CN101857849A - 一株苏云金芽孢杆菌的分离纯化及其驯化方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自生产农药恶草酮废水处理池的污泥中分离、纯化得到的并经鉴定为一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY。本菌株可用于高盐度有机废水的生化治理，特别是含有氯仿、甲苯等芳香族化合物难降解有机污染物废水的生化治理。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种存在于污泥中的微生物的提取方法和用途，具体地说是一株存在于噁草酮废水处理池污泥中的苏云金芽孢杆菌的分离纯化及驯化方法与用途。
二、背景技术
据有关部门调查，我国2008年用水量为8000亿吨，其中工业用水约占全国总用水量的25.4％，我国人均占有水资源仅有2410吨。随着生产的发展，水资源短缺带来的压力及制约越来越严重。有数据表明，全国七万余家企业中，工业废水年排放量稳中有升，已达250亿吨，占废水总排放量的51％，COD排放量约620万吨，农药行业在化学工业中是污染大户，也是治理污染难度最大、投资最多的行业。
农药生产废水主要来自于合成反应中的生成水以及设备和车间地面冲洗水、产品精制洗涤水。其生产废水往往有以下特点：①有机物含量很高，毒性大，合成废水的COD浓度一般为6000-90000mg/L，有的甚至高达几十万mg/L；②污染物成分较复杂，农药废水中含有各种农药中间体、磷、硫化物和盐类。多数农药有杀菌作用，能抑制微生物代谢活动，使生物***紊乱；③生物难降解的物质较多，有些农药分子是芳香族化合物或卤代芳烃及有机硫磷化合物，这些都属于难生物降解物质；④产品排放的废水量很大，加之生产管理与操作水平的限制，使废水的水质、水量常有变化和波动，从而给废水处理带来难度。农药有机废水的排放，直接造成总磷、氨、氮等超标，进而使水体富营养化，藻类植物的大量繁殖，另外有些高含毒农药及酚、氰等化合物的废水排放，对水体中各种植物造成了极大的危害，同时对地下水及地表水造成污染，严重破坏环境，影响人类生存。
目前，农药废水的处理技术概括可分为生化法、物化法和化学法等。
农药废水生化处理的原理是通过微生物自身的氧化还原等作用将吸收的一部分有机物分解为简单的无机物的同时得到微生物生长、活动所需的能量，而另一部分有机物则转为生物体所需的营养质，组成新的原生质或细胞物质，使微生物生长、繁殖。废水中的可溶有机物可直接通过细胞壁被微生物吸收，而固态或胶态的附于细胞壁的不溶有机物则为微生物分泌的酶分解之后而吸收。
生化处理所用的微生物有好氧和厌氧两种。好氧微生物在氧气的存在下，能将有毒有机物分解为二氧化碳、水、硝酸盐、盐酸盐、磷酸盐等稳定、无臭物质。厌氧微生物在无氧条件下才能将有毒有机物分解为甲烷、二氧化碳、氨、硫化氢等物质。生化处理的关键在于保证微生物生长与繁殖的条件。废水中应保持足够的溶氧量；酸碱度应控制在pH9-11，温度控制在15-50℃，以18-40℃为佳；废水应控制一定比例的碳、氮、磷含量和一定量的养料如生活污水、硫铵等，以保持微生物生长繁殖必需的养料。生化处理过程与设备亦应适应微生物生长、繁殖的需要。
农药废水的一个很主要的特点就是含盐份高，这也就制约了此类废水的高效治理。高盐度有机废水是指含盐总量(包括Na+、Ca2+、SO4 2-、Cl-等)不低于1％的废水，其来自于工业方面所包含的行业有：印染、化工、制药、造纸、农药等。高盐度有机废水除盐度高外，有机物含量也很高，如不经处理直接排放，会给环境带来极大的污染和破坏，进而威胁到人类的生命健康。
三、发明内容
本发明的第一个目的是提供一株耐高盐、高效降解含氯仿、甲苯等芳香族化合物难降解有机污染物废水的苏云金芽孢杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY分离纯化与培养方法。
本发明的第三个目的是提供苏云金芽孢杆菌在废水的生物治理中的应用。
苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY，属革兰氏阳性杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为杆状，兼性厌氧，有鞭毛，有芽孢，有较高的耐盐度，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上生长迅速。
本发明的技术方案如下：
1、自生产农药恶草酮废水处理池的污泥中分离出苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillusthuringiensis)ODPY
A、在无菌条件下，将生产农药恶草酮废水处理池的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，用0.8％的生理盐水梯度稀释10-1～10-8，得到8份稀释菌液；
B、在无菌工作台上，取8个平板，向每个平板注入融化后降温至约40～50℃的分离纯化固体培养基15～20mL，待凝固；
C、取A中已稀释好的菌液各0.1～0.2mL分别用灭过菌的三角涂布棒均匀涂布到8只平板上，并依次编号；
D、将上述已制备好的8个平板置于培养箱中28～32℃培养18～60h；
2、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的纯化
E、当D步骤培养结束后，自各个平板中挑取形态较清晰的单菌落，按编号，依次置放到另外8只平板上已凝固的分离纯化固体培养基上并划线，将划过线的平板置于培养箱中28～32℃培养18～60h；
上述E步骤至少重复两次，最后在电子显微镜下观察，确保为纯的单菌落后，将纯化的菌种接种到斜面培养基中，保存在4℃冰箱中。
3、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的鉴定
通过菌落观察、染色、光学显微镜观察、电子显微镜观察及其一系列生化鉴定，遵循《伯杰氏细菌鉴定手册》，对得到菌株进行比对，鉴定该菌株属芽孢杆菌属；又进行16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY。
4、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的培养条件为：在无机盐液体培养基中加入葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源，pH值为8.5。
