CN101730706B

CN101730706B - 具有神经保护和增强记忆活性的受体拮抗剂

Info

Publication number: CN101730706B
Application number: CN200880021517.1A
Authority: CN
Inventors: 叶玉如; 叶翠芬; 胡月青; 叶文才
Original assignee: BIOTECHNOLOGY RES CORP Ltd (HK)
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: US20130012462A1; US8642567B2; GB2462235A; CN104844678A; US8637474B2; WO2008138200A1; CN101730706A; HK1140209A1; GB0920516D0; CN104844678B; US20100222286A1; GB2462235B; GB2462235B8

Abstract

本发明提供作为NMDA和MC受体拮抗剂的治疗活性化合物和组合物，其通过抑制NMDA和/或MC受体的过度激活来用于预防和治疗中枢神经***障碍。在一方面，本发明提供治疗和/或预防神经变性疾病和神经病障碍的方法，在诸如中风的应激条件下提供神经保护的方法，增强大脑认知功能的方法和治疗哺乳动物和人中由慢性疾病诱导的忧郁、焦虑和恶病质的方法。

Description

具有神经保护和增强记忆活性的受体拮抗剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年5月11日提交的美国临时专利申请号60/917,562的优先权，出于所有目的该申请以其整体通过引用并入本文。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体为主要位于中枢神经***(CNS)的配体门控离子通道。它们属于离子型谷氨酸受体家族，且由于可被表达的亚基-NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)和NR3的不同组合，它们以多种亚型存在。除了激动剂结合位点外，NMDA受体对增强、调节和抑制所述受体活性的各种化合物具有多种不同的结合位点。

已知NMDA受体涉及神经元通讯(neuronal communication)并在突触可塑性以及学***的谷氨酸(即，在生理条件下)时，NMDA受体变得过度活化，导致过量的Ca²⁺流入到神经细胞中，这又导致了引发神经元凋亡的几个信号传导通路的兴奋性中毒和激活。在脑组织中谷氨酸诱导的凋亡还伴随着氧化应激，所述氧化应激导致ATP丧失、线粒体膜电位的丧失和引起相关细胞损伤和死亡的反应活性氧类和反应活性的氮类(例如，H₂O₂、NO、OONO^-、O₂ ^-)的释放。最终发生神经细胞功能降低和神经元细胞死亡。如果细胞的能量代谢被损害，也会出现兴奋性中毒。

NMDA受体的过度活化与神经变性疾病和其他神经相关病症有关，因为其引起神经元丢失和认知损害，并且还在导致各种神经变性障碍，诸如，肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈病，以及病症(诸如中风)中神经元损伤的最终共同途径中起作用。最近的发现暗示NMDA受体与许多其它神经障碍诸如，多发性硬化、脑瘫(脑室周围白质软化症)和脊髓损伤，以及慢性和重度心境障碍有关(Mathew SJ等人，Rew Bras Psiquiatr，27：243-248(2005))。

NMDA受体在调节和促进正常神经***功能以及在引起细胞死亡中起关键作用，所述细胞死亡导致致死性病症。关于给予细胞的信号类型取决于激活的NMDA受体的位置的证据不断增加。促进生长和存活的信号由激活的突触NMDA受体产生，而引起细胞死亡的信号由突触外NMDA受体产生。最近的研究还指出激活的突触NMDA受体导致转录因子CREB在转录调节残基Ser133上的强磷酸化并促进CREB-依赖性的基因表达和神经元存活。然而，所述激活的突触外NMDA受体使CREB瞬时磷酸化，但并不激活CREB-依赖性的基因表达，导致神经元细胞死亡(Hardingham GE等人，Nat Neurosci，5：405-414(2002))。

然而，几乎没有用于兴奋性中毒的有效治疗剂，以减轻与其相关的神经元障碍的症状。开发有效的作为神经治疗药物的NMDA拮抗剂的一个复杂因素是许多NMDA拮抗剂还具有致精神病和神经中毒的性质。例如，MK-801(地佐环平马来酸盐)在缺血性中风中能提供一定程度的神经保护，但与致精神病和不良运动影响相关。因此，希望鉴定和/或开发能加强带来神经保护的NMDA突触活性的化合物。

黑皮质素(MC)受体是一类G蛋白偶联受体。MC为一组垂体肽激素，其包括促肾上腺皮质激素(ACTH)和α、β和γ促黑素细胞激素(MSH)。它们来源于激素原阿黑皮素原(Adan等人，(2000)Melanocortins and the brain：from effects via receptor to drugtargets.Eur J Pharmacol 405：13-24)。MC通过多个黑皮质素受体(命名为MC1至MC5)起作用。MC1受体在巨噬细胞和单核细胞、角化细胞和黑素细胞、内皮细胞、神经胶质瘤细胞和星形胶质细胞、以及垂体和导水管周围灰质中表达，其中它们参与黑素元生成和消炎过程(Kang等人，(2006)A selective small molecule agonist of themelanocortin-1 receptor inhibits lipopolysaccharide-inducedcytokine accumulation and leukocyte infiltration in mice.JLeukoc Biol 80：897-904；和Slominski等人，(2004)Melaninpigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation.Physiol Rev 84：1155-228)。还在肥胖受试者的皮下脂肪中发现它们并认为它们在肥胖的病理生理学中起作用(Hoch等人，Expressionand localization of melanocortin-1 receptor in human adiposetissues of severely obese patients.Obesity(Silver Spring)15：40-9)。ACTH与MC2受体(ACTH受体)结合并主要在肾上腺和肾上腺皮质中表达。而MC3在外周和神经组织中均有表达，MC4主要在CNS中被发现并为第二神经MC受体，它们在大脑的多个区域(包括皮层、丘脑、下丘脑、脑干和脊髓)中表达。所述受体还在室旁核中高度表达并参与垂体功能的调节。与MC4高度同源的MC5是在骨骼肌中发现的唯一的MC受体且在外周区域中被广泛表达并存在于特定的脑区域中。

MC4受体活性与神经突增生和外周神经再生(Tanabe等人，(2007)Melanocortin receptor 4 is induced in nerve-injuredmotor and sensory neurons of mouse.J Neurochem 101：1145-52；和Adan等人，(1996)Melanocortin receptors mediatealpha-MSH-induced stimulation of neurite outgrowth in neuro 2Acells.Brain Res Mol Brain Res 36：37-44)，大脑缺血性中风中的神经保护和认知功能(Giuliani等人，2006)，星形胶质细胞中的炎症反应(Caruso等人，(2007)Activation of melanocortin 4receptors reduces the inflammatory response and preventsapoptosis induced by lipopolysaccharide and interferon-gammain astrocyte s.Endocrinology 148：4918-26)有关。对七肽Semax(Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro)进行研究，所述七肽Semax是促肾上腺皮质激素片段(4-10)的类似物但缺乏ACTH激素活性，是MC4 受体的拮抗剂(Adan等人，(1994)Identification of antagonistsfor melanocortin MC3，MC4 and MC5 receptors.Eur J Pharmacol269：331-7)。已经报道Semax通过调节海马BDNF/trkB***的表达和活化来增强大脑的认知功能(Tsai，(2007)Semax，an analogue ofadrenocorticotropin(4-10)，is a potential agent for thetreatment of attention-deficit hyperactivity disorder and Rettsyndrome.Med Hypotheses 68：1144-1146；和Dolotov等人，(2006)Semax，an analogue of adrenocorticotropin(4-10)，bindsspecifically and increases levels of brain-derivedneurotrophic factor protein in rat basal forebrain.J Neurochem97 Suppl 1：82-86)。BDNF因其参与学习和记忆而早已被了解，调节树突棘密度和形态、调节轴突生长、以及神经障碍的各种治疗策略已经以BDNF为靶点(Winckler，(2007)BDNF instructs the kinaseLKB1 to grow an axon.Cell 129：459-60；Ji等人，(2005)CyclicAMP controls BDNF-induced TrkB phosphorylation and dendriticspine formation in mature hippocampal neurons.Nat Neurosci 8：164-72；Pezet等人，(2004)Brain-derived neurotrophic factorasa drug target for CNS disorders.Expert Opin Ther Targets 8：391-399；Yamada等人，(2003)Brain-derived neurotrophicfactor/TrkB signaling in memory processes.J Pharmacol Sci 91：267-270)。BDNF表达还与应激与抑郁有关，且各种关于抑郁的治疗(诸如抗抑郁剂和电休克治疗)通过诱导大脑中BDNF的表达起作用(综述于Castren等人，(2007)Role of neurotrophic factors indepression.Curr Opin Pharmacol 7：18-21；Kuipers等人，(2006)Brain-derived neurotrophic factor mechanisms and function inadult synaptic plasticity：new insights and implications fortherapy.Curr Opin Drug Discov Devel 9：580-586；和Malberg等人，(2005)Antidepressant action：to the nucleus and beyond.Trends Pharmacol Sci 26：631-638)。同样地，假定MC4受体拮抗作用为对抗忧郁、焦虑和恶病质的治疗机理(Chaki等人，(2007)Melanocortin-4 receptor antagonists for the treatment of depression and anxiety disorders.Curr Top Med Chem 7：1145-1151；和Foster等人，(2007)Melanocortin-4 receptor antagonists as potential therapeutics in the treatment of cachexia.Curr Top Med Chem 7：1131-1136)。

因此，需要开发有效的NMDA和MC4拮抗剂，所述NMDA和MC4拮抗剂具有高效能并能(i)预防和/或治疗CNS障碍，诸如兴奋性中毒、神经变性疾病和神经病理学病症(neuropathologicalconditions)；(ii)在应激条件(诸如，中风)下提供神经保护；(iii)增强大脑的认知功能；和(iv)提供对病症的治疗，所述病症诸如忧郁、焦虑、厌食和由其他慢性疾病诱导的恶病质。本发明满足这些和其他需要。

发明内容

在一方面，本发明提供式(I)的化合物、或其药学可接受的盐、前药、水合物、异构体；

其中：

R¹、R³、R⁴和R⁵各自独立地为C_1-4烷基；

R²选自C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、-X¹CN，-X¹NO₂、-X¹C(O)R^a、-CR^b＝NOR^c、-X¹CO₂R^c、-X¹C(O)NR^cR^d、-X¹C(NR^cR^d)＝NR^c、-X¹C(O)NR^cS(O)R^d、-X¹C(O)NR^cS(O)R^d、-X¹OR^e、-X¹SR^e、-X¹NHR^e和-X¹N(R^e)₂和-X¹R^e，其中X¹各自独立地为键或C_1-4亚烷基，其中R^e为被R^f中的1-3个成员取代的C_1-6烷基、卤代烷基、芳基C_0-6烷基、或环烷基，且其中R^a、R^b、R^c和R^d各自独立地为H、C_1-6烷基或芳基-C_1-6烷基；其中每个R²取代基的脂肪族部分任选地被1-3个R^f取代，其中R^f选自卤素、CN、NO₂、-OH、-R^g、-OR^g、-OC(O)NHR^g、-OC(O)N(R^g)₂、-OC(O)R^g、-OC(O)H、-NH₂、-NHR^g、-N(R^g)₂、-SH、-SR^g、-S(O)₂R^g、-SO₂NH₂、-SO₂NHR^g、-SO₂N(R^g)₂、-NHS(O)₂R^g、-NR^gS(O)₂R^g、-C(O)NH₂、-C(O)NHR^g、-C(O)N(R^g)₂、-C(O)H、-C(O)R^g、-NHC(O)R^g、-NR^gC(O)R^g、-NHC(O)NH₂、-NR^gC(O)NH₂、-NR^gC(O)NHR^g、-NHC(O)NHR^g、-NR^gC(O)N(R^g)₂、-NHC(O)N(R^g)₂、-COOH、-CO₂R^g、-NHCO₂R^g、-NR^gCO₂R^g和-OSi(R^g)₃，其中R^g各自独立地为C_1-6烷基；A选自C＝Y¹、C＝NOR^c、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)R^g、C＝NOCO₂R^g、C＝NOC(O)NH₂、C＝NOC(O)NHR^g、C＝NOC(O)N(R^g)₂和-CR^cR^h，其中Y¹为＝O或＝S，且R^h选自卤素、CN、NO₂、-OH、-ORⁱ、-OC(O)NHRⁱ、-OC(O)N(Rⁱ)₂、-OC(O)Rⁱ、-OC(O)H、-NH₂、-NHRⁱ、-N(Rⁱ)₂、-SH、-SRⁱ、-S(O)₂Rⁱ、-SO₂NH₂、-SO₂NHRⁱ、-SO₂N(Rⁱ)₂、-NHS(O)₂Rⁱ、-NRⁱS(O)₂Rⁱ、-C(O)NH₂、-C(O)NHRⁱ、-C(O)N(Rⁱ)₂、-C(O)H、-C(O)Rⁱ、-NHC(O)Rⁱ、-NRⁱC(O)Rⁱ、-NHC(O)NH₂、-NRⁱC(O)NH₂、-NRⁱC(O)NHRⁱ、-NHC(O)NHRⁱ、-NRⁱC(O)N(Rⁱ)₂、-NHC(O)N(Rⁱ)₂、-COOH、-CO₂Rⁱ、-NHCO₂Rⁱ、-NRⁱCO₂Rⁱ、-OSi(Rⁱ)₃、-O-(Z)_1-6、-S-(Z)_1-6、-NH(Z)_1-6和-NR^c(Z)_1-6，其中Rⁱ各自独立地为任选被1-3个R^f取代的C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、芳基C_0-6烷基或C_3-6环烷基；-(Z)_1-6为通过醚键连接在一起的1-6个独立选择的C_4-7单糖残基的序列，任选地Z各自独立地被1-3个C_1-6烷基或R^f取代。R⁶选自C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、-X²CN、-X²NO₂、-X²C(O)R^a、-CR^b＝NOR^c、-X²OC(O)R^a、-X²CO₂R^c、-X²C(O)NR^cR^d、-X²C(NR^cR^d)＝NR^c、-X²C(O)NR^cS(O)R^d、-X²C(O)NR^cS(O)R^d、-X²OR^a、-X²SR^a、-X²NHR^a和X²N(R^a)₂，其中X²各自独立地为键或C_1-4亚烷基；其中每个R⁶取代基的脂肪族部分任选被1-3个R^f取代，其中两个相邻的R^f取代基与和它们相连的原子一起任选形成具有1-3个选自N、O或S的杂原子的5-元杂环，其中所述杂环任选被1-3个R^g取代，且每个R⁶的芳香环任选被1-5个R^f取代；和 R⁷选自C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、C_2-6链烯基、C_2-6卤代链烯基、C_5-6环烯基和C_2-6环氧烷基，其各自任选被1-3个R^f取代，条件是所述化合物不是如表1所示的DA001-003、DA005-006、DA010-011、DA015、DA018和DA020。在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含式I的化合物和药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

在另一方面，本发明提供一种抑制NMDA和/或MC受体活性的方法。所述方法包括使式I的化合物或化合物DA001-047中的任一种与NMDA和/或MC受体接触。

在另一方面，本发明提供预防和/或治疗受试者(诸如哺乳动物或人)中中枢神经障碍的方法。在一个实施方案中，本发明提供预防和/或治疗哺乳动物中神经变性疾病和神经病理学病症的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了增强哺乳动物的大脑认知功能的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了预防哺乳动物在诸如中风的应激条件下神经元损伤的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗忧郁、焦虑和由慢性疾病诱导的恶病质的方法。在上述实施方案中，治疗和/或预防CNS障碍的方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的式I的化合物或化合物DA001-047中的任一种或包含式I的化合物或化合物DA001-047中的任一种的药物组合物。

附图说明

图1.DA001降低海马神经元中NMDA诱导的电流。从18天的胚胎大鼠分离海马神经元，使其胰蛋白酶化，以3x10⁴细胞/板的密度置于35-mm的板上并在补充有B27营养物的神经基质培养基(NB)中培养。在DA001(10μg/ml)存在或不存在下用NMDA(50μM)处理DIV10-14大鼠海马神经元。数据表示为NMDA-诱导电流的百分比。DMSO为溶剂对照。

图2.在DA001和美金刚存在或不存在下，用10μM甘氨酸和20μMNMDA体外处理11天(DIV)的胚胎大鼠原代皮层神经元培养物。测量相对荧光单位(Relative fluorescence unit)并计算为对NMDA的相对响应的百分比。从相同的草药中分离化合物A0178和A0179，但使用FLIPR测定法只有DA001显示对NMDA-诱导的电流具有相对的抑制作用。

图3.DA001加强由1μM NMDA诱导的钙电流(突触活性(synaptic activity))。在37℃下，在由10mM HEPES pH 7.4、丙磺舒和钙敏感性荧光染料Fluo4-AM(4mM)组成的缓冲溶液中体外温育9-13天(DIV)的胚胎大鼠原代皮层神经元培养物1个小时。在NMDA(1μM)存在或不存在下向细胞加入DA001。使用FLIPR监测荧光活性的变化两分钟。数据表示为与溶剂对照(DMSO)相比响应±标准偏差的平均倍数。*表示P＜0.05，**表示P＜0.005，如由t-test所计算的。

