CN113567410B - 一种低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨显微成像装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨显微成像装置与方法，具体的说，利用单束近红外连续型激光激发稀土掺杂纳米颗粒，在低功率的激光激发下引发多个不同波段的光子雪崩上转换荧光辐射，光子雪崩荧光对激发光强具有高阶的非线性响应，使用聚焦到衍射极限的激发光斑进行激发，能够得到在三个维度上被同时压缩的荧光点扩散函数，突破光学衍射极限的限制，通过激光逐点快速扫描并记录，在短时间内即可获得大视野的超分辨图像。基于上述方法，搭建由激发光生成模块、激光扫描模块、光电探测模块组成的显微成像装置，实现在低功率单光束激光激发下，无光漂白、低光毒性、高分辨，实时成像，低复杂度、低成本、易用的三维超分辨显微技术。

Description

一种低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨显微成像装置 与方法

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨显微成像方法与装置。

技术背景

在光学显微成像中，由于衍射极限的存在，光学显微镜能够达到的极限分辨率在200nm左右，难以满足对于纳米尺度结构的观测。为了能够突破光学衍射极限，研究人员提出了一系列的远场光学超分辨显微成像方法，其中最具代表性的是基于激光扫描的受激发射损耗显微术(Stimulated emission depletion microscopy，STED)，该方法使用高斯型聚焦激光扫描样品的同时，采用另一束环形光聚焦损耗荧光点周围荧光，得到更小的有效荧光点扩散函数，进而扫描得到超分辨荧光图像。由于其实时、快速及超高分辨率等特点，被广泛应用于观测亚细胞结构及其他细胞生物学问题的研究中。

但是STED技术需要使用高功率损耗光，不可避免地带来光漂白与光损伤等问题，同时两束光需要进行空间耦合与时序调制，***复杂度高，操作困难，而且STED中往往使用昂贵的脉冲光源，成本较高。如果能克服以上缺陷，开发一种更简便的突破光学衍射极限的实时扫描成像超分辨技术，具有超低光强、无光漂白、极低光毒性，***简单易用，适合超长时程活细胞成像等优点，对于增强我国在超分辨显微成像基础研究和仪器开发的国际影响力将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服受激发射损耗显微术固有的低效性，提供一种通过光子雪崩荧光效应打破光学衍射极限的方法。发明人以超高阶非线性响应调制压缩成像点扩散函数作为突破口，提出新型稀土离子掺杂体系，在纳米材料中实现具有超高阶非线性光学响应的光子雪崩发光物理效应。通过光子雪崩荧光纳米探针的实现，在成像过程中探测的荧光点扩散函数能够在XYZ三个维度上被大幅度压缩，从而在逐点扫描过程中能分辨更小的区域，得到突破衍射极限的成像分辨率。

本发明的另一个目的在于解决传统光子雪崩效应响应时间过长，无法实用于大视野点扫描成像的难题。本发明提供一种新型光子雪崩荧光纳米探针，具有高阶非线性光学响应的同时，荧光上升时间短，在低功率单束激光激发下，能够实现大视野点扫描的超分辨成像。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种新型光子雪崩荧光纳米探针的实现，包括以下步骤：

(1)合成核壳结构的稀土离子掺杂的光子雪崩纳米颗粒，通过新型多离子掺杂体系的构建，在纳米尺度下实现光子雪崩荧光的发射。纳米颗粒的核由双能级结构的蓄水离子Yb³⁺与三能级结构的雪崩离子Pr³⁺共同掺杂在氟化物纳米晶体，Yb³⁺掺杂浓度较高，Pr³⁺掺杂浓度较低，壳层是惰性氟化物纳米晶体；

(2)使用一束连续型近红外激发光激发光子雪崩荧光纳米探针，该波长的光子能量不完全匹配Pr³⁺从³H₄到¹G₄的基态吸收，但能完美匹配Pr³⁺从¹G₄到³P₀的激发态吸收。在一定功率的近红外激光激发下，处于³H₄的粒子首先少部分被激发到¹G₄，随后被快速激发到³P₀，Pr³⁺与Yb³⁺之间有一个高效的能量转移过程，Pr³⁺中处于³P₀的粒子将能量传递给Yb³⁺中处于基态能级²F_7/2的粒子后驰豫回¹G₄，而Yb³⁺基态能级的粒子被激发到²F_5/2后，又将能量转移回Pr³⁺，使Pr³⁺基态能级的粒子激发到¹G₄，从而实现¹G₄粒子数的翻倍，经过若干循环以后，¹G₄粒子数呈现雪崩式增长，而从¹G₄被激发到其他能级的粒子也有类似雪崩式增长现象发生，比如³P₀、³P₀和¹D₂等，这些能级发出的荧光对激发光具有超高阶非线性响应，响应曲线(荧光强度与激发光强度的对数关系曲线)呈现″S型″，在功率达到一定阈值后，一定功率范围内的非线性效应开始急剧增强；

