CN101718696A - 激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，盖玻片或样品池置于X-Y扫描平台上，显微镜物镜安装在Z向***上，扩束的激光经激发滤光片过滤，再经双色镜反射进入物镜，经物镜聚焦后照射到盖玻片上方的样品中，样品产生荧光经同一物镜收集穿过双色镜并经发射滤光片滤掉杂散光，然后经聚焦透镜聚焦到与单光子检测器耦合的小孔，单光子检测器产生的信号经数据采集卡进入计算机。计算机内三维纳米位移和定位***控制软件控制X-Y扫描平台发生X-Y二维平动，Z向***控制物镜焦点发生Z向移动形成对样品的三维扫描。***记录的三维空间位置信息和单光子检测器产生信号在计算机内构建出三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

Description

激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪

技术领域

本发明涉及一种激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，是一种将激光共聚焦扫描成像(Laser Confocal Scanning Imaging)与荧光相关光谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS)技术联用的装置，用于生命科学、化学、物理学等领域中的荧光扫描成像和单分子探测研究，属生命科学、分析化学检测技术以及光学仪器领域。

背景技术

细胞是生命活动的基本单位，也是目前人类对生命活动进行调控的最小单元。但细胞却又是一个非常微小而复杂的生物体系。一个简单细胞的直径仅有几个微米到几十个微米，但其中却含有成千上万种不同大小分子。每种分子与细胞中的其它分子一起参与大量的化学反应，而使自然界表现出***、缤彩夺目的生命现象。因此，了解细胞内物质的组成及化学反应原理和过程是揭示生命奥秘的必由之路。由于生物组织的不均匀性，同种细胞的大小、形状、生物活性及生理状态等均有差异。如在癌症发展过程中，由于外界因素的影响导致同种细胞间蛋白组分差异越来越大，而最终破坏细胞的正常功能，导致癌症的发生。而目前通常采用的细胞群体分析方法(系综分析法)获得的细胞的平均化学信息，往往掩盖了单个细胞之间的差异，使得生物学及医学等很多领域的发展受到限制。单细胞分析通过对单个细胞发生的生物、化学过程进行动态地跟踪，实现原位、实时分析，进而阐释生命现象的奥秘。而基于荧光显微技术发展起来的单分子检测技术如荧光相关光谱是目前进行单细胞研究的几种重要手段之一。

荧光相关光谱通过测定激光高聚焦的检测微区内(通常＜10^-15L)荧光分子由于布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落(荧光强度的明暗变化)，并对这种随时间变化的荧光涨落信号进行相关函数分析，从而对细胞检测区域内分子浓度变化以及分子的运动行为进行研究的一种单分子检测技术。它是目前用于单细胞分析中最有前途的几种方法之一。譬如用于研究细胞内部大分子的迁移运动，酶活性分析，钙调素蛋白(calmodulin)和激酶II(CaMKII)的结合作用，甚至对IgE受体FcεRI和激酶Lyn的结合作用所引发的细胞内部磷酸化过程进行了***研究等。如Carl Zeiss公司的ConfoCor II共聚焦荧光扫描***在对细胞进行三维扫描成像的同时，也具有荧光相关光谱单分子探测分析的功能。这些***在进行三维扫描成像时，通常采用动光模式来实现样品的三维扫描成像，即采用扫描镜来改变光路从而改变聚焦点位置，实现对细胞的三维扫描和定位分析。这种工作模式的共聚焦荧光扫描***在技术上存在一些不可避免的缺陷。首先，其扫描精度和回复性都较低(几百个纳米)。其次，在对非物镜焦点位置进行扫描时会产生光学变形(非物镜焦点区的光学构型已不再具有三维高斯分布)，导致在扫描成像后进行原位的荧光相关光谱单分子探测定量分析的准确度较差，获得的荧光相关光谱信息具有较大的偏差(如在非物镜焦点区分析时检测微区大小，形状的变化等)。这些因素都极大地影响了这种共聚焦荧光扫描***在单细胞分析中的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，设计提供一种激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，能有效消除扫描过程中聚焦区光学构型的变化对荧光相关光谱单分子探测的影响，提高荧光相关光谱单分子检测定量分析的准确性，特别适合单细胞的研究。

