CN101780125B

CN101780125B - 急性子抗类风湿性关节炎的医药用途

Info

Publication number: CN101780125B
Application number: CN2010101263364A
Authority: CN
Inventors: 李会军; 于俊杰; 李萍
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-03-18
Also published as: CN101780125A

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种急性子的医药用途，即其急性子抗类风湿性关节炎的医药用途。药理学试验表明，急性子总皂苷具有较好的抗类风湿性关节炎的用途。在30μmol/L浓度时即对刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用。

Description

急性子抗类风湿性关节炎的医药用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种急性子用于治疗类风湿性关节炎的用途。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节病变为主的慢性全身性的自身免疫性疾病，目前其发病机制尚不明了，临床认为RA的发病主要是由于患者自身免疫功能失调，导致不正当的过敏反应，使抗炎细胞变质变性，沉积于关节部位并使关节组织畸形、致残。据调查，世界范围内RA的发病率大约为1-2％，我国RA患者总数已超过400万，且发病率仍呈上升趋势。

目前RA的治疗以药物为主，包括糖皮质激素、非甾体抗炎药(NSAIDs，如双氯酚酸、阿司匹林、布洛芬等)、改善病情的抗风湿药(DMARDs，如甲氨喋呤、金盐、柳氮磺胺吡啶等)等三大类，前两者只能缓解症状而不能阻止病情进展；多种DMARDs的联合治疗成为当前RA治疗的主流，但该类药物需长期使用且毒副作用较大。近年来，国内外学者在植物药治疗RA方面进行了广泛而深入的研究，发现许多天然药物如雷公藤多苷、白芍总苷、毒藤碱等具有较好的RA治疗作用。因此，从中药中开发出安全高效的RA治疗药物具有广阔的市场前景。

急性子为我国历版药典收载品种，其药材来源为凤仙花科植物凤仙花Impatiens balsamina L.的干燥成熟种子。夏、秋季果实即将成熟时采收，晒干，除去果皮及杂质。味微苦，性温，有小毒，具有破血软坚，消积之功效。用于经闭，噎膈，腹部肿块，骨哽咽喉，外疡坚块等症。(国家药典委员会.中华人民共和国药典.化学工业出版社，2005，一部：186)。凤仙萜四醇苷类三萜皂苷为急性子所含有的特征性化学成分，目前已从中分离得到凤仙萜四醇苷A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K，L，M，N，O等十多种三萜皂苷，此外急性子还含蛋白质、脂肪油类(脂肪油含量17.9％)等成分。现代药理学研究表明，急性子具有兴奋子宫平滑肌、促透皮、抗生育、抗肿瘤、抗菌、抗癌等药理作用。

发明内容

本发明公开了急性子的医药用途，即用于制备治疗抗类风湿性关节炎的药物的用途。

药理学试验表明，急性子总皂苷具有优异的抗类风湿性关节炎的用途。本发明急性子总皂苷经口服给药，在30μmol/L浓度时即对刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用。

本发明的急性子总皂苷可用下列方法提取得到：

取急性子药材，用乙醇回流提取，提取液浓缩，过滤或离心，滤液或上清液上大孔树脂，用水洗脱后再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，蒸干或减压干燥，即得急性子总皂苷。

上述制备方法中提取时乙醇的浓度优选50-90％。更优选70-80％。

上述制备方法中大孔树脂优选为Diaion HP-10型、Diaion HP-20型、Diaion HP-20型、Diaion HP-30型、AB-8型或D101型大孔树脂。更优选的大孔树脂为AB-8型或D101型大孔树脂。

上述制备方法中洗脱时乙醇的浓度优选50-90％。更优选的浓度是50～70％。

采用上述方法制备的急性子总皂苷提取物，其中总皂苷含量高达50-85％。

本发明的急性子总皂苷主要由风仙萜四醇苷类三萜皂苷组成，包括凤仙萜四醇苷A，B，C，D，F，G，K，L，M等。

R1 R2 R3

Hosenkosides A -Glc-Glc -Glc -H

Hosenkosides D -Glc-Glc -Glc -H

Hosenkosides K -Glc-Glc -Glc -Glc

Hosenkosides L -Glc-Xyl -Glc -H

Hosenkosides M -Glc-Xyl -Glc -Glc

R1 R2

Hosenkosides B -Glc-Glc -Glc

Hosenkosides F -Glc-Xyl -Glc

R1 R2

Hosenkosides C -Glc-Glc -Glc

Hosenkosides G -Glc-Xyl -Glc

本发明的急性子总皂苷提取物可以作为药物活性成分制备成各种临床用药物制剂，其中含有治疗有效量的急性子总皂苷提取物及药学上可接受的载体。还可以作为活性部位与其他中药提取物/有效部位或相关化学合成药物与药学上可接受的赋形剂或辅料一起用于制备药物组合物。

