CN101825611A - 一种检测天麻多糖中单糖组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测天麻多糖中单糖组成的新方法。本发明公开了天麻多糖首先水解成为单糖，再经衍生化试剂衍生，之后进HPLC-UV***检测，得到各个单糖的含量。本方法所用高效液相检测***条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为按一定比例混合的缓冲溶液和有机溶剂，流速0.8～1.5ml/min，紫外或PDA检测器。本方法重复性好，灵敏度高，可以方便、准确的检测天麻多糖中单糖组成。
Description
技术领域
本发明涉及多糖组分分析领域。具体涉及一种检测天麻多糖中单糖组成的方法。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Blume)属兰科非自养型植物的干燥块茎，是我国传统的名贵中药，天麻具有平肝熄风止痉之功效，主要用于治疗治疗头痛眩晕、惊风抽搐、肢体麻木、面肌痉挛、高血压、冠心病等疾病。早期的研究者提取分离出天麻中许多活性成分，包括天麻素、天麻苷元、派立新、香草醇、对羟基苯甲醛、甾醇、柠檬酸、琥珀酸等。近年来，许多研究工作者都从天麻中分离得到了天麻多糖，并对其药理活性进行了实验研究，结果表明，天麻多糖具有清除自由基、抗眩晕、降血压，增强免疫，抑菌等功效。
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。随着分子生物学和细胞生物学的发展，多糖及其缀合物作为支持组织和能量来源的传统观念早已被突破，而被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子，而且由于它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重视。
多糖的生物活性与其平均分子质量大小和单糖组成有密切的关系，所以检测多糖中单糖的组成对多糖生物活性的研究有很大的帮助。
用于多糖测定的方法主要有显色法、气相色谱法、毛细管电泳法、阴离子色谱法，C18柱HPLC-UV法等。其中显色法只能检测总多糖含量，专属性差。气相色谱法过程复杂而且会出现异构化色谱峰。毛细管电泳法存在灵敏度差的缺点。阴离子色谱法所用柱子价格昂贵，且需要很长的时间来平衡。C18柱HPLC-UV法对植物多糖中单糖组分的检测具有检测设备相对便宜，灵敏度高，准确性好等优点，被越来越多的多糖研究人员采用。
目前，天麻多糖的检测主要用到上述的显色法和阴离子色谱法，未见天麻多糖中单糖检测用到C18柱HPLC-UV法的研究报道。由于干扰成分和单糖组成的不同，在直接使用文献中报道的其他多糖C18柱HPLC-UV法检测时，总会出现各种各样的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、稳定、准确的检测天麻多糖中单糖组成的方法。
本发明针对天麻多糖检测过程中干扰成分和组成单糖的不同，在现有C18柱HPLC-UV法检测其他植物多糖的基础上，进一步发展和改进，形成了一种新的方法用于天麻多糖中单糖组成的检测。
本发明的技术解决方案为：
从天麻中提取制得的天麻多糖，先通过酸水解使其成为单糖，然后加入衍生化化试剂进行衍生化，衍生化完成后，进入HPLC***检测。在HPLC***中，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行分离，柱温35℃，流动相是按一定比例混合的缓冲盐和有机溶剂，流速0.8～1.5ml/min，紫外检测器，波长220～360nm。
在本发明中，天麻多糖首先加酸水解形成单糖，所用酸选自无机酸或有机酸，包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸等。水解物用衍生化试剂进行衍生化，所用衍生化试剂包括但不限于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。
在HPLC***中，使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱子内径、颗粒粒径和柱子长度可任意选择，只要能分离开各个单糖即可。流动相为缓冲溶液和有机溶剂的混合液，所用缓冲溶液是弱酸与其盐的混合溶液，包括但不限于磷酸二氢钾水溶液-氢氧化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、醋酸-醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液-醋酸、柠檬酸-柠檬酸钠水溶液等，所用有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈等。流速在0.8～1.5ml/min范围内任意选择。紫外检测器的波长在220～360nm间任意选择。
使用本发明所述方法，可一次性分离检测出天麻多糖中各个单糖含量，方法的专属性强，灵敏度高，准确性好。所使用的仪器设备比较常见，方法容易实现，检测成分较低。
附图说明：
图1天麻多糖HPLC检测色谱图
具体实施方式：
实施一
1.仪器与试药
1.1仪器
Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；水浴锅BC-W203(上海贝凯)；XS105电子天平(Mettler-Tolledo)
1.2试药
超纯水，娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈均为色谱纯迪马公司；氯仿、甲醇、浓硫酸、葡萄糖、NaOH、盐酸、冰醋酸、乙酸铵均为分析纯广州试剂厂；甘露糖、鼠李糖、***糖均为分析纯上海试剂二厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析纯天津大茂。
2.色谱条件
色谱柱：phenmenex-C18(150*4.6mm，5μm)；柱温35℃；波长254nm；
流动相：0.1mol/l醋酸铵水溶液-醋酸缓冲盐∶乙腈，梯度洗脱
3.标准溶液制备
3.1单糖对照品混合液的配制分别精密称取甘露糖0.0192g、鼠李糖0.0183g、葡萄糖0.0420g、***糖0.0212g，置10mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得
3.2单糖对照品混合液的衍生精密吸取单糖对照品混合液1ml，于具塞试管中，分别加入0.3mol/L氢氧化钠1ml和0.5mol/L PMP甲醇溶液1ml，涡旋混合30s，置于70℃水浴反应40min，取出，冷却至室温，加入0.3mol/L盐酸1ml进行中和，然后加入5ml氯仿涡旋混匀30s，静置5min，小心用注射器吸取下层有机相，上层水相再重复萃取2次，经0.45μm微孔滤膜滤过，进样分析
4.样品溶液制备
4.1样品水解精确称取天麻多糖20.0mg，置于10mL具塞试管内，加入1mol/L的硫酸溶液2.0mL，于100℃水浴中水解2h，得水解样品溶液。用2mol/L氢氧化钠水溶液中和至pH 7.0，并以纯化水稀释到5.0mL，离心，吸取上清夜，得多糖水解样品。
4.2衍生化化将水解后的天麻多糖按“3.2”项下方法进行衍生化处理
5.线性关系考察