图4.用10μM甘氨酸和20μM NMDA体外处理11天(11DIV)的胚胎大鼠原代皮层神经元培养物。然后用DMSO、美金刚或DA001处理它们。DMSO的百分比变化与每剂量DA001的溶剂百分比变化一致；对于所有的IC₅₀而言，R2＝≤0.97。

图5 DA001保护大鼠皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒。在TCM样品(μg/ml)或美金刚(μM)存在或不存在下，用NMDA(20μM)处理胚胎大鼠皮层神经元(11DIV)。美金刚为已知的NMDA拮抗剂。在温育过夜后测量培养基中LDH的释放并将细胞的细胞毒性计算为相对溶剂对照(DMSO)的百分比。

图6.DA001保护大鼠原代海马神经元免受NMDA兴奋性中毒。在DA001(μM)或美金刚(μM)存在或不存在下用NMDA(20μM)处理胚胎大鼠海马神经元(11DIV)。在温育过夜后测量培养基中LDH的释放并将细胞的细胞毒性计算为相对溶剂对照(DMSO)的百分比。

图7.DA001保护胚胎大鼠原代皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒。用β-微管蛋白III型抗体(beta-tubulin type IIIantibody)对神经突进行免疫染色，并用FITC-缀合抗体进行检测。细胞体用DAPI染色进行标记。DMSO用作溶剂对照(CTL)。

图8.DA001显示对原代神经元没有任何细胞毒性作用。用不同浓度的DA001处理原代皮层神经元24个小时。在所有测试的剂量下没有观察到明显的细胞死亡。

图9.DA001诱导CREB长期磷酸化。通过加入荷包牡丹碱(bicuculine)(50μM)、4-AP(200μM)、CNQX(10μM)和尼莫地平(5μM)来刺激突触活性(SA)。NMDA(50μM)诱导CREB瞬时磷酸化。DA001(13μM)和SA诱导CREB长期磷酸化。

图10.DA001和美金刚的相对剂量曲线和对应的EC₅₀。

图11A.DA001降低Morris水迷宫模型中的逃避潜伏期(escape latency)。首先给小鼠腹膜内施用东莨菪碱(SCOP；4mg/kg)以损害它们的记忆。然后给东莨菪碱-诱导的记忆损害的小鼠经口施用三种不同剂量的DA001(10、30或100mg/kg)中的一种，并在5天时间内使其进行Morris水迷宫。在每一天，测量小鼠在水迷宫中发现隐藏平台所需的时间，以秒为单位。计算测量值为每只小鼠的平均潜伏期，n＝12/组。数据表示为平均±s.e.m.并与Oil/SCOP组比较。剂量以mg/kg表示。

图11B.DA001降低Morris水迷宫模型中的逃避潜伏期。首先给小鼠腹膜内施用东莨菪碱(SCOP；4mg/kg)以损害它们的记忆。然后给东莨菪碱-诱导的记忆损害的小鼠经口施用DA001(10和100mg/kg)，并在5天时间内使其进行Morris水迷宫。在每一天，测量小鼠在水迷宫中发现隐藏平台所需的时间，以秒为单位。计算测量值为每只小鼠的平均潜伏期，n＝24。数据表示为平均±s.e.m.并与Oil/SCOP组比较。剂量以mg/kg表示。

图12.DA001的衍生物保护皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒。在DA001或其衍生物(10或30μM)存在或不存在下，用NMDA(20μM)处理胚胎大鼠皮层神经元(11DIV)；在过夜或24小时温育后测量培养基中LDH的释放并将细胞死亡计算为相对DMSO溶剂对照的百分比。数据表示为平均+s.e.m.*＝P＜0.05。

图13.DA001的两种衍生物DA002和DA021降低NMDA-诱导的兴奋性中毒。在DA002或DA021(μg/ml)存在或不存在下，用 NMDA(20μM)处理胚胎大鼠皮层神经元(11DIV)。在过夜温育后测量培养基中LDH的释放并将细胞的细胞毒性计算为相对溶剂对照DMSO的百分比。

图14表示DA001调节海马神经元中脊骨的形态(spinemorphogenesis)。与对照(DMSO)相比，DA001显著增加脊骨密度(spinedensity)和大的脊(头＞1um)的数量，而丝状伪足的数量显著下降。N＝20，符号**表示P＜0.005。

图15说明DA001在培养的皮层神经元中诱导更长的轴突。

图16说明DA001保护神经元抵抗不同浓度的NMDA。

图17说明DA001包含神经元免受谷氨酸损伤(glutamateinsults)。

图18显示DA001降低缺血性大脑的梗塞大小和水肿。值为平均±S.E.M，n＝8，DA001；n＝7，对照(CTL)；和符号**表示相对对照组P＜0.01。

图19显示DA001在NMDA处理后诱导BDNF表达。

图20说明DA001在NMDA处理后诱导BDNF和NT-3的表达但不诱导Bcl-2或c-fos的表达。

图21显示DA001抑制黑质皮素与MC1和MC4受体结合。获得DA001对人MC1或MC4受体的竞争曲线。

图22说明了在强迫游泳测试中DA001对不动时间的持续长度的影响。数据表示为平均+s.e.m，n＝30。符号*表示P＜0.05，且符号**表示P＜0.005。

发明详述

I.介绍

本发明涉及作为NMDA和MC受体拮抗剂的治疗活性化合物和药物组合物，抑制NMDA和MC受体过度活化的方法，治疗和/或预防神经变性疾病和神经病障碍(neuropathological disorder)的方法，在应激条件下(诸如，中风)提供神经保护的方法，以及增强哺乳动物和人的大脑认知功能的方法。例如，本发明提供预防和/或治疗急性和慢性CNS障碍的治疗剂和方法，所述CNS障碍的范围从神经病理学病症(诸如，神经性疼痛、中风、脑外伤和癫痫症)到神经变性疾病(诸如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病)。此外，本发明提供抵抗谷氨酸诱导的神经变性和毒性的神经元保护，并增强大脑的认知功能，诸如学习和记忆。例如，化合物3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃***糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA001)及其衍生物能通过阻断过度活化的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的毒性作用来保护经受谷氨酸诱导的应激的神经细胞和组织免受损害。

有利地，本发明提供NMDA和MC受体拮抗剂。具体地，本发明提供具有独特功能的NMDA和MC受体拮抗剂，例如能(i)抑制NMDA和MC受体-介导的兴奋性中毒；(ii)预防和/或治疗神经变性疾病(包括肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病)和神经病理学病症；(iii)通过提高长时程增强效应来改善哺乳动物或人的学习和记忆；(iv)在氧化应激下和在类似中风的病症中赋予神经保护；和(v)治疗由其它慢性疾病诱导的抑郁、焦虑、厌食和恶病质的化合物。同样地，所述化合物对一系列障碍(包括痴呆、神经变性、大脑外伤和中风)在治疗上是有效的。

II.定义

可用本发明化合物治疗以抑制NMDA和/或MC受体活性并预防谷氨酸诱导的神经毒性的疾病状态包括，但不限于，神经变性障碍、头和脑创伤(head and brain trauma)、遗传性障碍、传染病、炎症性疾病、药物治疗、药物和酒精所致的障碍(medication，drug andalcohol disorders)、神经性疼痛、癌症、代谢紊乱、精神发育迟滞、和学习记忆障碍，诸如年龄相关的记忆损失、阿尔茨海默病、轻度认知障碍、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈病、健忘症、B1缺乏、精神***症、抑郁症和双相型障碍、中风、脑积水、蛛网膜下腔出血、血管功能不全、脑血管缺血、脑瘤、癫痫、帕金森氏病、脑微血管病、止痛药物(pain medicdin)、化疗、缺氧(例如，由心肺机、麻醉或接近溺死(near drowning)引起)、痴呆(血管、额颞、路易小体(Lewy-body)、语义的原发性进行性失语(semantic，primaryprogressive aphasia)、Pick′s)、进行性核上麻痹、皮质基底核退化症(corticobasal degeneration)、桥本脑病(Hashimotoencephalopathy)、ADD、ADHD、阅读障碍、唐氏综合征、脆性X染色体综合征(fragile X syndrome)、特纳氏综合征、胎儿酒精综合征、诸如在精神***症、脑瘫和孤独症中的例如抑郁、焦虑、厌食、恶病质和认知恶化(cognitive deterioration)。

“神经性的”疼痛指由于外周和/或中枢感觉传导通路的损伤或慢性变化引起的疼痛，其中所述疼痛常常发生或在无明显伤害性刺激(xoxious input)下持续。

如本文所使用的，“给药”指口服给药、以栓剂给药、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内(intralesional)、鼻内或皮下给药，或植入缓释装置如小型渗透泵到受试者。

如本文所使用的，术语“烷基”指具有指定数量的碳原子的直链或支链的饱和脂肪烃基。例如，C₁-C₆烷基包括，但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。

如本文所使用的，术语″链烯基″指具有一个或多个双键的直链或支链的不饱和烷基。示例性的C_2-6链烯基包括，但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯、3-(1，4-戊二烯)和更高级的类似物和异构体。

如本文所使用的，术语″环烷基″指具有指定数量的环原子的烃环(例如，C_3-6环烷基)和是完全饱和的或在环顶点之间具有不超过一个双键。一个或两个碳原子可以任选地被羰基替代。

如本文所使用的，术语″亚烷基″本身或作为另一个取代基的一部分指衍生自烷烃的二价基团，例如-CH₂CH₂CH₂CH₂-。通常，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，在本发明中具有10个或更少碳原子的那些是优选的。

如本文所使用的，除非另外说明，术语″芳基″指多不饱和的，通常是芳香的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(至多三个环)。芳基的非限制性实例包括苯基、奈基和联苯基。

如本文所使用的，术语″组合物″意图包括包含特定量的特定成分的产物，以及由特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产物。

如本文所使用的，术语″环氧烷基″意指具有环氧基的如上定义的烷基。更具体地，C_2-6环氧烷基包括环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基、环氧戊基、环氧己基和其他异构体形式。例如，C_2-3环氧烷基包括环氧乙基和环氧丙基。如本文所使用的，术语″环氧化物″指包含桥氧的化合物或试剂，其中桥连原子还直接或间接地与另一个键合。环氧化物的实例包括1，2-环氧乙烷(1，2-epoxyethylene)环氧乙烷)、环氧丙烷等。

如本文所使用的，除非另外说明，术语“卤代”或″卤素″本身或作为另一个取代基的一部分指氟、氯、溴或碘原子。

如本文所使用的，术语诸如″卤代烷基″意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语″C_1-4卤代烷基″意图包括三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

如本文所使用的，术语“水合物”指与至少一个水分子复合的化合物。本发明的化合物与1至10个水分子复合。

如本文所使用的，术语“抑制”指部分或完全阻止一个特定效果或功能的化合物或方法。

如本文所使用的，术语″单糖″或″糖″指直链醛类或酮类的糖类分子，其可以与缩醛或缩酮形式组合。分子剩余的碳通常具有氢和多个羟基。单糖具有经验式(CH₂O)_n，其中n为3-7，和优选4-7，甚至更优选5-7。在一些实施方案终，该术语指″单糖(simplesugars)″，其由单个多羟基醛或酮单元组成。单糖的代表性实例包括，但不限于，葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖。二糖的代表性实例包括，但不限于，乳糖、麦芽糖和蔗糖。

如本文所使用的，术语“有需要的患者”指患有中枢神经障碍的患者，所述中枢神经障碍包括神经变性疾病和神经病理学病症。非限制性实例包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、神经性疼痛、中风、脑外伤、卒中癫痫(epilepsystroke)和痴呆。患有可用NMDA拮抗剂治疗的其他病症的患者也可以用本发明的方法治疗。使用本发明的方法可治疗的患者为动物，诸如哺乳动物，包括，但不限于灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，所述患者是人。

如本文所使用的，术语“前药”指共价键合的载体，当给哺乳动物受试者施用前药时，所述载体能释放本发明方法的活性试剂。活性成分的释放在体内发生。前药可以通过本领域技术人员已知的技术制备。这些技术通常修饰给定化合物中合适的官能团。然而，这些经修饰的官能团通过常规操作或在体内重新生成最初的官能团。本发明活性试剂的前药包括其中羟基、脒基、胍基、氨基、羧酸基或类似基团被修饰的活性试剂。

如本文所使用的，术语“盐”指本发明方法中使用的化合物的酸式或碱式盐。药学可接受的盐的说明性实例是无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐，有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐，季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应该理解药学可接受的盐是无毒的。关于适合的药学可接受的盐的其他信息可在Remington′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985中发现，其通过引用并入本文。

如本文所使用的，本发明碱性化合物的药学可接受的盐是与酸(诸如，无机酸、有机羧酸和有机磺酸，例如，盐酸、甲基磺酸、马来酸)形成的盐，还可能提供的是碱性基团，诸如，构成结构的一部分的吡啶基。

如本文所使用的，″药学可接受的″指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容且对其接受者无害。

所述化合物的中性形式可通过使所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来重新获得。化合物的母体形式在某些物理性质方面与多种盐形式不同，诸如，在极性溶剂中的溶解度，然而就本发明目的而言所述盐与化合物的母体形式是等价的。

如本文所使用的，术语“治疗有效量或剂量”或“治疗上足够的量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”指对施用其的对象产生治疗效果的剂量。准确的剂量将取决于治疗目的，且本领域的技术人员使用已知技术是可确定的(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，TheArt，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；和Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，20th Edition，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams & Wilkins)。在致敏细胞中，所述治疗有效剂量通常低于用于非致敏细胞的常规治疗有效剂量。

如本文所使用的，术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指任何在治疗或改善损伤、病状、病症或症状(例如，疼痛)上的成功指标，包括任何客观或主观的参数，诸如消除；好转；症状减少或使患者更能忍受症状、损伤、病状或病症；降低症状或病症频率或持续时间；或者，在一些情况下，预防症状或病症的发作。症状的治疗或改善可以基于任何客观或主观参数，包括，例如身体检查的结果。

III.化合物

在一个方面，本发明提供式(I)的化合物：或其药学可接受的盐、前药、水合物、异构体。

在式I中，R¹、R³、R⁴和R⁵各自独立地为C_1-4烷基。在一个实施方案中，R¹、R³、R⁴和R⁵各自独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和仲丁基。在另一实施方案中，R¹、R³、R⁴和R⁵各自独立地为甲基。

在式I中，R²选自C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、-X¹CN、-X¹NO₂、-X¹C(O)R^a、-CR^b＝NOR^c、-X¹CO₂R^c、-X¹C(O)NR^cR^d、-X¹C(NR^cR^d)＝NR^c、-X¹C(O)NR^cS(O)R^d、-X¹C(O)NR^cS(O)R^d、-X¹OR^e、-X¹SR^e、-X¹NHR^e和-X¹N(R^e)₂和-X¹R^e，其中X¹各自独立地为键或C_1-4亚烷基，其中R^e为被R^f中的1-3个成员取代的C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、芳基C_0-6烷基或C_3-6环烷基，和其中R^a、R^b、R^c和R^d各自独立地为H、C_1-6烷基或芳基-C_1-6烷基；其中每个R²取代基的脂肪族部分任选被1-3个R^f取代，其中R^f选自卤素、CN、NO₂、-OH、-R^g、-OR^g、-OC(O)NHR^g、-OC(O)N(R^g)₂、-OC(O)R^g、-OC(O)H、-NH₂、-NHR^g、-N(R^g)₂、-SH、-SR^g、-S(O)₂R^g、-SO₂NH₂、-SO₂NHR^g、-SO₂N(R^g)₂、-NHS(O)₂R^g、-NR^gS(O)₂R^g、-C(O)NH₂、-C(O)NHR^g、-C(O)N(R^g)₂、-C(O)H、-C(O)R^g、-NHC(O)R^g、-NR^gC(O)R^g 、-NHC(O)NH₂、-NR^gC(O)NH₂、-NR^gC(O)NHR^g、-NHC(O)NHR^g、-NR^gC(O)N(R^g)₂、-NHC(O)N(R^g)₂、-COOH、-CO₂R^g、-NHCO₂R^g、-NR^gCO₂R^g和-OSi(R^g)₃，其中R^g各自独立地为C_1-6烷基，R^g还可以任选地被芳基取代。在某些情况下，在R^g中的芳基可以进一步地被1-3个R^f取代。在一个实施方案中，R^a、R^b、R^c和R^d各自独立地为H、C_1-6烷基或苯基-C_1-6烷基。

在一组具有式I的化合物的实施方案中，R²选自-X¹C(O)R^a、-CR^b＝NOR^c、-X¹NHR^e、-X¹N(R^e)₂和-X¹R^e。在某些情况下，X¹为键。在某些其他情况下，X¹为CH₂。在某些其他情况下，R^e为被1-3个R^f取代的C_1-6烷基。在一些情况下，R^e为-CH₂-R^f。

