CN101768619A - 一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法 - Google Patents

一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，通过如下方案实现：将1单位质量提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd、0.5-1单位质量国产的蜗牛酶和1单位体积无菌水混合均匀，于30-45℃下保温72-120小时之后，便可将单体人参皂甙Rd转化为稀有人参皂甙IH-901。本发明的制备稀有人参皂甙IH-901的方法，以提取自绞股蓝的单一人参皂甙Rd为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶，反应后的体系中成分简单，后续的产物提取非常简单。由于绞股蓝中单体人参皂甙Rd的含量是人参中的8倍，与现有技术相比，本发明的制备方法，采用的原料为在廉价的绞股蓝中含量很高的单体人参皂甙Rd，采用的酶为廉价的国产蜗牛酶，采用的反应介质为无菌水，具有成本低，以及反应结束后体系中成分简单有利于产物提取等优点。

Description

一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法
技术领域
本发明涉及一种制备稀有人参皂甙IH-901的方法。
背景技术
现代药理研究表明，人参发挥抗肿瘤作用的最终活性物质不是天然人参皂甙如：人参皂甙Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等，而是其一系列肠道菌群的作用下所产生的代谢物，即天然人参皂甙只是抗肿瘤天然前体药物，人参皂甙肠道菌代谢产物才是抗肿瘤活性本质或活性实体。人参皂甙的代谢研究发现，其中，人参皂甙肠道菌代谢物：20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-20(S)-原人参二醇(简称稀有人参皂甙IH-901，M1或Compound K)是天然二醇组人参皂甙如Rb1、Rb2等口服后由肠道细菌所分泌的糖苷酶选择性水解C-3位糖配体所得的最终主要代谢产物，是人参皂甙抗肿瘤作用的最终主要活性形式之一。而且大量有关天然人参皂甙与IH-901的代谢关系研究不断证实，一些含量较高、极性较大的二醇组皂甙均能通过肠道菌代谢最终降解为IH-901被机体吸收。
稀有人参皂甙IH-901属二醇组皂甙，在天然的人参中不存在，是其他二醇组人参皂甙在人肠道内的降解代谢产物。近年来诸多研究表明人参的许多生物学活性都是由该化合物引起的，特别是在抗肿瘤、抗衰老，抗炎症等方面都体现良好的药效。目前其研究的热点集中体现在IH-901化合物的大规模制备和生物活性深入研究两个方面，我国对该化合物的研究尚处于起步阶段，未见***研究报道。由于IH-901为体内代谢产物，故无毒，研究表明具有广泛的抗肿瘤活性，迄今，稀有人参皂甙IH-901的临床价值已引起各国高度重视，并成为各大制药公司研究的热点。
IH-901将是一个很有前途的抗肿瘤药物，未来将相继以保健品及国家新药形式陆续上市，稀有人参皂甙项目在21世纪生物医药及生物健康品具有前瞻性、稀缺性以及需求巨大性，国际国内市场对其需求有着巨大的潜力。目前稀有人参皂甙IH-901由于其价格昂贵，市场上含量在99％以上价格达1000万元/公斤，而人参皂甙仅800元/公斤，难以被肿瘤病人使用，因此稀有人参皂甙IH-901的生产方法备受关注。
由于人参皂甙四环三萜母核结构上3位和20位糖苷键的特异性，决定了IH-901只能由温和的生物转化方法获得，而常用的酸或碱水解方法是行不通的。目前，生物转化方法通常包括微生物发酵和酶转化两种主要方法。
微生物发酵法制备所用的微生物主要是肠道厌氧菌，而其他微生物的研究比较少。肠道厌氧菌发酵最初是以人***物中的总菌物进行发酵，后来研究筛选单一肠道菌来转化，如采用肠道乳酸菌转化二醇型皂苷制备IH-901，发现运用Bifidobacterium minimum KK-1和B.choerinum KK-2共发酵转化Rb1时效果最好，转化率达到41％左右，但肠道菌多为厌氧菌，培养条件苛刻，培养基成本高。另有研究筛选原始土壤微生物来降解人参皂苷，但酶解能力低下，目的产物收率不高，须通过优化发酵条件和菌种诱变等方法来提高转化能力。中科院大连化学物理研究所申请发明专利用黑曲霉酶解人参皂苷制备稀有低极性人参皂苷的方法，所用黑曲霉菌是将各种来源的黑曲霉菌转入含有人参皂甙的培养基中，经传代培养、驯化、筛选得到的能够酵解产生稀有人参皂甙及甙元的菌株。目前在微生物发酵制备方面并没有适用大规模制备的成熟的方法或工艺。
而参照肠内菌代谢原理，酶转化法制备是利用酶作为催化剂实现化学转化的过程，是酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应，酶及酶体系能将许多天然化合物转化为具有较高生物活性的物质，酶法转化法的优点在于流程短、专一性强、产物易分离纯化。用于制备的酶大部分是工业酶制剂，一般采用具有酶解糖苷键的酶，如柚皮苷酶、果胶酶、纤维素酶、蜗牛酶以及乳糖酶等。国内学者利用β-葡萄糖苷酶对三七茎叶总皂苷进行转化，取得较好的转化效果。也有从具有转化活性的菌株中分离专一性更强的转化酶，如从食用微生物Bifidobacterium sp.Int57和Bifidobacterium sp.SJ32中提取的粗酶，可转化Rb2和Rc成Rd和F2，进而转化成终产物人参皂甙IH-901，从人肠道菌Fusodobacterium K-60分离纯化的葡萄糖苷酶，亦能直接转化Rb1生成稀有人参皂甙IH-901。但这些方法也存在酶的用量大、来源困难、底物成分较高等缺点，所以上述方法也尚无法应用于工业化生产。酶转化法选择性强、一般产物也便于提取分离，工艺研究控制方便，该制备法更有利于规模化制备，其研究关键在于获得廉价而有高效专一的工业酶制剂。