取适量对照品混合液按“3.2”方法进行衍生，经0.45μm微孔滤膜滤过，分别进样3.0，4.0，5.0，8.0，10.0μL，记录色谱图，以紫外测定的峰面积为纵坐标，以相应单糖的进样量为横坐标进行线性回归。结果表明各单糖的进样量(X)与峰面积(Y)有良好的线性关系，见下表
| 单糖 | 标准曲线 | 相关系数 |
| 甘露糖 | Y＝572.30X-1537.2 | 0.9982 |
| 鼠李糖 | Y＝751.51X-1625.9 | 0.9973 |
| 葡萄糖 | Y＝797.32X-2102.1 | 0.9995 |
| ***糖 | Y＝901.71X-2030.1 | 0.9992 |
6.结果
天麻多糖样品水解并衍生化后，经HPLC检测，各单糖含量为甘露醇1.8％，鼠李糖1.7％，葡萄糖85.2％，***糖1.5％。
7.分析条件的确定
7.1水解用酸的确定
分别选用2mol/L盐酸、1mol/L硫酸、2mol/L甲酸、2mol/L乙酸、2mol/L三氯乙酸和2mol/L三氟乙酸进行天麻多糖的水解实验。各次实验的多糖用量、水解温度、水解时间，酸加入量均相同。结果各这些酸均能水解多糖，但是甲酸、乙酸、三氯乙酸水解后样品中各多糖含量的检测结果明显比用其他酸低。盐酸的氯离子对HPLC***有害，所以不宜用。三氟乙酸和硫酸的结果相当，但是三氟乙酸有毒，所以也不宜用。所以，最后确定水解用酸为1mol/L硫酸。
7.2流动相中缓冲溶液的确定
分别选用磷酸二氢钾水溶液-氢氧化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、醋酸-醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液-醋酸、柠檬酸-柠檬酸钠水溶液等缓冲溶液与有机溶剂组成流动相，恒比例洗脱，其中有机溶剂为乙腈，比例为30％。
结果使用用醋酸铵水溶液-醋酸时的分离效果比较好。
7.3流动相中有机溶剂的确定
分别选用甲醇、乙醇、乙腈与醋酸铵水溶液-醋酸缓冲溶液按照30∶70组成流动相，恒比例洗脱。结果使用乙腈时的分离效果比较好。
7.4梯度洗脱的确定
在恒比例洗脱条件下，各单糖分离度只达到0.8～1.0，不是很好，所以改用梯度洗脱。从0～30分钟，乙腈的比例从10％～50％之间调整。结果按以下梯度洗脱，各单糖分离度能到1.5以上。
乙腈 缓冲溶液
0min 20 80
25min 40 60。
Claims (7)
1.一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于天麻多糖首先水解成为单糖，再经衍生化试剂衍生，之后进HPLC-UV***检测，得到各个单糖的含量。
2.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于本检测方法是检测天麻多糖中单糖的含量。
3.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于天麻多糖水解为酸水解，所用的酸选盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸。
4.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于高效液相检测***所用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
5.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于流动相为缓冲溶液与有机溶剂的混合液，其中有机溶剂的比例在10-50％之间。
6.根据权利要求5所述色谱检测的流动相条件，其特征在于所用缓冲溶液由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液，缓冲溶液选自磷酸二氢钾水溶液-氢氧化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、醋酸-醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液-醋酸、柠檬酸-柠檬酸钠水溶液。
7.根据权利要求5所述色谱检测的流动相条件，其特征在于所用有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102053029A (zh) * | 2010-11-02 | 2011-05-11 | 北京绿竹生物制药有限公司 | 多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法 |
| CN102590370A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-18 | 南京林业大学 | 一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法 |
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| CN109991067A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-09 | 河北大学 | 一种准确检测天麻多糖回转半径及分子量分布的方法 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 宝炉丹等: "柱前衍生化HPLC 分析白花蛇舌草多糖中单糖组成", 《中成药》 * |
| 李超等: "天麻多糖的分离及其单糖组成分析", 《中国农业通报》 * |
| 林雪等: "RP-HPLC 用于芦荟多糖的单糖组成研究", 《食品科学》 * |
| 马定远等: "柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成", 《分析化学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102053029A (zh) * | 2010-11-02 | 2011-05-11 | 北京绿竹生物制药有限公司 | 多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法 |
| CN102053029B (zh) * | 2010-11-02 | 2013-07-03 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法 |
| CN102590370A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-18 | 南京林业大学 | 一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法 |
| CN105319307A (zh) * | 2014-06-12 | 2016-02-10 | 饶君凤 | 一种测定西红花多糖中的单糖组成的分析方法 |
| CN109991067A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-09 | 河北大学 | 一种准确检测天麻多糖回转半径及分子量分布的方法 |
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