在另一组具有式I的化合物的实施方案中，R²选自-CH₂OH、-CH₂OAc、-CH₂OC_1-6烷基、-CHO、-CH＝NOR^c、-CH₂NHR^e、-CH₂OSi(R^e)₃和-CH₂OSi(R^f)₃。在某些情况下，R²为-CH₂OH、-CH₂OAc、-CH₂OC_1-6烷基、-CHO，-CH₂OSiTBS、-CH＝NOH、-CH₂NH-C_1-6烷基-芳基和-CH＝NOR^g。在某些其他情况下，R²选自-CH₂OH、-CH₂OAc、-CH₂OTBS、-CHO、-CH＝NOH和-CH₂NHBn。

在式I中，符号A选自C＝Y¹、C＝NOR^c、C＝NOC(O)R^g、C＝NOCO₂R^g、C＝NOC(O)NH₂、C＝NOC(O)NHR^g和C＝NOC(O)N(R^g)₂和-CR^cR^h，其中Y¹为＝O或＝S，且R^h选自卤素、CN、NO₂、-OH、-ORⁱ、-OC(O)NHRⁱ、-OC(O)N(Rⁱ)₂、-OC(O)Rⁱ、-OC(O)H、-NH₂、-NHRⁱ、-N(Rⁱ)₂、-SH、-SRⁱ、-S(O)₂Rⁱ、-SO₂NH₂、-SO₂NHRⁱ、-SO₂N(Rⁱ)₂、-NHS(O)₂Rⁱ、-NRⁱS(O)₂Rⁱ、-C(O)NH₂、-C(O)NHRⁱ、-C(O)N(Rⁱ)₂、-C(O)H、-C(O)Rⁱ、-NHC(O)Rⁱ、-NRⁱC(O)Rⁱ、-NHC(O)NH₂、-NRⁱC(O)NH₂、-NRⁱC(O)NHRⁱ、-NHC(O)NHRⁱ、-NRⁱC(O)N(Rⁱ)₂、-NHC(O)N(Rⁱ)₂、-COOH、-CO₂Rⁱ、-NHCO₂Rⁱ、-NRⁱCO₂Rⁱ、-OSi(Rⁱ)₃、-O-(Z)_1-6、-S-(Z)_1-6、-NH(Z)_1-6和-NR^c(Z)_1-6，其中Rⁱ各自独立地为任选被1-3个R^f取代的C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、芳基C_0-6烷基或-(Z)_1-6；-(Z)_1-6为通过醚键连接在一起的1-6个独立选择的C_4-7单糖残基的序列，任选地Z被1-3个C_1-6烷基或R^f取代。

在一组具有式I的化合物的实施方案中，A为CR^c-O(Z)_1-6。在一个实例下，Z独立地为C_4-7单糖。在另一个实例下，Z独立地为C_5-6单糖残基。示例性C_4-7单糖包括，但不限于赤藓糖、苏糖、***糖、核糖、核酮糖、木糖、木酮糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、山梨糖、塔罗糖和塔格糖，景天庚酮糖。优选地，Z为选自下述的C_5-6单糖残基：***糖、核糖、核酮糖、木糖、木酮糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、山梨糖、塔罗糖、塔格糖，且其各自任选被乙酰化。在其他情况下，-(Z)₂选自：其中，波浪线表示与分子剩余部分的连接点。

在另一组具有式I的化合物的实施方案中，A选自C＝O、CR^cR^h、C＝NOR^c、C＝NOC(O)R^g、C＝NOCO₂R^g、C＝NOC(O)NH₂、C＝NOC(O)NHR^g和C＝NOC(O)N(R^g)₂。在一个实例下，A选自C＝O、CR^c-OR^d、CR^c-OC(O)Rⁱ、C＝NOR^c、C＝NOC(O)R^g、C＝NOCO₂R^g、C＝NOC(O)NH₂、C＝NOC(O)NHR^g、C＝NOC(O)N(R^g)₂、CR^c-NH₂、CR^c-NHRⁱ、CR^c-OSi(Rⁱ)₃和CR^c-N(Rⁱ)₂。在另一实例下，A选自C＝O、CR^c-β-OH、CR^c-OBn、CR^c-OAc、C＝NOH、CR^c-NHR^c和CR^c-SiTBS。在一个实例下，R^c为H。在某些其他情况下，A选自CH-OH、CHOAc、C＝O、C＝NOAc、CHO、

R⁶选自C_1-6代烷基、C_3-6环烷基、-X²CN、-X²NO₂、-X²C(O)R^a、-CR^b＝NOR^c、-X²CO₂R^c、-X²C(O)NR^cR^d、-X²C(NR^cR^d)＝NR^c、-X²C(O)NR^cS(O)R^d、-X²C(O)NR^cS(O)R^d、-X²OR^a、-X²SR^a、-X²NHR^a和-X²N(R^a)₂和-X²R^e，其中X²各自独立地选自键或C_1-4亚烷基；其中每一个R⁶取代基的脂肪族部分任选被1-3个R^f取代，其中两个相邻的R^f取代基与和它们相连的原子一起任选形成具有1-3个选自N、O或S的杂原子的5-元杂环，其中所述杂环任选被1-3个R^g取代，且每个R⁶的芳香环任选被1-5个R^f取代。

在一组实施方案中，R⁶选自-X²OC(O)R^a，-X²CO₂R^c，-X²C(O)NR^cR^d，-X²R^e，-X²C(O)R^a和-CR^b＝NOR^c。在某些情况下，R⁶选自-COOH、-COOR^g、-CH₂OH、-CH₂OR^g、-CHO、-CH₂NHCH₂Ph和-CH＝NOR^c、-CH₂OAc、-CH₂CH₂OH、-C_1-6亚烷基-OH、CO₂-C_1-6亚烷基-OH、-CH₂CH(OH)-CH₂OH、CO₂-CH₂CH(OH)-CH₂OH、-C_1-6亚烷基-NH₂、CONH-C_1-6亚烷基-NH₂、-C(O)NH₂、-C(O)NHR^c和其中R^c任选被-OH或NH₂取代。在某些其他情况下，R⁶选自-COOH、-CH₂OH和-CH＝NOR^c。在一个实例下，R^c为-H。在另一实例下，R⁶选自-COOH、-COOMe、-COOEt、-CH₂OH、-CHO、-CH＝NOH、-CH₂OAc、-CH₂CH₂OH、-CO₂CH₂CH₂OH、-C_1-6亚烷基-OH、-CO₂-C_1-6亚烷基-OH、-CO₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH(OH)-CH₂OH、CO₂-CH₂CH(OH)-CH₂OH、-C_1-6亚烷基-NH₂、-C(O)NH₂、-C(O)NHCH₃、-C(O)NHCH₂Ph、-C(O)NH-C_1-6亚烷基-OH、-CONHCH₂CH₂OH、-C(O)NH-C_1-6亚烷基-NH₂、-CONHCH₂CH₂NH₂和在另一实例下，R⁶选自-COOH、-COOMe、-COOEt、-CH₂OH、-CHO、-CH＝NOH、-CH₂OAc、-CO₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂OH、-CO₂CH₂CH(OH)-CH₂OH、-C(O)NH₂、-C(O)NHCH₃、-C(O)NHCH₂Ph、-C(O)NH-CH₂CH₂-NH₂和其中，波浪线表示与分子剩余部分的连接点。

R⁷选自任选被1-3个R^f取代的C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、C_2-6链烯基、C_2-6卤代链烯基、C_5-6环烯基和C_2-6环氧烷基。在某些情况下，在R^f中的芳基可进一步被1-3个R^f基团取代。

在一组实施方案中，R⁷选自C_1-6烷基、C_2-6链烯基和C_2-6环氧烷基，其各自任选被1-3个R^f取代。在某些情况下，R⁷为C_1-6烷基或C_2-6链烯基。在某些其他情况下，R⁷是环氧乙烷基，任选被1-3个R^f取代。例如，R⁷是被1-3个C_1-6烷基取代的环氧乙烷。示例性R⁷包括环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基、环氧戊基、环氧己基和其他异构体形式，诸如1，2-环氧丙基、1，2-环氧-2-丙基、1，2-环氧-3-丙基、1，2-环氧丁基、1，2-环氧-2-丁基、1，2-环氧-3-丁基、2，3-环氧丁基等。在某些其他情况下，R⁷选自-CH＝CH₂、-C(CH₃)＝CH₂、-C(CH₂OH)＝CH₂、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)CH₃、环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基和1，2-环氧-2-丙基。在一个实例下，R⁷选自-C(CH₃)＝CH₂、-C(CH₂OH)＝CH₂和1，2-环氧-2-丙基。

在一个实施方案中，式I的化合物具有子式Ia：其中取代基R²、R⁶、R⁷和A如上所定义。

在一组具有式Ia的化合物的实施方案中，A为CR^c-OH。在一个实例下，R⁶为-COOH。

在另一组具有式Ia的化合物的实施方案中，R²为被1-3个羟基取代的C_1-6烷基、卤代烷基或环烷基，且A不是CR^c-OC(O)C_1-6烷基。在某些情况下，R²为被羟基取代的C_1-6烷基。例如，R²为-CH₂OH。

在一个实例中，子式Ia的化合物具有子-子式(Sub-Subformula)Ia-1：其中，取代基R²和R⁶如上所定义。

在第二个实例中，子式Ia的化合物具有子-子式Ia-2：其中，取代基R²和R⁶如上所定义。

在第三个实例中，子式Ia的化合物具有子-子式Ia-3：其中，取代基R²和R⁶如上所定义。

在第四个实例中，子式Ia的化合物具有子-子式Ia-4：其中，取代基R²和R⁶如上所定义。

在第五个实例中，子式Ia的化合物具有子-子式Ia-5：其中，取代基R²和R⁶如上所定义。

在一个实施方案中，化合物具有选自下述的式：如表1所示的DA004、DA007-9、DA012-14、DA016-17、DA019、DA021-029和DA033-047。

表1列出了根据本发明的一些实施方案所选的化合物。示例性化合物包括所选的3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃***糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸衍生物。表1. 化合物的制备

如以下实施例所述，存在多种合成途径，通过它们，本领域的技术人员能制备本发明的化合物和中间体。方案1-4描述了若干制备某些3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃***糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(白头翁皂苷)衍生物的方法。在每一个方案中，R、R′、R″和R″′为无干扰的取代基。

下述方案提供某些合成途径，依据这些合成途径可以获得本发明的某些白头翁皂苷衍生物。其他途径或下面提供的途径的变化形式对本领域的技术人员而言是显而易见的且在本发明的范围内。

方案1显示了通过修饰C20-C29双键合成本发明的某些化合物。方案1

方案2显示通过在C3位置处进行修饰来合成本发明的某些化合物。方案2

方案3显示通过在C28位置处进行修饰来合成本发明的某些化合物。方案3

方案4显示通过在C23位置处进行修饰来合成本发明的某些化合物。方案4

方案5显示根据本发明的实施方案合成化合物D033-036的合成方法。方案5

方案6显示根据本发明的实施方案合成化合物DA038-DA040。方案6

方案7描述了根据本发明的实施方案合成化合物DA041-DA047。方案7

IV.药物组合物

除了上面提供的化合物外，用于调节人和动物中NMDA和/或MC受体活性的组合物通常包含式I的化合物或化合物DA001-047中的任何一种以及药学载体、赋形剂或稀释剂。

用于给予本发明化合物的药物组合物可方便地以单位剂量形式提供，并通过任何药剂学和药物递送领域中熟知的方法制备。所有的方法包括使活性成分与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种助剂。通常，通过下述方式制备药物组合物：使活性成分与液态载体或精细分散的固体载体或两者均一和紧密地结合，然后，如果需要，将所述产品制成所需制剂。在所述药物组合物，以足以对疾病的过程或病症产生所需作用的量包含活性目标化合物。

含有活性成分的药物组合物可以为适合口服应用的形式，例如片剂、锭剂、糖锭、悬浮水溶液或悬浮油溶液、可分散粉剂或粒剂、如在美国专利申请2002-0012680中所述的乳剂和自乳化剂、硬或软胶囊、糖浆、酏剂、溶液、口腔贴片剂，口服胶、口香糖、咀嚼片剂、泡腾粉剂和泡腾片剂。意图用于口服应用的组合物可以根据制备药物组合物领域中熟知的任何方法制备，且所述组合物可包含一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂以提供药学上优美的和美味的制剂。片剂含有与无毒的药学可接受赋形剂(其适用于制备片剂)混合的活性成分。这些赋形剂例如可以是惰性稀释剂，诸如纤维素、二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、碳酸钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如PVP、纤维素、PEG、淀粉、明胶或***树胶、和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或包衣的，肠溶衣地或通过已知方法延迟在胃肠道中的崩解和吸收从而在较长周期内提供持续作用。例如，可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之类的延时材料。它们还可以通过美国专利号4,256,108、4,166,452和4,265,874中所述的技术来进行包衣以形成控制释放用的等渗治疗片剂。

口服应用的制剂还可以以硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或以软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。此外，乳剂可以用诸如油之类的非水易混合成分制备并用诸如甘油一酸酯、甘油二酯、PEG酯等稳定。

水性悬浮液含有与赋形剂混合的活性材料，所述赋形剂适合于制备水性悬浮液。这样的赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和***树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烷醇醚与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如十七烷氧乙烯十六烷基醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐(hexitol anhydrides)的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如，液体石蜡)来制备。所述油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡，固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂(诸如上面所述的那些)和调味剂来提供美味的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂(诸如，抗坏血酸)来保存。

适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉剂和粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂由上面已经提到的那些来举例。还可以存在其他赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以为水包油的乳液形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的橡胶，例如***树胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以与甜味剂一起制备，所述甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。所述制剂还可以含有缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和着色剂。口服溶液例如还可以与环糊精、PEG和表面活性剂组合来制备。

药物组合物可以为无菌可注射的水性悬浮液或油性(oleagenous)悬浮液。该悬浮液可以根据已知的技术使用那些上面提到的合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来制备。无菌可注射制剂还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂可以是水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，可以方便地采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可用于制备注射剂。

还可以以栓剂形式施用本发明的化合物以用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述无刺激性赋形剂在普通温度下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。这样的材料包括可可脂和聚乙二醇。此外，所述化合物可以经由眼部递送以溶液或软膏方式施用。此外，本发明化合物的经皮递送可以通过离子电渗贴剂等方式实现。对于局部应用，采用含有本发明化合物的霜剂、软膏、凝胶剂、溶液或悬浮液等。如本文所使用的，局部应用还意图包括使用漱口剂和含漱剂。

本发明的化合物还可以与载体结合，所述载体为用作可靶向药物载体的合适聚合物。这样的聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基-天冬酰胺-苯酚、或用棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与载体结合，所述载体是一类用于实现药物的可控释放的可生物降解的聚合物，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯(polyepsilon caprolactone)、聚羟基丁酸酯(polyhydroxy butyric acid)、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚腈基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。聚合物和半透性聚合物基质可以形成特型制品，诸如瓣膜(valves)，支架(stents)，管形，假体(prostheses)等。在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物与成形为支架装置(stent device)或覆膜支架装置(stent-graft device)的聚合物或半透性聚合物基质结合。

V.治疗由NMDA和MC受体调节的疾病和障碍的方法

在另一方面，本发明提供抑制NMDA受体和/或MC受体(例如MC1或MC4受体)活性以治疗和/或预防CNS障碍的方法。所述方法包括使式I化合物或化合物DA001-047中的任何一种，或其药物组合物与NMDA受体接触。优选地，所述NMDA受体是激活的NMDA受体。在一个实施方案中，所述方法包括使三萜化合物3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃***糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯 -28-羧酸(DA001)或化合物DA001的药物组合物与NMDA受体或MC1或MC4受体接触。化合物DA001分离自草药白头翁(PulsatillaChinensis)(参见，Chen等人，″Saponins from PulsatillaChinensis″Acta Chimica Sinica 1990，48，501)。

在一个实施方案中，本发明的化合物是NMDA和/或MC拮抗剂，其可用于抑制NMDA和/或MC受体配体(例如，谷氨酸盐)与体内或体外NMDA受体结合。通常，这些方法包括在NMDA或MC受体配体存在下，在水溶液中并在其他适合所述配体与NMDA或MC受体结合的条件下，使NMDA受体或MC与足量的一种或多种本文提供的NMDA或MC受体拮抗剂接触。所述NMDA或MC受体可以存在于悬浮液(例如，在分离的膜中或细胞制剂(cell preparation)中)中，或在培养或分离的神经元细胞中。

优选地，与所述受体接触的NMDA或MC受体调节剂的量应足以抑制NMDA或MC与体外NMDA或MC受体结合，例如使用全细胞膜片钳研究、钙动员测试法(calcium mobilization assay)、荧光成像阅读仪(FLIPR)检测法、或神经元存活检测法所测量的，如本文所述。

