CN115589945A - 一种开放式培养生姜试管苗的方法 - Google Patents

一种开放式培养生姜试管苗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115589945A
CN115589945A CN202211237430.6A CN202211237430A CN115589945A CN 115589945 A CN115589945 A CN 115589945A CN 202211237430 A CN202211237430 A CN 202211237430A CN 115589945 A CN115589945 A CN 115589945A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ginger
culture
culture medium
test
bacteriostatic agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211237430.6A
Other languages
English (en)
Inventor
蔡小东
赵小琴
姜栋柱
向元园
李港
余双迎
张一鸣
胡柳
贾切
朱永兴
刘奕清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangtze University
Original Assignee
Yangtze University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangtze University filed Critical Yangtze University
Priority to CN202211237430.6A priority Critical patent/CN115589945A/zh
Publication of CN115589945A publication Critical patent/CN115589945A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/002—Culture media for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于园艺植物生物技术领域，公开了一种开放式培养生姜试管苗的方法，包括生姜根茎催芽、复配抑菌剂的配置、培养基配置、接种用具及接种室消毒、丛生芽诱导、增殖及壮苗培养、试管苗驯化移栽。本发明通过在培养基中添加复配抑菌剂而建立生姜开放组培体系，可有效抑制试管苗污染的发生，培养基无需进行高温高压灭菌，接种操作不需要超净工作台，只需要在洁净的室内进行，从根本上简化了生姜组培环节，降低了试管苗生产成本。相比于传统组培，本发明生姜试管苗生产投资少，实用性强，成本可降低30％以上，适宜生姜试管苗的商业化生产。

Description

一种开放式培养生姜试管苗的方法
技术领域
本发明属于园艺植物生物技术领域，具体涉及一种开放式培养生姜试管苗的方法。
背景技术
生姜(Zingiber officinale Roscoe)为姜科姜属多年生宿根草本植物，具有药食同源的特性，单位面积经济效益位居农作物前列，已成为农民增收、农业增效、国家乡村振兴战略的高效支柱产业。生姜在生产上主要以成熟根状茎进行无性繁殖，繁殖系数低，连续多年种植致使姜瘟病等土传病害逐年加重，导致生长势衰退、种性退化、产量品质下降，成为制约生姜生产的重要因素。
为防止病害和提高繁殖系数，目前，一般采用茎尖分生组织离体培养脱除生姜病菌病毒，进而建立种苗、种姜快繁体系。通过脱毒脱菌组培得到的生姜苗，能显著提高生姜品质，大幅度降低病毒病菌感染，并且在种植上降低了成本投入。现有技术表明，生姜脱毒苗种植土地产出率是传统栽培的10倍，试管苗和生姜生产种产比系数达1：300，单株平均产量达800g，亩产达5260kg，比生姜传统种植提高产量30％-45％以上。然而，生姜离体快繁体系要求严格的无菌环境和无菌操作，操作步骤繁琐，常因其中一个小环节的疏忽造成污染。此外，传统组培的无菌操作需要在超净工作台中进行，配置的培养基需要经过高温高压灭菌而耗费电能，对培养容器的要求也较高。这些因素导致生姜传统组培苗生产成本较高，限制了其商业化发展。
为降低组培苗生产成本，简化工作程序，学者们一直在努力探索一种能高效率、低成本和规模化生产试管苗的新技术。植物开放组培是指在抑菌剂的作用下，使植物离体培养脱离严格无菌的操作环境，培养基不需高温高压灭菌，接种可不在超净工作台中进行，用普通容器替代传统的组培瓶，在自然、开放的有菌环境中进行植物的离体培养。与传统组培技术相比，开放组培可简化操作程序、降低组培成本，将污染率控制在可接受的范围且不影响外植体的生长发育。此外，开放组培不需高温高压灭菌，培养基中的植物生长调节剂及营养元素损失较少，培养容器较传统组培容器透光性好。许多研究表明开放组培再生的植株生长健壮，分化率相对较高，植株移栽成活率也较高。因此，植物开放组培自诞生以来一直受到研究者的青睐，在甘蔗、大叶相思、马铃薯、牡丹等植物中受到了广泛关注。