(3)当探针处于高阶非线性响应阶段，由高斯型光斑激发产生的荧光点扩散函数被大幅度压缩，随着非线性阶数N的提升，点扩散函数横向与轴向的半高宽都缩小为原来的1/√N，当非线性阶数足够高，成像分辨率能够在三个维度突破光学衍射极限。

基于上述新型光子雪崩荧光纳米探针，本发明提供一种低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像方法，包括以下步骤：

(1)近红外激光器产生一束稳定的连续型近红外激发光，该激光经过准直后，由高倍物镜聚焦产生衍射极限大小的高斯型光斑；

(2)通过生物化学方法，将光子雪崩荧光纳米探针标记在样品的不同部位或结构上，将样品固定在载物台，在不同功率的高斯型实心光斑照射下，光子雪崩荧光纳米探针产生不同的非线性效应，当激发光功率达到光子雪崩阈值时，非线性效应最大，成像分辨率达到最高；

(3)光子雪崩荧光纳米探针在高斯型实心光斑作用下发出的光子雪崩荧光信号由光电探测器进行收集探测，同时通过扫描装置移动高斯型光斑对样品进行XYZ三维逐点扫描，获得样品在三维空间上荧光信号的分布，重构得到三维超分辨荧光图像。

为了实现上述技术目的，本发明还提供一种低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像装置，包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的连续型近红外稳态激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品，对不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的超分辨荧光信号。

具体的，所述激发光生成模块包括近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片，准直扩束镜(包含针孔滤波器)，二分之一波片以及偏振片。近红外激光器产生连续型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了雪崩离子的激发态吸收，激光束经过滤光片与准直扩束镜的滤波处理与准直扩束，由二分之一波片与偏振片调节其功率；

具体的，所述的多光子显微扫描模块，包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜，扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜用于反射近红外激发光与透射样品荧光，分离激发光与荧光，激光束经过物镜聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品；

具体的，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在沿物镜收集的荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射超分辨荧光，物镜收集一部分的超分辨荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个区域从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。

本发明有益效果在于：

1、与传统STED技术相比，本发明只需要低功率的单束连续型近红外光进行激发，在低功率下实现超高分辨率。传统STED技术需要两束激光工作，一束激发光与一束损耗光，其中损耗光往往需要较高的功率来实现高效荧光损耗与高分辨率，容易不可逆地破坏荧光分子，造成严重的光漂白现象，同时高功率激光对于生物组织会造成一定的光损伤。与此相比，本发明只需要较低功率的激光进行激发，避免了光漂白与光毒性的问题，有利于在细胞中实现超长时间的实时超分辨成像；

2、与传统STED技术相比，本发明只需要单束近红外光对样品进行直接激发，即可达到突破衍射极限的分辨率。传统STED技术中的两束激光需要进行严格的空间耦合与时序调制，大大增加了***的复杂度，操作繁琐，同时使用的脉冲激光器价格昂贵。与此相比，本发明基于常规激光扫描显微***，利用单束激光进行激发，操作简便，容易推广，而且使用的连续激光器价格低，易产业化；

3、与传统多光子荧光探针相比，本发明的新型光子雪崩荧光探针非线性响应的阶数高，能够实现突破光学衍射极限的超分辨显微成像；

4、与传统光子雪崩荧光探针相比，本发明的新型光子雪崩荧光探针发光仅需毫秒量级的上升时间，而过往研究上升时间大多达到秒以上，本发明探针快速较短的荧光上升时间为在大视野下进行快速点扫描超分辨成像提供重要基础。

附图说明

图1为实施例1中材料NaYF₄:Yb/Pr(15/0.5％)@NaYF₄的透射电镜图；

图2为实施例2中多离子掺杂光子雪崩体系原理示意图；

图3为实施例2中光子雪崩荧光纳米探针的发光光谱；

图4为实施例2中光子雪崩荧光纳米探针的荧光响应曲线；

图5为实施例2中不同非线性阶数的发光点扩散函数半高宽；

图6为实施例4中显微成像装置的结构示意图。

具体实施例

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种利用低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像装置的实现方法，所述方法包括以下步骤：