所述0.8％的生理盐水配方：NaCl 0.8g、水100mL
所述分离纯化固体培养基配方：NaCl 2～7g、蛋白胨9～12g、牛肉膏2～5g、琼脂10～30g、水1000mL，pH值为6.0～9.0。
实验证明，本发明提供的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY，通过驯化后可以有效地生物降解高盐度有机废水，特别是含氯仿、甲苯等芳香族化合物难降解有机污染物废水，为该类废水的生物治理提供功能显著的菌株，具有较高的研究和应用价值。
四、具体实施方式
实施例1：苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY的分离、纯化，具体步骤为：
A、在无菌条件下，将生产农药恶草酮废水处理池的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，用0.8％的生理盐水梯度稀释10-1～10-8，得到8份稀释菌液；
B、在无菌工作台上，取8个平板，向每个平板注入融化后降温至约40～50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基15～20mL，待凝固；
C、取A中已稀释好的菌液0.1～0.2mL分别用灭过菌的三角涂布棒均匀涂布到8只平板上，并依次编号；
D、将上述已制备好的8个平板置于30℃的培养箱中培养18～60h；
E、从各个平板中挑取形态较清晰的单菌落，按编号，依次置放到另外8只平板上已凝固的牛肉膏蛋白胨固体培养基上并划线，将划过线的平板置于30℃的培养箱中培养18～60h；
多次重复上述E步骤，并在电子显微镜下观察，确保为纯的单菌落。
上述A步骤中的0.8％的生理盐水配方为：NaCl 0.8g、水100mL。
上述B、E步骤中的牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：NaCl 2-7g、蛋白胨9-12g、牛肉膏2-5g、琼脂10-30g、水1000mL，pH值为5.0-9.0。
实施例2：苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY的菌种鉴定
通过对得到的菌株ODPY进行菌落观察、染色、光学显微镜观察、电子显微镜观察、生理生化实验。该菌株菌落形态呈圆形，边缘呈小锯齿状，颜色呈乳白色，湿润有光泽。菌落的表面形态呈凸面，上表面平滑。光学显微镜下观察，菌落菌体为杆状，兼性厌氧，有鞭毛，有芽孢；革兰氏染色呈阳性，能利用多种有机化合物为唯一碳源生长，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》得到初步鉴定，判断该菌株属芽孢杆菌属。
再对该菌株进行16S rDNA序列测序，将所得序列在NCBI数据库中BLAST进行比对，结果表明，16S rDNA基因序列所对应种名与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)最为相近，相似性达99％，根据细菌***分类原则，若两菌的16S rDNA同源性大于99％，基因水平上为同一种细菌，因此推测该菌株ODPY应属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。根据16S rDNA基因序列，将苏云金芽孢杆菌与亲缘关系最近的几株Bacillus的遗传进化关系进行比对分析，结果表明该菌株ODPY与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的亲缘关系最近。
综上所述，鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY。
实施例3：苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY培养条件的优化
一、最适生长pH值的确定
考察苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY在不同初始pH值培养基的环境中的生长情况，具体操作方法为：遵循单一变量原则，固定其他培养条件如恒温摇床温度30℃、转速150rpm，调牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH(配方同分离纯化培养基)使其初始pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，振荡培养24h后取样，用吸光度法测定细菌浓度OD600。试验结果显示，苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY的最适生长pH值为8.5。
二、碳源的优化
考察苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY对葡萄糖、蔗糖、淀粉等几种碳源的利用状况，具体方法为：遵循单一变量原则，固定氮源成分玉米浆3g/L与无机盐液体培养基其他组分，改变碳源成分为葡萄糖、蔗糖、淀粉(含量均为150mg/L)，接种苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY，恒温摇床温度30℃、转速150rpm，避光培养36h，测定OD600。试验结果显示，适宜的碳源为葡萄糖。
三、氮源的优化
考察苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY对玉米浆和酵母粉的利用状况，具体方法为：遵循单一变量原则，固定碳源成分葡萄糖150mg/L与无机盐液体培养基其他组分，改变氮源成分为玉米浆或酵母粉，接种苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY，恒温摇床温度30℃、转速150rpm，避光培养36h，测定OD600。试验结果显示，适宜的氮源为酵母粉。
四、苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY的驯化
取纯化后的菌株按5％～10％(W/V)的接入量接种于无机盐培养基中，以最大浓度压力式驯化法进行驯化，使得恶草酮的最大浓度为100mg/L。于25～35℃、120～170rpm摇床中驯化培养，每隔5～10d按5％～10％的接种量接种于新的培养基，驯化时间共为2～4个月。
