TWI389701B

TWI389701B - 沉香屬果殼之萃取物及其於治療癌症之用途

Info

Publication number: TWI389701B
Application number: TW98145190A
Authority: TW
Inventors: Ching Chiung Wang; Lih Geeng Chen; Ding Lin Chang; Chi Ting Hsieh
Original assignee: Univ Taipei Medical
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2009-12-25
Publication date: 2013-03-21
Also published as: TW201121561A

Description

沉香屬果殼之萃取物及其於治療癌症之用途

本發明係關於一種用於殺死癌細胞及治療/預防癌症之沉香屬(Aquilaria )果殼之甲醇萃取物的乙酸乙酯層及其用途。詳言之，萃取物來自沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)且具有大量葫蘆素。

沉香屬為分類學上歸入瑞香科(Thymelaceaceae )之被子植物。已報導十五種沉香屬植物且均產生沉香木。此等物種之分類學並不完全清楚且分類學者未識別所有物種。物種包括容水沉香(Aquilaria malaccensis )、印度沉香(A. agallocha )、巴氏沉香(A. baillonii )、奇楠沉香(A. crassna )、赫塔沉香(A. hirta )、羅氏沉香(A. rostrata )、貝氏沉香(A. beccariana )、孜然沉香(A. cummingiana )、費氏沉香(A. filaria )、卡氏沉香(A. khasiana )、小果沉香(A. microcarpa )、格氏沉香(A. grandiflora )、土沉香(A. chinesis )或白木香(A. sinensis )、婆羅沉香(A. borneensis )及邦卡沉香(A. bancana )。沉香樹原產於亞洲(自印度北部至越南及印度尼西亞)。其尤其出現於印度尼西亞、泰國、柬埔寨、老撾、越南、馬來西亞、印度北部、菲律賓、婆羅洲及新幾內亞島之雨林中。沉香樹為生長至30-40公尺高且直徑達60公分之常綠樹。其開白花，花香芬芳。沉香樹之健康木材為白色、質軟、紋理均勻且在新近切割時不發出氣味。在某些病理條件下，心材變得飽和有樹脂，且最終變硬至極硬。最上等沉香木質硬，幾乎為黑色且在置入水中時下沉。一般而言，色調較淺之沉香木由於其樹脂量較少而被視作次品。

天然葫蘆素構成一組因苦味及毒性而為吾人所熟知的多種三萜類物質。其特徵在於四環葫蘆烷核骨架，亦即19-(10→9β)-移-10a-羊毛甾-5-烯(亦稱為9β-甲基-19-降羊毛甾-5-烯)，其在不同位置具有多種氧化官能基。傳統上，葫蘆素被任意分成十二個類別，併入葫蘆素A-T中。在此項技術中已知葫蘆素具細胞毒性且具有抗癌活性。然而，葫蘆素之應用潛力實質上受其非特異性細胞毒性阻礙，且因此在嚴格醫療控制下僅實行極有限使用。葫蘆素最初係以葫蘆科之苦味成分分離，且後來發現其以非糖基化或糖基化形式存在於十字花科(Brassicaceae )、玄參科(Scrophulariaceae )、秋海棠科(Begoniaceae )、杜英科(Elaeocarpaceae )、四數木科(Datiscaceae )、離水花科(Desfontainiaceae )、花蔥科(Polemoniaceae )、報春花科(Primulaceae )、茜草科(Rubiaceae )、梧桐科(Sterculiaceae )、薔薇科(Rosacease )及瑞香科(Thymelacaeceae )之植物中(Jian Chao Chen等人,Nat. Prod. Rep.,2005,22,第386-399頁)。Sonja Sturm及Hermann Stuppner應用高壓液相層析-質譜(HPLC-MS)來分析藥用植物中之葫蘆素且經由測定藥西瓜(Citrullus colocynthis )(葫蘆科)、異株瀉根(Bryonia cretica ssp. dioica )(葫蘆科)、水八角(Gratiola officinalis )(玄參科)、胡黃連(Picrorhiza kurroa )(玄參科)及屈曲花(Iberis umbellate )(十字花科)中之葫蘆素證明其可應用性(Phytochem. Anal. 11,121-127(2000))。制定HPLC方法以用於同時測定苦味西葫蘆(Cucubita pepo cv Dayangua )(葫蘆科)中之四種生物活性葫蘆素(Journal of Chinese Medicinal Materials,2007,第30卷，第4期，第418-420頁及Chin Hosp Pharm J,2007,Dec,第27卷，第12期，第1694-1969頁)。