为实现上述目的，在本发明的技术方案中，以激光为激发光源，以激光共聚焦构型为主体光学结构，选用高数值孔径的显微镜物镜作为光学收集元件，针孔作为空间滤波元件。激光荧光扫描***的光路保持不变，采用单光子检测器将荧光信号转换为电信号，数据采集卡用于数据采集和实时分析。采用精确的三维纳米位移和定位***来控制样品的载物台，实现对样品的X，Y二维扫描控制和物镜的Z向控制，进行样品的三维扫描，提高荧光相关光谱单分子检测定量分析的准确性。

本发明单分子探测仪的具体结构包括第一激光器，第二激光器，第一中性衰减片，第二中性衰减片，第一激光准直扩束镜，第二激光准直扩束镜，第一激发滤光片，第二激发滤光片，第一双色镜，全反射铝镜，激光激发光束，第二双色镜，Z向***，显微镜物镜，盖玻片(或样品池)，X-Y扫描平台，载物台，控制器，第三双色镜，第一发射滤光片，第一聚焦透镜，第一针孔，第一单光子检测器，第二发射滤光片，第二聚焦透镜，第二针孔，第二单光子检测器，探测仪基座，数据采集卡，计算机，X-Y扫描平台安装在显微镜载物台上，显微镜物镜安装在Z向***上，载物台和Z向***安装在探测仪基座上，控制器通过连接电缆与X-Y扫描平台和Z向***连接，并通过连接电缆与计算机连接，盖玻片(或样品池)置于X-Y扫描平台上，样品液滴置于盖玻片(或样品池)上，第一激光器与第一激光准直扩束镜之间安置第一中性衰减片，第二激光器与第二激光准直扩束镜之间安置第二中性衰减片，第一激光准直扩束镜的输出光路上依次设置第一激发滤光片和第一双色镜，扩束的激光经第一激发滤光片过滤后穿过第一双色镜再经第二双色镜反射进入显微镜物镜；第二激光准直扩束镜的输出光路上依次设置第二激发滤光片和全反射铝镜，扩束的激光经第二激发滤光片过滤后经全反射铝镜反射和第一双色镜反射，再经第二双色镜反射进入显微镜物镜，经显微镜物镜聚焦后照射到盖玻片或样品池上方的样品液滴中，样品液滴被激光激发出的荧光经过显微镜物镜收集穿过第二双色镜后，到达第三双色镜，荧光中波长较长的部分在穿过第三双色镜后被第一发射滤光片滤掉杂散光，由第一聚焦透镜会聚到第一针孔进入第一单光子检测器；荧光中波长较短的部分经第三双色镜反射后被第二发射滤光片滤掉杂散光，由第二聚焦透镜会聚到第二针孔进入第二单光子检测器。第一针孔和第二针孔分别与第一单光子检测器和第二单光子检测器的光敏感区耦合，第一单光子检测器和第二单光子检测器通过连接电缆与数据采集卡连接，数据采集卡通过USB数据线与计算机连接。由计算机根据数据采集卡实时采集的单光子检测器信号，实时给出待测样品的三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

本发明的工作原理是：由压电陶瓷驱动器控制的三维纳米位移和定位***在加上闭环反馈回路后，***所施加的激励电压与位移具有线性关系。连续施加的激励电压可驱动载物台上的样品发生三维线性平动。同时激光高聚焦区中的样品受激光激发产生光信号，并由***的检测***获得。根据三维扫描过程中三维线性平动产生的空间位置信息和实时获得的光强信号信息构建样品的三维扫描图像，从而实现对样品的三维扫描。而在激光高聚焦区(微区体积约为10^-15L)内样品中的荧光粒子由于布朗运动或化学反应导致进入或离开微区的分子数目总是在其平衡值处变化，因而产生荧光的涨落现象。这种荧光涨落的变化与粒子进出微区的时间(延迟时间)有关，从而产生反映粒子的扩散运动等信息的荧光相关光谱曲线。