在本发明的一个实施方案中，本发明的NMDA或MC受体拮抗剂用于调节，优选抑制NMDA或MC受体活性，例如通过在适合于所述调节剂与受体结合的条件下使本发明的一种或多种化合物与NMDA或MC受体(体内或体外)接触。所述受体可存在于溶液或悬浮液中，在培养或分离的细胞制剂中或在患者中。可以使用膜片钳、FLIPR或钙试验技术通过检测穿过神经元表面的离子电流，或通过存活检测法，或免疫细胞化学分析来评估任何活性调节。通常，有效量的NMDA或MC拮抗剂为在膜片钳研究和钙动员测试法中，接下来在神经元存活检测法中足以调节体外NMDA或MC受体活性的量。

在另一个实施方案中，进行比较研究以确定其相对于已知拮抗剂美金刚的功效。所述化合物对认知功能，诸如在治疗痴呆、改善受试者的记忆中的影响在使用Morris水迷宫任务的动物模型中进行评价。

在另一方面，本发明提供了式I化合物和化合物DA001-047中的任何一种预防和/或治疗哺乳动物或人的神经变性疾病或神经病理学病症的方法和用途。所述方法包括给所述哺乳动物或人施用治疗有效量的本发明化合物。

在另一方面，本发明提供式I化合物或化合物DA001-047中的任何一种增强哺乳动物或人大脑的认知功能的方法和用途。所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的本发明化合物。

在另一方面，本发明提供式I化合物或化合物DA001-047中的任何一种抑制MC受体活性的方法和用途。所述方法包括使所述化合物与所述MC受体接触。在一个实施方案中，所述MC受体是MC1或MC4受体。在另一实施方案中，所述MC受体是MC4受体。

在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物中的忧郁、焦虑和由慢性疾病诱导恶病质的方法。所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或化合物DA001-047中的任何一种。非限制性的能诱导恶病质的慢性疾病包括癌症、AIDS、肾衰竭、肝功能衰竭、充血性心力衰竭和肺病。

可以用NMDA和MC受体拮抗剂治疗的病症：

本发明提供神经保护以及改善认知缺陷。作为NMDA受体拮抗剂，本发明化合物用于治疗CNS的急性和慢性障碍，范围从神经病理学病症到神经变性疾病以及与兴奋性中毒相关的病症。使用本发明化合物可以治疗的疾病状态包括，但不限于例如神经变性障碍、头和脑创伤、遗传性疾病、传染病、炎症性疾病、药物治疗、药物和酒精所致的障碍、神经性疼痛、癌症、代谢紊乱、精神发育迟滞、和学习记忆障碍，诸如年龄相关的记忆损失、阿尔茨海默病、轻度认知障碍、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈病、健忘症、B1缺乏、精神***症、抑郁症和双相型障碍、脑血管、中风、脑积水、蛛网膜下腔出血、血管供能不全、脑瘤、癫痫、帕金森氏病、脑微血管病、止痛药、化疗、缺氧(例如，由心肺机、麻醉、或接近溺死引起)、痴呆(血管、额颞、路易小体、语义的原发性进行性失语、Pick′s)、进行性核上麻痹、皮质基底核退化症、桥本脑病、ADD、ADHD、阅读障碍、唐氏综合征、脆性X染色体综合征、特纳氏综合征、胎儿酒精综合征、抑郁、焦虑、厌食和恶病质。

本发明还提供缺血性中风治疗的新范例。目前的治疗受到严格地限制。传统上，使用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)治疗急性缺血性中风。但只有在事件的头三个小时内静脉内给药且大脑内没有出血，该药物才能预防与中风相关的一些不利影响。对于这么小的治疗窗，只有少部分的中风患者(～3％)接受有效的治疗。近年来，中风研究关注开发神经保护试剂(可以使大脑更能耐受中风引起的损伤的化合物)。本发明的化合物能停止缺血级联。

本发明化合物具有神经保护特性。此外，它们证实在应激条件下具有预防神经元损伤的能力。当暴露于中风相关条件下时，它们还对神经元组织进行保护，并在作为预防和控制缺血性中风的治疗药物上具有巨大潜力。

在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗选自下述的疾病：肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病、急性或慢性神经性疼痛、中风、脑外伤、卒中癫痫和痴呆。

通常，本文提供的治疗方法包括给患者施用有效量的一种或多种本文提供的化合物，例如，经口、经鼻或肠胃外。适合的患者包括，患有或易患有(即，预防性治疗)本文所述的障碍或疾病。如本文所述，治疗的典型患者包括哺乳动物，特别是灵长类，尤其是人。其他合适的患者包括驯养的伴生动物诸如狗、猫、马等，或家畜诸如牛、猪、绵羊等。

通常，本文提供的治疗方法包括给患者施用治疗有效量的本文提供的一种或多种化合物，例如式I的化合物。在优选的实施方案中，优选给患者(例如，人)经口施用本发明的化合物。有效量可以是足以调节NMDA和/或MC受体活性的量和/或足以降低或减轻患者所表现的症状的量。优选地，施用的量足以产生足够高的化合物(或其活性代谢物，如果所述化合物是前药的话)血浆浓度以可检测地抑制体外NMDA和/或MC受体。治疗方案可以根据所用的化合物和待治疗的具体病症来变化；对大多数障碍，每天4次或更少的给药频率是优选的。通常，每天2次的剂量方案是更优选的，而每天给药一次尤其优选。然而，将理解对于任何具体患者的具体剂量水平和治疗方案将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、基本健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径、***速率、药物联合(即，给所述患者施用的其他药物)和正在治疗的具体疾病的严重程度，以及执业医师的判断。通常，使用足以提供有效治疗的最小剂量是优选的。通常可以使用适用于正被治疗或预防的病症的医学标准或兽医标准来监控患者的治疗有效性。

可以根据需要尽可能频繁的给予本发明的化合物，包括每小时、每天、每周或每个月。给药频率还可以根据所用的化合物和所治疗的具体疾病来变化。然而，对治疗大多数障碍而言，每天4次、每天三次或更少的剂量方案是优选的，而每天一次或每天两次的剂量方案是特别优选的。在本发明的药物方法中使用的化合物以每天约0.0001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量给予。可以使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。然而，所述剂量可以根据患者需要，被治疗的病症的严重程度和所采用的化合物来变化。例如，可以考虑具体患者经诊断的疾病类型和阶段通过经验确定剂量。在本发明的上下文中，给患者施用的剂量随时间应足以在患者中产生有益的治疗反应。剂量的大小还由特定患者中伴随给予具体化合物的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。然而，应理解任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、基本健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径、和***速率、药物联合(即，给所述患者施用的其他药物)、正在治疗的具体疾病的严重程度和其他因素，包括执业医师的判断。确定具体情况的合适剂量在从业者的技能范围内。通常，用较少剂量(其低于化合物的最佳剂量)来起始治疗。然后，一点一点地增加所述剂量直到达到环境下的最佳效果。为了方便，如果需要的话，可以将总的日剂量分开并在一天内分批给予。剂量可以每天或隔天给予，由治疗医师确定。剂量还可以在较长时间段(数周、数月或数年)内定期或连续给予，诸如通过使用皮下胶囊、小袋或储库，或经由贴剂。

可以以多种方式给患者施用药物组合物，包括局部、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、经结肠地、经直肠地或腹膜内。优选地，通过肠胃外、局部、静脉内、肌肉内或口服施用药物组合物。

式I或式DA001-047的化合物还可以与其他治疗剂联合施用，或诊断试剂与式I或式DA001-047的化合物联合施用。

VI.实施例

下述缩写在实施例和本发明的整个说明书中使用：TBSC1/TBDMSC1：叔丁基二甲基氯硅烷NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸LAH：氢化铝锂PCC：氯铬酸吡啶鎓(pyridinum chloro chromate)PDC：二氯铬酸吡啶鎓(pyridinum dichloro chromate)DMAP：4-二甲基氨基吡啶Ac：乙酰基DMSO：二甲亚砜Bn：苄基MC：黑皮质素

使用本领域技术人员已知的各种反应，可以如下所述合成本发明范围内的化合物。本领域的技术人员还承认可以使用备选方法来合成本发明的目标化合物，且本文主体中描述的方法不是穷举的，但的确提供了目的化合物的广泛适用和实用的途径。

用于合成本文关键化合物的实验过程的详细描述得到这样的分子，所述分子用鉴定它们的物理数据以及与它们相关的结构说明来描述。

本领域的技术人员还承认在有机化学的标准后处理过程中，常常使用酸和碱。在本专利所述的试验过程中，如果母体化合物本身具有所需的酸性或碱性的话，有时生成母体化合物的盐。实施例1：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA002)的合成

向HCl甲醇试剂10(10mL)的溶液中加入白头翁皂苷A(DA001，100mg)，并将所得的混合物在35℃下搅拌4天。在倒入水(10ml)中后，用氯仿(3×50ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×10ml)、盐水(1×10ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并在真空下浓缩。采用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，30∶1)，在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率85％。实施例2：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA003)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(10mg，0.021mmol)的THF(2mL)溶液中加入K₂CO₃(4.4mg，0.032mmol)和MeI(1.7μL，0.032mmol)。在室温下搅拌12个小时后，通过加入20％Na₂S₂O₃(0.5ml)和饱和的NaHCO₃(0.5ml)来淬灭反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取混合物。用H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并在真空下浓缩。采用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，30∶1)，在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率95％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.73(s，1H)，4.59(s，1H)，3.71(d，J＝10.5Hz，1H)，3.66(s，3H， OCH₃)，5.59-3.64(m，1H)，3.41(d，J＝10.5Hz，1H)，2.98-3.00(m，1H)，2.19-2.24(m，2H)，1.79-1.90(m，2H)，1.70(s，3H，CH₃)，1.00-1.68(m，22H)，0.89-0.99(m，12H，4×CH₃)。实施例3：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸乙酯(DA004)合成

室温下向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(20mg，0.043mmol)的DMF(2ml)溶液中加入K₂CO₃(9mg)和EtI(5.2μl)，并在40℃下搅拌所得混合物过夜。在反应用20％Na₂S₂O₃(0.5ml)和饱和的NaHCO₃(0.5ml)淬灭后，用乙酸乙酯(3×15ml)萃取所述混合物。用H₂O(6×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并在真空下浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，30∶1)，在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的化合物DA004，产率90％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.72(s，1H)，4.59(s，1H)，4.13(q，J＝6.3Hz，2H)，3.70(d，J＝10.5Hz，1H)，3.60(t，J＝7.5Hz，1H)，3.40(d，J＝10.5Hz，1H)，2.95-3.00(m，1H)，2.20-2.24(m，2H)，1.70-1.90(m，2H)，0.99-1.67(m，28H)，0.85-0.95(m，12H，4×CH₃)。实施例4：3，23-二羟基-羽扇豆烷-28-羧酸(DA005)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(20mg，0.043mmol)的MeOH(5ml)溶液中加入催化量的10％Pd/C。在氢气氛(气球压力)下搅拌所述混合物3天。在通过过滤除去催化剂后，在减压下浓缩所述滤液得到白色固体状的所需产物，产率95％。实施例5：3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA006)、3-乙酰氧基-23-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA007)和23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA008)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(40mg，0.085mmol)的吡啶(2.0ml)溶液中加入DMAP(cat)和Ac₂O(16.5μL，0.174mmol)。在室温下搅拌1个小时，用水稀释所述反应。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取所述混合物，然后用5％HCl(1×3ml)、饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH，在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到三种所需产物。 3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA006)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.75-4.79(m，2H)，4.62(s，1H)，3.84(d，J＝11.6Hz，1H)，3.69(d，J＝11.6Hz，1H)，2.95-3.06(m，1H)，2.18-2.29(m，2H)，2.07(s，3H，CH₃)，2.02(s，3H，CH₃)，1.70(s，3H，CH₃)，1.02-1.68(m，23H)0.98(s，3H，CH₃)，0.94(s，3H，CH₃)，0.88(s，3H，CH₃)，0.81(s，3H，CH₃)。 3-乙酰氧基-23-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA007)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.87(dd，J＝12.4，4.4Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.61(s，1H)，3.37(d，J＝12.8Hz，1H)，2.95-3.02(m，1H)，2.89(d，J＝12.8Hz，1H)，2.10-2.28(m，2H)，2.08(s，3H，CH₃)，1.73-2.05(m，2H)，1.69(s，3H，CH₃)，1.07-1.64(m，22H)，0.98(s，3H，CH₃)，0.93(s，3H，CH₃)，0.83(s，3H，CH₃)，0.65(s，3H，CH₃)。 23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA008)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.75(s，1H)，4.61(s，1H)，4.18(d，J＝11.6Hz，1H)，3.80(d，J＝11.6Hz，1H)，3.40(t，J＝8.8Hz，1H)，2.95-3.02(m，1H)，2.17-2.29(m，2H)，1.95-1.99(m，2H)，2.10(s，3H，CH₃)，1.69(s，3H，CH₃)，1.17-1.64(m，22H)，0.98(s，3H，CH₃)，0.94(s，3H，CH₃)，0.86(s，3H，CH₃)，0.75(s，3H，CH₃)。实施例6：3，23-二羟基-20(29)-环氧-羽扇豆烷-28-羧酸(DA009)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(35mg，0.074mmol)的THF(3ml)溶液中加入MCPBA(73％混合，35mg，0.15 mmol)。在室温下搅拌2天后，用饱和的NaHCO₃(0.5ml)淬灭所述反应。在水后处理后，使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，20∶1)作为洗脱液，在硅胶上通过柱色谱纯化所述残余物得到白色固体状的所需产物，产率90％。¹H NMR(400MHz，CD₃OD，δppm)：3.58-3.60(m，1H)，3.51(d，J＝11.2Hz，1H)，3.26-3.31(m，3H)，1.32-2.25(m，28H)，1.24(s，3H，CH₃)，1.00(s，3H，CH₃)，0.95(s，3H，CH₃)，0.89(s，3H，CH₃)，0.67(s，3H，CH₃)。实施例7：20(29)-羽扇豆烯-3，23，28-三醇(DA010)的合成

在0℃下向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(30mg，0.062mmol)的THF(3ml)溶液中加入LiAlH₄(12mg，0.31mmol)。使所述反应回温到室温并搅拌过夜。在用水(1ml)淬灭后，用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，30∶1)作为洗脱液，在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率92％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.68(s，1H)，4.58(s，1H)，3.79(d，J＝10.8Hz，1H)，3.73(d，J＝10.4Hz，1H)，3.62(t，J＝8.4Hz，1H)，3.42(J＝10.4Hz，1H)，3.33(d，J＝10.8Hz，1H)，2.35-2.39(m，1H)，1.83-1.94(m，4H)，1.68(s，3H，CH₃)，1.05-1.65(m，23H)，1.02(s，3H，CH₃)，0.98(s，3H，CH₃)，0..88(s，6H，2×CH₃)。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃，δppm)：150.1，109.5，71.9，60.4，50.3，49.8，48.6，47.7，42.7，41.8，40.8，38.3，37.2，37.0，33.9，29.7，29.1，27.0，25.1，20.8，19.1，18.4，16.4，16.0，14.7，11.3，11.2。实施例8：3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA011)和23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA012)的合成

在冰水浴中向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(50mg，0.10mmol)的吡啶(1ml)溶液中加入DMAP(cat)和Ac₂O(9μL，0.10mmol)。在相同温度下搅拌0.5个小时后，用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×5ml)、饱和的NaHCO₃(1×5ml)、H₂O(1×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，浓缩所述混合物，并使用石油-乙酸乙酯，在硅胶上通过柱色谱纯化所得混合物得到所需的产物。 3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA011)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.74-4.79(m，2H)，4.61(s，1H)，4.85(d，J＝11.6Hz，1H)，4.69(d，J＝11.6Hz，1H)，3.67(s，3H，CH₃)，2.98-3.00(m，1H)，2.17-2.25(m，2H)，2.07(s，3H，CH₃)，2.02(s，3H，CH₃)，1.87-1.90(m，2H)，0.96-1.73(m，23H)，0.93(s，3H，CH₃)，0.90(s，3H，CH₃)，0.87(s，3H，CH₃)，0.81(s，3H，CH₃)。 23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA012)

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.74(s，1H)，4.60(s，1H)，4.17(d，J＝11.6Hz，1H)，3.80(d，J＝11.6Hz，1H)，3.67(s，3H，CH₃)，3.40(br，1H)，2.98-3.02(m，1H)，2.13-2.25(m，2H)，2.09(s，3H，CH₃)，1.85-2.07(m，2H)，1.68(s，3H，CH₃)，1.02-1.66(m，21H)，0.97(s，3H，CH₃)，0.92(s，3H，CH₃)，0.86(s，3H，CH₃)，0.75(s，3H，CH₃). 实施例9：23-乙酰氧基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA013)的合成

