CN103468744B - Vegf165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及VEGF165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法，该方法包括以下的步骤：1）收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基；2)毛囊干细胞的纯化；3）毛囊干细胞的鉴定；4）包装慢病毒；5）慢病毒感染毛囊干细胞；6）获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。本发明以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管***，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。

Description

VEGF165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及皮肤组织工程学领域，尤其涉及一种毛囊干细胞基因修饰的方法和该方法获得的毛囊干细胞。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与***、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫***的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。

正因如此，科学家们一直试图寻找一种外源性的皮肤替代物。早在公元前1500年，异种皮肤移植就被用于临时覆盖皮肤缺损创面。而随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。组织工程学是应用工程学及生命科学的原理与方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高组织功能的一门学科。目前，国外应用皮肤组织工程学构建人工皮肤的研究已取得了实质性进展，Apligraf、OrCel、Suprathel、Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并已应用于临床皮肤缺损的治疗中。

然而，虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”：①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管***供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如：血管、毛发、汗腺等。

毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。Taylor等(TaylorG,Lehrer MS,Jensen PJ,et al.Involvement of follicular stem cells in forming not onlythe follicle but also the epidermis.Cell,2000,102(4):451-461.)研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，而且还参与了表皮组织的形成过程。Stelios等发表的最新研究结果证明，头发毛囊中含有大量的干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一，并已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管***。血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。

发明内容

为了解决目前人工皮肤产品存在的可能影响临床应用效果的诸多问题，本发明的一个目的是提供VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，本发明的另外一个目的是提供上述的方法获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。本发明以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管***，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，该方法包括以下的步骤：

1)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25％Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37℃、5％C0₂培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；

2)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。

3)毛囊干细胞的鉴定：

a、采用Q-PCR法：分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

b、细胞免疫荧光染色法：将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4％PFA固定后，再用5％BSA室温封闭。分别加入一抗整合素β1多克隆抗体、整合素a6多克隆抗体以及角蛋白15多克隆抗体，室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min，加DAPI染核5min，避光晾干，用mounting solution封片，观察。

4)包装慢病毒：取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于100mm培养皿中，待次日细胞长至50％-70％即可；病毒包装采用钙转法进行：转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10％FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLenti-IRES-VEGF165-EGFP10ug和3种包装质粒VSVG、RSV-REV、RRE各5ug加入50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH₂O至500μl作为B液，另准备500μlCaCl₂A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min；逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10％FBS+DMEM高糖+1％双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，用超速离心机4℃，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100μl培养基吹打分装成2管，-80℃保存病毒液；

5)慢病毒感染毛囊干细胞：取培养的毛囊干细胞，提前1天按照1×10⁵/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50μl病毒原液和50μl补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37℃、5％CO2培养箱静置30min，再补加400μl补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞。

6)获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。分别检测该细胞的增殖能力、RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达以及Western-Blot检测VEGF165蛋白表达情况。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

VEGF165基因修饰毛囊干细胞，该毛囊干细胞采用上述的方法获得。

本发明由于采用了上述的技术方案，以毛囊干细胞为种子细胞，利用VEGF165基因转染制得毛囊干细胞，可以将该毛囊干细胞种植于三维明胶海绵组织支架，构成成具有新的血管***的新型复合人工皮肤模型。该模型具有以下独特的优点：

①作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提高临床治疗效率；

②由于能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管***，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题；

③本研究中所用的种子细胞—毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非常容易获得，且不会对患者造成任何损伤和痛苦；

④由于种子细胞取自自体组织，免疫排斥反应和传播疾病等问题将迎刃而解；

⑤相对于目前的人工皮肤产品，此新型人工皮肤将更大程度的恢复和再生正常皮肤组织的解剖结构和生理功能。

附图说明

图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧40×。

图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状100×。

表1为分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

图4-图6为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色，分别为整合素β1、整合素a6、角蛋白15,100×。