本发明工作时，若需要采用长发射波长的第一激光器作为激发源进行工作，则打开第一激光器，待激光器稳定后，调节中性衰减片使激光强度达到要求；调节扩束装置，使激光束直径达到要求。扩束的激光经第一激发滤光片过滤，穿过第一双色镜再经第二双色镜反射进入显微镜物镜；若需要采用短发射波长的第二激光器进行工作时，打开第二激光器，待激光器稳定后，调节中性衰减片使激光强度达到要求；调节扩束装置，使激光束直径达到要求。扩束的激光经第二激发滤光片过滤，经全反射铝镜反射，第二双色镜再反射，第三双色镜1再反射进入显微镜物镜。当需要第一激光器和第二激光器同时作为激发源进行工作时，同时打开第一激光器和第二激光器，待激光器稳定后，调节中性衰减片使激光强度达到要求；调节扩束装置，使激光束直径达到要求；第一激光器发出的激光束到达第一双色镜，第二激光器发出的激光束经全反射铝镜反射，再经第一双色镜反射，与来自第一激光器的激光束重合同轴后，再经第三双色镜反射进入显微镜物镜。将装有样品溶液的盖玻片或者样品池放置在X-Y扫描平台上。激光经物镜聚焦后照射到盖玻片上方(或样品池内)的溶液。从显微镜物镜出来的激光聚焦后照射到盖玻片上的样品液滴中激发产生的荧光。激发产生的荧光穿过第二双色镜，到达第三双色镜。荧光中波长较长的部分在穿过第三双色镜后被第一发射滤光片滤掉杂散光，由第一聚焦透镜会聚到第一针孔进入第一单光子检测器；荧光中波长较短的部分经第三双色镜反射后被第二发射滤光片滤掉杂散光，由第二聚焦透镜会聚到第二针孔进入第二单光子检测器。启动第一单光子检测器，第二单光子检测器和数据采集卡，第一单光子检测器和第二单光子检测器产生的信号经数据采集卡采集，由USB数据线实时传输进入计算机。打开控制器和计算机内启动三维纳米位移和定位***的的三维扫描控制软件，开始X-Y扫描平台和Z向***的三维扫描。***记录的三维空间位置信息和单光子检测器产生的信号在计算机内构建出样品三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

本发明所述的激光器包括气体激光器，固体激光器，半导体激光器和染料激光器，可根据不同的研究目的进行选择。两个激光器可以单独工作，也可以同时工作。

本发明中，针对不同的荧光染料，激发滤光片和发射滤光片、双色镜可以方便地更换。

本发明中采用的显微镜物镜为高放大倍率(大于40)和高数值孔径(大于0.9)的水浸或油浸物镜。

所述的盖玻片(或样品池)为无荧光盖玻片(或样品池)，厚度为0.13～0.17mm；样品溶液用18MΩ的超纯水配制。

本发明采用的针孔直径从15μm到300μm可变，可方便更换。

本发明采用的单光子检测器包括了雪崩二极管型的单光子计数器以及高灵敏的光放大管。两个单光子检测器单独工作，也可以同时工作。

本发明采用的X-Y扫描平台的位移分辨率小于0.3nm，全行程重复定位精度小于2.5nm。

本发明采用的Z向***的位移分辨率小于0.7nm，全行程重复定位精度小于5nm。

本发明具有操作简单，准确度高，灵敏度高，稳定性好等特点。本发明消除了扫描过程中激光聚焦区光学构型的变化对荧光相关光谱单分子探测的影响，提高了荧光相关光谱单分子探测定量分析的准确性，操作简单，灵敏度很高，稳定性好。可应用于生命科学、化学以及物理学等领域的基础研究，特别在活细胞内单个分子的研究、生物分子相互作用(如抗体-抗原)、高通量筛选、肿瘤早期诊断、核酸分析等方面的基础研究中有广阔的前景。