然而，無任何先前技術提供關於來自沉香或其果殼之葫蘆素及其抗癌活性的資訊。

本發明提供一種用於殺死癌細胞及治療/預防癌症之沉香屬果殼萃取物，其包含藉由甲醇萃取接著以乙酸乙酯及水分配而獲得的甲醇萃取物之乙酸乙酯層。

本發明亦提供一種殺死癌細胞之方法，其包含向個體投與有效量之本發明萃取物，藉此可殺死癌細胞。

本發明亦提供一種治療/預防癌症之方法，其包含向個體投與有效量之本發明萃取物，藉此可治療及/或預防癌症。

本發明亦提供一種誘發癌細胞凋亡之方法，其包含向個體投與有效量之本發明萃取物，藉此使癌細胞凋亡。

本發明發現沉香屬果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯層具有大量葫蘆素及其他活性成份且此等化合物可有效用於殺死癌細胞、治療/預防癌症及誘發癌細胞凋亡。此外，沉香屬果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯層無毒性。

如本文中所用，「一」可意謂一或多個(種)。如本文於申請專利範圍中所用，當與詞「包含」結合使用時，詞「一」可意謂一個(種)或一個(種)以上。

如本文中所用之「沉香屬果殼」係指沉香樹果實之木質果殼。

如本文中所用之「治療」係指賦予受疾病折磨之患者以益處(包括改善患者病狀(例如，一或多種症狀)、延緩疾病進程、預防或延緩疾病發作等)的任何類型之治療。

本發明提供一種用於殺死癌細胞及治療/預防癌症之沉香屬果殼萃取物，其包含藉由甲醇萃取接著以乙酸乙酯及水分配而獲得的甲醇萃取物之乙酸乙酯層。可藉由二氧化矽管柱層析以(i)比率為1:0、10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:8、1:1及0:1之己烷-乙酸乙酯混合物及(ii)甲醇之移動相進一步劃分乙酸乙酯層，從而獲得13種劃分部。本發明發現劃分部3(10:2)特定地含有β-植固醇，劃分部7(10:5)特定地含有芫花素，劃分部8(10:5)特定地含有葫蘆素E，劃分部9(10:5)特定地含有葫蘆素I及葫蘆素E糖苷，劃分部11(1:1)特定地含有葫蘆素I糖苷且劃分部12(0:1)特定地含有芫花素5-O-糖苷及芒果苷。β-植固醇、芫花素、葫蘆素I、葫蘆素E、芒果苷及其衍生物具有抗癌活性。較佳實施例展示如下：β-植固醇

芫花素

葫蘆素E

葫蘆素I

葫蘆素E葡萄糖苷

葫蘆素I葡萄糖苷

芫花素-5-O -葡萄糖苷

芒果苷

在一實施例中，本發明提供一種用於殺死癌細胞之沉香屬果殼萃取物，其包含藉由甲醇萃取、以乙酸乙酯及水分配且使用己烷-乙酸乙酯混合物之移動相藉由矽膠層析溶離獲得之劃分部。己烷與乙酸乙酯混合物之比率較佳為10:5或10:6。較佳可進一步分離己烷與乙酸乙酯10:5劃分部以獲得芫花素、葫蘆素E、葫蘆素I及葫蘆素E糖苷。根據本發明之另一實施例，葫蘆素E及葫蘆素I存在於藉由將沈澱物溶解於己烷與乙酸乙酯10:5劃分部中、藉由矽膠管柱層析或矽膠濾筒以CHCl₃ 之移動相沖提所得溶液、以甲醇解吸附葫蘆素E及葫蘆素I而獲得之劃分部中。