随着天然人参皂甙类化合物肠道代谢研究的深入，研究表明肠道菌代谢降解人参皂甙其作用的并不是菌体本身，而是肠道菌分泌的生物酶，代谢的实质是酶对天然人参皂甙的结构进行了生物修饰或改造，而生成直接体现生物活性的代谢产物。参照肠道菌代谢机理，目前IH-901制备方法主要有微生物发酵法和酶法转化法两种方法。微生物发酵法由于发酵的培养条件苛刻，培养成本高，而且发酵也需要寻找到具高效的菌体，尚无法满足工业化生产需要。生物的方法酶解转化制备，由于酶解反应温和，条件易于控制，加之酶的选择性、专属性，只作用于特殊结构的固定位置，对其它的结构和空间构型没有影响，而且人参皂甙20位的糖苷键在酸性介质中的稳定性低于3位糖苷键，并且空间阻碍作用使得酶水解20位的糖苷键活力很低，因此，酶转化法成为目前采用的主要制备方法。实现规模化生产的体外酶法转化制备关键是筛选到来源广泛、成本低、高效专一性的生物酶，以及利用廉价的酶转化原材料，建立可适用于工业化工艺。目前据研究报道，国内外有酶法转化中国人参、高丽参、西洋参或三七等为稀有人参皂甙IH-901的工艺研究和文献报道，尚未见以廉价的绞股蓝为原料的报道，而且这些方法大多存在酶的来源困难、原料成本高等缺点，尚无法应用于规模化制备或工业化生产。
绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino]又名七叶胆、五叶参、甘茶蔓等，是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物。绞股蓝总皂苷含量是人参的3倍，其中单体人参皂甙Rd的含量是人参中的8倍。目前尚未见以在绞股蓝中含量极其丰富的单体人参皂甙Rd为底物，经国产蜗牛酶转化为稀有人参皂甙IH-901的工艺研究和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种以廉价、易得的单体人参皂甙Rd为底物，经廉价的酶催化，来制备昂贵的稀有人参皂甙IH-901的方法。
本发明的技术方案是这样的：一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，通过如下方案实现：将1单位质量提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd、0.5-1单位质量国产的蜗牛酶和1单位体积无菌水混合均匀，于30-45℃下保温72-120小时之后，便可将单体人参皂甙Rd转化为稀有人参皂甙IH-901。
采用上述方案后，本发明的制备稀有人参皂甙IH-901的方法，以提取自绞股蓝的单一人参皂甙Rd为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶，反应后的体系中成分简单，后续的产物提取非常简单。由于绞股蓝中单体人参皂甙Rd的含量是人参中的8倍，与现有技术相比，本发明的制备方法，采用的原料为在廉价的绞股蓝中含量很高的单体人参皂甙Rd，采用的酶为廉价的国产蜗牛酶，采用的反应介质为无菌水，具有成本低，以及反应结束后体系中成分简单有利于产物提取等优点。
具体实施方式
实施例一：
本发明的一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，通过如下方案实现：
①取1毫克提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd于无菌的反应管内，加入0.5毫克国产的蜗牛酶和1毫升无菌水；
②将单体人参皂甙Rd、蜗牛酶和无菌水混合均匀，于30℃恒温水浴120小时，反应底物单体人参皂甙Rd经薄层层析和液相色谱分析被证实已经转化为产物稀有人参皂甙IH-901。
实施例二：
本发明的一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，通过如下方案实现：
①取1毫克提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd于无菌的反应管内，加入0.75毫克国产的蜗牛酶和1毫升无菌水；
②将单体人参皂甙Rd、蜗牛酶和无菌水混合均匀，于40℃恒温水浴100小时，反应底物单体人参皂甙Rd经薄层层析和液相色谱分析被证实已经转化为产物稀有人参皂甙IH-901。
实施例三：
本发明的一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，通过如下方案实现：
①取1毫克提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd于无菌的反应管内，加入1毫克国产的蜗牛酶和1毫升无菌水；
②将单体人参皂甙Rd、蜗牛酶和无菌水混合均匀，于45℃恒温水浴72小时，反应底物单体人参皂甙Rd经薄层层析和液相色谱分析被证实已经转化为产物稀有人参皂甙IH-901。

Claims (1)

1.一种以Rd为底物制备稀有人参皂甙IH-901的方法，其特征在于：通过如下方案实现：将1单位质量提取自绞股蓝的单体人参皂甙Rd、0.5-1单位质量国产的蜗牛酶和1单位体积无菌水混合均匀，于30-45℃下保温72-120小时之后，便可将单体人参皂甙Rd转化为稀有人参皂甙IH-901。
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