有效的抑菌剂(组合)及其最佳浓度的筛选是成功建立开放组培体系的关键。理想的抑菌剂配方能高效抑制培养基微生物污染，且对瓶内培养物生长发育没有明显负作用。许多研究对常用抗生素、抗菌素、防腐剂或植物活性物质做了大量单一或组合添加到培养基中的试验，结果发现它们在植物组培污染的防治方面有一定的作用。然而，针对不同的物种要想找到一种合适的抑菌剂组合较困难，往往是培养基中的抑菌剂对植物组织的生长有抑制作用，或抗菌效果不佳。这可能是由于目前还没有一种抑菌剂对所有的细菌或真菌都有效，且有些抗菌素、防腐剂在有效浓度下其杀菌、抗菌成分对植物组织直接产生伤害，有些则产生盐害。针对抑菌剂(组合)筛选中的问题，只有选择与植物组织亲和、友好，药效期长(至少一个生长周期)，不产生盐害并具有杀菌、抗菌活性的物质，才能建立成功的开放组培体系。
生姜有消炎抗菌的作用，生姜的***提取物对多种微生物如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、黑曲霉、青霉、大肠杆菌、啤酒酵母菌有明显的抑制作用。研究发现浓度为0.25％–4.0％的生姜乙醇提取物在pH 6–8时，对细菌、酵母菌、和霉菌均有抑制作用。益培隆是一种长效、广谱、高活性、新型组织培养专用防污染杀菌剂。益培隆与微生物接触后，可使细胞死亡，从而迅速杀灭或抑制其生长。而次氯酸钠是一种作用迅速、低毒、价格低廉的广谱杀菌剂，对病毒、细菌、真菌和芽孢均有较强的杀灭能力。通过筛选有效的生姜提取物、益培隆、次氯酸钠复配抑菌剂，并应用于生姜脱毒苗生产中，可有效降低其生产成本。然而，目前生姜开放组培体系尚未建立，未筛选到适宜的抑菌剂配方。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的生姜试管苗培养方法需要进行外植体消毒、培养基灭菌、无菌接种、无菌培养等操作，成本高，操作步骤较繁琐，对环境要求高，易受到污染。这些因素限制了生姜组培苗的商业化和产业化发展；
(2)现有的抑菌剂配方在生姜开放组培中应用抑菌效果不佳，且会抑制、损害生姜组织或器官的生长和发育，无法体现开放组培技术的优越性。
发明内容
针对现有生姜组培技术操作步骤繁琐、成本高等问题，本发明提供了一种开放式培养生姜试管苗的方法。
本发明是这样实现的，一种开放式培养生姜试管苗的方法包括：
洗净的生姜根茎表面消毒后，用清水洗净，然后置于湿沙中催芽；
制备生姜提取液和益培隆母液，配置复配抑菌剂；
组培容器洗净晾干后用紫外灯杀菌，配置含有复配抑菌剂的丛生芽诱导培养基、增殖及壮苗培养培养基；
接种室降尘灭菌后再用紫外线灯照射，接种用具用乙醇消毒后浸泡于复配抑菌剂水溶液中；
生姜根茎萌发的嫩芽经升汞溶液消毒后用手术刀剥去外层叶鞘，切割的芽尖接种于丛生芽诱导培养基中培养；
诱导的丛生芽修整为微型团块，转接至增殖及壮苗培养基中培养；
再生的无菌苗洗净根部培养基，移栽至装有育苗基质的穴盘中，浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，待小苗有新叶长出时可定植于田间；
进一步，生姜根茎催芽时，将洗净的生姜根茎用1000倍稀释的多菌灵浸泡30min，清水洗净后置于灭菌后的沙子中，加入适量自来水以保持湿度，在25±2℃黑暗的条件下催芽20-30d；
进一步，生姜粗提液的制备时，姜块洗净去皮后切成5mm厚姜片，置于恒温干燥箱内60℃条件下烘15h，用粉碎机粉碎，60目过筛后称重姜粉，按料液比1：10(g/mL)加入50ml70％乙醇溶液浸泡0.5h，用索氏提取器回流直至提取器中液体为无色，提取温度为60℃，经0.22um孔径滤膜过滤得黄色油状物粗提液。平行提取多份，合并粗提液，用旋转蒸发仪旋转蒸发(温度45℃)至乙醇挥发完全。膏状物用50％乙醇作溶剂配制成1g(姜粉质量)/mL的生姜提取物溶液，置4℃冰箱保存；
进一步，益培隆母液制备时，将益培隆B瓶白色粉末溶解于益培隆A瓶缓冲液中，加10mL蒸馏水稀释成浓度为4.35×104mg/L的母液；
进一步，复配抑菌剂的配置时，取15.5mL上述生姜提取物溶液、1.0mL益培隆母液、0.05ml浓度为10％的次氯酸钠溶液，混合后用蒸馏水定容至100mL，即为复配抑菌剂水溶液；
进一步，用于丛生芽诱导、增殖及壮苗培养的培养基在添加各组分后加热至沸腾，于培养基温度降至50℃时向培养基中加入1mL/L复配抑菌剂，混匀后立即分装至预先洗净晾干且用紫外灯杀菌30min的培养容器中备用，不用进行高温高压灭菌；
进一步，接种室用75％乙醇喷雾降尘后再用紫外线灯照射30min，接种用具用75％乙醇消毒后浸泡于1.0％(v/v)的复配抑菌剂水溶液中至少1h以上，且接种时一直浸泡于该抑菌剂水溶液中；
进一步，丛生芽诱导时，取生姜根茎催芽所新萌发的的1.5～2cm长的嫩芽，用自来水冲洗15min后用70％乙醇浸泡15s，再用0.1％(m/v)升汞溶液浸泡15min，消毒处理后用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干嫩芽表面的水分。用手术刀剥去外层叶鞘，切割0.3-0.5cm长的芽尖接种于MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L 6-BA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH 5.8)的丛生芽诱导培养基中；