根據本發明之較佳實施例，沉香屬果殼係獲自沉香之果殼，沉香(同義名稱：奇南沉香(Agallochum malaccense (Lam.) Kuntze)、麻六甲沉香(Aquilariella malaccensis (Lam.) Tiegh)、土沉香(Aquilaria sinensis )、白木香(A. sinensis(Lour.) Gilg)；普通名稱：沉香木(agarwood)、沉香(eaglewood)、沉香木(gaharu)、伽羅木(aloeswood))為15種沉香屬物種中的一種。沉香為產於印度、中國及西藏之常綠植物，通常描述為蘆薈林木(aloe wood)或瓊脂木(agar wood)。傳統上，樹皮、樹根及心材由於其醫藥性質而用作治療炎症、關節炎、嘔吐、心臟病症、咳嗽、哮喘、麻瘋病、厭食、頭痛及痛風的民間醫藥。然而，無任何先前技術教示或表明沉香屬果殼萃取物可有效用於殺死癌細胞及治療/預防癌症。

根據本發明之另一實施例，可藉由離心分配層析(CPC)分離沉香屬果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯層。在含有氯仿-甲醇-水(其比率較佳為6:7:4，v/v/v)之溶劑系統中溶解沉香屬果殼之乙酸乙酯層，使溶劑經受離心分配層析以分離葫蘆素。根據本發明，可獲得葫蘆素I葡萄糖苷、葫蘆素E葡萄糖苷、葫蘆素I及葫蘆素E。根據本發明之另一實施例，獲得9種劃分部，其中在0-14分鐘內獲得劃分部1，在15-18分鐘內獲得含有82.49%芒果苷之劃分部2，在19-22分鐘內獲得劃分部3，在23-26分鐘內獲得含有73.54%葫蘆素I糖苷之劃分部4，在27-38分鐘內獲得含有63.24%葫蘆素E糖苷之劃分部5，在39-63分鐘內獲得含有80.09%葫蘆素I之劃分部6，在64-65分鐘內獲得含有β-植固醇之劃分部7，在66-75分鐘內獲得含有76.87%葫蘆素E之劃分部8且在最後76-80分鐘內獲得劃分部9。可進一步使用分子篩(凝膠過濾或凝膠滲透)層析以提高上述化合物之純度。

本發明之萃取物可經調配以投與用於治療癌症。在本發明之醫藥調配物之製造中，本發明之萃取物通常尤其與醫藥學上可接受之載劑混合。當然，載劑必須在與調配物中任何其他成份相容之意義上可令人接受且必須對患者無害。載劑可為固體或液體或其兩者，且較佳與萃取物一起調配為單位劑量調配物。本發明之萃取物可併入本發明之調配物中，可藉由任何熟知製藥技術(基本上包括將視情況包括一或多種配合劑之組份混合)來製備本發明之調配物。

本發明之調配物包括適於口服、經直腸投與、局部投與、經頰投與、非經腸投與(例如，皮下投與、肌肉內投與、皮內投與、吸入投與或靜脈內投與)及經皮投與之調配物，但在任何既定情況下最合適途徑將視所治療病狀之性質及嚴重程度以及所用特定活性產物之性質而定。

適於口服之調配物可呈不連續單元形式，諸如膠囊、扁膠劑、***錠或錠劑，各含有預定量之活性化合物；呈散劑或顆粒形式；呈水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或呈水包油或油包水乳液形式。可藉由包括使本發明萃取物與合適載劑(如上所述其可含有一或多種配合劑)相締合之步驟的任何合適製藥方法來製備該等調配物。

