具体实施方式
实施例1
a、取干燥没食子药材粉碎,过2号筛,称取100g药材粉末,加水提取3次,每次加5倍量水,提取20min;
b、将提取液减压浓缩至500ml,浓缩液用***萃取至醚层澄清,弃去***层;
c、将水层部位再用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,真空干燥,温度45℃,得到30%的没食子有效部位;
d、将步骤c得到的没食子有效部位用凝胶层析柱(型号:Sephadex LH-20)进行化学成分的分离,以水和20%-100%甲醇进行梯度洗脱,得到了40%-70%甲醇洗脱液的浸膏Ⅰ和70%-100%甲醇洗脱液的浸膏Ⅱ,再将浸膏Ⅰ和Ⅱ分别用型号:MCI-GEL CHP-20P凝胶层析柱分离,以水和20%-80%甲醇梯度洗脱;浸膏Ⅰ得到了化合物没食子酸,间-双没食子酸和没食子酸甲酯;浸膏Ⅱ得到了30%-60%甲醇洗脱液的浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ,再分别将浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ用型号:Sephadex LH-20凝胶层析柱分离,以水和20%-100%的甲醇进行梯度洗脱,在浸膏Ⅲ的60%-100%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖;在浸膏Ⅳ的40%~60%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
没食子有效部位采用2000年版药典附录Ⅹ B鞣质含量测定法,测定鞣质的含量大于50%。
实施例2
a、取干燥没食子药材粉碎,过2号筛,称取100g药材粉末,加水提取3次,每次加10倍量水,提取50min;
b、将提取液减压浓缩至800ml,浓缩液用***萃取至醚层澄清,弃去***层;
c、将水层部位再用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,真空干燥温度65℃,得到45%的没食子有效部位;
d、将步骤c得到的没食子有效部位用凝胶层析柱(型号:Sephadex LH-20)进行化学成分的分离,以水和20%-100%甲醇进行梯度洗脱,得到了40%-70%甲醇洗脱液的浸膏Ⅰ和70%-100%甲醇洗脱液的浸膏Ⅱ,再将浸膏Ⅰ和Ⅱ分别用型号:MCI-GEL CHP-20P凝胶层析柱分离,以水和20%-80%甲醇梯度洗脱;浸膏Ⅰ得到了化合物没食子酸,间-双没食子酸和没食子酸甲酯;浸膏Ⅱ得到了30%-60%甲醇洗脱液的浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ,再分别将浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ用型号:Sephadex LH-20凝胶层析柱分离,以水和20%-100%的甲醇进行梯度洗脱,在浸膏Ⅲ的60%-100%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖;在浸膏Ⅳ的40%-60%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
没食子有效部位采用2000年版药典附录Ⅹ B鞣质含量测定法,测定鞣质的含量大于50%。
实施例3
a、取干燥没食子药材粉碎,过2号筛,称取100g药材粉末,加水提取3次,每次加15倍量水,提取120min;
b、将提取液减压浓缩至1500ml,浓缩液用***萃取至醚层澄清,弃去***层;
c、将水层部位再用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,真空干燥温度90℃,得到60%的没食子有效部位;