图7-图9为喷金显示明胶海绵三维支架扫描电镜，分别为SEM 50×、200×、400×。

图10、图11分别为倒置荧光显微镜下，P3代毛囊干细胞用慢病毒感染完72h的GFP图和PH图100×。

图12为VEGF165基因修饰后的毛囊干细胞的生长曲线图。

图13为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的mRNA的RT-PCR结果图。

图14为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的VEGF165蛋白的表达结果。

图15～图17分别为复合人工皮肤的HE染色，分别为注射浓度1×106、5×106、1×107/cm2，bar：200×。

图18-19为做大鼠背部移植时创面图。

图20-23为7d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。

图24-27为14d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。

图28-31为21d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。

图32为7d、14d、21d四个组的创面愈合率。

图33-35为21d后对取材组织做的HE染色，观察血管形成情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组。100×

具体实施方式

实施例1大鼠毛囊干细胞的分离、培养，鉴定

1.1)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25％Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37℃、5％C0₂培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密。

1.2)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。如图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状。

1.3)毛囊干细胞的鉴定：

a、采用Q-PCR法：分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

b、细胞免疫荧光染色法：将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4％PFA固定后，再用5％BSA室温封闭。分别加入一抗整合素β1(integrin-β1)多克隆抗体(1：100)、整合素a6(integrin-a6)多克隆抗体(1：50)以及角蛋白15(keratin-15)多克隆抗体(1:100)，室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min，加DAPI(1:2000)染核5min，避光晾干，用mounting solution封片。图4-图6为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色，分别为整合素β1、整合素a6、角蛋白15。

实施例2明胶海绵三维组织支架的制备

2.1)明胶海绵三维组织支架制备：

A.取含量为5％的明胶溶解于25℃的蒸馏水10ml，分别加入0.05％6-硫酸软骨素钠盐(C6S)和0.2％透明质酸钠盐(HA)；

B.室温下用磁力搅拌器搅拌60分钟后，将交联剂0.5％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液(EDC)和0.25％N-羟基琥珀酰亚胺溶液(N-Hydroxysuccinimide)滴入溶液中混匀5分钟后，再将溶液注入12控办孔板的模具中，水平摇晃均匀。

C.于-80℃下冷冻2小时

D.然后上冻干机，冻干24小时得到厚度为2mm的多孔海绵状的Gel-C6S-HA支架。

2.2)观察：取少量支架样品，扫描电镜观察并记录，图7-图9为喷金显示明胶海绵三维支架扫描电镜，分别为SEM 50×、200×、400×.

实施例3血管内皮生长因子165基因(VEGF165)修饰毛囊干细胞的制备

3.1包装慢病毒：取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于100mm培养皿中，待次日细胞长至50％-70％即可；病毒包装采用钙转法进行：转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10％FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLenti-IRES-VEGF165-EGFP10ug和3种包装质粒VSVG、RSV-REV、RRE各5ug加入50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH₂O至500μl作为B液，另准备500μlCaCl₂A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min；逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10％FBS+DMEM高糖+1％双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，用超速离心机4℃，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100μl培养基吹打分装成2管，-80℃保存病毒液。

3.2慢病毒感染毛囊干细胞：取培养的毛囊干细胞，提前1天按照1×10⁵/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50μl病毒原液和50μl补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37℃、5％CO₂培养箱静置30min，再补加400μl补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞。图10、图11分别为倒置荧光显微镜下，P3代毛囊干细胞用慢病毒感染完72h的GFP图和PH图。

3.3生长曲线测定：将感染完72h的P3代毛囊干细胞，消化后以1×10⁵/ml的细胞浓度接种在24孔板上，分别于1、2、3、4、5、6、7d进行细胞计数板计数，每天设置6个复孔，取平均数。然后绘制细胞生长曲线。如图12为VEGF165基因修饰后的毛囊干细胞的生长曲线图。

3.4反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转然后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达。

(1)提取总RNA：将接种了毛囊干细胞的六孔培养板置于冰上，吸去培养液；每孔加预冷的Trizol试剂1ml，反复吹打裂解充分后移入EP管中；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀后放置2-3min；12000g,4℃离心15min；将上清液移入另一EP管中，约0.5ml，加等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10min，离心(12000g，4℃)10min，弃上清；用0.5ml DEPC处理的75％酒精1ml洗涤沉淀，离心(7500g，4℃)5min；倾去酒精，倒置EP管，干燥至酒精挥发；加适量的DEPC处理的水-70℃冷冻备用。

(2)毛囊干细胞RNA的逆转录体系：

(3)聚合酶链式反应(PCR)

a)PCR引物VEGF165蛋白引物设计，Action作为对照。如Table1.