一般而言，藉由將活性化合物與液體或細粉狀固體載體或其兩者均一且緊密地混合且接著必要時成形所得混合物來製備本發明之調配物。舉例而言，可藉由壓製或模製含有活性化合物及視情況一或多種配合劑的粉末或顆粒來製備錠劑。可藉由在合適機器中壓製呈自由流動形式之化合物(諸如視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑及/或表面活性/分散劑混合之粉末或顆粒)來製備壓製錠劑。可藉由在合適機器中模製經惰性液體黏合劑濕潤之粉末狀化合物來製造模製錠劑。

除了本文中描述之萃取物之外，本發明亦提供有效治療方法及用途。舉例而言，本發明提供一種殺死癌細胞之方法及一種治療/預防癌症之方法。根據本發明之一實施例，提供一種殺死癌細胞及治療/預防癌症之方法，其中該方法包含向個體投與有效量之本發明萃取物以便可治療及/或預防癌症。根據本發明之另一實施例，誘發癌細胞凋亡之方法包含向個體投與有效量之本發明萃取物以便治療及/或預防癌症。亦提供一種本發明萃取物於殺死癌細胞及治療/預防癌症之用途。根據本發明之一實施例，本文中提及之癌症係選自由結腸直腸癌、胃癌、***癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌及肝細胞癌組成之群。

可藉由使用本發明萃取物來治療個體且通常為人類個體，但本發明之方法亦可適用於其他個體以達成獸醫用途，尤其為哺乳動物個體，包括(但不限於)馬、牛、犬、兔、羊及其類似物。在不同化合物之間、不同患者之間，任何特定化合物之治療有效劑量將在一定程度上有所改變，且將取決於患者之病狀及傳遞途徑。作為一般建議，約50 mg/kg至約1,000 mg/kg之劑量將具有治療功效，更高劑量可能用於口服及/或氣霧劑投與。劑量較佳為約50 mg/kg至約800 mg/kg、約50 mg/kg至約600 mg/kg、約50 mg/kg至約500 mg/kg、約50 mg/kg至約300 mg/kg、約100 mg/kg至約300 mg/kg、約100 mg/kg至約500 mg/kg、約150 mg/kg至約500 mg/kg、約200 mg/kg至約500 mg/kg或250 mg/kg至約400 mg/kg。

本發明亦提供包含本發明之萃取物或醫藥調配物、至少一種選自由蛋白質、碳水化合物及脂肪組成之群之巨量養分的藥膳食物或膳食補充劑，該藥膳食物經化合以用於改善癌症相關疾病。本發明之膳食補充劑及藥膳食物兩者均較佳以粉末形式使用，其可溶解於適於人類消耗之液體(諸如水或果汁)中。然而，本發明之膳食補充劑及藥膳食物可以任何合適形式使用，諸如實心棒、糊狀物、凝膠、錠劑、膠囊或液劑。

實例

實例1　沉香果殼之萃取

將1.5 Kg沉香果殼烘乾且壓榨且接著用40 L甲醇萃取。在減壓下濃縮所得溶液，接著以乙酸乙酯及水分離。將乙酸乙酯部分與矽藻土545混合且使用乙酸乙酯/正己烷之溶離梯度在低極性溶離至高極性溶離情況下藉由矽膠管柱層析(10.5 cm(內徑)×95 cm)分離。以甲醇溶離樣品。進行薄層層析(TLC)以鑑別各劃分部中之組份。

