Rep western blot

[0090] A Figura 6 mostra a expressão de proteína rep durante as passagens de Bac.VD183 como analisado por Western blot.

3. Exemplo 3

[0091] O efeito do nível de expressão Rep52 em dois parâmetros da produção rAAV foi determinado. Em particular o efeito do nível de expressão relativo Rep52 comparado ao nível de expressão de Rep78 em 1) do nível de produção rAAV como expressado nas cópias de genoma por volume celular bruto por ml (gc/mL CLB) e 2) a razão de vírion AAV total ao vírion AAVs total (vírion AAV total são os vírions que compreendem uma cópia do genoma rAAV). Estes parâmetros foram comparados por três construções rAAV Rep diferentes que cada um resulta em nível de expressão Rep52 diferente e nas razões diferentes entre os níveis Rep52 e rep78. As três construções foram pVD88 (referidos como REP-ACG / PSC em WO2007/148971), pVD183 (descrito no exemplo 2 neste acima), e pVD189 (ver abaixo).

3.1 Construção de pVD189

[0092] A construção pVD88 foi re-projetada pela eliminação das sequências 9 ATG entre a partida de tradução dos genes Rep78 e Rep 52, e pela mudança do códon de iniciação de tradução Rep78 ACG ao CTG. Ver a sequência abaixo. Baseclear (Leiden, The Netherlands) sintetizado o novo gene e clonado na substituição pVD88 pela existência do gene Rep para obter pVD189. A sequência de nucleotídeo da sequência codificadora Rep em pVD189 é descrito na SEQ ID N°: 11.

3.2 Produção de rAAV

[0093] Baculovírus foram feitos com as construções VD88, VD183, e VD189, e estes foram usados pela produção de rAAV1. A comparação das construções VD88, VD183, e VD189 na produção rAAV resultou em melhor produção rAAV (cópias do genoma) como medido por Q-PCR no volume de célula bruta (CLB). A Figura 7 mostra que a construção Rep padrão VD88 que resulta em quantidades inferiores de Rep52 (Figura 9) resultam em aproximadamente 4 x 1010 GC / ml medido no CLB. VD189 que leva a uma quantidade levemente mais alta Rep 52 (Figura 9) resultou em uma produção rAAV medida em CLB de aproximadamente 9,5 x 1010 GC / ml. O VD183 que leva a uma quantidade claramente mais alta Rep52 (Figura 10) e resultou em uma produção rAAV medida em CLB de aproximadamente 6 x 1010 GC / ml.

[0094] Um parâmetro de qualidade muito importante é o total: razão total da batelada rAAV. A Figura 8 mostra que a melhor razão do (vírions) total: (vírions) total é obtida com a construção VD183 que mostra a quantidade mais alta Rep52 relativa à quantidade Rep78 em comparação com as construções Bac.VD189 e Bac.VD88 na Figura 9.

3.3 Construções adicionais

[0095] As seguintes construções são construídas, testadas e são parte da invenção: construções promotore(s) códons de iniciação e sequências codificadoras

[0096] 1, 2, 4, 5, 8 e 9 têm 1 unidade de transcrição para a expressão de proteínas Rep 78 e 52. 3, 6 e 7 têm 2 unidades de transcrição para a expressão de proteínas Rep 78 e 52.

[0097] Uma estimativa aproximada das quantidades de proteínas rep 78 e rep 52 e razões para as construções diferentes durante a produção de rAAV (rep78:rep52): 78 52 1) 1 : 1 2) 1,5 :2 3) 1 : 20 4) 5 : 0,25 5) 1 : 5 6) 0,5 : 30 7) 0,75 : 30 8) 5 : 20 9) 1 : 10 Tabela 1. Frequências de códons de Spodoptera frugiperda com base em 127 sequências codificadoras (33098 códons)

Tabela 2. Tabela de uso de códon de nucleopoliedrovírus múltiplo de Autographa californica (AcMNPV) com base em 277 sequências codificadoras (77487 códons)

GC codificador 41,86 % 1° letra GC 43,60 % 2° letra GC 32,68 % 3° letra GC 49,29 %

Claims (17)

1. Primeira construção de ácido nucleico e segunda construção de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de que a primeira construção compreende uma primeira sequência de nucleotídeo que codifica uma primeira sequência de aminoácido de uma proteína parvoviral Rep52 ou 40 e a segunda construção de ácido nucleico compreende uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica uma segunda sequência de aminoácido de uma proteína parvoviral Rep78 ou 68, em que a primeira e a segunda sequências de aminoácidos compartilham uma sequência de aminoácido comum de pelo menos 100 aminoácidos que é idêntica entre a primeira e a segunda sequências de aminoácidos, e em que a primeira sequência de nucleotídeo é a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4 e 10 e a segunda sequência de nucleotídeo é a sequência de nucleotídeo de posições 11 - 1876 de SEQ ID NO: 7.

2. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo tem o códon otimizado para a célula de inseto em comparação com a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo, ou em que a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo tem um códon otimizado para a célula de inseto em comparação com a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira sequência de nucleotídeo.

3. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a diferença no índice de adaptação de códon entre a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na primeira e na segunda sequências de nucleotídeo é pelo menos 0,2.

4. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50 % dos códons em uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido comum na segunda sequência de nucleotídeo são alterados em comparação com o códon correspondente na primeira sequência de nucleotídeo para maximizar o teor de AT ou CG da segunda sequência de nucleotídeo.

5. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são parte de uma única construção de ácido nucleico.

6. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são cada uma ligadas operacionalmente a sequências de controle de expressão para expressão em uma célula de inseto.

7. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido nucleico é parte de uma construção de ácido nucleico que é um vetor compatível com célula de inseto, preferivelmente um vetor baculoviral.

8. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o parvovírus é AAV.

9. Método para produzir um vírion parvoviral recombinante em uma célula de inseto, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) cultivar uma célula de inseto compreendendo i) construções de ácido nucleico como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, ii) uma terceira sequência de nucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo de repetição terminal invertida (ITRs) parvoviral, e, iii) uma quarta sequência de nucleotídeos compreendendo sequências codificadoras de proteína de capsídeo parvoviral operacionalmente ligadas a sequências de controle de expressão para a expressão em uma célula de inseto, sob condições tais que vírion parvoviral recombinante é produzido e, b) recuperar o vírion parvoviral recombinante.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a terceira sequência de nucleotídeo compreende ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse e através da qual a pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene de interesse se torna incorporada no genoma de um vetor parvoviral na célula de inseto.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a terceira sequência de nucleotídeos compreende duas sequências de nucleotídeos ITR parvoviral, e em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse está localizada entre duas sequências de nucleotídeo ITR parvoviral.

12. Método de acordo com as reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma da primeira, segunda sequências, terceira e quarta sequências é estavelmente integrada no genoma da célula de inseto.

13. Método de acordo com as reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das primeira, segunda, terceira e quarta sequências de nucleotídeos é/são parte(s) de uma construção de ácido nucleico que é um vetor compatível com célula de inseto, preferivelmente um vetor baculoviral.

14. Método de acordo com as reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de purificação por afinidade do vírion usando-se um anticorpo anti-parvoviral imobilizado, preferivelmente um anticorpo de camelídeo de cadeia simples ou um fragmento deste.

15. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 14, caracterizado pelo fato de que o vírion parvoviral recombinante é um vírion AAV recombinante.

16. Método para produzir um vírion parvoviral recombinante em uma célula de inseto, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) cultivar uma célula de inseto sob condições tais que o vetor parvoviral recombinante (rAAV) é produzido, em que a célula de inseto compreende pelo menos uma construção de ácido nucleico para a expressão de uma proteína Rep78 ou 68 parvoviral tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e uma proteína Rep52 ou 40 parvoviral tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6, e ainda compreende uma terceira e uma quarta sequência de nucleotídeo como definidas em qualquer uma das reivindicações de 7 a 12 e em que a pelo menos uma construção de ácido nucleico para a expressão da proteína Rep78 ou 68 parvoviral e a proteína Rep52 ou 40 produz uma razão molar de proteína Rep52 ou 40 para a proteína Rep78 ou 68 em uma célula de inseto que é mais alta do que 10:1, e (b) recuperar o vetor parvoviral recombinante (rAAV).

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucleico para a expressão da proteína Rep78 ou 68 parvoviral e da proteína Rep52 ou 40 parvoviral é uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência codificadora única para a expressão tanto das proteínas Rep78 ou 68 parvovirais quanto a proteínas Rep52 ou 40 parvovirais e em que a sequência codificadora compreende uma ou mais das seguintes características: a) o códon de iniciação para a tradução da proteína Rep78 ou 68 parvoviral é um códon de iniciação subótimo selecionado de ACG, TTG, CTG e GTG; b) uma, mais ou todas as sequências de ATG que ocorrem entre o início da tradução das proteínas Rep78 ou 68 e Rep 52 ou 40 proteínas são eliminadas; c) o contexto do códon de iniciação de tradução da proteína Rep52 ou 40 é otimizado de acordo com o contexto de iniciador ótimo de 5'- N N N N N N A U G A a/c/g N-3' para o início de tradução eficiente nas células de lepidópteras; d) uma sequência de controle de expressão que compreende uma sequência de 9 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, está presente a montante do códon de iniciação da proteína Rep52 ou 40 e, e) a parte da sequência codificadora que codifica para a proteína Rep52 ou 40 tem um códon melhorado para a célula de inseto em comparação com a parte da sequência codificadora entre o início de tradução das proteínas Rep78/68 e Rep 52/40.

Images