CN107400650A - 一种变形假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种变形假单胞菌及其应用，具体提供了一种变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD，其保藏编号为CGMCC No.14205。本发明实施例提供变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD，可以以腈类化合物作为唯一能源进行生长繁殖，可降解丙烯腈废水中的腈类化合物等污染物，降低丙烯腈废水的化学需氧量和生化需氧量，从而提高丙烯腈废水的可生化性。

Description

一种变形假单胞菌及其应用
技术领域
本发明是关于一种变形假单胞菌及其应用，具体地说，是关于一种能降解丙烯腈废水中的腈类化合物的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)及其相关应用。
背景技术
丙烯腈废水通常来自于丙烯腈的生产废水、腈纶的生产废水、以及丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)塑料的生产废水。丙烯腈废水中含有大量的丙烯腈、丙烯腈二聚体、乙腈、单核芳烃、以及丙烯腈衍生物(如丙烯醛、丙酮氰醇、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、二甲基甲酰胺)等物质，其中丙烯腈废水中的腈类化合物是剧毒物质，若将丙烯腈废水直接排放，必定会对环境造成巨大的危害，故对丙烯腈废水的处理至关重要。
现阶段国内外处理炼化污水应用比较广泛的方法为生物强化方法，是通过将筛选的或通过生物工程技术得到的菌种添加到污染体系中，可以以某些难降解、有毒有害的物质为能源生存，实现对某些难降解、有毒有害的物质降解。菌种可以附着在载体上，形成高效生物膜；也可以以游离的状态存在。
然而，目前还有没有针对降解丙烯腈废水中的腈类化合物的生物强化方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可以降解丙烯腈废水中的腈类化合物的微生物。
本发明的另一目的在于提供所述微生物的相关应用。
在第一方面，本发明提供了一种变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，其是从中石油大连石化公司污水车间活性污泥法处理工艺A池出口取活性污泥中分离获得，本发明中命名为BD。该菌株BD已于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，保藏编号：CGMCC No.14205。
在第二方面，本发明提供一种菌制剂，包括上述的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)BD，还可进一步包括营养培养基。营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、LB营养培养基、以及添加有碳源的无机盐培养基中的任意一种。其中，碳源优选为葡萄糖或蔗糖。
牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量为：牛肉3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0-8.0，优选pH＝7.4-7.6。
LB营养培养基的成分及含量为：酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、蛋白胨10.0g/L，pH＝7.2～7.6。
无机盐培养基的成分及含量为：硝酸钠10g/L、钼酸钠0.08g/L、七水合硫酸亚铁0.12g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.12g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二胺1g/L，pH＝7.2-7.6。
本发明的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD可以以腈类化合物作为唯一能源进行生长繁殖。腈类化合物包括：丙烯腈、乙腈、双腈胺、2-氯-5-硝基苯甲腈和丙酮氰醇等中的至少一种。腈类化合物优选为丙烯腈。
在第三方面，本发明还提供了所述的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)BD或所述的菌制剂在降解腈类化合物中的应用。其中，所述腈类化合物包括：丙烯腈、乙腈、双腈胺、2-氯-5-硝基苯甲腈和丙酮氰醇中的至少一种。
在第四方面，本发明还提供了所述的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)BD或所述的菌制剂在降解丙烯腈废水中的应用。具体应用时，丙烯腈废水的温度为20-40℃，优选为35℃，pH值为7-9，优选为7.5-8.5，更优选为8，有利于变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD在丙烯腈废水中生长繁殖，从而加快对丙烯腈废水中的腈类化合物的降解。进一步地，丙烯腈废水的化学需氧量为600-1200mg/L。
在第五方面，本发明提供了一种提高丙烯腈废水可生化性和/或降低COD的方法，该方法包括：
a)、将权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂与待处理丙烯腈废水混合，得到含有变形假单胞菌的丙烯腈废水输送至厌氧生物膜反应器中闷罐24h，进行挂膜；
b)、闷罐结束后，将丙烯腈废水的化学需氧量稀释至第一浓度，输送至厌氧生物膜反应器中，控制厌氧生物膜反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第一预设时间；
c)、调节步骤b厌氧生物膜反应器进口处丙烯腈废水的化学需氧量至第二浓度，控制厌氧生物反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第二预设时间；