进一步，丛生芽诱导2个月后，将诱导的丛生芽基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH5.8)的增殖及壮苗培养基上；
进一步，丛生芽诱导、增殖及壮苗培养中接种材料均培养于光照强度2000lx左右、光周期14h/10h、温度25℃±2℃的培养室内；
进一步，增殖及壮苗培养2个月后，待苗高5-6cm后打开罐头瓶瓶盖，注入少量自来水以让无菌苗慢慢适应有菌环境，3d后用自来水洗净无菌苗根部培养基，将小苗移栽至装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔栽植1株，基质为体积比为3：1的丹麦Pindstrup泥炭土和珍珠岩。浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，驯化条件为温度25℃、相对湿度80％、光强3000lx左右。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明以筛选的复配抑菌剂进行生姜的开放组培育苗，能够有效避免试管苗的污染发生。在丛生芽诱导及增殖过程中，与传统组培相比，开放组培的污染率、丛生芽诱导率、增殖率均无显著差异。从试管苗的生长状况看，由于开放组培培养基未经过高温高压灭菌，营养元素和激素损失较小，更有利于试管苗的生长。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明建立的生姜开放组培技术体系能有效降低组培苗生产成本30％以上，应用前景广阔。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明筛选的复配抑菌剂在生姜开放组培中具有高效、低毒害的特性，商业应用前景广阔；建立的开放组培体系可降低生姜试管苗生产成本，促进生姜试管苗的商业化生产。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：生姜有消炎抗菌的作用，生姜提取物对多种微生物如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、黑曲霉、青霉、大肠杆菌、啤酒酵母菌有明显的抑制作用。本发明首次将生姜提取物应用于开放组培中，取得了较好地效果。
(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
传统生姜离体快繁体系要求严格的无菌环境和无菌操作，操作步骤较繁琐，常因其中一个小环节的疏忽造成污染。此外，传统组培的无菌操作需要在超净工作台中进行，配置的培养基需要经过高温高压灭菌而耗费电能，对培养容器的要求也较高。这些因素导致生姜传统组培苗生产成本较高，限制了生姜组培苗的商业化发展。本发明通过在培养基中添加复配抑菌剂而建立生姜开放组培体系，可有效抑制污染的发生且对植株的生长没有影响，降低了试管苗生产成本。
附图说明
图1是本发明实施例提供的生姜开放组培方法流程图；
图2是本发明实施例提供的凤头姜在25±2℃、黑暗沙藏20d后萌发的嫩芽；
图3是本发明实施例提供的刚接种于丛生芽诱导培养基上的芽尖；
图4是本发明实施例提供的丛生芽诱导培养基上培养2个月后形成的丛生芽
图5是本发明实施例提供的在增殖及壮苗培养基上培养2个月再生的植株；
图6是本发明实施例提供的驯化培养1个月后的试管苗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明实施例提供的一种开放式培养生姜试管苗的方法包括以下步骤：
S101：生姜根茎催芽。将洗净的生姜根茎用1000倍稀释的多菌灵浸泡30min，清水洗净后置于灭菌后的沙子中，加入适量自来水以保持湿度，在25±2℃黑暗的条件下催芽20-30d；
S102：复配抑菌剂的配置。
(1)生姜粗提液的制备：姜块洗净去皮后切成5mm厚姜片，置于恒温干燥箱内60℃条件下烘15h，用粉碎机粉碎，60目过筛后称重姜粉，按料液比1：10(g/mL)加入50ml 70％乙醇溶液浸泡0.5h，用索氏提取器回流直至提取器中液体为无色，提取温度为60℃，经0.22um孔径滤膜过滤得黄色油状物粗提液。平行提取多份，合并粗提液，用旋转蒸发仪旋转蒸发(温度45℃)至乙醇挥发完全。膏状物用50％乙醇作溶剂配制成1g(姜粉质量)/mL的生姜提取物溶液，置4℃冰箱保存；
(2)益培隆母液制备：将益培隆B瓶白色粉末溶解于益培隆A瓶缓冲液中，加10mL蒸馏水稀释成浓度为4.35×104mg/L的母液；
(3)复配抑菌剂的配置：取15.5mL上述生姜提取物溶液、1.0mL益培隆母液、0.05ml浓度为10％的次氯酸钠溶液，混合后用蒸馏水定容至100mL，即为复配抑菌剂水溶液；
S103：培养基配置及培养条件。用于丛生芽诱导、增殖及壮苗培养的培养基在添加各组分后加热至沸腾，于培养基温度降至50℃时向培养基中加入1mL/L复配抑菌剂，混匀后立即分装至罐头瓶或三角瓶中备用；接种后均培养于光照强度2000lx左右、光周期14h/10h、温度25℃±2℃的培养室内。
