CN101792723A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖上的应用 - Google Patents
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Abstract
一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖上的应用。菌株分离自污染河沟底泥中，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏中心。该菌株在温度20℃-45℃内，酸碱度pH5.0-10.0内都能正常生长，该菌株按接种量为1∶20接种在初始pH为7.0肉汤培养基上，150r·min-1，39℃培养18h既能达到发酵终点。本发明的特点：该菌株能使养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮、COD等含量明显降低，且对人畜无害，可规模化生产用于改善水产养殖环境。该发明中的解淀粉芽孢杆菌对模拟养殖水体中的主要污染物有明显的降解作用，可制成微生态制剂用于养殖水体的水质净化。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物应用领域，涉及一株新筛选的解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖上的应用。
背景技术
我国是世界上从事水产养殖历史最悠久的国家之一，水产养殖面积较大，2001年统计为665万公顷。随着养殖业的迅猛发展，集约化程度不断提高，养殖水体的理化环境和生态环境日趋恶化；同时，工业废水和生活污水的排放也加剧了养殖水体质量的下降；这些问题造成养殖病害日趋严重，损失不断增大，据估算，全国每年因病害造成的养殖产品损失近百亿元。另一个重要后果是抗生素和化学药品的滥用导致水产品的有害残留超标，直接威胁人类的健康。微生物修复法具有修复时间短，操作简便，费用低，不会产生二次污染，污染物降解彻底等多种优势成为利用生物修复的方法来改善养殖生境的常用手段。
芽孢杆菌是利用微生物修复养殖生境的常用益生菌，芽孢杆菌在繁殖过程中分泌大量的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，能迅速降解鱼虾残留饵料和***物中的淀粉、蛋白和脂肪等有机物，在池内其它微生物的共同作用下，大部分进一步分解为水和二氧化碳，小部分成为新细胞合成的物质，从而净化水体。目前用于水产养殖的芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌，未见将解淀粉芽孢杆菌用于水产养殖水质净化的专利，且该菌株对温度和pH的耐受范围广，投入水体后易于生长繁殖，水质净化效果良好，可用于修复养殖水体。
发明内容：
本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖上的应用，它是一种为水产养殖提供一个能快速降解养殖水体中硝态氮、亚硝态氮和COD的新菌株。
本发明内容：
本发明提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，分离自天津市西青区污染河沟的底泥中，已于2009年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，100101北京市朝阳门大屯路中国微生物研究所保藏号CGMCCNo.3261。
一株解淀粉芽孢杆菌的鉴定方法：该菌株的形态特征为菌体杆状，单个排列，革兰氏阳性，好氧，芽孢椭圆形；
该菌株的鉴定特征如下：16s rDNA测序显示：所测得的部分序列在NCBI上BLAST结果与已知Bacillus subtilis和菌株的相似性菌为均为100％；脂肪酸组成：主要组成成分15:0iso(40.16％)和15:0anteiso(38.16％)，与数据库中Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens(Bacillus subtilis group)相似值最高；经BiologMicroplate GP检测(24小时培养)，可利用95种碳源中的如下类型：β-Methyl-D-Glucoside，α-Methyl-D-Glucoside，α-D-Glucose，Tween 80，Tween 40，Turanose，Sucrose，N-Acetyl-D-Glucosamine，Maltotriose，Maltose，L-Fucose，L-Arabinose，Glycerol，Gentiobiose，D-Xylose，D-Trehalose，D-Ribose，D-Psicose，D-Mannose，D-Mannitol，D-Fructose，Dextrin，D-Cellobiose，2，3-Butanediol，其他为阴性，其中不利用乳糖和葡萄糖酸盐(酯)为Bacillus amyloliquefaciens区别于Bacillus subtilis主要特征。