d、将步骤c得到的没食子有效部位用凝胶层析柱(型号:Sephadex LH-20)进行化学成分的分离,以水和20%-100%甲醇进行梯度洗脱,得到了40%-70%甲醇洗脱液的浸膏Ⅰ和70%-100%甲醇洗脱液的浸膏Ⅱ,再将浸膏Ⅰ和Ⅱ分别用型号:MCI-GEL CHP-20P凝胶层析柱分离,以水和20%-80%甲醇梯度洗脱;浸膏Ⅰ得到了化合物没食子酸,间-双没食子酸和没食子酸甲酯;浸膏Ⅱ得到了30%-60%甲醇洗脱液的浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ,再分别将浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ用型号:Sephadex LH-20凝胶层析柱分离,以水和20%-100%的甲醇进行梯度洗脱,在浸膏Ⅲ的60%-100%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖;在浸膏Ⅳ的40%~60%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
没食子有效部位采用2000年版药典附录Ⅹ B鞣质含量测定法,测定鞣质的含量大于50%。
实施例4
a、取干燥没食子药材粉碎,过2号筛,称取100g药材粉末,加水提取3次,每次加12倍量水,提取80min;
b、将提取液减压浓缩至1100ml,浓缩液用***萃取至醚层澄清,弃去***层;
c、将水层部位再用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,真空干燥温度80℃,得到50%的没食子有效部位;
d、将步骤c得到的没食子有效部位用常规方法凝胶层析(型号:Sephadex LH-20)进行化学成分的分离,以水和20%-100%甲醇进行梯度洗脱,得到了40%-70%甲醇洗脱液的浸膏Ⅰ和70%-100%甲醇洗脱液的浸膏Ⅱ,再将浸膏Ⅰ和Ⅱ分别用型号:MCI-GEL CHP-20P凝胶层析柱分离,以水和20%-80%甲醇梯度洗脱;浸膏I得到了化合物没食子酸,间-双没食子酸和没食子酸甲酯;浸膏Ⅱ得到了30%-60%甲醇洗脱液的浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ,再分别将浸膏Ⅲ和浸膏Ⅳ用型号:Sephadex LH-20凝胶层析柱分离,以水和20%-100%的甲醇进行梯度洗脱,在浸膏Ⅲ的60%-100%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖;在浸膏Ⅳ的40%~60%的甲醇洗脱液中得到了化合物1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
没食子有效部位采用2000年版药典附录Ⅹ B鞣质含量测定法,测定鞣质的含量大于50%。
没食子有效部位作为制备治疗抗溃疡性结肠炎作用的药物的用途,采用水提后有机溶剂萃取即可得到没食子有效部位,主要包括鞣质类;有效部位经凝胶色谱提取分离即可得到单体化合物,包括没食子酸、间-双没食子酸、没食子酸甲酯、1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖,按常规方法将提取的没食子有效部位制成口服制剂。
实施例5没食子有效部位在制备治疗抗溃疡性结肠炎的实验研究
摘要:目的:研究没食子提取物对大鼠溃疡性结肠炎(UC)动物模型的治疗作用。方法:采用三硝基苯磺酸和乙醇复合方法制备大鼠UC模型,经病理切片证实造模成功后,随机分为没食子提取物高、低剂量组,模型组和柳氮磺吡啶组。灌胃给药20d后,评价大鼠结肠黏膜损伤指数(CMDI);检测体重、肠重指数和免疫器官重量指数的变化;检测大鼠结肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性。结果:没食子提取物高剂量组动物溃疡均完全愈合,与模型组动物相比较,高、低剂量组动物组织中SOD显著增高(P<0.01),MPO显著降低(P<0.01)。结论:没食子提取物对大鼠溃疡性结肠炎有明显的治疗作用。
本发明通过建立大鼠结肠炎模型,没食子提取物给药后,观察其治疗作用并检测相关指标,了解其治疗溃疡性结肠炎的作用机理。
实验材料与方法
动物及分组
SPF级SD大鼠50只,雌雄各半,200-250g,提供单位:中国人民解放军***医学动物实验中心,许可证号:SCXK(苏)2003-0004。随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组及没食子提取物高、低剂量组,每组10只。
药物及试剂