表1.引物序列信息

(Table 1.Oligonucleotide sequences for PCR amplifycatio)

b)PCR反应条件,如Table2.

表2.PCR过程

(Table 2.The process of PCR)

c)PCR反应体系

(4)琼脂糖电泳：取扩增产物6μl上样，1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。如图13为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的mRNA的RT-PCR结果图。

3.5Western blotting法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白的表达

(1)毛囊干细胞裂解

a)用预冷的PBS洗毛囊干细胞3遍。

b)加预冷的lysing buffer(lysis buffer是生物学实验中经常使用的缓冲液。目的是裂解细胞)，6孔板：80μl/well；60mm培养皿：300μl/disk，4℃孵育20min。

c)用细胞刮棒把细胞碎片连同lysing buffer集中于一侧，4℃孵育40min并转移至预冷的离心管中。离心(12000g，4℃)5min。

d)将上清移入另一离心管中，除部分用来测蛋白浓度外，其余直接用于实验或-70℃冷冻备用。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳

a)制备8％分离胶:1.5mM Tris-HCl(pH 8.8)1.3ml，dddH₂O 2.3ml，30％聚丙烯酰胺1.3ml，10％SDS 50μl，10％过硫酸胺50μl，TEMED 3μl(加入后混匀，快速制胶)。3ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以少量三蒸水封胶面，室温聚合30min，吸去上层三蒸水。

b)制备5％积层胶:1mM Tris-HCl(pH 6.8)0.25ml，ddH2O 1.4ml。

c)30％聚丙烯酰胺0.33ml，10％SDS 20μl，10％过硫酸胺20μl，TEMED 2μl(加入后混匀，快速制胶)。1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速***梳子，聚合完全后小心取出梳子。

d)电泳:取含同等蛋白量的样本稀释至等体积，和5×sample buffer按4：1体积混匀，100℃水浴5min，乘热加样，每孔道30μl，加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳。电泳条件：积层胶内95V×15min，分离胶内165V×50min，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳。

e)电转移:SDS-PAGE后，将聚丙烯酰胺胶卸下，取与凝胶相同大小的6张滤纸和一张硝酸纤维膜(NC)，在半干转移缓冲液中平衡15min，依次从下到上放好3张滤纸、凝胶、NC膜、另3张滤纸，然后夹于半干转膜装置中，膜朝正极，胶向负极，根据膜面积大小，以1.25mA/cm2的恒流，转膜90min。

f)检测NC膜上的蛋白质:将膜浸在丽春红染色液中染色，约3min可见红色蛋白质色带出现,然后将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数分钟，然后更换脱色液数次，直至背景色很淡。g)免疫学检测：1、封闭：转膜后，将硝纤膜置TTBS中，缓摇10min，然后膜于封闭液中37℃摇床缓慢平摇2h。2、结合一抗：封闭后将硝纤膜移入一抗(1：1000)，4℃过夜或室温平摇3h。回收一抗，硝纤膜浸入TTBS 20ml中，急摇10min，连续3次，清洗膜上残余一抗。3、结合二抗：将硝纤膜移入马抗兔二抗反应液(1：2000)中，室温平摇2h后，硝纤膜浸入TTBS 30ml中，急摇15min，连续3次，清洗膜上残余二抗。4、免疫复合物的检测：GE ImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪显影拍照。图14为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的VEGF165蛋白的表达结果。

实施例4复合人工皮肤样品的制备

1)样品的制备：取之前4℃保存的明胶海绵支架，用75％乙醇消毒，再用PBS彻底冲洗；平铺于50mm培养皿中，置于37℃CO₂培养箱中孵育1h；先将转染72h后的毛囊干细胞用0.25％Trypsin-0.02％EDTA消化后，取细胞悬液，500r/min离心5min，弃上清，用5ml DMEM/F12液重新悬浮细胞，用注射法分别以1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷/cm²的密度将细胞接种于明胶海绵支架内部。再取之前保存的毛囊干细胞，同样以1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷/cm²的密度将毛囊干细胞接种于明胶海绵支架表面，DMEM/F12补充培养基培养，置于5％的CO₂孵箱内37℃液面下培养2周，细胞融合后改为气-液界面培养10d。