附图说明

图1为本发明的结构原理图。

图1中，1第一激光器，2第二激光器，3第一中性衰减滤光片，4第二中性衰减滤光片，5第一激光准直扩束镜，6第二激光准直扩束镜，7第一激发滤光片，8第二激发滤光片，9第一双色镜，10全反射铝镜，11激光激发光束，12第二双色镜，13Z向***，14显微镜物镜，15盖玻片(或样品池)，16X-Y扫描平台，17样品液滴，18载物台，19控制器，20第三双色镜，21第一发射滤光片，22第一聚焦透镜，23第一针孔，24第一单光子检测器，25第二发射滤光片，26第二聚焦透镜，27第二针孔，28第二单光子检测器，29探测仪基座，30数据采集卡，31计算机。

图2为荧光量子点染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析。

图3为荧光量子点染HeLa肿瘤细胞后细胞膜上量子点的荧光相关光谱分析。

图4为丫啶橙(AO)和DiI混染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析。

图5为DiI染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。以下实施例中采用的组件数据不构成对本发明的限定。

本发明的激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪的结构如图1所示，主要由第一激光器1，第二激光器2，第一中性衰减片3，第二中性衰减片4，第一激光准直扩束镜5，第二激光准直扩束镜6，第一激发滤光片7，第二激发滤光片8，第一双色镜9，全反射铝镜10，激光激发光束11，第二双色镜12，Z向***13，显微镜物镜14，盖玻片(或样品池)15，X-Y扫描平台16，载物台18，控制器19，第三双色镜20，第一发射滤光片21，第一聚焦透镜22，第一针孔23，第一单光子检测器24，第二发射滤光片25，第二聚焦透镜26，第二针孔27，第二单光子检测器28，探测仪基座29，数据采集卡30，计算机31组成。X-Y扫描平台16安装在载物台18上，显微镜物镜14安装在Z向***13上，载物台18和Z向***13安装在探测仪基座29上，控制器19通过连接电缆与X-Y扫描平台16和Z向***连接，并通过连接电缆与计算机31连接，盖玻片(或样品池)15置于X-Y扫描平台16上，样品液滴17置于盖玻片(或样品池)15上，第一激光器1与第一激光准直扩束镜5之间安置第一中性衰减片3，第二激光器2与第二激光准直扩束镜6之间安置第二中性衰减片4，第一激光准直扩束镜5的输出光路上依次设置第一激发滤光片7和第一双色镜9，扩束的激光经第一激发滤光片7过滤后穿过第一双色镜9再经第二双色镜12反射进入显微镜物镜14；第二激光准直扩束镜6的输出光路上依次设置第二激发滤光片8和全反射铝镜10，扩束的激光经第二激发滤光片8过滤后经全反射铝镜10反射和第一双色镜9反射，再经第二双色镜12反射进入显微镜物镜14，经显微镜物镜14聚焦后照射到盖玻片或样品池15上方的样品液滴17，样品液滴17的发射荧光经过显微镜物镜14收集穿过第二双色镜12后，到达第三双色镜20，荧光中波长较长的部分在穿过第三双色镜20后被第一发射滤光片21滤掉杂散光，由第一聚焦透镜22会聚到第一针孔23进入第一单光子检测器24；荧光中波长较短的部分经第三双色镜20反射后被第二发射滤光片25滤掉杂散光，由第二聚焦透镜26会聚到第二针孔27进入第二单光子检测器28。第一针孔23和第二针孔27分别与第一单光子检测器24和第二单光子检测器28的光敏感区耦合，第一单光子检测器24和第二单光子检测器28通过连接电缆与数据采集卡30连接，数据采集卡30通过USB数据线与计算机31连接。

