CN105936879B - 枯草芽孢杆菌k13及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10917，属于植物保护技术领域。同时公开了所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法和应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株经平板对峙实验筛选所得，能够有效抑制橡胶树炭疽病菌的生长，对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不易产生抗性，能够进行商业开发，应用前景广阔。

Description

枯草芽孢杆菌K13及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13及其培养方法和应用。

背景技术

d然橡胶是重要的战略物资，属于一种紧缺性资源。它与铁矿石、石油、煤炭并列为四大工业原料。在交通和国防工业上都发挥着巨大的作用，同时它又与国民经济状况、经济周期和金融货币政策及国家贸易政策有着紧密联系；因此d然橡胶种植业具有举足轻重的地位。d然橡胶的生产过程与农产品一样受季节和d气等因素影响，在我国热区农业发展中，在d然橡胶比较集中的产区，当地农民和农场职工把d然橡胶种植作为增收的支柱产业，大约有300多万人从事d然橡胶的种植生产。d然橡胶产业为我国的经济建设、国防安全都提供了强大的支持。为各地区的经济发展，和谐稳定都作出了巨大的贡献。

橡胶炭疽病是橡胶树上的一种重要病害，橡胶炭疽病病情逐年严重，截止目前为止，该病在世界各植胶国均有发生。从苗圃小苗、大田幼树直至成龄开割胶树均可受到炭疽病为害。该病菌感染橡胶树的嫩叶、叶柄、嫩梢和果实，严重时引起嫩叶脱落，嫩梢回枯和果实腐烂，甚至形成僵果悬挂在树上。

橡胶炭疽病自1906年Petch在斯里兰卡首次发现，近年来，国内橡胶产业形势发生了明显变化，种植、栽培、管理模式等的多元化，加上生态环境的改变，橡胶重要病害检测、监测和防控技术上出现一些新的问题。如，病害发生、灾变情况发生变化，病害疫情、发生及流行规律研究缺乏***性，基础研究工作薄弱；病害监测，监测预警工作技术支撑不足；新发生和灾变危险性病害缺乏认识和技术储备；化学防治方法单一，存在生态和抗药性安全隐患；抗病橡胶种质资源情况不清楚，抗病性基因资源的挖掘和利用在病害防治中的巨大作用未得到充分发挥。

综上所述，需要针对橡胶炭疽病的特征，开发出一种专治橡胶炭疽病的防治方法，填补现有技术的不足之处。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术的空白，提供一种抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13是一种从橡胶树内分离筛选获得对橡胶树炭疽病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对橡胶树炭疽病的防治具有重要意义。

本发明的另一目的在于提供所述抑制橡胶树炭疽病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K13的分离方法与在防治炭疽病灾害方面的应用。

本发明为了实现上述目的采用如下技术方案：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No.10917，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步的，所述枯芽孢杆菌K13分离自橡胶树叶。

上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法，包括如下步骤：

将所述枯草芽孢杆菌接种于液体LB培养基中振荡培养得到；

所述液体LB培养基的配方：每1000mL水中含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g；pH为7.4。

进一步的，包括如下步骤：

步骤一：将所述枯草芽孢杆菌接入马铃薯葡萄糖琼脂并密封，恒温培养，得到单菌落；

步骤二：取所述单菌落转接至液体LB培养基中，密封，置于摇床上震荡培养，然后将所述液体LB培养基转移至LB固体培养基上，涂抹均匀，恒温培养，通过无限稀释法获得单一菌株；

步骤三：对所述单一菌株分别进行对峙培养：取炭疽菌RC178的菌饼，置于LB平板培养基中间，在所述菌饼周围接种所述单一菌株，密封，恒温培养，根据所述单一菌株对炭疽菌RC178的抑菌作用，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13；

步骤四：取所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13在液体LB培养基中振荡培养，得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌种。

进一步的，包括如下步骤：所述步骤一中：所述恒温培养条件为：将接种后的培养基倒置放入恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养时间为48h。

进一步的，包括如下步骤：所述步骤二中：所述恒温培养条件为：将LB固体培养基倒置放入恒温培养箱中培养的温度为28℃，培养时间为48h，置于摇床上震荡培养的温度为28℃，培养时间为12h。

进一步的，包括如下步骤：所述步骤三中：将接种后的LB平板培养基倒置放入恒温培养箱中培养的温度为28℃，培养时间为4～7d；所述菌饼的直径为6mm；所述对峙培养设置3个重复，以只接种所述炭疽菌RC178，不接种所述单一菌株为对照；

所述筛选方法为：采用两点对峙培养；挑取28℃恒温培养7d的拮抗菌和病原菌的同质等量菌丝，接种于距离PDA平皿中心1.5cm的2个点上，再置于28℃恒温箱中培养，逐日观察抑菌作用；上述对峙培养方式设3个重复，以仅接种病原真菌的平皿作为对照。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的基因序列如SEQ ID NO 1所示。

上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13用于制备对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化试剂。

本发明的有益效果在于：

1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13为植物内生菌，对橡胶树炭疽病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如：种类和数量众多，在植物叶际，叶内大量存在；对病原菌的作用方式多种多样，例如：对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用，对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用；对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用。繁殖速度快，对橡胶树炭疽病的防治具有重要意义。