S104：器皿、用具、接种室消毒。组培瓶洗净晾干后用紫外灯杀菌30min，接种室用75％乙醇喷雾降尘灭菌后再用紫外线灯照射30min，接种用具用75％乙醇消毒后浸泡于1.0％(v/v)的配抑菌剂水溶液中至少1h以上；
S105：丛生芽诱导。取生姜根茎催芽所新萌发的的1.5～2cm长的嫩芽，用自来水冲洗15min后用75％乙醇浸泡15s，再用0.1％(m/v)升汞溶液浸泡15min，消毒处理后用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干嫩芽表面的水分。用手术刀剥去外层叶鞘，切割0.3-0.5cm长的芽尖接种于MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L 6-BA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂的丛生芽诱导培养基(pH 5.8)中；
S106：增殖及壮苗培养。丛生芽诱导2个月后，将诱导的丛生芽基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH 5.8)增殖及壮苗培养基上；
S107：试管苗移栽驯化。增殖及壮苗培养2个月后，待苗高5-6cm后打开罐头瓶瓶盖，注入少量自来水以让无菌苗慢慢适应有菌环境，3d后用自来水洗净无菌苗根部培养基，将小苗移栽至装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔栽植1株，基质为体积比为3：1的丹麦Pindstrup泥炭土和珍珠岩。浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，驯化条件为温度25℃、相对湿度80％、光强3000lx左右。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
应用实施例1，凤头姜开放组培体系的建立(图2-图6)
(1)将洗净的凤头姜老熟根茎置于灭菌后的沙子中，加入适量自来水以保持沙子湿度，置于人工气候箱中在25±2℃黑暗的条件下培养；
(2)复配抑菌剂的配置：取15.5mL浓度为1g(姜粉质量)/mL生姜提取物溶液、1.0mL浓度为4.35×104mg/L益培隆母液、0.05ml浓度为10％的次氯酸钠溶液，混合后用蒸馏水定容至100mL，即为复配抑菌剂水溶液。
其中生姜粗提液的制备方法为：称取1.0Kg凤头姜姜块，洗净去皮后切成5mm厚姜片，置于恒温干燥箱内60℃条件下烘15h后用粉碎机粉碎，60目过筛后称重姜粉，按料液比1：10(g/mL)加入50ml 70％乙醇溶液浸泡0.5h，用索氏提取器回流直至提取器中液体为无色，提取温度为60℃，经0.22um孔径滤膜过滤得黄色油状物粗提液。平行提取多份，合并粗提液，用旋转蒸发仪旋转蒸发(温度45℃)至乙醇挥发完全。膏状物用50％乙醇作溶剂配制成1g(姜粉质量)/mL的生姜提取物溶液，置4℃冰箱保存；
其中益培隆母液配置方法为：将益培隆B瓶白色粉末溶解于益培隆A瓶缓冲液中，加10mL蒸馏水稀释成浓度为4.35×104mg/L的母液；
(3)配置丛生芽诱导、增殖及壮苗培养的培养基。丛生芽诱导培养基为MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L 6-BA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 5.8；增殖及壮苗培养的培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/LIBA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂增殖培养基(pH 5.8)。用于丛生芽诱导、增殖及壮苗培养的培养基在添加各组分后加热至沸腾，于培养基温度降至50℃时向培养基中加入1mL/L复配抑菌剂，混匀后立即分装至罐头瓶或三角瓶中备用。其中罐头瓶或三角瓶使用前先洗净晾干后用紫外灯杀菌30min，分装培养基后不用高温高压灭菌；
(4)接种前接种室用75％乙醇喷雾降尘灭菌后再用紫外线灯照射30min，接种用具用75％乙醇消毒后浸泡于1.0％(v/v)的配抑菌剂水溶液中至少1h以上；
(5)取凤头姜新萌发的的1.5～2cm长的嫩芽，用自来水冲洗15min后用75％乙醇浸泡15s，再用0.1％(m/v)升汞溶液浸泡15min，消毒处理后用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干嫩芽表面的水分。用手术刀剥去外层叶鞘，切割0.5cm长的芽尖接种于丛生芽诱导培养基中，接种后均培养于光照强度2000lx左右、光周期14h/10h、温度25℃±2℃的培养室内；
(6)丛生芽诱导2个月后，将诱导的丛生芽基部0.5cm以上部分切除，用手术剪刀剪除诱导的根系，形成微型团块转接至MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/LIBA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂增殖培养基(pH 5.8)上；