一株解淀粉芽孢杆菌的培养方法：该菌株在20℃-45℃的温度范围内，在pH5.0-10.0的酸碱度范围内都能正常生长，该菌株按接种量为1∶20接种在初始pH为7.0肉汤培养基上，150r·min-1，39℃培养18h既能达到发酵终点，
一株解淀粉芽孢杆菌在水产养殖上快速降解养殖水体中硝态氮、亚硝态氮和COD的应用。
本发明的特点：一株净化水质的解淀粉芽孢杆菌菌株的选育，该菌株能使养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮、COD等含量明显降低，且对人畜无害，可规模化生产用于改善水产养殖环境。该发明中的解淀粉芽孢杆菌对模拟养殖水体中的主要污染物有明显的降解作用，可制成微生态制剂用于养殖水体的水质净化。
附图说明
图1菌株脂肪酸组成的气象色谱图
图2该菌在试验第6天基本能将水中亚硝态氮彻底降解图
图3该菌在试验第6天基本能将水中硝态氮彻底降解图
图4是处理和对照的pH值随时间逐渐降低图
图5是该菌能有效降解水中COD含量图。
具体实施方式
下面具体说明本发明菌株的选育过程及应用效果：
实施例1
菌株的分离筛选及培养
取样：在污染河沟3个不同取样点将底质污泥去掉约5mm厚的表层泥，取泥装入烧杯中，用保鲜膜将口封好带回室内迅速分离。
分离：将污泥用无菌水以1∶4的比例稀释，80℃水浴处理15min后，吸取100μL菌泥在淀粉培养基的平板上涂布，37℃培养。
纯化：平板培养2天后，挑选周围产生水解圈的菌株在NA培养基上进行划线，挑选不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型单菌落继续划线培养，划线培养5代后即得纯菌株。
筛选：将纯化的菌株点种到淀粉培养基上，测量菌落大小(C)和水解圈大小(H)，挑选H/C大的菌株进行复筛，将初筛的菌株接种到发酵培养基上，培养42h后测酶活值，挑选酶活值高的菌株用于菌种鉴定。
培养：将筛选到的菌株从试管斜面接种到液体培养基中，待细胞生长到对数期后以此作为液体菌种，将菌种以1∶20接种到新的培养基中，150r·min-1，39℃培养18h即达对数末期，所得的发酵液可直接作为菌剂应用，或将菌液离心或过滤即得菌剂。
实施例2
菌株的鉴定特征
1.菌体的形态观察和染色反应
在肉汤培养基上菌落接近奶油色，不透明，培养2d后起皱，边缘不整齐；在显微镜下观察为杆状(0.7～0.8μm×2～3μm)，革兰氏染色阳性，芽孢椭圆形中生，鞭毛侧生。
2.菌株的生理生化特征
将菌株接种在Biolog Microplate GP板上培养24h检测其对碳源的利用情况，结果见表1。
表1菌株对碳源的利用情况
| α-Cyclodextrin | - | β-Methyl-D-Galactoside | - | Pyruvic Acid Methyl Ester | - |
| β-Cyclodextrin | b | 3-Methyl-D-Glucose | - | Succinic AcidMono-Methyl Ester | - |
| Dextrin | + | α-Methyl-D-Glucoside | + | Propionic Acid | - |
| Glycogen | - | β-Methyl-D-Glucoside | + | Pyruvic Acid | - |
[0033]
| Inulin | - | α-Methyl-D-Mannoside | - | Succinamic Acid | - |
| Mannan | - | Palatinose | b | Succinic Acid | - |
| Tween 40 | + | D-Psicose | + | N-Acetyl-L-Glutamic Acid | b |
| Tween 80 | + | D-Raffinose | - | L-Alaninamide | - |
| N-Acetyl-D-Glucosamine | + | L-Rhamnose | - | D-Alanine | b |
| N-Acetyl-β-D-Mannosamine | - | D-Ribose | + | L-Alanine | - |
| Amygdalin | - | Salicin | - | L-Alanyl-Glycine | - |
| L-Arabinose | + | Sedoheptulosan | - | L-Asparagine | - |
| D-Arabitol | - | D-Sorbitol | b | L-Glutamic Acid | - |
| Arbutin | - | Stachyose | - | Glycyl-L-Glutamic Acid | - |
| D-Cellobiose | + | Sucrose | + | L-Pyroglutamic Acid | - |
| D-Fructose | + | D-Tagatose | - | L-Serine | - |
| L-Fucose | + | D-Trehalose | + | Putrescine | - |
| D-Galactose | b | Turanose | + | 2，3-Butanediol | + |