2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对橡胶树炭疽病菌抑制作用强，有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针对相应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态***中其它有益微生物产生不利影响，有助于维持有益微生物的生态平衡。

3、菌株培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13：

保藏编号为：CGMCC No.10917；

保藏日期：2015年5月27日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对橡胶树炭疽病菌的平板对峙拮抗作用图；(a)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果1，(b)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果2，(c)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果3，(d)为对照组——炭疽菌RC178的培养结果；

图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株的生长曲线。

具体实施方式

下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No.10917，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述枯芽孢杆菌K13分离自橡胶树叶。

上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13用于制备对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化试剂；用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化试剂。

实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13

1、采样：从橡胶树上摘取有炭疽病斑的叶片，用清水洗去叶片上的灰尘砂砾，晾干，用剪刀在病健交界处剪取小病叶备用；剪取小病叶的大小为5mm×5mm。

2、样品消毒：将所述小病叶放入烧杯，用升汞浸泡30s，期间不断地轻轻搅动，然后用无菌水冲洗三次，晾干，得到消毒后的小病叶。

3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13分离培养：用已灭菌的镊子将消毒后的小病叶贴放到马铃薯葡萄糖琼脂固体(PDA)培养基上，每皿均匀摆放4块，再将培养皿用保鲜膜密封，倒置放入恒温培养箱中，28℃培养，每隔12h进行观察，48h后将长出的菌体转接至另一马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，倒置放入恒温培养箱中，28℃培养48h后进行纯化，得到纯化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13。

采用梯度稀释法，将所述纯化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13分别涂布在不同的LB平板培养基中，倒置放入恒温培养箱中，28℃培养48h，分别取出上述LB平板培养基，分别挑取单菌落接种至不同试管中的斜面培养基上，置于培养箱中保存，温度为8～10℃。

4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的纯化

在无菌操作台中，将液体LB培养基分装到锥形瓶中，取出所述培养箱中保存的试管，用接种针挑取少量枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13分别接种于所述锥形瓶中，封口，置于摇床上震荡培养，温度为28℃，培养12h后，取出所述摇床上震荡培养的锥形瓶，用移液器吸取200微升于LB培养基上，用涂抹棒涂抹均匀，倒置放入28℃恒温培养箱培养，培养时间为48h，再通过无限稀释法处理获得29株单一菌株；

5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的筛选与培养

对所述29株单一菌株分别进行如下对峙培养：

用无菌打孔器打取炭疽菌RC178的菌饼，菌饼的直径为6mm，置于LB平板培养基中间，LB平板培养皿的直径为90mm，在所述菌饼周围十字交叉的4个角落接种所述单一菌株，设置3个重复，用保鲜膜封上培养皿防止污染。

采用点线处理法和其他对峙形式，进行对峙培养；以只接种所述炭疽菌RC178，不接种所述单一菌株为对照组。置于恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养时间为4～7d。

根据所述单一菌株对炭疽菌RC178的抑菌作用，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K13；筛选方法为：采用两点对峙培养；挑取28℃恒温培养7d的拮抗菌和病原菌的同质等量菌丝，接种于距离PDA平皿中心1.5cm的2个点上，再置于28℃恒温箱中培养，逐日观察抑菌作用；上述对峙培养方式设3个重复，以仅接种病原真菌的平皿作为对照。

6、在液体LB培养基中振荡培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌种。

图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对橡胶树炭疽病菌的平板对峙拮抗作用图，其中图1(a)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果1，图1(b)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果2，图1(c)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13与炭疽菌RC178对峙的结果3，图1(d)为对照组——炭疽菌RC178的培养结果。

实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的生理生化鉴定

1、V-P试验

1)原理

某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被空气里的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，则为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少，则可加入少量含胍基化合物，如肌酸或肌酐等。试验时加入α-萘酚可加速此反应。

2)培养基

蛋白胨5.0克，葡萄糖5.0克，K₂HPO₄(或NaCl)5.0克，蒸馏水1000毫升，pH为7.0～7.2，分装于试管中，每支试管5毫升，121℃灭菌20分钟。

3)试剂

6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。

4)方法

用琼脂培养物将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于28℃培养48-96h；于2毫升培养液内加入1毫升甲液和0.4毫升乙液，摇振混合。试验时强阳性者5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在36±1℃下培养4h再进行观察。(长时间无反应，可置于室温过夜)，次日不变者为阴性。

5)试验结果

表1为V-P试验结果。

表1为V-P试验结果

由实验结果得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13为V-P试验阳性，可知枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13含有丙酮酸脱羧酶，可以将细菌分解葡萄糖产生的丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境下可被氧化生成二乙酰，二乙酰再与含有胍基的化合物反应，生成红色的化合物，即为V-P实验阳性。

2、甲基红试验

1)原理：

甲基红试验是根据肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基的pH值降至4.5以下，使甲基红指示剂变红这个原理进行的测验。