(7)增殖及壮苗培养2个月后，待苗高5-6cm后打开罐头瓶瓶盖，注入几滴自来水以让无菌苗慢慢适应有菌环境，3d后用自来水洗净无菌苗根部粘连的培养基，然后将小苗移栽至装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔栽植1株，基质为体积比为3：1的丹麦Pindstrup泥炭土和珍珠岩。浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，驯化条件为温度25℃、相对湿度80％、光强3000lx左右
本发明实施例提供的凤头姜开放组培体系的建立方法包括：通过在培养基中添加1mL/L筛选的复配抑菌剂，以萌发的1.5-2.0cm长嫩芽为外植体，经过外植体消毒、丛生芽诱导、增殖及壮苗培养、驯化移栽等过程进而建立凤头姜的开放组培体系。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
1.实验方案
1.1材料、试剂及仪器
1.1.1材料
以长江大学香辛作物研究院细胞工程实验室保存的生姜种质资源为材料。
1.1.2主要试剂
益培隆、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IBA)等。
1.1.3主要仪器设备
索氏提取器、旋转蒸发仪、电子天平、移液枪、pH计、纯水仪等。
1.2开放组培体系的建立
1.2.1生姜提取物及益培隆复配抑菌剂配方的筛选
1)生姜活性物质的提取
选择1kg凤头姜老姜，清洗后切成5mm厚姜片，置于恒温干燥箱内60℃烘15h，至水分含量约为15％，用粉碎机粉碎，60目过筛随即装入塑料瓶中。密封后置于阴凉干燥处备用。称取3g姜粉，按料液比1：10(w/v)在70％乙醇溶液中浸泡30min，在索氏提取仪中提取回流直至提取器中液体为无色，提取温度为60℃。经0.22μm孔径滤膜过滤得到黄色油状粗提液，用旋转蒸发仪旋转蒸发(温度45℃)至乙醇挥发完全，所得膏状物用50％乙醇做溶剂配制成质量浓度为1.0g/mL供试原液，置4℃冰箱保存备用。
2)自然落菌试验
试验采用三因素四水平正交试验处理用于自然落菌试验。
因素一：生姜提取物浓度
水平1：0mg/mL
水平2：7.65mg/mL
水平3：15.5mg/mL
水平4：25.0mg/mL
因素二：益培隆浓度
水平1：0.0mg/mL
水平2：0.155mg/mL
水平3：0.25mg/mL
水平4：0.50mg/mL
因素三：次氯酸钠浓度
水平1：0.0mg/mL
水平2：0.155mg/mL
水平3：0.25mg/mL
水平4：0.50mg/mL
选择洁净的房间作为操作室，关闭门窗，用75％乙醇喷雾降尘灭菌，紫外线灯照射30min。所用培养基为生姜常用增殖培养基：MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH＝5.8。先将培养皿(60mm×15mm)洗净晾干后用紫外灯杀菌30min，MS培养基各组分添加完后按照常规方法加热至沸腾，在培养基温度降至大约50℃(琼脂未凝固前)加入不同浓度生姜提取物及益培隆复配抑菌剂，充分搅拌培养基，然后在培养皿中分别加入5mL添加不同配方复配抑菌剂的增殖培养基，不经高压灭菌，在空气中暴露l h，封口后置于培养室中培养。试验共16个处理，共64个，每处理设4个培养皿，重复3次。
3)复配抑菌剂对凤头姜不同外植体离体培养的影响
采用上述筛选的最佳复配抑菌剂配方，以凤头姜姜芽、无菌试管苗、细菌污染的试管苗及真菌污染的试管苗为材料，探讨复配抑菌剂对凤头姜不同外植体离体培养的影响。丛生芽诱导、增殖及壮苗培养基配置方法同上，以未添加抑菌剂的培养基为对照，接种方式同上。接种用具始终浸泡在75％乙醇中，使用时用酒精灯进行灼烧。选择洁净的房间作为接种室，关闭门窗，用75％乙醇喷雾降尘灭菌，紫外线灯照射30min，75％乙醇将接种台面和手擦干净，处理组在常规实验台面接种，对照在超净台内接种。每个罐头瓶分别接种4个外植体，接种后转入光照培养室培养，培养条件同上。每处理接种4瓶，重复3次。4)外植体污染、生长及再生植株的移栽驯化
外植体接种15d后观测接种材料的污染及生长情况。再生植株苗高5-6cm后打开罐头瓶瓶盖，注入几滴自来水以让无菌苗慢慢适应有菌环境，3d后用自来水洗净无菌苗根部粘连的培养基，然后将小苗移栽至装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔栽植1株，基质为体积比为3：1的丹麦Pindstrup泥炭土和珍珠岩。浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，驯化条件为温度25℃、相对湿度80％、光强3000lx左右。每个处理移栽16棵小苗，移栽1个月后统计移栽成活率，试验重复3次。
2.试验结果
2.1不同配方复配抑菌剂对自然落菌条件下培养基污染的影响