S1激光器发出一束稳定的近红外激光，激光的光子能量与雪崩离子的激发态吸收能量相匹配，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜扫描***经物镜聚焦获得衍射极限尺寸的高斯型光斑；

S2聚焦的高斯型光斑激发光子雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，调节激光功率，当功率稍微超过光子雪崩阈值时，纳米探针发出的光子雪崩荧光对激发光强度具有超高阶非线性响应关系，荧光点扩散函数被大幅压缩，即分辨率能大幅提高，以至于突破衍射极限；

S3通过生物化学方法，将光子雪崩荧光纳米探针标记在样品的不同部位或结构上，用功率稍超过光子雪崩阈值的同一近红外激光聚焦作用到样品上，进行XYZ方向逐点扫描，利用光电探测器检测每点对应的光子雪崩荧光信号，得到三维超分辨荧光图像。

需要说明的是，所述纳米探针是通过稀土离子掺杂合成特定的核壳结构上转换纳米材料获得，其核由双能级结构的蓄水离子Yb³⁺与三能级结构的雪崩离子Pr³⁺共同掺杂在氟化物纳米晶体，Yb³⁺掺杂浓度较高，Pr³⁺掺杂浓度较低，其壳是惰性氟化物纳米晶体。

需要说明的是，所述纳米探针在使用单束低功率激光的多光子显微成像***中进行扫描成像，成像过程中荧光点扩散函数在XYZ三个维度上被大幅压缩，达到突破衍射极限的分辨率，并且基于较短的响应时间，能够在大视野下进行快速的点扫描成像。

需要说明的是，用一束近红外激光进行激发，该波长的光子能量匹配了雪崩离子的激发态吸收，雪崩离子通过较弱的基态吸收与较强的激发态吸收进行能级跃迁，在蓄水离子辅助下，能量在两个离子之间进行循环传导，当激光功率达到雪崩阈值后继续提高，雪崩离子与蓄水离子中的多个能级粒子数呈现雪崩式增长，能级对应的荧光辐射对激发光强度具有超高阶非线性响应关系。。

本发明还提供实现一种低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像的装置，所述装置包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块和光电探测模块；其中，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的连续型近红外稳态激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品，对样品不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的荧光信号。

需要说明的是，所述激发光生成模块包括近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片、准直扩束镜、二分之一波片以及偏振片；近红外激光器产生连续型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了雪崩离子的激发态吸收，激光束经过滤光片与准直扩束镜的滤波与准直扩束，由二分之一波片与偏振片配合调节其功率。

需要说明的是，所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，激光束经过物镜聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品。

需要说明的是，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射光子雪崩荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。

实施例1

本实施例提供新型光子雪崩荧光纳米探针的实现方法。本实施例中通过核壳结构上转换纳米颗粒构筑光子雪崩荧光纳米探针，纳米颗粒的核由蓄水离子Yb³⁺与雪崩离子Pr^{3 +}共同掺杂在NaYF₄纳米晶体，Yb³⁺掺杂浓度在15％左右，Pr³⁺掺杂浓度在0.5％左右，壳层是氟化物纳米晶体。

采用溶剂热法合成核壳结构的光子雪崩荧光纳米材料，步骤如下：首先合成核结构，在室温下(23-25℃)，往100mL圆底烧瓶中加入5mL 0.2M Ln(CH₃COO)₃溶液(Ln＝Y/Yb/Pr)，再依次加入7mL油酸和17.5mL 1-十八烯，在150℃下反应40分钟，形成前驱体。移开加热套并允许反应混合物一边搅拌一边冷却至40℃，快速加入10mL NH₄F-甲醇溶液(0.4M)和2.5mL NaOH-甲醇溶液(1M)的混合液，然后在40℃下反应4小时，随后在110℃真空下反应30分钟去除甲醇。甲醇蒸发后，在氩气氛围下升温至300℃并在该温度恒温下反应1.5小时。移开加热套并一边搅拌一边让反应物温度降到室温，然后加入10mL无水乙醇，在7500r.p.m.转速下离心5分钟，去除上清液收集产物，用乙醇和环己烷混合液清洗，烘干，获得上转换纳米颗粒的核NaYF₄:Yb/Pr，分散在9mL的环己烷中。通过调节Y³⁺、Pr³⁺和Yb³⁺的浓度比例，可以获得确定组分的NaYF₄:Yb/Pr(15/0.5％)纳米颗粒。