没食子有效部位浸膏,新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所提供,批号:090926;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)为Sigma公司产品,50%体积分数,批号:046K5008;无水乙醇(AR)为南京化学试剂有限公司产品,批号:061110961;***(AR)为南京化学试剂有限公司产品,批号:060610483;柳氮磺吡啶肠溶片为上海三维制药有限公司产品,国药准字:H31020450,批号:200701C03;SOD试剂盒(测总超氧化物歧化酶),批号:20070516;髓过氧化物酶(MPO)测试盒,批号:20070516,以上测试盒均由南京建成生物工程研究所产品
模型制备
SD大鼠60只,雌雄各半,200~250g,分组称重标记,禁食一天,自由饮水。造模:将50%(V/V)的乙醇与5%的TNBS等量混匀,配成造模溶液。用***将大鼠麻醉,并固定,将一段直径2.0mm长约10cm的婴儿导尿管,由大鼠***轻缓***深约8cm,缓缓注入TNBS与乙醇混合溶液1ml/只,注入时让大鼠仰面稍微倾斜,防止漏液。随后2~3天内,观察大鼠的生理变化。出现腹泻,粘液脓血便造模成功。
给药
从制备模型后的第7天开始灌胃给药,每日1次,共20天。空白对照组和模型组灌胃给予10ml/kg生理盐水。阳性对照组:柳氮磺吡啶肠溶片100mg/kg,没食子提取物高、低剂量组给药剂量分别为1.68g/kg和0.34g/kg。
组织标本的制备及指标检测
大鼠给药第21天,处死大鼠,取结肠组织,进行形态观察及结肠组织损伤评分(CMDI);剪取结肠称重计算肠重指数。随机选取部分结肠,用10%(V/V)的***溶液固定,然后取病变处及其前后各三段肠管,经流水冲洗,常规制备切片、HE染色。同时摘取脾脏和胸腺,称其重量,并计算其脏器指数。处死大鼠前眼球取血,分离得到血清,3000r/min离心10分钟,-4℃保存备用,按试剂盒说明书测定SOD及MPO活性。
统计学处理
采用SPSS11.5软件处理统计数据资料,采用t检验和F分析(q检验)分析上述各组实验各均数。
实验结果
没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠结肠损伤的影响
CMDI是反应结肠损伤程度的主要指标,高剂量组和阳性药组与模型组比较有显著差异(P<0.01),低剂量组与模型组比较无统计学差异。
表1没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠结肠损伤的影响
与模型组组比较:▲P<0.05▲▲P<0.01。
没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠结肠肠重指数的影响:
没食子有效部位高剂量组和阳性药组肠重指数与正常组比较无明显差异(P>0.05),与模型组比较显著降低(P<0.01);没食子提取物低剂量组肠重指数与正常对照组有显著差异(P<0.01),与模型组比较明显降低(P<0.05)。
表2没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠结肠肠重指数的影响
与正常组比较:**P<0.05,**P<0.01;与模型组组比较:▲P<0.05▲▲P<0.01
大鼠免疫器官相对重量的测定
与对照组比较,阳性药组、没食子提取物高、低剂量组的免疫器官均无显著差异(P>0.05);各组与模型组比较均无统计学意义(P>0.05)。
表3没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠免疫器官的影响
与正常组比较:*P<0.05**P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05▲▲P<0.01。
没食子有效部位对TNBS所致的UC大鼠血清MPO活性的影响:
与模型组比较,高剂量组和阳性药组MPO活性显著降低(P<0.01),低剂量组与模型组比较无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,阳性药、没食子提取物高、低剂量组SOD活性显著升高(P<0.01)。
表4没食子有效部位对TNBS所致溃疡性结肠炎大鼠血清中MPO、SOD活性的影响
与正常组比较:*P<0.05**P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05▲▲P<0.01。
病理检查结果