生姜粗提液浓度均值分析结果(表1)表明，K2＞K4＞K3＞K1，由此判断A2为A因素的最优水平，即1.25mg/mL为生姜粗提液的最佳浓度。同理确定B4(4.35mg/L)为益培隆的最佳浓度，C3(0.005mg/L)或C4(0.01mg/L)均为次氯酸钠的最佳浓度。但考虑到培养基中次氯酸钠对外植体的伤害作用，因此，通过对正交实验数据进行分析，得出的复配抑菌剂的最适浓度组合为：1.25mg/mL生姜提取物+4.35mg/L益培隆+0.005mg/L次氯酸钠。极差值越大表示因素的水平变化对试验指标的影响越大、越重要，影响复配抑菌剂效果的因素排序为益培隆＞次氯酸钠＞生姜粗提液(表1)。
表1不同配方复配抑菌剂对自然落菌条件下培养基污染的影响
Figure BDA0003882113310000141
注：因素A为生姜粗提液(mg/mL),因素B为益培隆(mg/L),因素C为生姜粗提液(mg/mL)
2.2复配抑菌剂对凤头姜姜芽离体再生的影响
如图2-图6所示，凤头姜在25±2℃、黑暗沙藏20d后萌发了0.5-1.0cm长的嫩芽(图2)。以嫩芽外植体，接种于添加有最佳复配抑菌剂(1.25mg/mL生姜提取物+4.35mg/L益培隆+0.005mg/L次氯酸钠)的丛生芽培养基中(图3)。培养15d后，污染率统计结果表明凤头姜初代开放组培污染率平均为25.9％，污染率在初代培养中属于可接受范围。未污染的芽培养15d后，基部膨大，芽尖逐渐转绿。培养60d后，形成了高度5-6cm的丛生芽(图4)。丛生芽切割后进行壮苗和增殖培养，2个月后长满了罐头瓶，叶片浓绿，根系发达(图5)。在玻璃温室驯化培养1个月后，大多数植株长出了2-3片新叶(图6)，移栽成活率达92.6％。
2.3复配抑菌剂对凤头姜未污染及污染试管苗继代培养的影响
如表2所示，不同外植体在筛选的复配抑菌剂的处理条件下，无菌试管苗为外植体的污染率最低(5.56％)。由于培养基未经高温高压灭菌而造成营养流失，与对照植株相比未污染试管苗其株高增加了7.21％。接种被细菌或真菌污染的试管苗，其污染率较虽然都达到了100％，但相比于对照(细菌或真菌污染的试管苗)，由于抑菌剂的存在，其培养基中菌斑较小，植株仍能较好生长。
表2复配抑菌剂对凤头姜不同来源外植体污染率及生长的影响
Figure BDA0003882113310000151
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述开放式培养生姜试管苗的方法包括：
洗净的生姜根茎表面消毒后，用清水洗净，然后置于湿沙中催芽；
制备生姜提取液和益培隆母液，配置复配抑菌剂；
组培瓶洗净晾干后用紫外灯杀菌，配置含有复配抑菌剂的丛生芽诱导培养基、增殖及壮苗培养培养基；
接种室用降尘灭菌后再用紫外线灯照射，接种用具用乙醇消毒后浸泡于复配抑菌剂水溶液中；
生姜根茎萌发的嫩芽经升汞溶液消毒后用手术刀剥去外层叶鞘，切割的芽尖接种于丛生芽诱导培养基中培养；
诱导的丛生芽修整为微型团块，转接至增殖及壮苗培养基中培养；
再生的无菌苗洗净根部培养基，移栽至装有育苗基质的穴盘中，浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，待小苗有新叶长出时可定植于田间。
2.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述生姜根茎催芽方法包括：将洗净的生姜根茎用1000倍稀释的多菌灵浸泡30min，清水洗净后置于灭菌后的沙子中，加入适量自来水以保持湿度，在25±2℃黑暗的条件下催芽20-30d。
3.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述复配抑菌剂配置方法包括以下步骤：
步骤一，姜块洗净去皮后切成5mm厚姜片，置于恒温干燥箱内60℃条件下烘12h，用粉碎机粉碎，60目过筛后称重姜粉，按料液比1：10(g/mL)加入50ml 70％乙醇溶液浸泡0.5h，用索氏提取器回流直至提取器中液体为无色，提取温度为60℃，经0.22um孔径滤膜过滤得黄色油状物粗提液；平行提取多份，合并粗提液，用旋转蒸发仪旋转蒸发(温度45℃)至乙醇挥发完全；膏状物用50％乙醇作溶剂配制成1g(姜粉质量)/mL的生姜提取物溶液，置4℃冰箱保存；
步骤二，将益培隆B瓶白色粉末溶解于益培隆A瓶缓冲液中，加10mL蒸馏水稀释成浓度为4.35×104mg/L的母液；
步骤三，取12.5mL上述生姜提取物溶液、1.0mL益培隆母液、0.05ml浓度为10％的次氯酸钠溶液，混合后用蒸馏水定容至100mL，即为复配抑菌剂水溶液。
4.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述培养基配置方法包括：用于丛生芽诱导、增殖及壮苗培养的培养基在添加各组分后加热至沸腾，于培养基温度降至50℃时向培养基中加入1mL/L复配抑菌剂，混匀后立即分装至预先洗净晾干且用紫外灯杀菌30min后的罐头瓶或三角瓶中，不用进行高温高压灭菌。
5.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述接种室和接种用具消毒方法包括：接种室用75％乙醇喷雾降尘灭菌后再用紫外线灯照射30min，接种用具用75％乙醇消毒后浸泡于1.0％(v/v)的复配抑菌剂水溶液中至少1h以上，且接种时一直浸泡于该抑菌剂水溶液中。