2)复合人工皮肤样品的检测：液面下培养48h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况。以后每24h观察一次。制备好的复合人工皮肤用4％PFA溶液固定，进行常规的脱水、包埋、切片，HE染色，光镜下观察。如图15～图17分别为复合人工皮肤的HE染色，分别为注射浓度1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷/cm²，bar：200×。

实施例5拟人大鼠皮肤缺损模型移植人工皮肤

1)体内移植实验动物模型制备及实验分组：

健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠18只,体重200-220g。术前2d脱去术区背毛。

实验分组：每只大鼠背部正中作4个创面，随机分为4组：A组(注射VEGF165基因修饰的毛囊干细胞的复合人工皮肤)，B组(注射空基因修饰的毛囊干细胞的复合人工皮肤)，C组(不注射细胞的人工皮肤)和D组(创面覆盖纱布)。A\B组注射浓度为1×10⁷/cm²。如图18-19。

2)术前大鼠称重，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定四肢后，碘伏消毒背部皮肤，设计背部尾侧正中两旁做1.2cm×1.2cm的全层皮肤缺损创面4块，美蓝标记皮肤剪除范围，每侧2个术区，每块间隔1cm。以尖刀片沿标记线切开皮肤，深至皮下浅筋膜层，切除全层皮肤，形成暴露筋膜的创面。充分止血后，后随机分为四组，将A、B、C组上述材料分别植入缺损创面，5一0丝线间断缝合固定于创缘皮肤，D组用凡士林纱布及无菌敷料覆盖,打包固定。(为防止大鼠自己咬损患处，造成污染及破坏，设计弹性外套防护。

3)移植术后处理：实验动物麻醉苏醒后，送回饲养间，单笼饲养。次日恢复正常饮食，尽量避免术区纱布浸湿、污染。一旦外层敷料浸湿，立即以无菌纱布更换。每天用注射用青霉素钠注射抗感染。

4)组织标本采集：分别于术后7d，14d，21d，每次取6只动物处死，用普通索尼相机W570拍照观察创面愈合情况，如图20-31。计算不同时间不同组别的创面愈合率。如图32。

5)21d后对取材组织做HE染色，观察血管形成情况。如图33-35。

序列表

<110>杭州市萧山区中医院

<120>VEGF165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法

<160>4

 

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

GTCCCTCACC CTCCCAAAAG 20

 

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

GCTGCCTCAA CACCTCAACC C 21

 

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

CACCCACCCA CATACATACA 20

 

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

CTCCCAACTC AAGTCCACA 19

 

Claims (2)

1.VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25% Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；

2) 毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次；

3）毛囊干细胞的鉴定：

a、采用Q-PCR法：分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测；

b、细胞免疫荧光染色法：将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭；分别加入一抗整合素β1多克隆抗体、整合素a6多克隆抗体以及角蛋白15多克隆抗体，室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min，加DAPI染核5min，避光晾干，用mounting solution封片，观察；

4）包装慢病毒：取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于100mm培养皿中，待次日细胞长至50%-70%；病毒包装采用钙转法进行：转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10％FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLenti-IRES-VEGF165-EGFP10ug和3种包装质粒VSVG、RSV-REV、RRE各5ug加入50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH₂O至500μl作为B液，另准备500μlCaCl₂ A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min；逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10％FBS+DMEM高糖 +1%双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，用超速离心机4℃，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100μl培养基吹打分装成2管，-80℃保存病毒液；

5）慢病毒感染毛囊干细胞：取培养的毛囊干细胞，提前1天按照1×10⁵/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50μl病毒原液和50μl补充培养基混匀的吹打后接种在预铺胶的24孔板，在37℃、5%CO₂培养箱静置30min，再补加400μl补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰的毛囊干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法获得的VEGF165基因修饰的毛囊干细胞。