空白对照组:各鼠结肠组织内衬单层柱状上皮,粘膜完整,杯状细胞丰富,粘膜间散在淋巴浆细胞浸润,部分区粘膜下可见淋巴滤泡,肌层及浆膜层均无明显异常。模型组:其中9只鼠结肠粘膜上皮基本变性、脱落,被大片坏死及炎性渗出物所代替,粘膜下高度水肿,粘膜下、肌层、浆膜层及浆膜外见大量炎症细胞浸润,以中性粒细胞为主。另1鼠除结肠粘膜中炎症细胞略增多外,大致与空白对照组鼠结肠组织形态相似。阳性药给药组:各鼠结肠组织形态与空白对照组基本一致,内衬单层柱状上皮,粘膜完整,杯状细胞丰富,粘膜间散在淋巴浆细胞浸润,部分区粘膜下可见淋巴滤泡,肌层及浆膜层均无明显异常。低剂量给药组:其中7例鼠结肠粘膜见散在点状上皮变性、脱落,粘膜下及肌层见较多急慢性炎细胞浸润,并有淋巴滤泡形成充填溃疡,其余3例鼠结肠粘膜形态与空白对照组基本一致,粘膜完整,杯状细胞丰富,粘膜间散在淋巴浆细胞浸润,部分区粘膜下可见淋巴滤泡,肌层及浆膜层均无明显异常。高剂量给药组:8例鼠结肠粘膜见多处粘膜较大面积上皮变性、脱落,炎性渗出物及坏死较多,粘膜下、肌层及浆膜层均可见大量炎细胞浸润,以中性粒细胞为主。其余2例鼠结肠粘膜形态与空白对照组基本一致,粘膜完整,杯状细胞丰富,粘膜间散在淋巴浆细胞浸润,部分区粘膜下可见淋巴滤泡,肌层及浆膜层均无明显异常。
讨论
目前,治疗溃疡性结肠炎的常用药物主要包括激素(如皮质类固醇类)、氨基水杨酸类(如:SASP、5-ASA)和免疫抑制剂(如氨甲喋呤)、钙离子拮抗剂、肝素等,但效果欠佳,且不良反应多,停药后容易复发。中医治疗多从调理脾胃、滋肝补肾治其本,清热解毒,活血祛淤,固肠治其标。治法上通过口服中药、中西药联用及中药保留灌肠诸法,临床中均收到了一定的疗效,特别值得一提的是中药口服与西药口服对照结果看,中医中药的疗效均优于单纯使用西药,说明中医中药在治疗该病有其一定的优势,同时对于中药保留灌肠也收到了与内服药同样的疗效,并且操作简便。没食子性干寒,味苦涩,具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用,研究表明,没食子含鞣质、黄酮、没食子酸等成分,其中鞣质提取物的鞣质含量超过50%。药理学研究证明,没食子提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、β-溶血性链球菌等有较强的抑制和杀灭作用;并能显著抑制急、慢性炎症,提高机体非特异性免疫功能,具有清热镇痛,清除自由基和抑制脂质过氧化损伤等作用,临床常用于治疗溃疡性结肠炎疗效显著。
本发明采用TNBS与乙醇复合法制作大鼠溃疡性结肠炎模型。TNBS是一种半抗原物质,乙醇溶解肠粘膜表面的粘液,破坏肠粘膜屏障,使TNBS与肠组织大分子组织蛋白结合后成为完全抗原,导致针对肠粘膜的免疫反应,诱发溃疡性结肠炎的产生。其病理特点是结肠组织呈一种慢性炎症变化,病程较长,病理变化与人类溃疡性结肠炎相相似。试验证实没食子提取物(高、低剂量组)对TNBS所致大鼠结肠溃疡有明确的治疗作用。从病理结果显示没食子提取物高剂量组动物结肠组织已无明显异常,模型组大鼠结肠黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润,以中性粒细胞浸润为主,部分出现上皮脱落和黏膜层坏死,出现明显的肉芽肿。MPO是存在于中性粒细胞中的一种酶,是中性粒细胞浸润的重要指标,也是结肠炎损伤程度的指标,实验结果表明,没食子提取物可明显降低模型大鼠血清中MPO水平,说明没食子提取物有明显的抗炎作用。自由基损伤是UC发病的重要机制之一,SOD是机体清除氧自由基的重要酶类,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,它能抑制肠组织中的脂质过氧化反应,并能稳定细胞膜,实验结果显示,没食子提取物明显提高了大鼠外周血中SOD水平,说明其有抗氧化损伤能力。本研究表明,没食子有效部位对溃疡性结肠炎有显著的治疗作用,其机制可能与没食子提取物的抗炎、抗氧化作用有关。
实施例6没食子有效部位在制备治疗抗炎、镇痛和抗菌实验研究