6.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述生姜丛生芽诱导方法包括：取生姜根茎催芽所新萌发的的1.5～2cm长的嫩芽，用自来水冲洗15min后用70％乙醇浸泡15s，再用0.1％(m/v)升汞溶液浸泡12min，消毒处理后用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干嫩芽表面的水分；用手术刀剥去外层叶鞘，切割0.3-0.5cm长的芽尖接种于MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH 5.8)的丛生芽诱导培养基中，培养于光照强度2000lx左右、光周期14h/10h、温度25℃±2℃的培养室内。
7.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述生姜增殖及壮苗培养方法包括：丛生芽诱导2个月后，将诱导的丛生芽基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+1mL/L复配抑菌剂+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH5.8)的增殖及壮苗培养基上；每2个月继代培养1次，培养条件为光照强度2000lx左右、光周期14h/10h、温度25℃±2℃的培养室内，继代培养2次后小苗可进行驯化移栽。
8.如权利要求1所述开放式培养生姜试管苗的方法，其特征在于，所述生姜试管苗驯化移栽方法包括：增殖及壮苗培养2个月后，待苗高5-6cm后打开罐头瓶瓶盖，注入少量自来水以让无菌苗慢慢适应有菌环境，3d后用自来水洗净无菌苗根部培养基，将小苗移栽至装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔栽植1株，基质为体积比为3：1的丹麦Pindstrup泥炭土和珍珠岩；浇透水后置于智能玻璃温室中进行炼苗，驯化条件为温度25±2℃、相对湿度80％、光强3000lx左右。
CN202211237430.6A 2022-10-10 2022-10-10 一种开放式培养生姜试管苗的方法 Pending CN115589945A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211237430.6A CN115589945A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种开放式培养生姜试管苗的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211237430.6A CN115589945A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种开放式培养生姜试管苗的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115589945A true CN115589945A (zh) 2023-01-13

Family

ID=84847666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211237430.6A Pending CN115589945A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种开放式培养生姜试管苗的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115589945A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101836586A (zh) * 2010-01-15 2010-09-22 重庆市澳桉花木种植有限公司 竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法
CN102405842A (zh) * 2011-10-14 2012-04-11 福建农林大学 一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法
CN102577976A (zh) * 2012-03-17 2012-07-18 福建农林大学 一种构树简便组培方法
CN103348917A (zh) * 2013-07-18 2013-10-16 湖北蔬谷农业科技有限公司 生姜一步成脱毒苗快速繁殖方法
CN103651124A (zh) * 2013-11-22 2014-03-26 张明 一种生姜再生植株的诱导方法
CN105123750A (zh) * 2015-10-15 2015-12-09 贵州省生物技术研究所 开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂及其使用方法