d)、调节步骤c厌氧生物膜反应器进口处丙烯腈废水的化学需氧量至第三浓度，控制厌氧生物膜反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第三预设时间，得到处理后的提高可生化性和/或降低COD的出水；
其中，所述丙烯腈废水的化学需氧量的第一浓度小于所述丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度，所述丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度小于所述丙烯腈废水的化学需氧量的第三浓度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的提高丙烯腈废水可生化性和/或降低COD的方法中，步骤a)中，变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂与待处理丙烯腈废水混合后，混合体系中活菌数为1X105～1X108cell/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的提高丙烯腈废水可生化性和/或降低COD的方法中，丙烯腈废水的化学需氧量的第一浓度可以为450-500mg/L，pH值为7-9，优选为7.5-8.5；。丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度可以为500-550mg/L，pH值为7-9，优选为7.5-8.5；丙烯腈废水的化学需氧量的第三浓度可以为700-800mg/L，pH值为7-9，优选为7.5-8.5。
根据本发明的具体实施方案，通常情况下，待处理的丙烯腈废水的化学需氧量在1000mg/L左右(一般800～1500mg/L)，可用自来水进行稀释至所需浓度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的提高丙烯腈废水可生化性和/或降低COD的方法中，所述第一预设时间可以为55-65h，优选为60h；第二预设时间可以为65-75h，优选为72；第三预设时间可以为75-86h，优选为84。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：本发明实施例提供变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD，可以以腈类化合物作为唯一能源进行生长繁殖，可降解丙烯腈废水中的腈类化合物等污染物，降低丙烯腈废水的化学需氧量和生化需氧量，从而提高丙烯腈废水的可生化性。
附图说明
图1为本发明实施例3中变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的菌落形态图；
图2为本发明实施例3中变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的浓度与丙烯腈废水的COD的关系图；
图3为本发明实施例3中变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的浓度与丙烯腈废水的B/C的关系图；
图4为本发明实施例4提供的水解酸化反应器的进水和出水的COD、BOD、COD去除率、以及B/C与时间的关系图；
图5为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器厌反应器的进水和出水的pH值与时间的关系图；
图6为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水和出水的氨氮浓度与时间的关系图；
图7为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水和出水的氧化还原电位与时间的关系图；
图8A为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水的COD、BOD、以及B/C与时间的关系图；
图8B为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的出水的COD、BOD、以及B/C与时间的关系图；
图8C本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水的B/C与出水的B/C的差值与时间的关系图。
用于专利程序的微生物保存：
本发明的处理丙烯腈废水的高效菌BD
保藏日期：2017年5月27日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏编号：CGMCC No.14205；
分类命名：变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图与实施例对本发明作进一步地详细描述。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。
实施例1
本发明中，是从中石油大连石化公司污水车间活性污泥法处理工艺A池出口污泥中筛选获得变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD。具体过程如下：
步骤1)、从中石油大连石化公司污水车间活性污泥法处理工艺A池出口取活性污泥；
步骤2)、将5g的活性污泥接种至丙烯腈体积分数为0.5％的无机盐培养基中，在温度为35℃、转速为150转/分钟的摇床上培养7天，得到第一菌液；
步骤3)、吸取步骤2)中的第一菌液转接至丙烯腈体积分数为1.5％的无机盐培养基中，在温度为35℃、转速为150转/分钟的摇床上培养7天，得到第二菌液。
步骤4)、吸取步骤3)中的第二菌液转接至丙烯腈体积分数为2.0％的无机盐培养基中，在温度为35℃、转速为150转/分钟的摇床上培养7天，得到第三菌液；
步骤5)、吸取步骤4)中的第三菌液涂布于丙烯腈体积分数为2.0％的无机盐固体培养基中，在温度为35℃、转速为150转/分钟的摇床上培养2天，获得单菌落；