摘要:目的:观察没食子有效部位的抗炎、镇痛和抗菌等药理作用。方法:通过二甲苯致小鼠耳壳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶诱发的小鼠腹腔白细胞游走、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀、大鼠棉球肉芽肿、醋酸所致小鼠扭体反应、以及常见肠道细菌的体外抗菌等试验,观察没食子提取物的抗炎、镇痛和抗菌作用。结果:没食子有效部位小鼠(2.5、5.0、10.0ml/kg),大鼠(1.75、3.5、7.0ml/kg)灌胃给药,明显抑制二甲苯所致小鼠耳壳肿胀;拮抗乙酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高;显著减少角叉菜胶所致大鼠腹腔白细胞游走;明显抑制小鼠足趾角叉菜胶致肿;对大鼠棉球肉芽肿形成有抑制作用;能明显减少醋酸所致小鼠扭体反应次数。体外抗菌试验对伤寒沙门氏菌属、乙型副伤寒沙门氏菌属、鼠伤寒沙门氏菌属、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、痢疾志贺氏菌属、福氏志贺氏菌属、宋内氏志贺氏菌属等9种常见指标菌的最小杀菌浓度(MBC)分别为0.0650%、0.0650%、0.0650%、0.0650%、0.0650%、0.150%、0.150%、0.150%、0.50%。结论:没食子有效部位有明显的抗炎、镇痛作用,对溃疡性结肠炎有关的常见致病菌有抑菌作用。
没食子是没食子蜂科昆虫没食子蜂Cynips gallae-tinctoriceOliv的幼虫,寄生于壳斗科植物没食子树Quercus infectoriaOliv.幼枝上,所产成的虫瘿。没食子性干寒,味苦涩,具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用,是维吾尔医常用药材。维吾尔医理论认为其针对结肠炎引起的肠壁吸收力及捏住力下降,直接作用于肠壁,敛肠,消炎止泻,开通肠阻,促使溃疡愈合。临床用于溃疡性结肠炎的治疗,疗效显著。但是其治疗溃疡性结肠炎的作用机理尚未明确,本实验通过对没食子有效部位的抗炎、镇痛和抗菌作用进行研究,探讨其治疗溃疡性结肠炎的作用机理,为没食子的新药开发提供依据。
实验材料与仪器
药品与试剂
受试药物:没食子有效部位浸膏(每毫升含生药40mg),新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所提供,批号:090926。
试验试剂:二甲苯,分析纯,天津市北方化玻购销中心(批号031228)。伊文思兰:上海化学试剂采购供应站提供,Fluka进口分装(批号82-11-02)。醋酸:郑州市德众化学试剂厂(批号030506)。角叉菜胶:北京医科大学药理室提供。指标菌,伤寒沙门氏菌属(50071)、乙型副伤寒沙门氏菌属(50602)、鼠伤寒沙门氏菌属(50115)、肠产毒性大肠杆菌(44815)、肠致病性大肠杆菌(44336)、肠侵袭性大肠杆菌(44850)、痢疾志贺氏菌属(51570)、福氏志贺氏菌属(51142)、宋内氏志贺氏菌属(51592)。新疆医科大学微生物学教研室提供。
营养琼脂培养基,杭州天河生物试剂有限公司产品(批号200304)。MH肉汤培养基,浙江省军区后勤部卫生防御检验所提供(批号200304)。MH琼脂培养基,杭州天河生物试剂有限公司(批号200304)。生理盐水:山东华鲁制药有限公司(批号H20030128)。
试验仪器
BS110S电子天平:北京塞多利斯天平有限公司。DT200电子天平:上海恒平科学仪器有限公司。JM31000电子天平:余姚市纪铭称重校验设备有限公司。外径千分尺:上海量具刃具厂。电子体温计:福建康科技实业有限公司。秒表:上海金星仪表厂,QB/T1534-199。FM生化培养箱:上海福玛实验设备有限公司。YJ-875超净工作台:吴江市海留净化设备有限公司。DM2500显微成像***:德国Leica公司产品。
实验动物
Wistar和SD雄性大鼠,普通级;小鼠,昆明种,普通级,雌雄各半。由新疆医科大学实验动物中心提供,合格证书:新疆医动字16-003号。
方法与结果
没食子有效部位对小鼠耳壳二甲苯致肿的影响取昆明种小鼠50只,体重20±2g,雌雄各半。随机分为5组,每组10只,即为空白对照组、阳性对照组、没食子有效部位小、中、大剂量组,每日一次,连续灌胃给药(ig)7天,于末次给药1小时后,每组小鼠右耳两面涂抹二甲苯50μl,1h后脱颈处死小鼠,用8mm打孔器取左右耳片,称重,以两耳片重量差值为肿胀度,进行组间均数t检验,并依“(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%”计算验证抑制率。