向23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(95mg，0.18mmol)的CH₂Cl₂(3ml)溶液中加入硅胶(200mg)和PDC(136mg，0.36mmol)。在室温下搅拌过夜后，通过硅胶柱垫过滤所述混合物。浓缩所述滤液并使用石油-乙酸乙酯(v/v 4∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得的黄色油状物得到白色固体状的所述产物，产率90％。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.73(s，1H)，4.60(s，1H)，4.05(d，J＝11Hz，1H)，4.02(d，J＝11Hz，1H)，3.66(s，3H，OCH₃)，2.98-3.00(m，1H)，2.42-2.47(m，2H)，2.25-2.24(m，2H)，2.02(s，3H，CH₃)，1.88-1.93(m，2H)，1.68(s，3H，CH₃)，1.18-1.64(m，18H)，0.99(s，3H，CH₃)，0.97(s，3H，CH₃)，0.96(s，3H，CH₃)，0.94(s，3H，CH₃)。实施例10：23-羟基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA014)的合成

向23-乙酰氧基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(83mg，0.16mmol)的MeOH(3ml)溶液中加入K₂CO₃(25mg，0.18mmol)。在室温下搅拌所述混合物3个小时。停止所述反应并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×5ml)、盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。使用石油-乙酸乙酯(v/v 4∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率98％。实施例11：23-羟基-3-肟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA015)的合成

向23-羟基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(74mg，0.16mmol)的吡啶(2ml)溶液中加入盐酸羟胺(44mg，0.64mmol)。在室温下搅拌2个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×5ml)、饱和的NaHCO₃(1×5ml)、H₂O(1×5ml)、盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤并浓缩，使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，10∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率98％。实施例12：23-乙酰氧基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA016)的合成

向23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(100mg，0.20mmol)的CH₂Cl₂(3ml)溶液中加入硅胶(200mg)和PDC(147mg，0.40mmol)。在室温下搅拌1.5个小时后，停止反应。通过硅胶塞过滤所述混合物并浓缩所述滤液。使用石油-乙酸乙酯(v/v 4∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率69％。 ¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.75(s，1H)，4.61(s，1H)，4.07(d，J＝11Hz，1H)，4.02(d，J＝11Hz，1H)，3.03-3.06(m，1H)，2.45-2.51(m，2H)，2.28-2.33(m，2H)，2.03(s，3H)，1.70-2.00(m，2H)，1.67(s，3H，CH₃)，1.05-1.63(m，19H)，0.94-1.00(m，12H，4×CH₃)。实施例13：23-羟基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA018)的合成

向23-乙酰氧基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(62mg，0.121mmol)的MeOH(3ml)溶液中加入K₂CO₃(20mg，0.15mmol)。在室温下搅拌2个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物，并用H₂O(1×5ml)、盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，60∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物，产率90％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：4.74(s，1H)，4.62(s，1H)，3.65(d，J＝11.2Hz，1H)，3.41(d，J＝11.2Hz，1H)，2.98-3.01(m，1H)，2.57-2.61(m，1H)，2.21-2.30(m，3H)，1.97-2.00(m，3H)，1.04-1.67(m，22H)，1.00(s，3H，CH₃)，0.98-0.99(m，9H，3×CH₃) 实施例14：23-羟基-3-肟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(DA019)的合成

向23-羟基-3-氧代-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(24mg，0.051mmol)的吡啶(2ml)溶液中加入盐酸羟胺(7mg，0.102mmol)。在室温搅拌2个小时后，停止所述反应。用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×5ml)、饱和的NaHCO₃(1×5ml)、H₂O(1×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤和浓缩，使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，10∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所述混合物得到白色固体状的所需产物，产率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃/CD₃OD，δppm)：4.72(s，1H)，4.60(s，1H)，3.59(d，J＝11.2Hz，1H)，3.49(d，J＝11.2Hz，1H)，3.73-3.81(m，1H)，2.96-3.06(m，2H)，1.78-2.26(m，7H)，1.69(s，3H，CH₃)，1.16-1.61(m，18H)，0.96-1.04(m，12H，4×CH₃)。实施例15：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(DA020)的制备

3，23-二叔丁基二甲基硅氧基(3，23-di-tert-butyldimethylsilioxy)-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸的合成：向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸的DMF溶液中加入TBSC1、咪唑和DMAP。在室温下搅拌6个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取所述混合物。用H₂O(6×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用石油-乙酸乙酯(v/v 16∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到无色油状的3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，产率93％。

3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醇的合成：向3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(241mg，0.34mmol)的THF(5ml)溶液中加入LiAlH₄(42mg，1.36mmol)。在室温下搅拌8个小时后，用5％HCl(2ml)淬灭所述反应。用乙酸乙酯(3×40ml)萃取所述混合物。用5％HCl(1×3ml)、饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，50∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到无色油状的3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醇，产率87％。

3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛的合成：向3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醇(65mg，0.095mmol)的CH₂Cl₂(3ml)溶液中加入PCC(26mg，0.12mmol)和硅胶(130mg)。在室温下搅拌2.5个小时后，通过硅胶柱过滤所述混合物。浓缩滤液得到黄色油状的3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛，产率78％。

3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛的合成：向3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(23mg，0.034mmol)的THF/MeOH(1.5ml/1.5ml)溶液中加入6滴浓HCl。在室温下搅拌3.5个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×40ml)萃取所述混合物。用饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，40∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛，产率85％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：9.67(s，1H)，4.75(s，1H)，4.63(s，1H)，3.71(d，J＝10.4Hz，1H)，3.61(t，J＝8.4Hz，1H)，3.41(d，J＝10.4Hz，1H)，2.83-2.87(m，1H)，1.71-2.09(m，4H)，1.69(s，3H，CH₃)，1.05-1.65(m，22H)，0.97(s，3H，CH₃)，0.91(s，3H，CH₃)，0..86(s，6H，2×CH₃). 实施例16：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-iminol(DA021)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(7mg，0.015mmol)的吡啶(0.5ml)溶液中加入盐酸羟胺(2mg，0.031mmol)。在室温下搅拌2个小时后，用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×3ml)、饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)和盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥并在减压下浓缩后，使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，30∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所述混合物得到白色固体状的所需产物，产率96％。ESI-MS(m/z)，472.34(M+H⁺)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃/CD₃OD，δppm)：7.53(s，1H)，4.71(s，1H)，4.60(s，1H)，3.54-3.62(m，2H)，3.30-3.33(m，1H)，2.52(m，1H)，1.72-2.02(m，4H)，1.70(s，3H，CH₃)，1.03-1.67(m，23H)1.01(s，6H，2×CH₃)，0.88(s，3H，CH₃)，0.75(s，3H，CH₃)。实施例17：3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(DA022)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(22mg，0.053mmol)的吡啶(1ml)溶液中加入DMAP(cat)和Ac₂O(20μL，0.22mmol)。在室温下搅拌4.5个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×3ml)、饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，100∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所述产物，产率92％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：9.67(s，1H，CHO)，4.74-4.77(m，2H)，4.64(s，1H)，3.84(d，J＝11.2Hz，1H)，3.69(d，J＝11.2Hz，1H)，2.85-2.89(m，1H)，2.07(s，3H，CH₃)，2.02(s，3H，CH₃)，1.66-1.91(m，7H)，1.01-43(m，20H)，0.97(s，3H，CH₃)，0.92(s，3H，CH₃)，0.89(s，3H，CH₃)，0.81(s，3H，CH₃). 实施例18：3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-苄胺(DA023)的合成

向3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醛(20mg，0.04mmol)的CH₂Cl₂(2ml)溶液中加入苄胺(13μl，0.12mmol)、AcOH(5μl，0.08mmol)和NaB(OAc)₃H(51mg，0.24mmol)。在室温下搅拌9个小时后，用饱和的NaHCO₃(1ml)淬灭所述反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×2ml)和盐水(1× 2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH-NH₃OH(v/v，60∶1∶0.1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物，产率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：7.24-7.33(m，5H)，4.76(dd，J＝12.2，4.4Hz，1H)，4.65(s，1H)，4.56(s，1H)，3.88(d，J＝14Hz，1H)，3.84(d，J＝11.2Hz，1H)，3.76(d，J＝14Hz，1H)，3.69(d，J＝11.2Hz，1H)，2.66(d，J＝11.2Hz，1H)，2.32-2.37(m，1H)，2.18(d，J＝11.2Hz，1H)，2.06(s，3H，CH₃)，2.01(s，3H，CH₃)，1.83-1.87(m，3H)，1.00-1.66(m，26H)，0.93(s，3H，CH₃)，0.86(s，3H，CH₃)，0.82(s，3H，CH₃)，0.81(s，3H，CH₃)。实施例19：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-苄胺(DA024)的合成

向3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-苄胺(17mg，0.027mmol)的MeOH(2ml)溶液中加入K₂CO₃(22mg，0.16mmol)。在室温下搅拌3个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×2ml)和盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤并浓缩，使用CH₂Cl₂-MeOH-NH₃OH(v/v，40∶1∶0.1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所述混合物得到白色固体状的所需混合物，产率92％。ESI-MS(m/z)，547.49(M+H⁺)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：7.24-7.33(m，5H)，4.64(s，1H)，4.55(s，1H)，3.88(d，J＝13.6Hz，1H)，3.76(d，J＝13.6Hz，1H)，3.70(d，J＝10Hz，1H)，3.60(t，J＝9.2Hz，1H)，3.4(d，J＝10Hz，1H)，2.66(d，J＝11.6Hz，1H)，2.32-2.37(m，1H)，2.18(d，J＝11.6Hz，1H)，1.82-1.91(m，4H)，1.66(s，3H，CH₃)，1.02-1.62(m，23H)，0.93(s，3H，CH₃)，0.87(s，3H，CH₃)，0.84(s，3H，CH₃)，0.82(s，3H，CH₃)。实施例20：23-甲酰基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA026)的制备

23-乙酰氧基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯的合成：向23-乙酰氧基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯DA012(29mg，0.055mmol)的DMF(1ml)溶液中加入TBSC1(17mg，0.11mmol)、咪唑(10mg，0.14mmol)和DMAP(cat)。在室温下搅拌8个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取所述混合物。用H₂O(6×2ml)和盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。采用石油-乙酸乙酯(v/v 16∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到无色油状的23-乙酰氧基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯，产率93％。

23-羟基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯的合成：向23-乙酰氧基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(41mg，0.064mmol)的MeOH/THF(3ml/1ml)溶液中加入K₂CO₃(18mg，0.13mmol)。在室温下搅拌2个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×30ml)萃取所述混合物，并用H₂O(1×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤并浓缩，采用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，40∶1，20∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所述混合物得到白色固体状的23-羟基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯，产率90％。

23-甲酰基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯的合成：向23-羟基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(18mg，0.03mmol)的CH₂Cl₂(2ml)溶液中加入硅胶(36mg)和PCC(13mg，0.06mmol)。在室温下搅拌所述反应2.5个小时并停止反应。通过硅胶塞过滤所述混合物。浓缩滤液并采用石油-乙酸乙酯(v/v 10∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的23-甲酰基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯，产率76％。

23-甲酰基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯的合成：向23-甲酰基-3-叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(10mg)的THF/MeOH(1ml/1ml)溶液中加入3滴浓HCl。在室温下搅拌3.5个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取所述混合物。用饱和的NaHCO₃(1×3ml)、H₂O(1×2ml)和盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤并浓缩，使用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，10∶1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化所得残余物得到白色固体状的23-甲酰基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯，产率82％。实施例21：3-羟基-23-羟基亚氨基(hydroxylimino)-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA027)的合成

向23-甲酰基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(10mg，0.021mmol)的吡啶(1ml)溶液中加入盐酸羟胺(4mg，0.063mmol)。在室温下搅拌2个小时后，停止反应。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取所述混合物。用5％HCl(2×5ml)、饱和的NaHCO₃(1×5ml)、H₂O(1×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤合并的有机层。在用硫酸钠干燥后，过滤并浓缩，采用CH₂Cl₂-MeOH(v/v，10∶1)作为洗脱液在硅胶上通过色谱纯化所得残余物得到白色固体状的所需产物，产率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：7.24(s，1H)，4.74(s，1H)，4.60(s，1H)，3.67(s，3H，CH₃)，3.51-3.54(m，1H)，2.97-3.00(m，1H)，1.73-2.22(m，6H)，1.68(s，CH₃)，1.14-1.60(m，20H)，1.02(s，3H，CH₃)，0.96(s，3H，CH₃)，0.92(s，3H，CH₃)，0.87(s，3H，CH₃)。实施例22：23-苄氨基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA028)的合成

向23-甲酰基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(41 mg，0.085mmol)的CH₂Cl₂(4mL)溶液中加入苄胺(28μl，0.26mmol)、AcOH(10μl，0.17mmol)和NaB(OAc)₃H(108mg，0.51mmol)。在室温下搅拌过夜后，用饱和的NaHCO₃(1ml)淬灭所述反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。采用CH₂Cl₂-MeOH-NH₃OH(v/v，30∶1∶0.1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物，产率88％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：7.29-7.43(m，5H)，4.74(s，1H)，4.60(s，1H)，4.43(d，J＝5.6Hz，1H)，3.81(d，J＝11.6Hz，1H)，3.73(d，J＝11.6Hz，1H)，3.61-3.66(m，4H)，3.47-3.51(m，1H)，3.08(d，J＝12.0Hz，1H)，2.98-3.00(m，1H)，2.02-2.23(m，3H)，1.86-1.93(m，3H)，1.68(s，3H，CH₃)，1.12-1.60(m，19H)，0.95(s，3H，CH₃)，0.90(s，3H，CH₃)，0.89(s，3H，CH₃)，0.86(s，3H，CH₃)。实施例23：23-苄氨基-20(29)-羽扇豆烯-3，28-二醇(DA029)的合成

在0℃下，向23-苄氨基-3-羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(25mg，0.043mmol)的THF(3ml)溶液中加入LiAlH₄(9mg，0.22mmol)。在室温下搅拌过夜后，用H₂O(1ml)淬灭所述反应。用乙酸乙酯(3×10ml)萃取所述混合物。用H₂O(1×2ml)、盐水(1×2ml)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。使用CH₂Cl₂-MeOH-NH₃OH(v/v，30∶1∶0.1)作为洗脱液在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物，产率78％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：7.30-7.34(m，5H)，4.68(s，1H)，4.58(s，1H)，3.81(d，J＝12.8Hz，1H)，3.78(d，J＝10.8Hz，1H)，3.74(d，J＝12.8Hz，1H)，3.49(t，J＝9.2Hz，1H)，3.33(d，J＝10.8Hz，1H)，3.09(d，J＝11.6Hz，1H)，2.35-2.38(m，1H)，2.23(d，11.6Hz，1H)，1.84-1.94(m，4H)，1.68(s，3H，CH₃)，1.04-1.63(m，25H)，1.01(s，3H，CH₃)，0.96(s，3H，CH₃)，0.89(s，3H，CH₃)，0.87(s，3H，CH₃)。实施例24：28-乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯(DA033)的合成

向3，23-二叔丁基二甲基硅氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-醇(393mg，0.86mmol)的吡啶(4mL)溶液中加入乙酸酐(161uL，1.72mmol)。在室温下搅拌4个小时后，用300mL乙酸乙酯稀释所述反应。用5％HCl(5mLx6)、饱和的碳酸氢钠(5mLx1)、水(5mLx1)、盐水(5mLx1)洗涤所得的乙酸乙酯溶液，并用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱得到白色固体状的所需产物(390mg)。

将所述固体溶于THF/MeOH(3mL each)，加入6滴浓HCl。在室温下搅拌所得混合物3个小时，并用饱和的碳酸氢钠淬灭。在水后处理后，在硅胶上通过柱色谱纯化，得到白色固体状的所需产物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.68(s，1H)，4.58(s，1H)，4.24(d，J＝10.2Hz，1H)，3.84(d，J＝10.2Hz，1H)，3.69(d，J＝10.4Hz，1H)，3.60(t，J＝7.7Hz，1H)，3.40(d，J＝10.4Hz，1H)，2.73(br，2H)，2.39-2.48(m，1H)，2.13(s，3H，CH₃)，1.70-2.04(m，6H)，1.67(s，3H，CH₃)，1.04-1.63(m，29H)，1.02(s，3H，CH₃)，0.96(s，3H，CH₃)，0.85(s，6H，2×CH₃)

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：172.3，150.7，110.5，77.2，72.5，63.4，50.9，50.4，49.3，48.3，46.9，43.3，42.4，41.4，39.0，38.1，37.6，35.1，34.5，30.3，30.1，27.6，27.5，25.7，21.6，21.4，19.7，19.0，17.0，16.6，15.4，11.8。实施例25：28-乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-环氧-羽扇豆烷(DA034)的合成

向28-乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯(216mg，0.43mmol)的THF(4mL)溶液中加入mCPBA(149mg，0.86mmol)，并在室温下搅拌所得混合物过夜。用碳酸氢钠水溶液淬灭所述反应，并用300mL乙酸乙酯稀释。用饱和的碳酸氢钠(10mLx4)、水(10mLx1)、盐水(10mlx1)洗涤所述的乙酸乙酯层，并用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需环氧化产物(200mg)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：4.22(d，J＝10.2Hz，1H)，3.59-3.72(m，3H)，3.40(d，J＝10.2Hz，1H)，2.57-2.64(m，3H)，2.05(s，3H，CH₃)，1.26-1.98(m，26H)，1.24(s，3H，CH₃)，1.03(s，3H，CH₃)，0.96(s，3H，CH₃)，0.88(s，3H，CH₃)，0.86s，3H，CH₃).