| D-Galacturonic Acid | - | Xylitol | - | Glycerol | + |
| Gentiobiose | + | D-Xylose | + | Adenosine | b |
| D-Gluconic Acid | - | Acetic Acid | - | 2’-Deoxy Adenosine | - |
| α-D-Glucose | + | α-HydroxybutyricAcid | - | Inosine | b |
| m-Inositol | - | β-HydroxybutyricAcid | - | Thymidine | b |
| α-D-Lactose | - | γ-HydroxybutyricAcid | - | Uridine | b |
| Lactulose | - | p-Hydroxy-phenylacetic Acid | - | Adenosine-5’-Monophosphate | - |
| Maltose | + | α-Ketoglutaric Acid | - | Thymidine-5’-Monophosphate | - |
| Maltotriose | + | α-Ketovaleric Acid | - | Uridine-5’-Monophosphate | - |
| D-Mannitol | + | Lactamide | - | D-Fructose-6-Phosphate | - |
| D-Mannose | + | D-Lactic Acid Methyl Ester | - | α-D-Glucose-1-Phosphate | - |
| D-Melezitose | - | L-Lactic Acid | - | D-Glucose-6-Phosphate | - |
| D-Melibiose | - | D-Malic Acid | - | D-L-α-GlycerolPhosphate | - |
| α-Methyl-D-Galactoside | - | L-Malic Acid | - |
从表1可以看出，菌株可利用95种碳源中的如下类型：β-Methyl-D-Glucoside，α-Methyl-D-Glucoside，α-D-Glucose，Tween 80，Tween 40，Turanose，Sucrose，N-Acetyl-D-Glucosamine，Maltotriose，Maltose，L-Fucose，L-Arabinose，Glycerol，Gentiobiose，D-Xylose，D-Trehalose，D-Ribose，D-Psicose，D-Mannose，D-Mannitol，D-Fructose，Dextrin，D-Cellobiose，2，3-Butanediol，其他为阴性。其中不利用乳糖和葡萄糖酸盐(酯)为Bacillus amyloliquefaciens区别于Bacillus subtilis主要特征。
3.菌株脂肪酸成分
用气象色谱仪测定了菌株中脂肪酸成分，主要组成成分见表2，与已知菌株的比对结果见表3，气象色谱图见图1。
表2脂肪酸组成
表3与已知菌株的比对
Library Sim Index Entry Name
TSBA66.00 0.457 Bacillus-subtilis
0.427 Bacillus-amyloliquefaciens (Bacillus subtilis group)
0.327 Staphylococcus-xylosus
0.322 Bacillus-megaterium-GC subgroup A
0.287 Bacillus-pumilus-GC subgroup A
15:0iso(40.16％)和15:0anteiso(38.16％)，与数据库中Bacillus subtilis、Bacillusamyloliquefaciens(Bacillus subtilis group)相似值最高。
4.菌株的16S rDNA鉴定
利用细菌16S rDNA基因的通用引物对菌株进行PCR扩增，所测得的部分序列如下：
TCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGG
GCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGA
TTCCAGCTTCACGCAGTC
GAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTT
CGCTGCCCTTTGTTCTGT
CCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACC
TTCCTCCGGTTTGTCACC
GGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTG
CGGGACTTAACCCAACAT
CTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTC
CTATCTCTAGGATTGTCA
GAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCG
CTTGTGCGGGCCCCCGTC
AATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCT
GCAGCACTAAGGGGCGGA
AACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTG
将所测得的部分序列在NCBI上BLAST发现其基因序列与已知Bacillus subtilis和Bacillus amyloliquefaciens菌株的相似性均为100％。
5.培养条件对菌株生长的影响
a)培养温度对菌株生长的影响
将菌种接种到肉汤固体培养基中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下培养，观察其生长情况。结果见表4
表4菌株在各温度下的生长状况
注：“-”表示不生长，“+”表示生长较差，“++”表示生长一般，“+++”表示生长良好，“++++”表示生长很好。
从表1可以看出菌株在20℃-45℃的温度范围内都能正常生长，最适生长温度为35℃-40℃。
b)培养基初始pH对菌株生长的影响
将对数生长期的种子液以1∶20的比例接种到初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的培养基中，150r·min-1振荡培养，37℃培养24h后测菌液的OD600值。
表5pH对菌株生长的影响
| pH | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 | 10.0 | 11.0 | 12.0 |
| OD值 | 0.12 | 0.15 | 1.07 | 1.09 | 1.23 | 1.10 | 1.04 | 1.03 | 0.92 | 0.77 |
从表5可以看出，该菌在pH5.0-12.0的范围内都能生长，最适生长的pH为7.0-8.0，在碱性环境中的生长状况明显好于酸性环境。
实施例3菌株的水质净化功能
室内配置模拟养殖水，往缸中加入离心后的菌体细胞，使水中的含菌量在107CFU·L-1，加菌当天及加菌后的第1、2、3、6、7天取水立即取水测量水中亚硝酸盐、硝酸盐含量。
从图2和图3可以看出该菌在试验第6天基本能将水中亚硝态氮和硝态氮彻底降解。
实施例4菌株的水质净化功能
室内配置模拟养殖水，往缸中加入离心后的菌体细胞，使水中的含菌量在107CFU·L-1，投菌后第1、2、3、4、5天取样测水中pH值，第1天和第5天测水中的COD含量。
从图4可以看出，处理和对照的pH值随时间逐渐降低，处理的pH值低于对照，说明该菌对偏碱养殖水有一定的调节作用。从图5可以看出第五天对照的COD含量较第一天升高1倍多，处理降为原来的1/2，说明该菌能有效降解水中COD含量。
Claims (4)
1.一株解淀粉芽孢杆菌HN，分离自天津市西青区污染河沟底泥中，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名Bacillusamyloliquefaciens HN，保藏号CGMCC No.3261。
2.一株解淀粉芽孢杆菌的鉴定方法：该菌株的形态特征为菌体杆状，单个排列，革兰氏阳性，好氧，芽孢椭圆形；
该菌株的鉴定特征如下：16s rDNA测序显示：所测得的部分序列在NCBI上BLAST结果与已知Bacillus subtilis和菌株的相似性菌为均为100％；脂肪酸组成：主要组成成分15:0 iso-40.16％和15:0 anteiso-38.16％，与数据库中Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilisgroup，相似值最高；经Biolog Microplate GP检测：24小时培养，可利用95种碳源中的如下类型：β-Methyl-D-Glucoside，α-Methyl-D-Glucoside，α-D-Glucose，Tween 80，Tween 40，Turanose，Sucrose，N-Acetyl-D-Glucosamine，Maltotriose，Maltose，L-Fucose，L-Arabinose，Glycerol，Gentiobiose，D-Xylose，D-Trehalose，D-Ribose，D-Psicose，D-Mannose，D-Mannitol，D-Fructose，Dextrin，D-Cellobiose，2，3-Butanediol，其他为阴性，其中不利用乳糖和葡萄糖酸盐(酯)为Bacillus amyloliquefaciens区别于Bacillus subtilis主要特征。
3.一株解淀粉芽孢杆菌的培养方法：该菌株在20℃-45℃的温度范围内，在pH5.0-10.0的酸碱度范围内都能正常生长，该菌株按接种量为1∶20接种在初始pH为7.0肉汤培养基上，150r·min-1，39℃培养18h既能达到发酵终点。
4.一株解淀粉芽孢杆菌在水产养殖上快速降解养殖水体中硝态氮、亚硝态氮和COD的应用。
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