用甲醇萃取沉香葉子及種子。用乙酸乙酯萃取沉香莖部。在減壓下濃縮所得溶液且溶解於甲醇中以用於HPLC分析。

實例2 　本發明化合物之分離

使用正己烷/乙酸乙酯之溶離梯度在低極性溶離至高極性溶離情況下(己烷：EtOAc 1:0→10:1→10:2→10:3→10:4→10:5→10:6→10:8→1:1→0:1，v/v)藉由矽膠管柱層析(10.5 cm(內徑)×22 cm)分離乙酸乙酯部分，且接著用甲醇溶離。使用己烷：EtOAc(10:1)作為移動相藉由VersaPak^TM 矽膠管柱濾筒(40×150 mm)純化劃分部3(10:2)，獲得約0.3g化合物1(β-植固醇)。過濾劃分部7(10:5)，獲得210 mg化合物2(芫花素)(黃色粉末)。使用氯仿作為移動相藉由VersaPak^TM 矽膠管柱濾筒(40×150 mm)進一步純化經己烷-EtOAc(10:5)溶離之劃分部8及9，在劃分部8中獲得2.4 g化合物3(葫蘆素E)(晶體或白色沈澱)且在劃分部9中獲得0.5 g化合物4(葫蘆素I)(白色晶體)及5.1 g化合物5(葫蘆素E葡萄糖苷)。使用氯仿：甲醇(5:1)作為移動相藉由矽膠管柱層析(2.5 cm(內徑)×65 cm)或藉由Sephadex LH-20管柱(1.5 cm(內徑)×36 cm)純化利用己烷：EtOAc 1:1溶離劑獲得之劃分部11，獲得0.14 g化合物6(葫蘆素I葡萄糖苷)。使用氯仿：甲醇(20:1)作為移動相藉由矽膠管柱層析(2.5 cm(內徑)×65 cm)純化利用EtOAc溶離劑獲得之劃分部12，獲得19 mg化合物7(芫花素5-O-葡萄糖苷)。自劃分部12之不溶物過濾獲得3.79 g化合物8(芒果苷)。

圖1表示自沉香分離活性成份(化合物1至8)之流程。

實例3　本發明之沉香萃取物中所含之化合物的化學結構鑑別

將實例1中製備之沉香果殼之甲醇萃取物(其乙酸乙酯部分及水部分)、沉香葉子之甲醇萃取物、沉香莖部之乙酸乙酯萃取物及沉香種子之甲醇萃取物溶解於甲醇(5 mg/ml或1 mg/ml)中以用於HPLC分析。

HPLC分析條件：

管柱：LiChrospher 100 RP-18e(4 mm(內徑)×250 mm，5 μm)

管柱溫度：40℃

流動速率：1.0 ml/min

波長：236 nm

移動相：0.05% TFA/MeOH(42:58，固定比率)，用於葫蘆素E(滯留時間19.85分鐘)、葫蘆素I(滯留時間10.33分鐘)、葫蘆素E葡萄糖苷(滯留時間8.76分鐘)、葫蘆素I葡萄糖(滯留時間5.15分鐘)及芫花素5-O-葡萄糖苷(滯留時間4.06分鐘)；0.05% TFA-MeOH(75:25，固定比率)，用於芒果苷(滯留時間13.40分鐘)。HPLC層析結果展示於圖2(2-1至2-6)中。

藉由GC-MS偵測化合物1以測定其分子量且藉由126 MHz¹³ C-NMR偵測化合物1以測定其結構。¹³ C NMR譜資料展示於表1中。化合物1為β-植固醇。

藉由500 MHz¹ H-NMR及126 MHz¹³ C-NMR偵測化合物3以測定其結構。表2中展示之結果表明化合物3為葫蘆素E。

根據500 MHz¹ H-NNR及126 MHz¹³ C-NMR譜(參見以下表3)，化合物4之構架與化合物3極其類似。根據HMBC及HMQC譜，發現化合物4在葫蘆素E之側鏈上少一個乙醯基。化合物4為葫蘆素I。

根據NMR譜(參見以下表4)，化合物5為一種葫蘆素E化合物。碳2上之OH經O-糖苷置換，因此化合物5為葫蘆素E葡萄糖苷。

根據NMR譜(參見以下表5)，化合物6在構架結構上與葫蘆素I類似。與葫蘆素I相比，化合物6多一個葡萄糖。化合物6亦與葫蘆素E葡萄糖苷類似且少一個乙基。化合物6為葫蘆素I葡萄糖苷。