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：172.1，77.1，72.4，63.1，60.7，57.7，50.8，50.4，50.3，47.2，46.7，43.3，42.4，41.4，39.0，37.6，37.2，34.9，34.5，30.3，27.5，27.4，26.4，21.6，21.5，19.0，18.7，17.0，16.6，15.2，11.9。实施例26：20(29)-环氧-羽扇豆烷-3，23，28-三醇(DA035)的合成

向28-乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-环氧-羽扇豆烷(30mg，0.058mmol)的甲醇(2mL)溶液中加入碳酸钾(16mg，0.12mmol)并在室温下搅拌所得混合物6个小时。用乙酸乙酯(200mL)稀释所述混合物，并用水(5mLx3)和盐水(5mLx1)洗涤，用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹H NMR(300MHz，CD₃OD，δppm)：3.79(d，J＝11.0Hz，1H)，3.68-3.74(m，1H)，3.63(d，J＝11.0Hz，1H)，3.40(d，J＝11.0Hz，1H)，3.28(d，J＝11.0Hz，1H)，2.74-2.78(m，2H)，2.00-2.10(m，4H)，1.40-1.87(m，24H)，1.35(s，3H，CH₃)，1.19(s，3H，CH₃)，1.13(s，3H，CH₃)，1.02(s，3H，CH₃)，0.80(s，3H，CH₃)。

¹³C NMR(75MHz，CD₃OD，δppm)：72.5，65.9，60.6，58.9，56.8，50.3，48.0，47.6，46.8，46.1，42.6，42.1，40.8，38.4，36.7，36.4，33.6，33.5，29.0，26.9，26.6，26.3，25.7，20.7，17.8，17.0，15.7，15.2，13.8，11.3。实施例27：3，23，30-三羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(DA037)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸甲酯(240 mg，0.49mmol)溶于20mL氯仿的溶液中加入mCPBA(176mg，0.74mmol)。回流所得混合物过夜。用碳酸氢钠水溶液淬灭所述反应并用120mL乙酸乙酯稀释。用饱和的碳酸钠(5mLx2)、水(5mLx1)、盐水(5mLx1)洗涤乙酸乙酯层并用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹H NMR(300MHz，CD₃OD，δppm)：5.08(s，1H)，4.15(s，2H)，3.67-3.72(m，1H)，3.62(d，J＝10.9Hz，1H)，3.37-3.42(m，4H)，2.95-3.01(m，1H)，2.33-2.37(m，2H)，1.20-2.95(m，25H)，1.13(s，3H，CH₃)，1.04(s，3H，CH₃)，1.00(s，3H，CH₃)，0.79(s，3H，CH₃)。

¹³C NMR(75MHz，CD₃OD，δppm)：176.8，154.8，105.9，72.5，66.0，63.9，56.6，50.6，50.5，49.9，42.7，42.2，42.0，40.5，38.4，38.3，36.7，36.4，33.7，32.1，31.7，29.5，26.6，26.3，20.9，17.8，15.8，15.3，13.8，11.2。实施例28：3，28-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4基-甲酯(DA038)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(150mg，0.32mmol)的DMF(2mL)溶液中加入氢氧化钠(25mg，0.64mmol)。在室温下搅拌所得混合物15分钟后，加入4-(溴甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(310mg，1.6mmol)。在60℃下搅拌所述反应过夜。在TLC显示所述反应完成后，用水稀释所述混合物并用乙酸乙酯(60mLx3)萃取。用5％HCl(5mLx1)、饱和的碳酸氢钠(5mLx1)、水(5mLx1)、盐水(5mLx1)洗涤合并的乙酸乙酯层，并用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。实施例29：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，2，3-二羟基丙酯(DA039)的合成

向DA038(60mg)的甲醇(2mL)溶液中加入Dowex 50wx2-100(120mg)并将所得混合物在室温下搅拌过夜。在TLC显示所述反应完成后，停止反应并过滤除去Dowex树脂。浓缩滤液并在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹H NMR(300MHz，CD₃OD，δppm)：4.83(s，1H)，4.71(s，1H)，4.14-4.30(m，2H)，3.92-3.96(m，1H)，3.67-3.73(m，3H)，3.62(d，J＝10.9Hz，1H)，3.39(d，J＝10.9Hz，1H)，3.12-3.16(m，1H)，2.35-2.41(m，2H)，1.98-2.07(m，2H)，1.81(s，3H，CH₃)，1.27-1.78(m，24H)，1.12(s，3H，CH₃)，1.06(s，3H，CH₃)，1.00(s，3H，CH₃)，0.79(s，3H，CH₃)。

¹³C NMR(75MHz，CD₃OD，δppm)：176.2，150.5，109.0，72.6，70.0，66.0，64.7，63.1，56.7，50.6，49.3，42.3，42.0，40.6，38.4，38.3，36.8，36.6，33.7，31.8，30.3，29.5，26.2，25.5，20.8，18.2，17.8，15.8，15.4，13.8，11.3。实施例30：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，2-羟基-乙酯(DA040)的合成

向3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(100mg，0.21mmol)于2mL DMF的溶液中加入碳酸钾(58mg，0.42mmol)和2-(叔丁基二甲基硅氧基)-碘乙烷(121mg，0.42mmol)。室温下搅拌所述混合物过夜。水后处理，然后在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物(44mg)。

将所述白色固体溶于4mL MeOH中，并加入Dowex50wx2-100(88mg)。在室温下搅拌过夜后，过滤所述混合物。浓缩滤液并通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，2 drops CD₃OD，δppm)：4.70(s，1H)，4.57(s，1H)，4.11-4.23(m，2H)，3.77(t，J＝4.8Hz，2H)，3.62(d，J＝10.4Hz，1H)，3.52-3.58(m，1H)，3.33(d，J＝10.4Hz，1H)，2.92-2.98(m，1H)，2.22-2.25(m，3H)，1.84-1.91(m，2H)，1.65(s，3H，CH₃)，0.97-1.65(m，12H)，0.93(s，3H，CH₃)，0.88(s，3H，CH₃)，0.82(s，3H，CH₃)，0.81(s，3H，CH₃)。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，2 drops CD₃OD，δppm)：177.3，150.9，110.2，77.1，72.2，66.0，61.7，57.1，51.0，50.5，49.9，47.5，42.9，42.2，41.2，38.9，38.7，37.6，37.5，34.5，32.6，31.1，30.2，27.1，26.0，21.4，19.9，18.9，17.0，16.4，15.2，11.8。实施例31：3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，苯甲酰胺(DA041)的合成

在室温下向3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸(100mg，0.18mmol)的无水二氯甲烷(5mL)溶液中加入0.1mL乙二酰氯，并在室温下搅拌所得混合物6个小时。然后加入苄胺(5mL)和三乙胺(0.2mL)并搅拌所述反应过夜。在水后处理并通过柱色谱纯化后，得到白色固体状的所需产物。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：176.4，171.6，171.2，151.5，139.7，129.2，128.3，127.9，110.0，75.1，66.0，56.2，51.3，50.8，48.7，47.3，43.9，43.0，41.3，41.2，39.0，38.6，38.3，37.6，34.6，34.3，31.5，30.0，26.2，23.7，21.8，21.6，21.5，20.1，18.5，17.2，16.7，15.1，13.5。实施例32：3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，苯甲酰胺(DA042)的合成

向3，23-双乙酰氧基-20(29)-羽扇豆烯-28-羧酸，苯甲酰胺(121mg)的THF(3mL)和甲醇(1.5mL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(1M，1.5mL)。在室温下搅拌所得混合物4个小时。在水后处理和通过柱色谱纯化后，得到白色固体状的所需产物(两步的产率为84％)。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：176.6，151.4，139.6，129.2，128.3，127.9，109.9，77.3，72.5，56.2，51.2，50.7，50.6，47.2，43.8，43.0，42.3，41.3，39.0，38.2，37.6，34.7，34.3，31.4，30.0，27.4，26.2，21.5，20.1，19.0，17.1，16.7，15.2，11.9。实施例33：由DA001合成化合物DA043

在室温下搅拌DA001(100mg)于2mL吡啶和0.5mL乙酸酐中的溶液。用乙酸乙酯稀释所述混合物，并用5％HCl(x3)、饱和碳酸氢钠(x1)、盐水(x1)洗涤，用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：172.0，171.0，170.9，170.8，170.7，170.6，170.2，167.7，150.4，110.5，104.1，98.6，82.4，74.7，72.5，71.6，70.1，69.1，68.4，67.6，65.7，63.3，58.3，51.3，49.7，48.6，47.0，42.9，42.5，41.3，39.2，38.5，37.3，36.6，34.5，32.0，30.8，30.2，26.2，26.0，22.9，21.6，21.5，21.5，21.3，21.3，21.2，20.0，18.5，17.9，17.2，16.5，15.0，13.0。实施例34：化合物DA044的合成

向DA043(80mg)于3mL THF和3mL MeOH的溶液中加入1％HCl(2mL)并在室温下搅拌所述反应过夜。用乙酸乙酯稀释所述混合物，用水(x1)和盐水(x1)洗涤，并用硫酸钠干燥。在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需产物。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃，δppm)：182.2，171.0，171.0，170.9，170.7，170.6，170.2，151.0，110.3，104.1， 98.7，82.5，74.9，72.4，71.6，70.1，69.2，68.4，67.7，65.7，63.3，56.9，51.3，49.8，48.6，47.5，42.9，42.5，41.3，39.2，39.0，37.6，37.3，34.6，32.7，31.1，30.2，26.3，26.1，21.6，21.5，21.5，21.4，21.3，21.2，19.9，18.5，17.9，17.2，16.5，15.1，13.0。实施例35：化合物DA045的合成

在氮气下，向DA044(190mg)于2mL无水二氯甲烷的溶液中加入乙二酰氯(0.2mL)，并在室温下搅拌所得混合物6个小时。将所述反应冷却到0℃，并加入苄胺(5mL)和三乙胺(0.4mL)。在搅拌过夜后，停止反应。水后处理并在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需酰胺化合物。

将所述白色产物(180mg)溶于3mL THF和1.5mL甲醇中。加入氢氧化钠水溶液(1M，1.5mL)并使所得混合物在室温下搅拌过夜。水后处理并在硅胶上通过柱色谱纯化得到白色固体状的所需酰胺产物。

¹³C NMR(75MHz，CD₃OD，δppm)：179.0，152.4，141.2，129.5，128.6，128.0，110.1，104.3，102.0，82.4，76.7，74.0，73.7，72.2，72.1，70.2，69.2，64.8，64.7，57.1，52.1，51.5，48.1，44.1，44.0，43.8，43.7，42.0，39.5，39.0，37.9，35.1，34.3，32.0，30.6，27.1，26.8，22.3，19.8，18.9，18.1，17.4，16.9，15.2，13.6。实施例36：制备化合物DA046和DA047

采用在实施例36中关于化合物DA045所述的类似方法，通过DA044与1，2-乙二胺反应来制备化合物DA046和DA047。

化合物DA046的¹³C NMR(75MHz，CD₃OD，δppm)：180.1，172.7，172.1，172.0，171.9，171.8，171.6，152.4，110.2，104.8，99.4，83.0，75.7，74.0，72.3，71.0，70.3，69.7，68.5，66.6，64.1，57.2，52.4，51.5，49.6，48.3，43.6，43.3，42.1，41.8，41.1，40.0，39.4，39.1，38.1，35.4，34.2，32.0，30.7，27.1，27.0，22.3，21.1，21.0，20.9，20.8，20.8，20.7，19.8，19.2，18.0，17.4，16.9，15.2，13.4。

化合物DA047的¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆，ppm)：176.0，150.8，109.2，102.8，99.9，79.3，74.2，72.7，72.0，70.4，70.3，68.1，67.7，64.2，62.4，54.9，50.0，49.7，46.4，46.2，42.3，41.9，40.2，38.4，37.6，36.6，36.1，33.5，32.3，30.3，28.9，25.4，25.2，20.5，19.0，17.7，17.0，16.4，15.8，14.2，12.8。实施例37：经由全细胞膜片钳DA001具有NMDA受体拮抗剂活性

如图1所示，进行全细胞膜片钳研究通过测量在中毒剂量的NMDA存在下穿过海马神经元表面的离子电流来测量DA001(10μg/ml)对NMDA受体激活的影响。所述NMDA受体是门控离子通道，其在神经脉冲期间允许电流流入。该受体的拮抗剂将阻止电流流入。DMSO用作溶剂对照。实施例38：DA001抑制大鼠初生皮层神经元中NMDA受体的活性

使用荧光成像阅读仪(FLIPR)测量NMDA受体的抑制。用NMDA处理初生大鼠皮层神经元以激活NMDA受体。响应于NMDA处理的NMDA受体激活导致Ca²⁺流入，其以相对荧光单位进行测量。如图2所示，DA001以剂量依赖方式抑制Ca²⁺流入。美金刚(一种已知的NMDA受体拮抗剂)作为阳性对照被包括。A0178和A0179是结构上相关的化合物，其与DA001分离自相同的草药。实施例39：DA001加强由突触活性诱导的钙电流

如图3所示，在37℃下，在由10mM HEPES pH 7.4、丙磺舒和钙灵敏的荧光染料Fluo4-AM(4mM)组成的缓冲溶液中温育体外9-13天的胚胎大鼠初生皮层神经元培养物(DIV)1个小时。在NMDA(1μM)存在或不存在下将DA001加入到所述细胞中。采用FLIPR监控荧光活性的变化两分钟。数据表示为相对于溶剂对照(DMSO)的响应的平均倍数±标准偏差。*表示P＜0.05，**表示P＜0.005，如t-test所计算的。实施例40：DA001诱导NMDA受体在大鼠初生皮层神经元中的剂量依赖性抑制

如图4所示，用NMDA处理初生大鼠皮层神经元中的NMDA受体并使其接触各种剂量的DA001(从10nM至10μM)。发现DA001以剂量依赖方式抑制Ca²⁺流入，具有与已知NMDA拮抗剂美金刚相当的EC₅₀。实施例41：DA001保护大鼠初生皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒

如图5所示，进行NMDA存活测试来证实DA001具有防止初生皮层神经元细胞中NMDA受体诱导的兴奋性中毒的能力。图5显示在不同浓度的DA001存在或不存在下，NMDA对皮层细胞损伤的影响。与DMSO对照相比，DA001(10μg/ml)降低了超过60％的细胞死亡。化合物A0178和美金刚分别作为阴性和阳性对照被包括。实施例42：DA001保护初生大鼠海马神经元免受NMDA兴奋性中毒

进行NMDA存活测试来证实DA001具有防止初生海马神经元中NMDA受体诱导的兴奋性中毒的能力。图6在DA001存在或不存在下，NMDA对海马细胞损伤的影响。DA001(30μM)降低了约80％的细胞死亡。实施例43：DA001防止大鼠初生皮层神经元中NMDA-诱导的兴奋性中毒

在整个免疫染色实验过程中，明显体现了化合物DA001抵抗NMDA损伤的能力。在DA001或溶剂对照DMSO(CTL)存在下观察遭受NMDA损伤的初生大鼠皮层神经元，如图7所示。NMDA损伤明显引起细胞死亡，而加入化合物DA001(10μg/ml)保护细胞免受兴奋性中毒和以类似对照细胞的水平(没有NMDA)引起细胞凋亡。实施例44：DA001显示对初生神经元没有细胞毒性影响

发现DA001的神经保护作用主要针对NMDA损伤。如图8所示，在24小时温育后研究DA001对初级皮层神经元的影响。重要的是，DA001本身在所检测的所有浓度下不诱导细胞毒性和细胞死亡。实施例45：DA001诱导大鼠初生皮层神经元中CREB的磷酸化

最近发表的研究指出NMDA受体介导的突触活性(SA)导致抗凋亡活性和神经保护。此外，已经发现低浓度的NMDA诱导长期CREB的磷酸化，而高剂量的NMDA导致CREB的瞬时磷酸化和细胞毒性。在用高剂量的NMDA处理之前用SA预处理的神经元诱导长期CREB的磷酸化。因此，研究DA001预处理的神经保护作用，其结果在图9中表示。

在尼莫地平(以阻断L-型电压激活的Ca²⁺通道)和CNQX(非-NMDA离子型受体拮抗剂)存在下，通过施用4-AP(K⁺通道阻断剂)和荷包牡丹碱(GABAA受体拮抗剂)首先引发NMDA-介导的突触活性。接下来用高剂量的NMDA(50μM)进行处理。用DA001预处理皮层神经元导致类似于SA水平的长期CREB的磷酸化。实施例46：DA001以与美金刚相当的水平抵抗NMDA损伤