所述的无机盐液体培养基配方：K2HPO44～8g、KH2PO40.2～0.8g、MgSO40.2～0.6g、(NH4)2SO41～5g、MnSO4·H2O 0.04～0.08g、FeSO4·7H2O 0.008～0.02g、CaCl20.01～0.03g、硫酸铵0.1g、恶草酮0.1g、水1000mL。
实施例4：苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)对各种盐度下有机污染物有效降解的特性
取农药恶草酮生产废水，考察不同盐度下对废水中有机成份的降解情况。具体操作步骤为：
A、固定其他培养条件不变，取已知测出一定盐度的废水，依次稀释成盐度分别为40g、60g、80g、100g、120g/L，往里接入3％的牛肉膏蛋白胨培养基和10％的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)ODPY，置于温度28～35℃、转速150rpm的恒温摇床中避光培养90～120h。
B、在无菌工作台上取五只平板，分别向每个平板注入融化后降温至约30～50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基15～20mL，待凝固；
C、每隔18～25h取样测COD及COD对应梯度稀释菌液进行平板涂布。
实验中所用牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：NaCl 2～7g、蛋白胨9～12g、牛肉膏2～5g、琼脂10～30g、水1000mL，pH值为6.0～9.0。
试验结果表明，在各盐度条件下，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY均能生长且各COD值也有50～83％降幅，对各底物的降解率，分别达到：氯仿82～94％、甲苯82～92％、其他芳香族化合物80～95％。
实施例5：苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)ODPY对农药恶草酮生产废水的降解情况
取农药恶草酮产生的废水，考察不同COD下对废水中有机成份的降解情况。具体操作步骤为：
A、遵循单一变量原则，固定其他培养条件，取已知测出一定COD的废水，稀释成COD分别为5000、7500、10000、12500、15000mg/L，往里接入3％的牛肉膏蛋白胨培养基和10％的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY，置于温度30℃、转速150rpm的恒温摇床中避光培养90～120h。
B、在无菌工作台上取五只平板，分别向每个平板注入融化后降温至约30～50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基14～22mL，待凝固；
C、每隔24h取样测COD及各COD对应梯度稀释菌液进行平板涂布。
实验中所用牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：NaCl 2～7g、蛋白胨9～12g、牛肉膏2～5g、琼脂10～30g、水1000mL，pH值为6.0～9.0。
试验结果表明，在各COD情况下，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY均能生长，且各COD均有52～80％降幅，对各底物的降解率，分别达到：氯仿83～93％、甲苯82～94％、其他芳香族化合物81～93％。
Claims (7)
1.一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的分离纯化及驯化方法，其特征在于：
A、在无菌条件下，将生产农药恶草酮废水处理池的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，用0.8％的生理盐水梯度稀释10-1～10-8，得到8份稀释菌液；
B、在无菌工作台上，取8个平板，向每个平板注入融化后降温至约40～50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基15～20mL，待凝固；
C、取A中已稀释好的菌液各0.1～0.2mL分别用灭过菌的三角涂布棒均匀涂布到8只平板上，并依次编号；
D、将上述已制备好的8个平板置于30℃的培养箱中培养18～60h；
E、从各个平板中挑取形态较清晰的单菌落，按编号，依次置放到另外8只平板上已凝固的牛肉膏蛋白胨固体培养基上并划线，将划过线的平板置于30℃的培养箱中培养18～60h，此过程至少重复两次。
F、将纯化后的菌株按5％～10％(W/V)的接入量接种于无机盐培养基中，最大浓度为100mg/L。于25～35℃、120～170rpm摇床中驯化培养，每隔5～10d按5％～10％的接种量接种于新的培养基，驯化时间不少于2个月。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分离纯化固体培养基配方：NaCl 2～7g、蛋白胨9～12g、牛肉膏2～5g、琼脂10～30g、水1000mL，pH值为6.0～9.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无机盐液体培养基配方：每1000mL水中含K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、MgSO4 0.2～0.6g、(NH4)28O4 1～5g、MnSO4·H2O0.04～0.08g、FeSO4·7H2O 0.008～0.02g、CaCl2 0.01～0.03g、硫酸铵0.1g、恶草酮0.1g。
4.一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的用途，其特征在于：在生化治理有机废水中的应用。
5.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的用途，其特征在于：在生化治理高盐度有机废水中的应用。
6.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的用途，其特征在于：在农药恶草酮生产有机废水中的应用。
7.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ODPY的用途，其特征在于：在生化治理含氯仿、甲苯、芳香族化合物难降解有机污染物废水中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20101013 |