上述两种药物组合物均可采用制剂学的常规方法制备成各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、酊剂、口服液等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠道外给药剂型。

下面是部分急性子的药效学试验及数据：

一、急性子总皂苷提取物的对刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖的影响

药物：实施例1所得的急性子总皂苷提取物，用蒸馏水溶解。

试剂：氢化可的松琥珀酸钠，天津市生物化学制药厂，批号：20071008；刀豆蛋白A(ConA)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为Sigma公司)；RPM I-1640培养基(Gibco公司)、小牛血清(杭州四季青生物制品研究所)。

仪器：Multiskan spectrum MSS1500-320酶标仪、3111型细胞培养箱(Thermo Electron公司)；SW-CJ-IF超净台(苏州安泰空气技术有限公司)；XSZ-D₂倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；1-15K低温离心机(Sigma公司)。

动物：清洁级雄性BALB/c小鼠，体重20-22g，由扬州大学比较医学中心提供，合格证号：SCXK(苏)2007-0001。

实验方法：

1、脾细胞制备无菌条件下取出小鼠脾脏，研磨脾脏，过200目筛网，RPMI-1640培养液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心，弃上清，加入红细胞裂解液(0.155MNH4Cl和16.5mM Tris，pH 7.2)溶解红细胞，用RPMI-1640培养基(含10％小牛血清)将细胞洗涤2次，再用培养液重悬细胞，台盼蓝染色，细胞活力在99％以上。

2、化合物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

将脾细胞悬液接种于96孔细胞培养板(4×10⁵cell/孔)内，实验分组如下：正常组为脾淋巴细胞的自然培养，模型组为脾淋巴细胞与ConA(5μg/mL)共培养，化合物组(3、10、30、60、100μmol/L)为化合物与脾淋巴细胞及ConA共培养，阳性药组为氢化可的松(10μmol/L)与脾淋巴细胞及ConA共培养。各组细胞置于37℃、5％ CO₂培养48h后，加入含0.5％ MTT的培养基20μL，再培养4h后，弃培养液，加入150μL的DMSO，振荡10min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于570nm波长处测定吸光值。实验重复3次，每次3个复孔。细胞增殖的抑制率用以下公式计算：

抑制率＝(模型组OD₅₇₀-化合物组OD₅₇₀)/(模型组OD₅₇₀-正常组OD₅₇₀)×100％

抑制率数据以均值±SD表示，n＝3。采用t检验进行组间比较。

结果见表1。

表1 急性子总皂苷对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01，vs.空白对照组(抑制率0.0％)，。

结论：急性子总皂苷浓度30μmol/L即对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有显著抑制作用。

二、急性子总皂苷提取物的大鼠佐剂性关节炎的影响

药物：实施例3所得的急性子总皂苷提取物，用蒸馏水溶解，大鼠低、中、高剂量分别为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。

试剂：雷公藤多苷片(湖南一格制药有限公司，批号：200803118)，大鼠剂量12mg/kg；弗氏完全佐剂(Sigma公司)。

动物：SD大鼠，雄性，体重180-220g，第二军医大学大学实验动物中心。

实验方法：

大鼠54只，随机分为空白组、模型组、急性子总皂苷组(低、中、高剂量)及阳性对照组(雷公藤多苷片)，每组9只，每天1次ig给药，连续6天，于第6天(致炎前)用玻璃容积法测量大鼠右后足体积，并于末次给药后30分钟给大鼠右后足注射0.05mL弗氏完全佐剂致炎，16小时后测量大鼠右后足体积，并计算肿胀率和抑制率。

肿胀率＝(致炎后足趾容积-致炎前足趾容积)/致炎前足趾容积×100％

肿胀抑制率＝(对照组平均肿胀率-给药组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率×100％

各组数据作组间t检验。结果见表2。

表2 急性子总皂苷对大鼠佐剂性关节炎的影响

组别	n(只)	剂量(mg/kg)	肿胀率(％)	抑制率(％)
					空白组	9	-	-	-
模型组	9	-	30.64±6.4^**	-
					低剂量	9	30	13.94±3.3	54.50±8.2^Δ
中剂量	9	60	9.76±4.7	68.15±6.0^Δ
					高剂量	9	120	9.83±2.6	67.92±7.7^Δ
雷公藤组	9	12	9.41±4.8	69.28±8.6^Δ