如图10所示，DA001具有保护细胞免受神经毒性的NMDA受体拮抗剂活性。该抵抗NMDA诱导的损伤的能力与美金刚相当。美金刚是FDA-批准的NMDA拮抗剂，其用于临床指征，诸如阿尔茨海默病中的痴呆。对每个化合物进行剂量依赖性测试，并基于所得的剂量响应曲线测定每个化合物的对应EC₅₀。实施例47：在体内研究中新型化合物增强学习和记忆

如图11所示，使用Morris水迷宫任务来证实新型化合物对小鼠的空间学***台的水池组成。在连续几天的时期内，小鼠必须知道平台的位置，无论是采用背景线索还是位置线索。找到隐藏平台所用时间(逃避潜伏期)是对动物认知能力的测量。

对于化合物DA001，在5天的训练后，对照组的测试受试者(油/盐水)需要～30秒来发现平台。相反，在相同的训练时间后，东莨菪碱-诱导的记忆损伤组需要几乎两倍量的时间来找到平台。三个测试浓度的DA001都翻转了由东莨菪碱诱导的潜伏期增加。实施例48：新型的DA001衍生物保护大鼠初生皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒

进行NMDA存活测试来证实衍生自DA001的新型化合物具有预防NMDA受体诱导的兴奋性中毒的能力。进行NMDA存活测试来测量在NMDA损伤前用新型化合物(30μM，除了DA026为10μM外)处理时给皮层神经元细胞提供的保护程度。如图12所示，用多种衍生物进行处理降低细胞死亡到与没有用NMDA处理相当的水平。在这些衍生物中，尤其是DA021(一种具有新型结构的化合物)显示对皮层神经元对抗NMDA损伤的有前途的保护作用。实施例49：新型衍生物DA021保护大鼠初生皮层神经元免受NMDA兴奋性中毒

测试衍生自DA001的化合物抑制NMDA-诱导的兴奋性中毒的能力。在新型衍生物存在和不存在下，使初生皮层神经元遭受NMDA损伤。如图13所示，DA002和DA021与DA001相比均显著降低细胞死亡。实施例50：DA001调节海马神经元的脊形态发生

如图14所示，使用磷酸钙沉淀用EGFP(绿色荧光蛋白)构建体转染7DIV的海马神经元。然后用30μM DA001或媒介物对照(DMSO)处理表达GFP的神经元(14DIV)24个小时。在共聚焦显微镜下研究海马神经元树突的脊形态。与对照(DMSO)相比，DA001显著增加脊密度和大脊(头＞1um)的数量，而丝状伪足的数量显著降低。N＝20，**表示P＜0.005。

在海马神经元中鉴定两类脊：成熟的脊和丝状伪足(不成熟的脊)。当神经元细胞接触DA001时，经DA001-处理的神经元展示脊密度的百分比增加，尤其是头大于1μm的脊。而且，与对照相比丝状伪足的频率降低。实施例51：DA001调节皮层神经元中轴突的发育

在早期神经元分化期间，轴突和树突由神经元细胞体延伸。轴突将靶向另一个神经元的树突以形成突触。涉及轴突的适当延伸的过程对神经回路的形成是重要的。为了研究在该过程中DA001的影响，用该化合物处理新鲜分离的神经元并研究和定量轴突的延伸。DA001显著促进在这些培养物中轴突的长度。

如图15所示，用溶剂对照(DMSO)或DA001(30μM)处理分离的皮层神经元(0DIV)两天。然后固定细胞并用抗-Tau抗体染色。在Olympus共聚焦显微镜下获得图像。计算和定量轴突的长度(Tau-阳性细胞)。比例尺：50μm。*＝P＜0.01。实施例52：DA001保护神经元抵抗不同浓度的NMDA

用DA001预处理皮层神经元，然后接触不同浓度的NMDA。然后进行存活测试来确定DA001有效保护神经元细胞免受NMDA-诱导的兴奋性中毒的能力。如图16所示，在用DA001预处理后，在高浓度的NMDA下，细胞死亡与对照DMSO相比显著下降。

如图16所示，用DA001(30μM)或对照(DMSO)温育皮层神经元24个小时，然后用不同浓度的NMDA(1-200μM)处理20分钟。然后测量释放到培养基中的LDH。实施例53：DA001保护神经元免受谷氨酸损伤

谷氨酸是激活NMDA受体的神经递质。用DA001预处理皮层神经元，然后接触不同浓度的谷氨酸(5-200μM)。然后进行存活测试来确定DA001有效保护神经元细胞免受兴奋性中毒的能力。如图17所示，在用DA001预处理后，在高浓度的谷氨酸下，细胞死亡与对照DMSO相比显著下降。

如图17所示，用DA001(30μM)或对照(DMSO)温育皮层神经元24个小时，然后用不同浓度的谷氨酸(5-200μM)处理20分钟。然后测量释放到介质中的LDH。实施例54：DA001降低缺血性大脑的梗塞大小和水肿

进行MCAO(中颈动脉阻塞模型)来研究当大脑暴露于瞬时病灶性缺血(或缺氧)诸如在中风过程中DA001对大脑的保护作用。测量在缺血后6个小时用该化合物处理的受试者的大脑半球脑肿胀和梗塞体积(由血供应不足引起的死亡组织面积)并与对照组的进行比较。在缺血性病症过程中，DA001有效降低梗塞体积(由血供应不足引起的死亡组织面积)和水肿程度。

如图18所示，在缺血后6个小时给予(P.O.)DA001(12.6mg/kg和42mg/kg)能分别显著降低在MCAO大鼠中总的梗塞和水肿程度。实施例55：DA001诱导NMDA治疗后的BDNF表达

用DA001预处理皮层神经元，然后遭受NMDA损伤，此后，在治疗后的不同时间间隔时提取总的RNA。在6个小时的温育时间后，BDNF的表达增加了5倍。在用DA001处理后，BDNF的表达维持在对照(DMSO)的～3-4倍为12-24个小时。

如图19所示，用DA001或DMSO温育皮层神经元24个小时，然后用NMDA(20μM)或水处理20分钟。提取总的RNA，然后进行cDNA合成。针对看家基因(home gene)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对基因表达进行标准化。由DA001+H₂O和DA001+NMDA诱导的基因表达的相对变化分别与对照DMSO+H₂O和DMSO+NMDA进行比较。实施例56：在NMDA处理后，DA001诱导BDNF和NT-3的表达但不诱导Bcl-2或c-fos

用DA001预处理皮层神经元，之后使所述细胞遭受NMDA损伤。在三次不同的时间间隔测量BDNF的表达并与NT-3、Bcl-2和c-fos的表达比较。DA001诱导BDNF和NT-3的表达，但在相同条件下不诱导bcl-2或c-fos。

如图20所示，用DA001或DMSO对照温育皮层神经元24个小时，然后用NMDA(20uM)或水处理20分钟。针对看家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对基因表达进行标准化，并与用NMDA处理的对照(DMSO)进行比较。由DA001+NMDA诱导的基因表达的相对变化与DMSO+NMDA进行比较。实施例57：DA001抑制黑质皮素与MC1和MC4受体的结合

针对109个受体结合测试和17个酶测试来评价DA001，所述测试由选择性的、中枢和外周治疗相关靶组成。进行放射性配体竞争测试法从而在一个浓度(10μM)下测试DA001(一式两份)。DA001显著抑制对黑皮质素-1(MC1)和黑皮质素-4(MC4)受体的黑质皮素结合(基于制造商关于在50％的抑制下的阈值的指南)。其能与放射性配体[¹²⁵I-NDP-α-黑素细胞-刺激激素(α-MSH)]竞争与MC1和MC4的结合，但不竞争与MC3和MC5以及相关家族-黑色素聚集激素受体(MCH1和MCH2)的结合。对于红藻氨酸盐、褪黑激素(MT₁)和5-羟色胺(5-HT₁₀亚型)受体也观察到了DA001的中等至轻度的抑制。表2

结合测试	％对照特定结合的抑制	靶
			MC1	64	黑皮质素
MC3	12	黑皮质素
			MC4	59	黑皮质素
MC5	11	黑皮质素
			MCH1	-9	黑色素聚集激素
MCH2	-12	黑色素聚集激素
			红藻氨酸盐	35	红藻氨酸盐
MT1	28	褪黑激素
			5-HT1D	30	5-羟色胺

为了测定DA001抑制α-MSH与MC1和MC4受体结合的IC₅₀，通过剂量依赖性研究进一步表征所述化合物。在MC1和MC4受体结合测试中评价了8个浓度的DA001。DA001显示了对于MC1和MC4而言IC₅₀分别为10μM和6.8μM。表3

图21显示DA001对人MC1或MC4受体获得的竞争曲线。与该受体结合的特异性配体被定义为在过量未标记的配体的存在下测定的总的结合和非特异性结合之间的区别。结果表示为在DA001存在下获得的对照特异性结合的百分比[(所测量的特异性结合/对照特异性结合)x100]和对照特异性结合的抑制百分比{100-[(所测量的特异性结合/对照特异性结合)x100]}。通过竞争曲线的非线性回归分析确定IC₅₀值(引起对照特异性结合最大抑制达一半的浓度)和Hill系数(nH)，所述竞争曲线由平均的重复值采用Hill等式曲线拟合(Y＝D+[(A-D)/(1+(C/C50)nH)]，其中Y＝特异性结合，D＝最小的特异性结合，A＝最大的特异性结合，C＝化合物浓度，C50＝IC₅₀，和nH＝斜率因子)产生。采用Cerep(Hill software)开发的软件进行分析，并通过与商业软件SigmaPlot 4.0 for Windows ( 1997by SPSS Inc.)产生的数据比较来验证。实施例58：DA001对MC4受体的拮抗作用

为了确定DA001对配体与MC4受体结合的抑制作用是由激动作用还是拮抗作用引起，在这些特异性结合的测试中在一个浓度下评价DA001。DA001显示在α-MSH存在下对环AMP诱导25％的抑制，然而仅DA001不能引起cAMP对MC4受体的增加。表4

MC4受体	cAMP测量
		激动剂影响	-1
拮抗剂影响	25

如表4所示，DA001显示对MC4受体的中等拮抗作用。用过表达人MC4受体的细胞对DA001(10μM)进行配体结合测试。结果表示为在DA001存在下获得的对照特异性激动应答的百分比[100-(所测量的特异性激动应答/对照特异性激动应答)x100]。实施例59：研究DA001作为抗抑郁剂的影响

为了研究DA001用作抗抑郁剂的效力，使用强迫游泳测试(FST)来评价DA001的影响并与抗抑郁剂丙咪嗪比较。与媒介物对照相比，DA001显著降低FST中小鼠的不动时间。

如图22所示，在游泳训练之前给小鼠口服施用DA001(100mg/kg)。溶剂(CTL)和丙咪嗪(15mg/kg)分别用作阴性和阳性对照。测量结果计算为不动时间(sec)的平均值。实施例60：测试、检测和试验全细胞膜片钳

由18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠制备海马神经元。在从大脑取出海马体后，将分离的细胞以3x10⁵细胞/盘的密度置于多聚 d-赖氨酸(Poly d-Lysine)(PDL)(P0899，Sigma)-涂覆的35mm盘(153066，NUNC)上，使用含有B27增补物(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸(25030，Gibco)的神经基质培养基(NB)(21103-049，Gibco)。在37℃下，在空气中含5％CO₂的潮湿气氛中温育细胞培养物。用NB，B27和50μM L-谷氨酸每2-3天替换一半培养基。在体外的第12天(12DIV)时，进行全细胞膜片钳。内液含有120mM氯化铯、20mM四乙基氯化铵、2mM氯化镁、1mM氯化钙和10mM HEPES(pH 7.2)。外液含有137mM氯化钠、1mM碳酸氢钠、0.34mM磷酸氢二钠、5.37mM氯化钾、0.44mM磷酸二氢钾、2.5mM HEPES(pH 7.4)和22.2mM葡萄糖。以至多8个单独的控制管(List Medical，Germany)的线性阵列安排与50μM NMDA(M3262，Sigma)混合的样品，所述控制管与溶液储库相连。美金刚(10μM，M9292，Sigma)用作阳性对照。移液管用火焰磨光以产生3-5MΩ的移液管电阻。将细胞碎片的保持电位维持在-80mV并使用Axopatch-200B放大器(Axon Instruments，USA)记录电流。河豚毒素(5μM)和甲碘荷包牡丹碱(20μM)(0109，Tocris)存在于槽液中以阻断分别由电压门控钠离子通道和Ca²⁺-激活的钾离子通道介导的突触传递。用pClamp9软件分析数据并相对于溶剂对照表示NMDA-诱导的电流的抑制百分比。神经元培养物和针对NMDA损伤的神经元纯化测试

由18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠(E18)制备初生的皮层和海马神经元。将神经元以2x10⁵细胞/孔的密度置于24-孔板(TPP，Corning)，使用补充有2％B27(Invitrogen)的神经基质培养基(Invitrogen)。对体外第11-12天的神经元(12DIV)进行药物治疗。在NMDA处理前，用测试化合物预处理神经元2个小时。加入0.1μM(+)-MK-801 Hydrogen Maleate(Sigma)作为阳性对照。简言之，用不含Mg²⁺的Locke′s溶液(在Milli-Q水中5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM正磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖)清洗所述神经元，并加入甘氨酸(10μM)温育15分钟。在温育后，用测试化合物(溶于Locke′s+甘氨酸溶液)和NMDA(20μM；Sigma)共同处理所述神经元20分钟。用Locke′s+Mg²⁺清洗神经元并用新鲜的生长培养基替代。在24小时后，使用乳酸脱氢酶释放测试法(Roche)分析和定量细胞死亡。在皮层神经元培养物上进行NMDA受体活性测试(FLIPR)

从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠提取皮层，并在不含Mg²⁺和Ca²⁺的冷Hanks溶液中解离。将细胞以3x10⁴/孔置于底透明的涂覆有聚赖氨酸的96-孔黑板(BD Bioscience)上。培养物在补充有0.2％B27(v/v)(Invitrogen)的神经基质培养基中生长。体外9天(9DIV)至13DIV的培养物用于NMDA受体活性测试。在测试当天，在37℃下，在由10mM HEPES pH 7.4、丙磺舒和钙灵敏的荧光染料Fluo4-AM(Molecular Probes)(4mM)组成的平衡盐缓冲溶液中温育初生培养物1个小时。然后将细胞与对应的药物板一起置于荧光成像阅读仪(FLIPR，Molecular Devices)上。FLIPR自动地将测试化合物以50μl/秒的注射速率转移到孔中。然后通过荧光染料监控钙离子从细胞外膜移动到细胞内膜，监控2分钟。使用初生神经元培养物的FLIPR测试法

从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠提取海马体，并在不含镁和钙的冷Hanks溶液中解离。将细胞置于底透明的涂覆有聚赖氨酸的96-孔黑板(BD Bioscience)上。培养物在补充有0.2％B27(v/v)(Invitrogen)的神经基质培养基中生长。体外9至13天的培养物用于NMDA受体活性测试。在测试当天，在37℃下，在由10mM HEPES pH7.4、丙磺舒和钙灵敏的荧光染料Fluo4-AM(Molecular Probes)(4mM)组成的缓冲溶液中温育初生培养物1个小时。然后将细胞置于FLIPR(Molecular Devices)上，之后在NMDA存在或不存在下向所述细胞加入测试化合物。监测荧光活性的变化2分钟。数据表示为与溶剂(DMSO)对照相比的应答倍数。美金刚用作对照。在NMDA损伤后神经元的免疫细胞化学分析。

从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠(E18)制备初生的皮层和海马神经元。将神经元以1x10⁶细胞/板的密度置于35-mm盘(NUNC)上，采用补充有2％B27(Invitrogen)的神经基质培养基(Invitrogen)。用所述测试化合物处理体外1-12天(DIV)的神经元。在NMDA处理前，用所述测试化合物预处理神经元2个小时。加入0.1μM(+)-MK-801 Hydrogen Maleate(Sigma)作为阳性对照。简言之，用不含Mg²⁺的Locke′s溶液(在Milli-Q水中5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM正磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖)清洗所述神经元，并加入甘氨酸(10μM)温育15分钟。在温育后，用测试化合物(溶于Locke′s+甘氨酸溶液)和NMDA(20μM；Sigma)共同处理所述神经元20分钟。用Locke′s+Mg²⁺清洗神经元并用新鲜的生长培养基替代。在培养基中温育24个小时后，室温下用4％多聚甲醛固定神经元20分钟，透化并用4％山羊血清和0.4％TritonX-100封闭。通过在4℃下用对β微管蛋白同种型III(1∶1000；Sigma)特异性的鼠单克隆抗体温育神经元过夜，然后用FITC-缀合的山羊抗-小鼠抗体(1∶1000；Invitrogen)进行双重染色。用DAPI(1∶5000)对神经元进行复染色以在封固前显现细胞核。然后通过荧光显微镜用40X物镜(DMRA；Leica)分析神经元。用RT Slider数码相机(#2.3.1，Diagnostics Instruments)获得免疫荧光图像，用SPOT软件(Diagnostics Instruments)收集并准备用于Adobe 表示。细胞毒性测试