在得到纳米颗粒的核结构后，用相同方法合成上转换纳米颗粒的壳结构。往100mL圆底烧瓶中加入5mL 0.2M Y(CH3COO)₃溶液，再依次加入7mL油酸和17.5mL 1-十八烯，加热到120℃反应10分钟去除水分，然后在150℃下反应40分钟，形成前驱体。移开加热套并允许反应混合物一边搅拌一边冷却至80℃，然后加入3mL前面合成的上转换纳米颗粒的核结构，保持20分钟除去环己烷。冷却至40℃反应4小时，随后在110℃真空下反应30分钟去除甲醇。甲醇蒸发后，在氩气氛围下升温至300℃并在该温度恒温反应1.5小时。然后进行与前面相同的操作，降至室温，加入10mL无水乙醇，进行离心操作，弃去上清液收集产物，用乙醇环己烷混合液清洗，烘干，最后加入环己烷溶解，获得制备好的核壳结构光子雪崩纳米颗粒NaYF₄:Yb/Pr(15/0.5％)@NaYF₄。

成功合成的核壳结构光子雪崩纳米颗粒的透射电镜图如图1所示。

实施例2

基于实施例1中的新型光子雪崩荧光纳米探针的实现方法，本实施例阐明新型光子雪崩荧光纳米探针的超高阶非线性响应的实现原理。

使用一束连续型近红外激发光激发实施例1中合成的光子雪崩荧光纳米探针，该波长的光子能量不完全匹配Pr³⁺从³H₄到¹G₄的基态吸收，但能完美匹配Pr³⁺从¹G₄到³P₀的激发态吸收，在本实施例中选择波长为852nm。在一定功率的852nm近红外激光激发下，具体能级跃迁过程如图2所示，处于³H₄的粒子首先少部分被激发到¹G₄，随后被快速泵浦到³P₀，Pr³⁺与Yb³⁺之间有一个高效的能量转移过程，Pr³⁺中处于³P₀的粒子将能量传递给Yb³⁺中处于基态能级²F₇/₂的粒子后驰豫回¹G₄，而Yb³⁺基态能级的粒子被激发到²F_5/2后，又将能量转移回Pr³⁺，使Pr³⁺基态能级的粒子激发到¹G₄，从而实现¹G₄粒子数的翻倍，经过若干循环以后，¹G₄粒子数呈现雪崩式增长，而从¹G₄被激发到更高能级的粒子也有类似雪崩式增长现象发生，比如³P₁、³P₀和¹D₂等，这些能级对应的荧光具有超高阶非线性，本实施例中荧光发射峰包括有484nm、642nm、609nm、525nm等，图3展示了该荧光光谱。

在不同功率的近红外激发光作用下，光子雪崩荧光具有不同的非线性效应，随着激发光功率提升，非线性效应先增强后饱和，整体的荧光非线性响应曲线呈现″S″型，当激发光功率在光子雪崩阈值附近时，非线性效应最大，如图4所示。当探针处于高阶非线性效应阶段，由高斯型光斑激发产生的荧光点扩散函数被大幅度压缩，随着非线性阶数N的提升，点扩散函数横向与轴向的半高宽都缩小至原来的1/√N，当非线性阶数足够高，成像分辨率能够在三个维度突破光学衍射极限，图5展示了分辨率随非线性阶数增加的提升情况。

实施例3

本实施例提供一种基于光子雪崩荧光的低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像方法，该方法包括：

(1)激光器发出一束波长为852nm的连续型近红外激光，该激光经过滤光片、准直扩束镜、针孔滤波器等滤波处理与准直扩束后，获得聚焦的高斯型光斑；

(2)聚焦的高斯型光斑激发组分为NaYF₄:Yb/Pr(15/0.5％)@NaYF₄的光子雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩荧光，调节激光功率，当功率处于光子雪崩阈值附近时，纳米探针发出的光子雪崩荧光具有超高阶非线性响应，荧光点扩散函数被大幅压缩，达到突破衍射极限的分辨率；

(3)通过生物化学方法，将光子雪崩荧光纳米探针标记在样品的不同部位或结构上，将样品固定在载物台，调节激光功率，用功率稍超过光子雪崩阈值的同一近红外激光聚焦作用到样品上，进行XYZ方向逐点扫描，利用光电探测器检测光子雪崩荧光信号，得到三维超分辨荧光图像。