步骤6)、挑取步骤5)中的单菌落置于离心管中，与甘油(体积分数30％)1:1体积混合，制成菌液，并于-80℃超低温冰箱中保存。
实施例2
对实施例1筛选的菌种进行鉴定。
本发明的实施例1中，筛选到三株菌，本发明中分别命名为BD、DR、DW-2。其中，经鉴定，BD为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。
变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD在琼脂平板培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈奶白色圆形，***，不透明，大小不一，直径3～4mm，表面湿润，边缘平整。菌株BD的细胞为杆状，大小0.5～2.8μm，革兰氏染色为阴性，具有运动性，兼性厌氧生长。菌株生长温度为20～40℃，pH 6～9。最适生长条件：生长温度为35℃，pH 7.5。能利用葡萄糖，不能利用淀粉。
对实施例1中的步骤5)获得的单菌落提取DNA，并对菌种进行DNA测序。本发明中筛选得到一株菌，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。在GenBank数据库中通过Blast方法比对，采用MEGA 4软件用邻接(Neighbor-Joining)法构建***发育树，该菌株与邻近菌株的***发育学关系。该菌株已于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其分类命名为：变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，保藏编号为CGMCC No.14205。本发明中亦称该菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD。
实施例3
对实施例1获得的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD以及同时筛选到的DR、DW-2菌的有机物降解能力进行测定。具体步骤如下：
步骤1)、取实施例1获得的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入蒸馏水重新悬浮，于3000转/分钟离心10分钟，重复3次，得到变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD；
步骤2)、将0mL、8.2mL、4.92mL、以及1.64mL的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)BD分别加入编号为1、2、3、4的生化需氧量(Biochemical OxygenDemand，简称BOD)测试瓶中，并向每个BOD测试瓶中加入化学需氧量(COD)为404.8mg/L的丙烯腈废水至总体积均为164mL，编号1(对照)、2、3、4中的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)BD菌原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、5％、3％、1％。磁力搅拌，将安装有片状KOH的橡皮套套在BOD测试瓶的瓶颈上，将BOD测试瓶与BOD测量仪连接，构成BOD测量***；
步骤3)、将步骤2)中的BOD测量***置于培养箱中，于20℃培养5天，测得第五天后的COD和生化需氧量BOD5，并计算处理后的丙烯腈废水的COD去除率和可生化性B/C。
DR菌及DW-2菌的有机物降解能力测定同BD菌。
结果详见表1和图2。
表1丙烯腈废水的COD去除率和可生化性的数据
如图2和表1所示，随着BD、DR和DW-2投加量的增加，丙烯腈废水的的可生化性逐渐增加。体积分数为5％的BD、DR和DW-2的可生化性和COD的去除率高于体积分数为1％和3％的BD、DR和DW-2。其中添加5％的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida BD菌的B/C提高最高，为0.23，COD去除率最高，为48.40％。另外，发明人的研究发现，如果菌株在丙烯腈废水中的数量不足，可能会使一些菌株活性受到抑制甚至死亡，会使丙烯腈废水的COD进一步增加。
实施例4
将本发明的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD菌种加入到水解酸化反应器，对丙烯腈废水进行处理。具体步骤如下：
水解酸化反应器的有效容积为17L，水解酸化反应器为固定有用于附着厌氧微生物的生物膜的载体，能够使厌氧微生物能够容易栖息成长、快速繁殖的，同时又能防止厌氧污泥的流失。变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的接种量为水解酸化反应器的有效容积的5％，并投加葡萄糖1000mg/L。
请参见图3，图3为本发明实施例4提供的水解酸化反应器的进水和出水的COD、BOD、COD去除率、以及B/C与时间的关系图。如图3所示，进水COD为450-500mg/L，水力停留时间调为84小时，处理量6.8L/天，进水流速4.875mL/min，反应器运行第16天，出水COD为386mg/L，COD去除率为20％左右；向反应器内投加葡萄糖，在反应初期，不可避免的造成出水COD值高于进水COD值；
进水COD调至为500～550mg/L，水力停留时间、处理量和进水流速不变，反应器运行第25天，出水COD为315mg/L，COD去除率约为40％～50％；
进水COD调至为700-800mg/L，水力停留时间、处理量和进水流速不变，反应器运行第100天，出水COD为294mg/L，COD去除率约为50％。
请参见图5，图5为本发明实施例4提供的水解酸化反应器的进水和出水的pH值与时间的关系图。如图5所示，进水的pH值在7.75-8.89之间，所以厌氧生物膜反应器进水的pH值不用调节，厌氧生物膜反应器的出水pH值在7.65-8.59，一直小于进水pH值，但未见酸化现象产生。