当采用长发射波长的第一激光器1如632.8纳米的氦氖激光器作为激发源进行工作时，打开第一激光器1，稳定15分钟后，调节第一中性衰减片3使激光强度达到要求。调节第一激光准直扩束镜5，使激光束直径达到要求。激光在第一中性衰减片3衰减能量后经第一激光准直扩束镜5扩束后，经第一激发滤光片7过滤，穿过第一双色镜9再经第二双色镜12反射进入显微镜物镜14；当采用短发射波长的第二激光器2如488纳米的氩离子激光器作为激发源进行工作时，打开第二激光器2，稳定15分钟后，调节第二中性衰减片4使激光强度达到要求。调节第二激光准直扩束镜6，使激光束直径达到要求。激光在第二中性衰减片4衰减能量后经第二激光准直扩束镜6扩束后，经第二激发滤光片8过滤，经全反射铝镜10反射，第二双色镜9再反射，第三双色镜12再反射进入显微镜物镜14。当需要第一激光器1和第二激光器2同时作为激发源进行工作时，同时打开第一激光器1和第二激光器2，稳定15分钟后，第一激光器1发出的激光经第一中性衰减片3衰减能量，再经第一激光准直扩束镜5扩束和第一激发滤光片7过滤后到达第一双色镜9，第二激光器2发出的激光束经第一中性衰减片4衰减能量，再经第一激光准直扩束镜6扩束和第一激发滤光片8过滤后经全反射铝镜10反射，再经第一双色镜9反射，与来自第一激光器1的激光束重合，再经第三双色镜12反射进入显微镜物镜14。将待分析的样品溶液20-30微升滴于盖玻片(或者样品池)15上形成样品液滴17。从显微镜物镜14出来的激光聚焦后照射到盖玻片15上的样品液滴17中激发产生的荧光。激发产生的荧光穿过第二双色镜12，到达第三双色镜20。荧光中波长较长的部分在穿过第三双色镜20后被第一发射滤光片21滤掉杂散光，由第一聚焦透镜22会聚到第一针孔23进入第一单光子检测器24；荧光中波长较短的部分经第三双色镜20反射后被第二发射滤光片25滤掉杂散光，由第二聚焦透镜26会聚到第二针孔27进入第二单光子检测器28。启动第一单光子检测器24，第二单光子检测器28和数据采集卡30，第一单光子检测器24和第二单光子检测器28产生的信号经数据采集卡30采集，由USB数据线实时传输进入计算机31。打开控制器19和计算机31内启动三维纳米位移和定位***的的三维扫描控制软件，开始X-Y扫描平台16和Z向***13的三维扫描，实时地在计算机31中构建样品的三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

以下实施例是采用几种有机荧光染料和荧光纳米探针标记细胞，然后采用本发明的激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪得到细胞的三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

实施例中采用的组件为：

第一激光器1：氦氖激光器；

激光光束扩束后直径：8mm；

第二激光器2：氩离子激光器；

激光光束扩束后直径：8mm；

第一激发滤光片7：中心波长635nm；

第二激发滤光片8：中心波长490nm；

第一双色镜9：650DRLP；

第二双色镜12：LF405/488/561/635-A；

第三双色镜20：550DCLP；

显微镜物镜：数值孔径为1.2，放大倍数为60倍的水浸物镜；

数据采集卡；

Z向***：为压电陶瓷驱动器驱动，位移分辨率为0.7nm，全行程重复定位精度为5nm。

X-Y扫描平台：压电陶瓷驱动器驱动，位移分辨率为0.2nm，全行程重复定位精度为2.5nm。

控制器；

单光子检测器：雪崩二极管；

针孔：直径65μm。

实施例

1.荧光量子点染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析：

将荧光量子点与HeLa肿瘤细胞孵育20分钟后，获得荧光量子点染HeLa细胞样品。采用本发明的探测仪对样品进行扫描。图2给出了在不同深度扫描时量子点染HeLa细胞的光切片图。

2.荧光量子点染HeLa肿瘤细胞后细胞膜上量子点的荧光相关光谱分析：

将荧光量子点与HeLa肿瘤细胞孵育20分钟后，获得荧光量子点染HeLa细胞样品。采用本发明的探测仪对样品进行荧光相关光谱分析。图3给出了细胞膜上量子点的荧光相关光谱曲线。

3.丫啶橙(AO)和DiI混染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析：

将AO和DiI与HeLa肿瘤细胞混合孵育20分钟后，获得AO和DiI混染HeLa细胞样品。采用本发明的探测仪对样品进行扫描。AO标记在细胞核中，DiI标记在细胞膜上。图4给出了在不同深度扫描时AO和DiI混染HeLa细胞的光切片图。

4.DiI染HeLa肿瘤细胞的三维扫描成像分析：

将DiI与HeLa肿瘤细胞孵育20分钟后，获得DiI染HeLa细胞样品，采用本发明的探测仪对样品进行扫描。DiI标记在细胞膜上。图5给出了在不同深度扫描时DiI染HeLa细胞的光切片图。