根據NMR譜(參見以下表6)，化合物2為尤其存在於瑞香科植物中的類黃酮化合物-芫花素。化合物2之構架與類黃酮化合物之構架類似，但在C7(δC 165.0)上具有OCH₃ 且在56.0 ppm處發生化學位移。

根據NMR譜(參見以下表7)，化合物7具有類黃酮化合物芫花素之構架，其在C5(δ 102.7)上進一步具有取代基O-葡萄糖苷。化合物7為芫花素5-O-葡萄糖苷。

根據NMR譜(參見以下表8)，化合物8為氧雜蒽酮(xanthone)結構，其中C-糖苷連接至碳2。根據HMBC及¹ H-¹ H COSY，可推斷化合物8為芒果苷。

實例5　沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對細胞毒性之影響

測試沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對HT29細胞之細胞毒性的影響。用經稀釋之葫蘆素E及葫蘆素I(100-1.56 μg/ml)處理HT細胞。將細胞處理24小時後，藉由定量量測活細胞代謝活性的MTT檢定測定細胞活力。結果顯示分別高於14.1 μM及15.8 μM之葫蘆素E及葫蘆素I濃度極大地降低HT29細胞之細胞活力。請參見表9。結果明確表明葫蘆素E與葫蘆素I兩者均具有針對HT29癌細胞之有效毒性。此外，當將HT29細胞與本發明之沉香果殼之甲醇萃取物的100 μg/ml之各乙酸乙酯部分及水部分一起培育24小時時，乙酸乙酯部分與水部分相比展示較佳毒性(參見圖3)。

除了HT29細胞之外，亦藉由MTT檢定測定P-388白血病細胞。結果顯示高於分別6.5 μM及7.4 μM之葫蘆素E及葫蘆素I濃度抑制P-388細胞之細胞增殖。請參見表9。

實例6　沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對HT29細胞之細胞形態的影響

測試沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對HT29細胞之細胞形態的影響。用不同濃度之葫蘆素E或葫蘆素I處理HT細胞24小時且以10%吉姆沙(Giemsa)染色。在光學顯微鏡下測定HT細胞之變化且展示於圖4(4-1至4-3)中，結果表明隨著葫蘆素E及葫蘆素I之濃度增加，細胞核受擠壓且染色質濃縮。

實例7　沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對HT29細胞之細胞週期的影響

藉由流動式細胞量測術研究經處理細胞之細胞週期。沉香果殼萃取物中之葫蘆素E及葫蘆素I對HT29細胞之細胞週期分布的影響展示於圖5(5-1至5-2)中。葫蘆素E及葫蘆素I處理後HT29細胞之細胞週期概況的改變具有劑量依賴性。在HT29細胞中，隨著葫蘆素E及葫蘆素I之濃度增加，亞G1群體增加，表明葫蘆素E及葫蘆素I之處理將增加細胞死亡。

實例8 　向CDF1 小鼠投與沉香果殼萃取物之影響

在具有P-388D1之CDF1小鼠中測試沉香果殼萃取物活體內抑制癌症進程之潛力。雄性DBA小鼠及雌性BALB/c小鼠係購自臺灣臺北國家科學委員會(National Science Council,Taipei,Taiwan)且由本發明者飼養。交配後，獲得第一代雄性CDF₁ (八週齡，體重25±2 g)用於研究。為誘發癌症，向每一小鼠之腹胺皮下接種0.2 ml之1×10⁶ 個P-388細胞/毫升。接種後1小時，將小鼠指派成三組，藉由皮下投與使其接受溶劑對照物(道諾黴素(Daunorubicin)1毫克/公斤/天)或不同劑量(15及30毫克/公斤/天)之沉香果殼萃取物歷時9天。量測體重且展示於圖6中。經測試小鼠之存活天數展示於表10中。