^**P＜0.01，vs.空白组(肿胀率0.0％)；^ΔP＜0.05，vs.模型组(抑制率0.0％)。

结论：急性子总皂苷给药低剂量30mg/kg时即可显著降低由弗氏完全佐剂引起的大鼠原发性右后足趾肿胀(P＜0.05)，其作用强度与阳性药物雷公藤多苷片相当。

具体实施方式

实施例1

急性子总皂苷提取物的制备

称取急性子药材20kg，粉碎，加10倍量的70％乙醇，100℃回流提取3次，每次3小时。合并提取液，得浸膏A。将浸膏A以适量蒸馏水溶解，上Diaion HP-20型大孔树脂柱，分别以蒸馏水、10％、50％、70％、95％乙醇洗脱，合并50％乙醇洗脱液，蒸干得急性子总皂苷提取物968g，该提取物含总皂苷为53.47％。

实施例2

急性子总皂苷提取物的制备

称取急性子药材20kg，粉碎，加12倍量的95％乙醇，90℃提取3次，每次3小时。合并提取液，得浸膏A。将浸膏A以适量蒸馏水溶解，上D-101型大孔树脂柱，分别以蒸馏水、30％、50％、60％、70％、80％、90％乙醇洗脱，合并50-70％乙醇洗脱液，蒸干得浸膏B，将浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为2∶1，以无水乙醇热回流提取3次，所得提取液蒸干，得急性子总皂苷提取物792g，该提取物含总皂苷达74.53％。

实施例3

急性子总皂苷提取物的制备

称取急性子药材25kg，粉碎，加10倍量的100％乙醇，80℃提取3次，每次3小时。合并提取液，得浸膏A。将浸膏A以适量蒸馏水溶解，上AB-8型大孔树脂柱，分别以蒸馏水、30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇洗脱，合并50-100％乙醇洗脱液，蒸干得浸膏B。将浸膏B以甲醇溶解，加硅藻土拌匀，硅藻土与浸膏比例为2∶1，以无水乙醇热回流提取3次，所得提取液蒸干，得急性子总皂苷提取物643g，该提取物含总皂苷达85.06％。

实施例4

急性子总皂苷提取物的含量测定(HPLC-ELSD法)

仪器与试剂高效液相色谱仪Aglient1100系列，二元泵G1312A，自动进样器，Alltech2000蒸发光散射检测器，Agilent Chemstation6.01化学工作站，色谱柱：岛津Shim-packCLC-ODS(6.0mm×150mm)，超纯水(自制)，甲醇为色谱纯。

色谱条件流动相：水-甲醇(47∶53)，维持0-10min；在10-25min流动相比例线性改变至(40∶60)，25-40min流动相比例改变至(20∶80)；在40-42min线性改变至(0∶100)；在42-50min流动相比例线性维持在(0∶100)；流速为0.8mL/min，柱温20℃。

检测器条件漂移管温度为98.5℃，载气流速为2.7L/min，放大系数为1。

对照品溶液的制备取对照品凤仙萜四醇苷K 5mg，精密称定，置2mL锥形瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得。

供试品溶液的制备取实施例1、2、3所制备的急性子总皂苷提取物各20mg，精密称定，分别置2mL锥形瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液2，4，6，8，10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的对数(Y)对进样量的对数(X)进行线性回归，得回归方程为：Y＝1.025X+3.246。

测定法分别精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液5-10μL，注入液相色谱仪，记录各三萜皂苷色谱峰的峰面积，代入对照品凤仙萜四醇苷K的标准曲线，计算含量，得实施例1、2、3所制备的急性子总皂苷提取物中总皂苷含量分别为53.47％，74.53％，85.06％。

Claims

1.急性子总皂苷用于制备抗类风湿性关节炎药物的用途，其中急性子总皂苷用以下方法制备：取急性子药材，用乙醇回流提取，提取液浓缩，过滤或离心，滤液或上清液上大孔树脂，用水洗脱后再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，蒸干或减压干燥，即得急性子总皂苷。

2.权利要求1的用途，其中乙醇浓度为50-90％，为重量百分比。

3.权利要求1的用途，其中大孔吸附树脂为Diaion HP-10型、Diaion HP-20型、Diaion HP-20型、Diaion HP-30型、AB-8型或D101型大孔树脂。