本发明在以上实施例中，消除了扫描过程中激光聚焦区光学构型的变化对荧光相关光谱单分子探测的影响，提高了荧光相关光谱单分子探测定量分析的准确性，操作简单，灵敏度很高，稳定性很好。

Claims (4)

1.一种激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，其特征在于由第一激光器(1)，第二激光器(2)，第一中性衰减片(3)，第二中性衰减片(4)，第一激光准直扩束镜(5)，第二激光准直扩束镜(6)，第一激发滤光片(7)，第二激发滤光片(8)，第一双色镜(9)，全反射铝镜(10)，激光激发光束(11)，第二双色镜(12)，Z向***(13)，显微镜物镜(14)，盖玻片或样品池(15)，X-Y扫描平台(16)，载物台(18)，控制器(19)，第三双色镜(20)，第一发射滤光片(21)，第一聚焦透镜(22)，第一针孔(23)，第一单光子检测器(24)，第二发射滤光片(25)，第二聚焦透镜(26)，第二针孔(27)，第二单光子检测器，(28)，探测仪基座(29)，数据采集卡(30)，计算机(31)组成；X-Y扫描平台(16)安装在载物台(18)上，显微镜物镜(14)安装在Z向***(13)上，载物台(18)和Z向***(13)安装在探测仪基座(29)上；控制器(19)通过连接电缆与X-Y扫描平台(16)和Z向***(13)连接，并通过连接电缆与计算机(31)连接；盖玻片或样品池(15)放于X-Y扫描平台(16)上，样品液滴(17)置于盖玻片或样品池(15)上，第一激光器(1)与第一激光准直扩束镜(5)之间安置第一中性衰减片(3)，第二激光器(2)与第二激光准直扩束镜(6)之间安置第二中性衰减片(4)，第一激光准直扩束镜(5)的输出光路上依次设置第一激发滤光片(7)和第一双色镜(9)，扩束的激光经第一激发滤光片(7)过滤后穿过第一双色镜(9)再经第二双色镜(12)反射进入显微镜物镜(14)；第二激光准直扩束镜(6)的输出光路上依次设置第二激发滤光片(8)和全反射铝镜(10)，扩束的激光经第二激发滤光片(8)过滤后经全反射铝镜(10)反射和第一双色镜(9)反射，再经第二双色镜(12)反射进入显微镜物镜(14)，经显微镜物镜(14)聚焦后照射到盖玻片或样品池(15)上方的样品液滴(17)，样品液滴(17)的发射荧光经过显微镜物镜(14)收集穿过第二双色镜(12)后，到达第三双色镜(20)，荧光中波长较长的部分在穿过第三双色镜(20)后被第一发射滤光片(21)滤掉杂散光，由第一聚焦透镜(22)会聚到第一针孔(23)进入第一单光子检测器(24)；荧光中波长较短的部分经第三双色镜(20)反射后被第二发射滤光片(25)滤掉杂散光，由第二聚焦透镜(26)会聚到第二针孔(27)进入第二单光子检测器(28)；第一针孔(23)与第一单光子检测器(24)的光敏感区耦合，第二针孔(27)与第一单光子检测器(24)和第二单光子检测器(28)的光敏感区耦合；第一单光子检测器(24)和第二单光子检测器(28)通过连接电缆与数据采集卡(30)连接，数据采集卡(30)通过USB数据线与计算机(31)连接，由计算机(31)根据数据采集卡(30)实时采集的第一单光子检测器(24)和第二单光子检测器(28)信号，实时给出待测样品的三维扫描图像和荧光相关光谱曲线。

2.根据权利要求1的激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，其特征在于所述的X-Y扫描平台(16)的位移分辨率小于0.3nm，全行程重复定位精度小于2.5nm。

3.根据权利要求1的激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，其特征在于所述的Z向***(13)的位移分辨率小于0.7nm，全行程重复定位精度小于5nm。

4.根据权利要求1的激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪，其特征在于所述的第一针孔(23)和第二针孔(27)直径为15μm-300μm。

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