學生氏-t 檢驗(Student's-t test)：*p <0.05

壽命延長百分比

ILS%=[(T-C)/C]×100%

對照物：DMSO(0.1%)

T：治療組之平均存活天數

C：對照組之平均存活天數

結果表明投與本發明之沉香果殼萃取物顯著增加小鼠存活天數。本發明萃取物對壽命之影響具有劑量依賴性。如圖6所示，劑量為30/mg/kg之本發明萃取物顯著抑制腹水之進程。

實例9　沉香果殼萃取物對細胞毒性之影響

測試沉香果殼萃取物對T24細胞(人類膀胱癌細胞)、HT29細胞(人類結腸腺癌細胞)、海拉(HeLa)細胞(子宮頸癌細胞)、AGS細胞(胃上皮癌細胞)及Hep G2細胞(人類肝細胞肝癌細胞)之細胞毒性的影響。用沉香果殼萃取物處理上述細胞。細胞毒性測試程序與實例5中提及之程序相同。沉香果殼萃取物對於上述細胞之IC₅₀ 值展示於以下表11中。

實例10　藉由離心分配層析(CPC)自沉香果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯層分離葫蘆素

根據實例1中提及之材料及方法獲得沉香果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯層。在CPC中使用含有氯仿-甲醇-水(6:7:4，v/v/v)之溶劑系統。CPC為基於逆流層析(CCC)之方法。分離係基於組份在兩種不可混溶液體之間之分配特性的差異。保留於管柱中之相稱為固定相，且另一相稱為移動相。將0.75 g沉香果殼之甲醇萃取物之乙酸乙酯溶解於4 ml氯仿-甲醇-水中。60分鐘CPC後，將有機相用作固定相且將水用作移動相，流動速率為10.0 ml/min。60分鐘後，將有機相用作移動相。離心速率為700 rpm。使乙酸乙酯樣品經受CPC以進行分配且接著以UV偵測器(236 nm)偵測(參見圖7)。獲得9種劃分部(參見圖8)，其中在0-14分鐘內獲得劃分部1，在15-18分鐘內獲得含有82.49%芒果苷之劃分部2，在19-22分鐘內獲得劃分部3，在23-26分鐘內獲得含有73.54%葫蘆素I糖苷之劃分部4，在27-38分鐘內獲得含有63.24%葫蘆素E糖苷之劃分部5，在39-63分鐘內獲得含有80.09%葫蘆素I之劃分部6，在64-65分鐘內獲得含有β-植固醇之劃分部7，在66-75分鐘內獲得含有76.87%葫蘆素E之劃分部8且在最後76-80分鐘內獲得劃分部9。

回收量為0.749 g且回收率為99.87%。可進一步使用分子篩層析來提高上述化合物之純度。在分子篩層析中使用Sephadex LH-20凝膠(1.5 cm(內徑)×36 cm)且使用甲醇作為移動相。劃分部4中葫蘆素I葡萄糖苷之純度自73.54%增加至92.57%，劃分部5中葫蘆素E葡萄糖苷之純度自63.24%增加至90.24%且葫蘆素I之純度自80.09%增加至95.36%。因為芒果苷難以溶解於甲醇中，所以將劃分部2中之芒果苷分配且接著離心分離，獲得純度自82.49%增加至96.25%之芒果苷。葫蘆素E難以溶解於水及甲醇中，將劃分部8中之葫蘆素E分配且接著離心分離，獲得純度為96.87%之芒果苷。

圖1展示自沉香分離活性成份(化合物1至8)之流程。

圖2(2-1至2-6)展示葫蘆素E(滯留時間19.85分鐘)(圖2-1)、葫蘆素I(滯留時間10.33分鐘)(圖2-2)、葫蘆素E葡萄糖苷(滯留時間8.76分鐘)(圖2-3)、葫蘆素I葡萄糖苷(滯留時間5.15分鐘)(圖2-4)、芫花素5-O-葡萄糖苷(滯留時間4.06分鐘)(圖2-5)及芒果苷(滯留時間13.40分鐘)(圖2-6)之HPLC層析。