结果:没食子有效部位不同剂量灌胃给药,对二甲苯所致小鼠耳壳肿胀有明显地抑制作用(结果见表1)。
注:与空白对照组比较,***P<0.01、**P<0.05。
没食子有效部位对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响:
取昆明种小鼠50只,体重20±2g,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即为空白对照组、阳性对照组、没食子提取物小、中、大剂量组。每日一次,连续灌胃给药7天。末次给药后1h,各小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g,并立即ip0.6%冰醋酸0.2ml/只,20min后处死小鼠,用5ml生理盐水冲洗腹腔,收集洗涤液,洗涤液加生理盐水至10ml,3000rpm离心15min,取上清液于紫外分光光度计590nm波长处测定其OD值。以OD值表示冲洗液中伊文思兰的浓度,间接反映腹膜炎性渗出的程度。与空白对照组比较进行组间均数t检验,比较有无显著性差异。并以“(空白对照组平均OD值-给药组平均OD值)/空白对照组平均OD值×100%”计算抑制率。
结果,没食子有效部位各给药组腹腔洗涤液OD值较对照组明显低,表明该制剂明显抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增加(结果见表2)。
表2没食子有效部位组对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响(X±SD)
注:与空白对照组比较,***P<0.01。
没食子有效部位对小鼠足跖角叉菜胶致肿胀的影响:
取昆明种小鼠50只,体重20±2g,雌雄各半。随机分为5组,每组10只,即为空白对照组、阳性对照组、没食子提取物小、中、大剂量组。每日一次,连续灌胃给药7天。于末次给药后1h,用2%角叉菜胶0.06ml注入小鼠足跖中央皮下,致炎后1h、6h、24h,用千分尺测两足跖厚度,以致炎前后足跖厚度为肿胀度,进行各组均数t检验。
结果,没食子有效部位不同剂量灌胃给药,对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀有抑制作用,作用可维持24小时左右,其中大剂量组比较明显(结果见表3)。
表3没食子有效部位对小鼠足跖角叉菜胶致肿的影响(X±SD)
注:与空白对照组比较,*P>0.05、**P<0.05、***P<0.01。
没食子有效部位对大鼠腹腔白细胞游走的影响:
选取SD大鼠60只,体重200±20g,雌雄各半。随机分为6组,每组10只,即为空白对照组、模型组、阳性对照组、没食子有效部位小、中、大剂量组。空白对照组和模型组大鼠灌胃给予生理盐水,阳性对照组灌胃复方乙酰水杨酸片,受试物小、中、大剂量组分别灌胃给予相应剂量的没食子有效部位,每日一次,连续7天。于末次给药后1h,除对照组外其它组大鼠腹腔注射2%角叉菜胶0.4ml/只,5h小时后处死动物,用3ml生理盐水冲洗腹腔,收集洗条液1ml,置于小试管内,按白细胞计数方法计数每个视野的白细胞总数,以白细胞数均数为指标进行组间t检验。
结果表明,没食子有效部位不同剂量ig给药,对角叉菜胶所致大鼠腹腔白细胞游走有明显地抑制作用(结果见表4)。
表4没食子有效部位对大鼠腹腔白细胞游走的影响
注:与空白对照组比较△△△P<0.01;与模型组比较***P<0.01。
没食子提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响:
取Wistar大鼠40只,雌雄各半,体重200±20g,随机分为5组,每组8只。即正常组、5-ASA组、3个不同剂量的没食子有效部位给药组。在***浅麻醉,麻醉成功后,每只大鼠的两侧蹊部用碘酒消毒,75%酒精棉球脱碘后各剪小一口,以血管钳扩充皮下组织,用眼科镊子将20mg的高压灭菌棉球从切口处植入皮下,随缝合皮肤,术后当天开始每日一次,连续ig7天,第8天处死动物,剥离并取出棉球肉芽组织,于60℃烘箱内干燥12h后称重,减去原棉球重量,即为肉芽肿净重,并以大鼠体重折算成100g体重含肉芽肿mg数,以各组肉芽肿量均数作组间t检验,并以“(空白对照组肉芽肿净干重-给药组肉芽肿净干重)/空白对照组肉芽肿净湿重×100%”计算抑制率。
结果表明,没食子有效部位不同剂量灌胃给药,对大鼠棉球肉芽肿形成有明显地抑制作用(结果见表5)。