请参见图6，图6为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水和出水的氨氮浓度与时间的关系图。如图6所示，厌氧生物膜反应器启动初期，由于投加菌种的无机盐培养基中的营养成分，造成出水氨氮浓度比进水氨氮浓度高，随着反应器的运行，出水氨氮浓度基本比进水氨氮浓度高，表明反应器内发生氨化反应，丙烯腈废水中的一部分有机氮转变成氨氮，造成出水氨氮浓度较高的情况。整体趋势来看，出水氨氮值高于进水氨氮值，反应器内氨化作用明显，但偶尔能检测到出水氨氮值低于进水。
请参见图7，图7为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水和出水的氧化还原电位与时间的关系图。如图7所示，氧化还原电位(ORP)在-150mv—-400mv适合甲烷菌生长的环境，本实验厌氧生物膜反应器进水、出水的ORP均在此范围，因此提供了甲烷菌生长的环境，也为后续过程进一步去除丙烯腈废水中的污染物奠定了基础。
请参见图8A和图8B，图8A为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水的COD、BOD、以及B/C与时间的关系图；图8B为本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的出水的COD、BOD、以及B/C与时间的关系图。如图8A和图8B所示，运行阶段反应器进水BOD、出水BOD变化可以看出，反应器进水BOD值波动较大，其B/C值在0.13～0.32，可生化性较差。而厌氧生物膜反应器运行40天，主要以水解酸化阶段为主，出水的BOD值波动也较大，且规律与进水类似，其B/C值在0.3左右，最高达到0.36，可生化性(B/C)提高，可生化提高率维持在10％左右。厌氧生物膜反应器的水力停留时间继续保持84小时，水解酸化阶段逐渐转为产甲烷阶段为主，同时COD去除率逐渐增加，出水B/C降低，小于进水的B/C，此时在进水B/C波动较大的情况下，出水B/C较稳定，维持在0.13～0.21。
请参见图8C，图8C本发明实施例4提供的厌氧生物膜反应器的进水的B/C与出水的B/C的差值与时间的关系图。在图8C中，可以很直观地看出，随着时间的推移，出水可生化性明显高于进水可生化性，经过变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)BD的降解丙烯腈废水更容易处理。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，其保藏编号为CGMCCNo.14205。
2.一种变形假单胞菌菌制剂，该菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.14205的变形假单胞菌菌株，该菌制剂为固态或液态菌制剂。
3.根据权利要求2所述的菌制剂，该菌制剂中还包括营养培养基，所述的营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、LB营养培养基、以及添加有碳源的无机盐培养基中的任意一种或多种。
4.权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂在降解腈类化合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述腈类化合物包括：丙烯腈、乙腈、双腈胺、2-氯-5-硝基苯甲腈和丙酮氰醇中的至少一种。
6.权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂在降解丙烯腈废水中的应用。
7.一种提高丙烯腈废水可生化性和/或降低COD的方法，该方法包括：
a)、将权利要求1所述的变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂与待处理丙烯腈废水混合，得到含有变形假单胞菌的丙烯腈废水输送至厌氧生物膜反应器中闷罐24h，进行挂膜；
b)、闷罐结束后，将丙烯腈废水的化学需氧量稀释至第一浓度，输送至厌氧生物膜反应器中，控制厌氧生物膜反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第一预设时间；
c)、调节步骤b厌氧生物膜反应器进口处丙烯腈废水的化学需氧量至第二浓度，控制厌氧生物反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第二预设时间；
d)、调节步骤c厌氧生物膜反应器进口处丙烯腈废水的化学需氧量至第三浓度，控制厌氧生物膜反应器的温度在20-40℃，水力停留时间为第三预设时间，得到处理后的提高可生化性和/或降低COD的出水；
其中，所述丙烯腈废水的化学需氧量的第一浓度小于所述丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度，所述丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度小于所述丙烯腈废水的化学需氧量的第三浓度。
8.权利要求7所述的方法，其中，步骤a)中，变形假单胞菌或权利要求2或3所述的菌制剂与待处理丙烯腈废水混合后，混合体系中活菌数为1X105～1X108cell/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述丙烯腈废水的化学需氧量的第一浓度为450-500mg/L，pH值为7-9；丙烯腈废水的化学需氧量的第二浓度为500-550mg/L，pH值为7-9；丙烯腈废水的化学需氧量的第三浓度为700-800mg/L，pH值为7-9。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一预设时间为55-65h；第二预设时间为65-75h；第三预设时间为75-86h。
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