2)培养基

蛋白胨5.0克，葡萄糖5.0克，氯化钠5.0克，蒸馏水1000毫升，pH为7.0～7.2，分装于试管中，121℃灭菌20分钟。

3)试剂

甲基红0.1克、95％乙醇300毫升、蒸馏水200毫升。

4)方法

取10微升K13新鲜种子液接种于试管中，置于28℃恒温培养2、4、6d取出，然后在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色表示甲基红试验为阳性反应，黄色为阴性反应。

5)试验结果

表2为甲基红试验结果

表2甲基红试验结果

由实验结果得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13为甲基红试验阳性，可知枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13可产生大量酸性产物。

3、接触酶试验

1)原理

具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡，一般用来鉴别细菌的类型。革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

2)方法

取槽置于洁净的试管内或玻片上，加数滴3％过氧化氢溶液；或直接滴加3％过氧化氢溶液于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

3)试剂

3％过氧化氢溶液。

4)试验结果

表3为接触酶试验结果。

表3接触酶试验结果

由实验结果得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13为革兰氏阳性菌，是具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢产生水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

实施例5

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株生长曲线的绘制

1)方法

采用比色法测定：将液体LB培养基装入2000毫升三角瓶中，灭菌冷却后，接入活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株，置于28℃、180转每分钟的摇床上培养。每隔两个h取样，测定600纳米处菌液的吸光度(OD600)。

2)结果：

图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株的生长曲线图，其中OD600为纵坐标，培养时间为横坐标。因为吸光度由菌液密度决定，故由吸光度的变化趋势可以推测细菌的生长趋势。

由图2可知：0～7h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株生长缓慢，处于停滞生长期；7～16h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株生长迅速，处于对数生长期；16～56h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株生长相对平缓，处于稳定生长期；而在培养56h之后，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株生长开始出现负增长，处于生长的衰亡期。

实施例6

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究

1)材料

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，去离子水添加至1000毫升，高压下蒸汽灭菌20分钟。

2)方法

A、首次筛选：采用四点法。在事先备好的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，接种直径为6mm的炭疽菌RC178菌饼，同时在距马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央25mm的对称四点处接种单一菌株，每株菌重复3次，28℃下倒置培养，3d后观察有无抑菌带形成。

B、复筛：采用划线法。在事先备好的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，接种直径为6mm的炭疽菌RC178菌饼，同时在距马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央25mm处的两侧，用接种针蘸取待测菌分别划一条长30mm的直线，每个菌株重复3次，28℃下倒置培养4d后测量各菌株抑菌带的宽度。(放线菌生长较慢，需比病原菌提前3d划线，以确保其定殖)。

3)结果

表4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究的结果。

表4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究结果

菌株	1	2	3
				抑菌直径(mm)	6.5	5.5	6.5

可知。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果非常好。

实施例7

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对抗生素的敏感性研究

1)培养基

LB固体培养基。

2)试剂

氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素、红霉素、利福平、头孢霉素。

3)方法

用滤纸片法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对不用抗生素的敏感性，用打孔器制备直径7mm的滤纸片，高温灭菌；在溶化后冷却至50-55℃的LB固体培养基中加入1毫升枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13种子液，摇匀后倒平板，将灭菌后的滤纸片置于平板中，然后在滤纸上添加抗生素溶液，添加量相当于氨苄青霉素Amp 50微克每毫升、卡那霉素Kana 50微克每毫升、氯霉素Chl 50微克每毫升、链霉素Str 50微克每毫升、四环素Tet 50微克每毫升、红霉素Ery 50微克每毫升、利福平Rif 50微克每毫升、头孢霉素Cef50微克每毫升，放置于28℃恒温培养箱内培养，分别于24h、48h观察结果。

4)结果

表5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对抗生素的敏感性研究的结果。

表5枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对抗生素的敏感性研究结果表

抗生素	1	2	3
				Cef	2.8/2.7	2.1/2.2	2.6/2.7
Amp	—	—	—
				Kana	2.5/2.2	1.8/1.8	2.0/2.0
Chl	—	—	—
				Str	1.8/1.8	1.7/1.7	1.8/1.8
Tet	2.5/2.4	2.3/2.6	3.3/3.5
				Rif	1.1/1.1	1.1/1.1	—
Ery	2.0/2.2	1.6/1.7	3.0/3.5

本实验主要为了测试枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13对各种抗生素的敏感性，结果表明：氨苄青霉素、氯霉素对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13均无抑制。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13菌株能够有效抑制橡胶树炭疽病菌的生长，对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不易产生抗性，能够进行商业开发，应用前景广阔。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (6)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其保藏编号为：CGMCC No.10917，于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13，其特征在于，所述枯芽孢杆菌K13分离自橡胶树叶。

3.权利要求1或2任意一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述枯草芽孢杆菌接种于液体LB培养基中振荡培养得到；

所述液体LB培养基的配方：每1000mL水中含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g；pH为7.4。

4.权利要求1或2任意一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13用于制备对橡胶树炭疽病菌有拮抗作用的生化试剂。

5.权利要求1或2任意一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用，其特征在于，用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化试剂。

6.权利要求1或2任意一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K13的应用，其特征在于，用于制备对橡胶树炭疽病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化试剂。