注:与空白对照组比较,***P<0.01。
没食子有效部位对小鼠醋酸所致扭体反应的影响:
取昆明种小鼠50只,体重20±2g,雌雄各半。随机分为5组,每组10只,即为空白对照组、阳性对照组、没食子有效部位小、中、大剂量组。每日一次,连续灌胃给药7天。末次给药后1h,每鼠ip0.6%醋酸0.2ml/只,观察每只小鼠ip醋酸后的扭体反应潜伏期及15分钟内因疼痛引起的扭体次数。与对照组比较进行组间均数t检验,比较有无显著性差异。并以“(空白对照组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/空白对照组平均扭体次数×100%”计算镇痛百分率。
结果,没食子有效部位能明显降低醋酸所致小鼠扭体反应次数,表明该制剂具有显著的镇痛作用(结果见表6)。
注:与空白对照组比较***P<0.01。
没食子有效部位对九种常见肠道细菌的影响:
指标菌工作浓度:9株指标菌复苏并传代2次后,以无菌生理盐水下,比浊法配成工作浓度约为1×106/ml,同时稀释后接种平板,计算活菌数。药物经过滤除菌后,以MH肉汤作倍比稀释,分装小试管,每管1.8ml,药物稀释度分别为1∶1,1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64。取上述细菌工作菌液0.2ml,加入1.8ml含药肉汤的试管中,指标菌最终浓度约为1×106/ml,37℃培养24小时,分别接种平板观察有无相应细菌生长,计算最小杀菌浓度(MBC),试验重复三次。对照组:培养基无菌对照,药物无菌对照,生理盐水无菌对照。
指标菌工作浓度:107cfu/ml;伤寒沙门氏菌属工作浓度为2.7×107cfu/ml,指标菌终浓度2.7×106cfu/ml;乙型副伤寒沙门氏菌属工作浓度为6.2×107cfu/ml,指标菌浓度6.2×106cfu/ml;鼠伤寒沙门氏菌属工作浓度2.0×107cfu/ml,指标菌浓度2.0×106cfu/ml;肠产毒性大肠杆菌工作浓度0.6×107cfu/ml,指标菌浓度0.6×106cfu/ml;肠致病性大肠杆菌工作浓度4.8×107cfu/ml,指标菌浓度4.8×106cfu/ml;肠侵袭性大肠杆菌工作浓度0.7×107cfu/ml,指标菌浓度0.7×106cfu/ml;痢疾志贺氏菌属工作浓度7.0×107cfu/ml,指标菌浓度7.0×106cfu/ml;福氏志贺氏菌属工作浓度2.1×107cfu/ml,指标菌浓度2.1×106cfu/ml;宋内氏志贺氏菌属工作浓度1.8×107cfu/ml,指标菌浓度1.8×106cfu/ml。
结果表明,9种指标菌的最小杀菌浓度(MBC)分别为伤寒沙门氏菌属0.0650%,乙型副伤寒沙门氏菌属0.0650%,痢疾志贺氏菌属0.0650%,福氏志贺氏菌属0.0650%,宋内氏志贺氏菌属0.0650%,鼠伤寒沙门氏菌属0.150%,肠产毒性大肠杆菌属0.150%,肠侵袭性大肠杆菌属0.150%,肠致病性大肠杆菌属0.50%。对照:培养基无菌生长,生理盐水无菌生长,3种药物消毒后均无菌生长(表7)。
表7没食子有效部位对九种常见肠道细菌的影响
讨论
没食子为维吾尔医常用药材,收载于维吾尔药材标准-上册。具有固涩、燥湿、止血、消炎、防腐之功效。用于大肠虚滑、泻痢不止、习惯性肠炎、牙龈松弛、牙周炎、口臭、咽喉炎等。新疆维吾尔自治区维吾尔医医院临床利用没食子提取物,治疗溃疡性结肠炎所致的腹痛、腹泻和脓血症等,取得了显著的疗效。
体内试验研究证明,没食子提取物小鼠(2.5、5.0、10.0ml/kg)、大鼠(1.75、3.5、7.0ml/kg)灌胃给药,明显抑制二甲苯所致小鼠耳壳肿胀;拮抗乙酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高;减少角叉菜胶所致的腹腔白细胞游走;明显的抑制角叉菜胶所致小鼠足趾肿胀;对大鼠棉球肉芽肿形成有显著地抑制作用;能明显减少醋酸致小鼠扭体反应次数。体外抗菌试验研究证明,没食子提取物对伤寒沙门氏菌属、乙型副伤寒沙门氏菌属、鼠伤寒沙门氏菌属、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、痢疾志贺氏菌属、福氏志贺氏菌属、宋内氏志贺氏菌属等9种常见指标菌有抑制作用,其最小杀菌浓度(MBC)分别为伤寒沙门氏菌属0.0650%,乙型副伤寒沙门氏菌属0.0650%,痢疾志贺氏菌属0.0650%,福氏志贺氏菌属0.0650%,宋内氏志贺氏菌属0.0650%,鼠伤寒沙门氏菌属0.150%,肠产毒性大肠杆菌属0.150%,肠侵袭性大肠杆菌属0.150%,肠致病性大肠杆菌属0.50%。