进行细胞毒性测试以研究本发明对初生神经元的影响。在补充有2％B27和青霉素/链霉素溶液(Invitrogen)的神经基质培养基中培养从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠中分离的皮层神经元。在B27不存在下，用不同浓度的本发明来处理在培养物中7天的初生神经元(7DIV)，持续24个小时。乳酸脱氢酶(LDH)被释放到培养基中，测量并计算为相比于1％Triton X-100的百分比。在所有溶剂对照中检测到LDH的基本水平为约20％，对于DA001没有观测到显著毒性，包括在70μM的最大剂量下。蛋白质印迹检测CREB的磷酸化

对18天的胚胎Sprague Dawley大鼠幼崽进行斩首并取出它们的大脑，并分离皮层。粉碎组织并将分离的神经元置于60mm的板上，用补充有2％B27(Invitrogen)的神经基质培养基培养。在体外10-12天(DIV)后进行实验。在刺激前30分钟将培养的细胞从组织培养基转移到含1μM河豚毒素(TTX)的HEPES灌流液。用测试化合物或媒介物对照(DMSO)或突触活性混合物(荷包牡丹碱，50μM；4-氨基吡啶，200μM；尼莫地平，5μM；6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮，10μM)刺激细胞10分钟，并转移到含1μM TTX的灌注液中。然后在不同时间间隔用热(95℃)3X SDS样品缓冲溶液裂解细胞并在使用前在-80℃下贮藏。在上样前，将裂解物加热到95℃，持续10分钟，进行涡悬并在15,000xg下离心7分钟。提取物在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并转印至硝酸纤维素膜上。用溶于含0.1％TritonX-100的PBS中的5％(w/v)奶粉洗涤所述膜，然后在4℃温育过夜，其中兔多克隆抗-CREB在Ser 133处磷酸化(1∶1000，Cell SignalingTechnology)。接下来，洗涤所述膜并用辣根过氧化酶(HRP)-缀合的二抗温育。采用ECL蛋白质印记试剂盒显现信号。印记是条状的并探测总的CREB表达。Morris水迷宫

6-8周龄，重25-35g的远交雄性I.C.R.小鼠豢养在12个小时光/黑暗循环的环境控制的动物房间(23-25℃)中，两只/笼。所述动物可随意获得水和食物。把用于实验的小鼠带到具体的实验环境下，为期两天。所有的实验在14:00至18:00之间进行。将氢溴酸东莨菪碱(Sigma，USA)以0.1mg/kg溶于盐水中，并以10ml/kg体重的体积给予。将实验小鼠随机分配成4或6组，每一组由12只具有相似平均体重和年龄的小鼠组成。每天在实验前将所述测试化合物溶于生理盐水中。在游泳任务之前的30分钟通过腹膜内注射(i.p.)给予东莨菪碱(0.1-4mg/kg)以诱导记忆缺陷。在任务的第一天开始口服给予(p.o.)样品(0.1、0.2、0.4、30和100mg/kg)或其盐水(0.9％NaCl)，并根据10ml/kg体重的体积给予。在游泳任务之前45分钟进行口服给药并连续进行4天直到任务结束。

每只小鼠每天进行4次实验，连续进行5天。当保持面向池壁的小鼠浸入水中时，实验开始。然后让小鼠寻找平台60秒。如果小鼠在该时间段内没有逃脱，带领小鼠并将其置于平台上。无论小鼠是否找到平台，其在平台上停留20秒。在试验之间有30秒的恢复时期。从离平台最远的两个点(北边和西边)开始这4次试验。在第五天的行为测试(一个实验)中在60秒内评定探索实验(没有平台)，并用计算机记录在训练期间设置了逃生平台的西南象限中所花的时间，并表示为空间盲点的百分比。

因为在行为实验中小鼠的潜伏期和游泳距离显示相似的组间差异，只有在水迷宫中发现平台的潜伏期被用于评价所测试的小鼠的记忆功能。采用重复测量数据的双因素方差分析(two-way ANOVAwith repeated measures)来分析潜伏期值，并计算为每只小鼠的平均潜伏期。(通过使用双因素方差分析数据表示为平均±S.E.M.)。采用单因素方差分析然后Duncan多重比较(Duncan′smultiple-range test)(数据表示为平均±S.E.M.*P＜0.05和**P＜0.01相对东莨菪碱)来分析在探索实验期间收集的数据的组差异。脊的定量

从18天的胚胎大鼠制备培养的海马神经元并接种在涂覆有多聚D-赖氨酸(poly-D-lysine)的18mm盖玻片上。然后在补充有2％B27(Invitrogen)和0.5mM谷氨酸的神经基质培养基中生长神经元。为了显现树突脊的形态，采用磷酸钙沉淀用GFP DNA构建体转染7-9DIV的神经元。为了研究树突脊的发育，用DA001在14 DIV处理所述神经元。然后用4％多聚甲醛固定神经元并使用共聚焦显微镜研究形态。为了定量培养的海马神经元中的脊密度，使用60x物镜收集一堆图像(zstep，0.5μm)。合并图像并用MetaMorph软件(UniversalImaging Corp)分析。记录树突脊(定义为距树突表面至少0.5μm的突出物)并表示为每多少m的树突长度。随机选择来自每个神经元的三个树突并以双盲的方式定量。对于每个实验条件，分析来自3个独立实验的20至30个神经元。数据表示为平均±SEM。定量神经突的延伸

从18天的胚胎大鼠制备培养的海马神经元并接种在涂覆有多聚赖氨酸(poly-D-lysine)的18mm盖玻片上。然后在补充有2％B27(Invitrogen)的神经基质培养基中生长神经元。将DA001加入到ODIV培养的细胞中并温育48个小时。然后用4％多聚甲醛固定神经元并用抗-Tau抗体和抗-MAP2抗体进行免疫染色，所述抗-Tau抗体和抗-MAP2抗体分别检测轴突和树突。使用共聚焦显微镜研究形态。用MetaMorph Ver 5.0r1软件(Universal Imaging Corp.)追踪最长的轴突的长度。对于每个测试，对来自随机选择的区域和n＝3培养物的至少50个细胞进行计算。每个实验重复3次。针对NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)兴奋性中毒的皮层神经元存活测试

从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠制备皮层神经元。在从大脑中提取皮层后，将分离的细胞以2x10⁵细胞/孔的密度置于多聚赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)-涂覆的48孔板(150687，NUNC)上，使用含有B27增补物(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸(25030，Gibco)的神经基质培养基(NB)(21103-049，Gibco)。在37℃下，在含5％CO₂的空气的潮湿气氛中温育细胞培养物。在3个小时后，将培养基换成生长培养基(含青霉素/链霉素和B27增补物的神经基质培养基)。用生长培养基每2-3天替换一半培养基以维持细胞直到体外第10天(10DIV)。在生长培养基中制备系列稀释的样品并将0.1μM(+)-Hydrogen Maleate(MK-801)(M-107，Sigma)用作阳性对照。对于预处理测试，从孔中除去一半培养基，并用等量的稀释样品替代。然后，在37℃下，在含5％CO₂的空气的潮湿气氛中温育细胞2个小时。然后用Locke′s溶液(在Milli-Q水中5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM正磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖)洗涤培养物，然后在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)(M-3262，Sigma)处理前，在甘氨酸(10μM)存在下用Locke′s溶液温育15分钟。然后替代溶于Locke′s+甘氨酸溶液的NMDA(20μM)并在37℃下温育20分钟。对于共同处理的NMDA测试，在Locke′s溶液+甘氨酸和20μM NMDA溶液中制备系列稀释的样品，并在37℃下，在5％CO₂的下温育20分钟。之后，在生长培养基中温育细胞18-24小时并用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche)检测。针对谷氨酸兴奋性中毒的皮层神经元存活测试

从18天的胚胎Sprague-Dawley大鼠制备皮层神经元。在从大脑中提取皮层后，将分离的细胞以2x10⁵细胞/孔的密度置于多聚赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)-涂覆的48孔板(150687，NUNC)上，使用含有B27增补物(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸(25030，Gibco)的神经基质培养基(NB)(21103-049，Gibco)。在37℃下，在含5％CO₂的空气的潮湿气氛中温育细胞培养物。在3个小时后，将培养基换成生长培养基(含青霉素/链霉素和B27增补物的神经基质培养基)。用生长培养基每2-3天替换一半培养基以维持细胞直到体外第10天(DIV10)。在生长培养基中制备系列稀释的样品并将0.1M(+)-Hydrogen Maleate(MK-801)(M-107，Sigma)用作阳性对照。对于预处理测试，从孔中除去一半培养基，并用等量的稀释样品替代。然后，在37℃下，在含5％CO₂的空气的潮湿气氛中温育细胞2小时。然后用Locke′s溶液(在Milli-Q水中5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM正磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖)洗涤培养物，然后在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)(M-3262，Sigma)处理前，在甘氨酸(10μM)存在下用Locke′s溶液温育15分钟。然后替代溶于Locke′s+甘氨酸溶液的NMDA(20μM)并在37℃下温育20分钟。对于共同处理的NMDA测试，在Locke′s溶液+甘氨酸和20μM NMDA溶液中制备系列稀释的样品，并在37℃下，在5％ CO₂下温育20分钟。之后，在生长培养基中温育细胞18-24小时并用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche)检测。中颈动脉阻塞模型(Middle Carotid Artery Occlusion Model)

以8只每组豢养Sprague Dawley大鼠(8-周龄和300g)，可随意获得水和标准的喂鼠饲料，并在20℃的温度和07:00-19:00的光循环的控制条件下饲养。在09:00-12:00之间进行实验。根据关于实验室动物的照料和使用的地方机构指南进行研究设计和实验方案。所述测试化合物溶于蒸馏去离子水中以给予4ml/kg的腹膜内注射体积。使用腔内技术(intraluminal technique)来诱导瞬时病灶性缺血，其中将细丝从普通的颈动脉引入到颈内动脉并进到动脉循环中，由此使大脑中动脉闭塞。在诱导缺血后两个小时，除去细丝并允许再灌注持续22个小时。然后在不同时间以不同剂量给予所述新型化合物。

为了鉴定所述新型化合物对受试者的潜在保护或有害作用，采用四分制的神经评分***(Mann Whitney Utest)。在22小时再灌注后观察神经学缺损的严重程度：(0)没有观察到神经学缺损(正常)；(1)不能完全延伸左前爪(轻度的)；(2)环绕到对侧(中等)；和(3)不能行走和翻正反射(严重的)。

然后通过颈脱位法处死大鼠，并将大脑沿冠状面切成五片，每一片2-mm厚，通过将整个大脑从前部向尾部放置在大脑模具上。在37℃下，所述切片用2％2，3，5-三苯基氯化四唑(TTC)(Sigma，USA)在黑暗中染色10分钟，并用10％***的磷酸盐缓冲溶液[pH7.4]固定过夜。用成像分析程序(Sigma Scan Pro 5.0，StatisticsPackage for the Social Sciences；SPSS，Inc.，Chicago，IL，U.SA.)分析每个后面(posterior surface)的梗死面积。计算梗死面积和体积的百分比并表示为对侧大脑半球的梗塞面积的百分比，以消除水肿对缺血性病变的贡献。如下计算大脑半球肿胀(同侧体积-对侧体积)/对侧体积X 100％。用Mann-Whitney Utest确定结果的统计学显著性，且P＜0.05被认为是显著的。值表示为±SEM。RNA提取，cDNA合成和实时定量PCR

用DA001或DMSO预温育11DIV-12DIV的皮层神经元24 个小时。用不含镁的Locke′s培养基洗涤细胞15分钟，然后用NMDA(20μM)或水处理20分钟。用正常的生长培养基温育神经元，并在处理后的不同的时间间隔提取总RNA。根据制造商的说明采用RNeasyMini kit(Qiagen)来提取总RNA，并用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)和oligo-dT引物将所述总RNA逆转录到单链cDNA中。采用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在Mx3000P实时PCR***(Stratagene)上进行定量PCR。在95℃下以10-分钟的变性步骤开始热循环，然后进行95℃下30秒，60℃下1分钟和72℃下30秒的循环40个。在反应结束时，对终产物进行熔融曲线(Meltcurve)检测。针对看家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对基因表达的调节进行标准化。实时PCR引物如下：BDNF正向：TTGAGCACGTGATCGAAGAGBDNF反向：CCAGCAGAAAGAGCAGAGGANT-3正向：GGGGGATTGATGACAAACACNT-3反向：ACAAGGCACACACACAGGAABcl-2正向：ATAACCGGGAGATCGTGATGBcl-2反向：CAGGCTGGAAGGAGAAGATGc-fos正向：GGAGCCGGTCAAGAACATTAc-fos反向：TGCTGCATAGAAGGAACCAGHPRT1正向：TGACACTGGTAAAACAATGCAHPRT1反向：GGTCCTTTTCACCAGCAAGCTGAPDH正向：TGCACCACCAACTGCTTAGCGAPDH反向：GGCATGGACTGTGGTCATGAG强迫游泳测试(FST)

使用5周龄，重22-26g的远交雄性I.C.R.小鼠。小鼠可以自由获得食物(喂鼠饲料#2053，5g/小鼠/天)和水。笼子的地板铺有刨花，并每周处理小鼠一次同时清扫笼子。将小鼠随机分配到3个组：第1组-DA001；第2组-媒介物；第3组-丙咪嗪。每组小鼠的数量大约为10只。为了帮助适应新的环境，至少在测试前一周将小鼠从核心动物设施转移到测试区域。在早上的9:00am至12:00pm之间进行所有的实验训练。简言之，将小鼠置于30cm高和直径为11.5cm的耐热玻璃圆筒中。将小鼠置于有水(10cm)的圆筒中直到它们在6-分钟的时帧内不能接触到底部的程度。采用Etho- XTMobility detection，Noldus进行FST实验。该参数可用于对Porsolt游泳测试(PST)中的动物行为进行自动评分。在游泳训练前24个小时和45分钟口服给予DA001。在测试前12个小时内小鼠被禁食。

虽然出于清楚理解的目的已经以说明和举例方式详细地描述了前述发明，本领域的技术人员将理解某些变化和改变可以在所附权利要求的范围内实践。此外，本文提供的每一篇参考文献以其整体通过引用并入，其程度如同每一篇参考文献单独通过引用并入。

Claims

1.式(I)的化合物：

或其药学可接受的盐；其中

R¹、R³、R⁴和R⁵各自为甲基；

R²选自-CH₂OH，-CH₂OAc，-CH₂OTBS，CHO，CH＝NOH，和-CH₂NHBn；

A是C＝O；

R⁶选自-CH₂OH，CHO，CH＝N-OH，-CH₂OAc，和-CH₂NHCH₂Ph；和

R⁷选自2-丙烯基、异丙基和

2.根据权利要求1的化合物，其中R²是-CH₂OH。

3.根据权利要求1的化合物，其中R²选自-CH₂OH、-CH₂OAc、-CHO、-CH＝NOH和-CH₂NHBn。

4.根据权利要求1的化合物，其中R⁶选自-CH₂NHCH₂Ph、-CHO和-CH₂OAc。

5.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有选自下述的式：

6.一种药物组合物，所述组合物包括：根据权利要求1-5中任何一项的化合物和药学可接受的载体或赋形剂。

7.一种用于治疗或预防哺乳动物的中枢神经***的疾病或障碍的药物组合物，所述组合物包括：权利要求1的化合物以及药学可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1的化合物在制备用于抑制NMDA受体活性的药物中的用途。

9.根据权利要求8的用途，其中所述NMDA受体是激活的谷氨酸受体。

10.权利要求1的化合物在制备用于治疗哺乳动物的神经变性疾病或神经病理学病症的药物中的用途。

11.根据权利要求10的用途，其中所述疾病选自肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病。

12.根据权利要求10的用途，其中所述病症选自神经性疼痛、中风、脑损伤和癫痫症。

13.权利要求1的化合物在制备用于提高哺乳动物的大脑认知功能的药物中的用途。

14.权利要求1的化合物在制备用于防止哺乳动物在应激条件下神经元损伤的药物中的用途。

15.根据权利要求14的用途，其中所述应激条件是中风。

16.权利要求1的化合物在制备用于抑制MC受体活性的药物中的用途。

17.根据权利要求16的用途，其中所述MC受体是MC1或MC4受体。

18.权利要求1的化合物在制备用于治疗哺乳动物中忧郁、焦虑和由慢性疾病诱导的恶病质的药物中的用途。

19.根据权利要求18的用途，其中所述慢性疾病选自癌症、AIDS、肾衰竭、肝功能衰竭、充血性心力衰竭和肺病。

20.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有如表1所述的结构

21.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有如表1所述的结构

22.权利要求8，10，13，14，16或者18的用途，其中所述的化合物具有式