圖3說明沉香之乙酸乙酯層部分與沉香之水層部分相比展示較佳毒性。

圖4(4-1至4-3)展示隨著葫蘆素E及葫蘆素I之濃度增加，細胞核受擠壓且染色質濃縮。

圖5(5-1至5-2)展示沉香萃取物(葫蘆素E及葫蘆素I)對HT29細胞之細胞週期分布的影響。

圖6說明劑量為30/mg/kg之本發明萃取物顯著抑制腹水之進程。

圖7展示使用氯仿-甲醇-水溶劑系統之離心分配層析圖。

圖8展示使用氯仿-甲醇-水溶劑系統之離心分配層析圖，其中編號1-8表示劃分部1至8。

Claims

一種用於治療癌症之治療有效量之沉香(Aquilaria agallocha )果實之木質果殼之水性萃取物，其中該萃取物係將沉香(Aquilaria agallocha )藉由甲醇萃取接著以乙酸乙酯及水分配而獲得，其中係藉由矽膠管柱層析以己烷-乙酸乙酯混合物及甲醇進一步溶離該乙酸乙酯層。
如請求項1之萃取物，其中係藉由矽膠管柱層析以(i)比率為1：0、10：1、10：2、10：3、10：4、10：5、10：6、10：8、1：1及0：1之己烷-乙酸乙酯混合物及(ii)甲醇之移動相進一步溶離該乙酸乙酯層，從而獲得13種劃分部。
如請求項2之萃取物，其中溶離份10：5及10：6劃分部含有葫蘆素E及葫蘆素I。
如請求項2之萃取物，其中劃分部3(10：2)含有β-植固醇，劃分部7(10：5)含有芫花素，劃分部8(10：5)含有葫蘆素E，劃分部9(10：5)含有葫蘆素I及葫蘆素E葡萄糖苷，劃分部11(1：1)含有葫蘆素I葡萄糖苷且劃分部12(0：1)含有芫花素5-O-葡萄糖苷及芒果苷。
如請求項1之萃取物，其中係藉由離心分配層析(CPC)進一步分配該乙酸乙酯層，從而獲得9種劃分部。
如請求項4之萃取物，其中劃分部2含有芒果苷，劃分部4含有葫蘆素I葡萄糖苷，劃分部5含有葫蘆素E葡萄糖苷，劃分部6含有葫蘆素I，劃分部7含有β-植固醇且劃分部8含有葫蘆素E。
如請求項6之萃取物，其中可藉由分子篩層析進一步純化該等劃分部。
如請求項1之萃取物，其中該沉香(Aquilaria agallocha )果實之木質果殼之水性萃取物係來自沉香(Aquilaria agallocha Roxb)。
一種醫藥調配物，其主要由如請求項1之萃取物及醫藥學上可接受之載劑組成。
如請求項9之醫藥調配物，其係用於口服、經直腸投與、局部投與、經頰投與、非經腸投與及經皮投與。
如請求項10之醫藥調配物，其呈選自以下群組組成之形式：膠囊、扁膠劑、***錠或錠劑、散劑、顆粒、溶液、懸浮液或乳液。
一種如請求項1之萃取物之用途，其係用於製備殺死癌細胞之藥物。
一種如請求項1之萃取物之用途，其係用於製備治療癌症之藥物。
一種如請求項1之萃取物之用途，其係用於製備誘發癌細胞凋亡之藥物。
如請求項12、13或14之用途，其中該癌症係選自由結腸直腸癌、胃癌、***癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌及肝細胞癌組成之群。
如請求項15之用途，其中該癌症為膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌、胃癌及肝細胞癌。