上述研究表明,没食子提取物有明显的抗炎、镇痛作用,对溃疡性结肠炎有关的常见致病菌有抑菌作用。
实施例7
没食子有效部位在制备治疗抗溃疡性结肠炎48例的临床观察:
溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性溃疡性炎症。病变主要发生在大肠黏膜及黏膜下层,以溃疡及糜烂为主,以反复发作的腹泻、腹痛及脓血黏液便为主要临床表现。目前该病发病率上升,治疗棘手,被世界卫生组织列为现代难治病之一。西药治疗疗效不满意,不良反应大。没食子性干寒,味苦涩,具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用,是维吾尔医常用药材,主要用于治疗溃疡性结肠炎。使用没食子有效部位治疗溃疡性结肠炎48例,现将结果报告如下:
资料方法
一般资料
48例均为门诊轻、中度溃疡性结肠炎患者,随机分为治疗组和对照组。治疗组24例,男16例,女8例;年龄20-65岁,平均(42.4±12.5)岁;病程1-22年,平均(7.3±3.6)年;轻度11例,中度23例。对照组24例,男15例,女9例;年龄20-62岁,平均(41.7±11.9)岁:病程1-20年,平均(6.8±2.9)年:轻度12例,中度12例。经统计学处理,2组在性别、年龄、病程及病情程度方面无显著差异(P>0.05),具可比性。
纳入标准
所有病例均有不同程度的腹泻、腹痛及脓血黏液便,符合2000年成都全国炎症性肠病学术研讨会制定的诊断标准及疗效评价标准。所有病例均为符合该标准的轻、中度患者,凡腹泻>6次/d、有重度黏液血便、体温在37.5℃以上、脉搏>90次/min、血红蛋白<100g/L、血沉>30mm/h的重度患者均排除在外。
治疗方法
治疗组:用没食子有效部位1.0g,每日4次。
对照组:口服柳氮磺胺吡啶1.0g,每日4次;症状缓解后改为1.0g,每日2次。2组病例均治疗8周。
观察指标与方法
观察治疗前后患者腹泻、腹痛及脓血便等症状、体征改善情况;大便常规、血常规、结肠镜下黏膜变化、活体组织病理检查;观察不良反应。
疗效标准
采用1993年全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会标准:即①近期治愈:临床症状消失,结肠镜复查黏膜正常。停药或仅用维持量药物,观察6个月无复发。②有效:临床症状基本消失,结肠镜复查黏膜轻度炎症反应及部分假性息肉形成。③无效:经治疗后临床症状、内镜及病理检查无改善。
统计学方法
以SPSS12.0统计软件进行χ2检验。
观察结果
疗效比较见表1。
表1两组临床疗效比较(n=24)
组别 |
近期治愈 |
有效 |
无效 |
总有效率(%) |
治疗组 |
16(66.7%) |
6(25.0%) |
2(8.3%) |
91.7* |
对照组 |
12(50.0%) |
7(29.2%) |
5(20.8%) |
79.2 |
*:p<0.01,与对照组比较。
讨论
溃疡性结肠炎是一种以慢性非特异性炎症改变为主要特征的结肠病变综合征候群。本病易反复发作、迁延难愈、并发症较多。引起溃疡性结肠炎的病因有多种学说,如免疫因素、遗传因素、精神因素、感染因素、保护物质缺乏因素等学说。最近研究表明,溃疡性结肠炎病人肠壁黏膜中超氧化物歧化酶(SOD)活性较低。没食子性干寒,味苦涩,具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用,是维吾尔医常用药材。维吾尔医理论认为其针对结肠炎引起的肠壁吸收力及捏住力下降,直接作用于肠壁,敛肠,消炎止泻,开通肠阻,促使溃疡愈合。临床用于溃疡性结肠炎的治疗,疗效显著。
临床治疗观察结果表明,没食子有效部位对溃疡性结肠炎有明显的治疗作用,总有效率91.7%,近期治愈率66.7%,有效为25%,无效为8.3%,明显优于对照组。药理研究表明,没食子有效部位对大鼠溃疡性结肠炎有明显的治疗作用;可显著增高溃疡组织中SOD含量(P<0.01),降低MPO含量(P<0.01),且有明显的抗炎、镇痛作用,对溃疡性结肠炎有关的常见致病菌有抑菌作用。没食子有效部位是治疗溃疡性结肠炎的佳药。