实施例4

基于本实施例提供了一种低功率单光束大视野点扫描的超分辨成像装置，该装置结构参见图6，包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块、光电探测模块。

激发光生成模块，包括近红外连续激光器1，滤光片2，准直扩束镜3(包含针孔滤波器)，二分之一波片4以及偏振片5。近红外激光器产生波长为852nm的连续高斯型激光输出，滤光片滤除激光中其他波段的杂散光，准直扩束镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率，同时焦点处放置针孔滤波器，滤除高频杂散光，二分之一波片4安装在可旋转安装座上搭配线偏振器5用于调节激光束的功率。

多光子显微扫描模块，包括扫描振镜6，高反低透二向色镜7，扫描透镜8，管镜9，物镜10以及置于载物台的光子雪崩纳米材料或其标记样品11。扫描振镜控制激光束的光路偏转实现对样品的二维扫描，高反低透二向色镜对激光束进行反射，扫描透镜和管镜对扫描振镜出射光束进行聚焦和准直，使激光束在扫描过程中依然匹配显微物镜的入瞳大小，最后由物镜将激光聚焦到置于载物台的光子雪崩纳米材料或其标记样品。

光电探测模块，包括聚焦透镜10与光电探测器11。聚焦透镜和光电探测器设置在沿物镜收集的荧光的前进方向上，所述光电探测器与外部计算机连接。在光电探测器接收完一次检测信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机控制扫描振镜旋转，利用聚焦光斑逐点扫描样品的方式得到一幅二维激光扫描超分辨图像，所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过该电机，结合旋转装置可以获得三维激光扫描超分辨图像。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变，而所有的这些改变，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1激光器发出一束稳定的近红外激光，激光的光子能量与雪崩离子的激发态吸收能量相匹配，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜扫描***经物镜聚焦获得衍射极限尺寸的高斯型光斑；

S2聚焦的高斯型光斑激发光子雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，调节激光功率，当功率达到光子雪崩阈值时，纳米探针发出的多个不同波段的光子雪崩荧光对激发光强度具有超高阶非线性响应关系，荧光点扩散函数被大幅压缩，即分辨率能大幅提高，以至于突破衍射极限；

S3通过免疫荧光标记方法将光子雪崩荧光纳米探针标记在样品的不同部位或结构上，用功率达到光子雪崩阈值的同一近红外激光聚焦作用到样品上，进行XYZ方向逐点扫描，利用光电探测器检测每点对应的光子雪崩荧光信号，得到三维超分辨荧光图像；

所述纳米探针是通过稀土离子掺杂合成特定的核壳结构上转换纳米材料获得，其核由双能级结构的蓄水离子Yb³⁺与三能级结构的雪崩离子Pr³⁺共同掺杂在NaYF₄纳米晶体，Yb³⁺掺杂浓度为15％，Pr³⁺掺杂浓度为0.5％，其壳是NaYF₄纳米晶体；

所述激光器的激发波长为852nm;

雪崩离子通过较弱的基态吸收与较强的激发态吸收进行能级跃迁，在蓄水离子辅助下，能量在两个离子之间进行循环传导，当激光功率达到雪崩阈值后继续提高，雪崩离子与蓄水离子中的多个能级粒子数呈现雪崩式增长，能级对应的荧光辐射对激发光强度具有超高阶非线性响应关系。

2.根据利要求1所述的低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，所述纳米探针在使用单束低功率激光的多光子显微成像***中进行扫描成像，成像过程中荧光点扩散函数在XYZ三个维度上被大幅压缩，达到突破衍射极限的分辨率，并且基于较短的响应时间，能够在大视野下进行快速的点扫描成像。

3.根据利要求1所述的低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，执行所述方法的装置包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块和光电探测模块；其中，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的连续型近红外稳态激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品，对样品不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的荧光信号。

4.根据利要求3所述的低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，所述激发光生成模块包括近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片、准直扩束镜、二分之一波片以及偏振片；近红外激光器产生连续型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了雪崩离子的激发态吸收，激光束经过滤光片与准直扩束镜的滤波与准直扩束，由二分之一波片与偏振片配合调节其功率。

5.根据利要求4所述的低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，激光束经过物镜聚焦到固定在载物台上被光子雪崩荧光纳米探针标记的样品。

6.根据利要求5所述的低光强单光束大视野的激光点扫描超分辨成像的方法，其特征在于，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射光子雪崩荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。

Images