CN112704011A (zh) * 2021-01-08 2021-04-27 重庆市幅沅农业生物技术研究院有限公司 一种生姜组织培养的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101836586A (zh) * 2010-01-15 2010-09-22 重庆市澳桉花木种植有限公司 竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法
CN102405842A (zh) * 2011-10-14 2012-04-11 福建农林大学 一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法
CN102577976A (zh) * 2012-03-17 2012-07-18 福建农林大学 一种构树简便组培方法
CN103348917A (zh) * 2013-07-18 2013-10-16 湖北蔬谷农业科技有限公司 生姜一步成脱毒苗快速繁殖方法
CN103651124A (zh) * 2013-11-22 2014-03-26 张明 一种生姜再生植株的诱导方法
CN105123750A (zh) * 2015-10-15 2015-12-09 贵州省生物技术研究所 开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂及其使用方法
CN112704011A (zh) * 2021-01-08 2021-04-27 重庆市幅沅农业生物技术研究院有限公司 一种生姜组织培养的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李白等: ""四种蔬菜食用器官提取物对植物组培污染细菌的抑制作用"", 《浙江农业学报》, vol. 29, no. 11, pages 1854 - 1861 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ibrahim et al. Plant growth regulators affecting in vitro cultivation of Stevia rebaudiana
CN108293878B (zh) 一种栝楼嫩叶的组培育苗方法
CN100581353C (zh) 芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法
CN115281081A (zh) 一种微型试管脱毒种姜的繁育方法
CN113678737B (zh) 一种多花黄精的开放式组织培养方法
CN108770688B (zh) 一种千里香的快速繁殖方法
Patil et al. In vitro micropropagation of Lilium candidum bulb by application of multiple hormone concentrations using plant tissue culture technique
CN104855294A (zh) 一种白木通快速繁殖的方法
KR20090120813A (ko) 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용한 캘러스의 대량증식방법및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법
CN112470929A (zh) 大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法
CN115606503B (zh) 一种紫菀的组织培养方法
CN115589945A (zh) 一种开放式培养生姜试管苗的方法
CN114557279A (zh) 一种紫纹兜兰非共生萌发培养基及培养方法
CN110192526B (zh) 一种蓝莓单倍体的培养方法
CN112293252A (zh) 一种檀香石斛的人工高效无性系繁殖方法
CN113875587B (zh) 一种促进大莪术不定芽诱导和丛生芽增殖的方法
CN114009337B (zh) 一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法
CN116369207B (zh) 水茄组培快繁方法及应用
CN116034873B (zh) 一种柽柳组织快繁方法
CN110192528B (zh) 一种青钱柳不定芽诱导及继代增殖培养方法
CN114208680B (zh) 一种台湾佛甲草组织培养与快速繁殖方法
CN116369203B (zh) 一种石蒜属植物小花再生培养基及小花再生方法
WO2010113178A2 (en) Development of viable protocol for in vitro propagation of pomegranate
CN113475397B (zh) 船盔乌头的组培快繁方法及其应用
CN110432151B (zh) 一种重阳木的组培快繁方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination