CN101711164A - 可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶的合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有全长抗肌萎缩蛋白基因的基本生物功能的新的抗肌萎缩蛋白小/微-基因。尤其是，本发明提供了一系列合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因，其可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)。本发明还提供了治疗杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)，贝克尔肌肉萎缩症(BMD)和X染色体关联的扩张型心肌病(XLDC)的方法以及药物组合物。

Description

可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶的合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因

政府权利声明

本发明的完成至少有部分得益于政府的支持，获得来自美国国立卫生研究院的第AR49419号资助。美国政府对本发明可享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年1月18日提交的申请号为60/881,129以及于2007年10月16日提交的申请号为60/999,321的美国临时申请的权益。

技术领域

本发明涉及新的抗肌萎缩蛋白小/微-基因，其保留有全长抗肌萎缩蛋白基因的基本生物功能。尤其是，本发明提供了一系列合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因，其可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)。

技术背景

抗肌萎缩蛋白缺陷性疾病包括杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，贝克尔肌肉萎缩症(Becker Muscular Dystrophy，BMD)和X染色体关联的扩张型心肌病(X-linked Dilated Cardiomyopathy，XLDC)。它们都是非常常见的遗传疾病，在每3,000个新生儿中就有不止一名男婴患病。进行性肌肉退化及衰弱通常使病人在十几岁出头时就坐上轮椅，二十岁出头时就过世。女性携带者通常在四五十岁时也会患病。以上提到的肌肉疾病都是由于抗肌萎缩蛋白基因突变引起，特别是由于x染色体关联的隐性突变引起。抗肌萎缩蛋白基因是至今所知的最大基因，在x染色体上有近240万个碱基对，79个外显子，约11.5kb长的编码序列，并且具有很高的自发性突变率。

目前对于抗肌萎缩蛋白缺陷性疾病并无有效的治疗方法。已经开发出包括细胞治疗与基因治疗在内的新的遗传学方法。但是，抗肌萎缩蛋白基因的庞大体积与mRNA(14个千碱基；kb)是基因治疗发展上难以克服的障碍。因此，研究的焦点集中在开发简缩版的小-抗肌萎缩蛋白基因或微-抗肌萎缩蛋白基因。可以通过病毒载体(例如腺相关病毒载体(AAV载体)和慢病毒载体)或通过干细胞(例如与血管生成相关的干细胞(mesoangioblasts)，CD133+干细胞和侧群细胞)导入这些缩短的基因(Yuasa et al.，1998；Wang et al.，2000；Ferrer et al.，2000；Harper et al.，2002；Fabb et al.，2002；Sakamoto et al.，2002；Bachrach et al.，2004；Sampaolesi etal.，2006；Benchaouir et al 2007，Cell Stem Cell 1：646-657)。微基因一般是指自然产生的以及合成的抗肌萎缩蛋白基因，其具有等于或小于5kb长的编码序列并可被包装至一个单腺相关病毒载体(AAV)内。小基因是指合成抗肌萎缩蛋白基因，其具有等于或小于10kb，但大于5kb长的编码序列。小基因不能被包装至一个单AAV载体内，但可以通过变异的双载体进行传递，例如重叠载体(overlapping vector)，反式剪接载体及杂交载体。

野生型抗肌萎缩蛋白基因具有两个主要的生物功能。一是可提供细胞骨架与细胞外基质之间的机械连接，以使肌膜在收缩时保持稳定。另一个是可为许多重要的细胞活动提供信号传导功能。抗肌萎缩蛋白的信号传导功能主要通过被称为神经元型一氧化氮合酶(nNOS)(Rando，2001)的伴侣(partner)蛋白而完成。多项研究显示，可通过全长抗肌萎缩蛋白可将nNOS招募至肌纤维膜中(Brenman et al.，1995；Brenman et al.，1996)。最近的研究进一步显示，在DMD的动物模型和人类病人中，抗肌萎缩蛋白缺陷的肌肉中nNOS的丧失显著促成了疾病的发展(Brenman et al.，1995；Chang et al.，1996；Thomas et al.，1998；Sander et al.，2000)。此外，nNOS的转基因过表达在DMD mdx小鼠模型中可改善肌肉病理(Wehling et al.，2001；Tidball and Wehling-Henricks，2004；Shiao et al.，2004；Wehling-Henricks et al.，2005)。

对生成抗肌萎缩蛋白小基因与微基因的尝试已有记载。例如，ΔR4-R23/ΔC微抗肌萎缩蛋白可减少DMD小鼠模型的组织病理。但是，此微-蛋白不能将肌肉比力(specific force)恢复到正常水平(Harper et al，2002；Gregorevic et al.，2004；Liu et al.，2005；Yue et al.，2006；Gregorevic et al.，2006)。ΔH2-R19小-抗肌萎缩蛋白基因来自于一个病情非常轻微的病人(England et al.，1990；Harper et al.，2002)。这个小基因优于ΔR4-R23微基因或ΔR4-R23/ΔC微基因，因为它可以将肌肉比力恢复到与全长抗肌萎缩蛋白基因相同的水平(Harper et al.，2002；Lai et al.，2005)。但是，该小基因不能修复nNOS。事实上，现有的小-或微-抗肌萎缩蛋白基因均不能在肌纤维膜中招募nNOS(表一)(Chao et al.，1996；Crawford et al.，2000；Warneret al.，2002；Wells et al.，2003；Torelli et al.，2004；Lai et al.，2005；Yue et al.，2006；Li et al.，2006；Judge et al.，2006)。无法修复肌纤维膜中的nNOS将显著降低缩小的抗肌萎缩蛋白基因的疗效。

以前人们认为可通过抗肌萎缩蛋白的C端结构域将nNOS招募至肌纤维膜中(Brenmanet al.，1995；Brenman et al.，1996)。全长抗肌萎缩蛋白有四个结构域，包括N端结构域，中部杆状(mid-rod)结构域，富含半胱氨酸的结构域以及C端结构域。N端结构域和部分中部杆状结构域与细胞骨架F肌动蛋白相互作用。中部杆状结构域含有24个类血影蛋白重复单位及4个铰链。富含半胱氨酸的结构域与跨膜肌营养不良蛋白聚糖(dystroglycan)有相互作用，将抗肌萎缩蛋白与细胞外基质连接。C端结构域含有两个互生蛋白(syntrophin)结合位点与一个异连蛋白(dystrobrevin)结合位点。多项研究显示，通过nNOS与α-互生蛋白间的PDZ/PDZ结构域的相互作用，可将nNOS被招募至肌纤维膜中(Brenman et al.，1996；Hillier et al.，1999；Kameya et al.，1999；Tochio et al.，1999；Adams et al.，2001；Miyagoe-Suzuki and Takeda，2001)。这似乎显示了一个具有C端结构域的小-或微-基因应该能够在肌纤维膜中招募nNOS。但是，研究已重复显示，虽然在这些情况下互生蛋白很好地集中在肌纤维膜内，但现有的含有C端结构域的小/微-抗肌萎缩蛋白仍无法将nNOS带入肌纤维膜中(Chao et al.，1996；Lai et al.，2005)。此外，研究已显示C端截断的全长抗肌萎缩蛋白可将nNOS招募至肌纤维膜(Crawfordet al.，2000)。

表一评价并总结了几个自然产生的抗肌萎缩蛋白基因和几个代表性的合成抗肌萎缩蛋白小基因及微基因的结构与功能。在所有被测试的基因中，只有天然亚型Dp427(全长抗肌萎缩蛋白基因)、Dp260(全长基因的视网膜亚型)以及一个C端截断的全长基因(Δ71-78)被确定可在肌纤维膜中修复nNOS。但是，如前所述，这些基因由于体积过大而不适合AAV或慢病毒载体包装。

因此，有必要开发出一种或一系列小/微-抗肌萎缩蛋白基因，其有能力在肌纤维膜中修复nNOS，并可用于DMD，BMD与XLDC的基因治疗。

发明内容

本发明发现了新的抗肌萎缩蛋白小-基因和微-基因，其与全长抗肌萎缩蛋白基因相比体积显著缩小，并可修复例如神经元型一氧化氮合酶(nNOS)与肌纤维膜之间的机械连接功能与信号传导功能。

在一方面，本发明涉及一种核酸分子(在本申请中也称为小基因或微基因)，其含有一个核苷酸序列，编码一个修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽，该多肽保留有全长抗肌萎缩蛋白的N端结构域、富含半胱氨酸的结构域、两个或多个中部杆状结构域的重复单位以及两个或多个中部杆状结构域的铰链。优选地，该核酸分子在被保留的中部杆状结构域重复单位中至少保留有R 16和R 17。优选保留的中部杆状结构域铰链中含有H1和H4。

在另一方面，本发明的小基因或微基因编码的修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽进一步保留了全长抗肌萎缩蛋白的C端结构域。

在另一特定的方面，本发明提供了修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽分子，其含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，该序列可分别由以下小/微-抗肌萎缩蛋白基因或其修饰体或变体编码：ΔH2-R15(SEQ ID NO：7)，ΔH2-R15/ΔC(SEQ ID NO：10)，ΔH2-R15/ΔR18-19(SEQ ID NO：8)，ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC(SEQ ID NO：12)，ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC(SEQ ID NO：13)以及ΔR2-15/ΔH3-R23/ΔC(SEQ ID NO：11)。参见图1B和1C。

另一方面，本发明涉及重组腺相关病毒载体(AAVs)，可传递本发明中的核酸分子(小-和/或微-抗肌萎缩蛋白基因)，其能够在肌纤维膜中修复神经元型一氧化氮合酶(nNOS)。本发明所指的重组AAV载体(单载体或双载体)包含本发明中的任一可在肌纤维膜中修复nNOS的核酸分子(小-和/或微-抗肌萎缩蛋白基因)，表达框(expression cassette)(启动子与polyA)以及病毒性反向末端重复单位(ITRs)。本发明的一个特别方面是提供了示例的AAV载体，包括但不限于AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC，AV.miniCMV.ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC，AV.miniCMV.ΔR2-15/ΔH3-R23/ΔC，AV.ΔH2-R15供体/AV.ΔH2-R15接受体，AV.ΔH2-R15/ΔR18-19.头/AV.ΔH2-R15/ΔR18-19.尾以及对它们进行的修改与变化。本发明还提供了示例的慢病毒载体，包括但不限于Lenti.CK6.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC，Lenti.CK6.ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC，以及Lenti.CK6.ΔH2-R15。参见图2。根据本发明，一个双重组的AAV载体***含有两个AVV载体，其中两个AAV载体中的一个包括本发明的核酸分子、小基因或微基因的一部分，另一个载体包括核酸分子、小基因或微基因的剩余部分，这两个载体进一步包括了可允许双方重组从而形成全长核酸分子、小基因或微基因的序列。

在另一方面，本发明涉及一个在某对象中治疗DMD，BMD和/或XLDC的方法，通过对该对象给药治疗有效剂量的本发明的核酸分子(小和/或微-抗肌萎缩蛋白基因)，伴有或不伴有药用可接受的运载物。在一特别方面，适用于本发明方法的给药方式包括但不限于，为改善患者的局部肌肉功能而进行局部或区域性肌肉注射，对患者的身体某区域的全部肌肉或全身的全部肌肉进行***给药(例如静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药及心脏内给药)，在局部和/或***给药后用AAV或慢病毒载体在体外感染肌原性干细胞。

在另一方面，本发明涉及一个药物组合物，其包含一个或多个本发明的AAV载体和慢病毒载体以及一个药用可接受的运载物。

附图说明

本专利或本专利申请含有至少一个彩色附图。专利局在收到请求以及必要的费用时，可提供本专利或专利申请的带有彩图的公开文本。

图1A为全长抗肌萎缩蛋白基因与一系列小/微-抗肌萎缩蛋白基因及其相应的nNOS修复能力。

图1B为R16和R17的DNA序列及氨基酸序列，其来自人类抗肌萎缩蛋白基因与蛋白。在竖线前的序列是R16，竖线后的序列是R17。

图1C为来自不同物种的抗肌萎缩蛋白基因R16和R17的DNA序列比，这些物种包括人类、猕猴(macaca mulatta)、猪(sus scrofa)、狗(canis familliaris)、鼠(mus musculus)和鸡(gallus gallus)。星号表示在不同物种中相同的氨基酸。两个点表示在不同物种中具有高度同源性的氨基酸。一个点表示在不同物种中具有中度同源性的氨基酸。

图2为带有本发明的抗肌萎缩蛋白小/微-基因的AAV载体与慢病毒载体的构建图。

图3为全长抗肌萎缩蛋白基因以及几个由发明人开发的合成小-抗肌萎缩蛋白基因的鉴定酶切点(diagnostic cut)。这些小基因的结构概括在图1中。这些小基因在nNOS修复方面的生物功能在图4中详细讨论。

图4为两月龄抗肌萎缩蛋白缺陷mdx小鼠的骨骼肌中nNOS的修复与抗肌萎缩蛋白表达的免疫荧光(IF)分析，mdx小鼠用带有全长或某些合成小-抗肌萎缩蛋白基因的质粒进行治疗，这些基因包括ΔH2-R15，ΔH2-R16，ΔH2-R17或ΔH2-R19。同时显示了在未治疗的md肌肉中的回复突变(revertant)纤维的克隆体。注射后2到3个星期时进行检测。

图5为在抗肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠的骨骼肌中nNOS的修复与抗肌萎缩蛋白表达的另一组免疫荧光(IF)分析和nNOS活性的组织-酶学染色。Mdx小鼠用带有另一组小/微-基因(ΔH2-R15/ΔR18-19，ΔH2-R15/ΔC和ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC)的质粒进行治疗，这些质粒在发明人实验室里合成。同时显示了在未治疗(无质粒)的mdx肌肉中发现的回复突变纤维。

图6A比较了发明人开发的带有微基因ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC的AAV载体的结构与另一研究者(Wang et al.，2000)开发的Δ3849微基因表达框的结构。

图6B为正常小鼠肌肉中nNOS、人抗肌萎缩蛋白和nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。

图6C为mdx小鼠肌肉中nNOS、人抗肌萎缩蛋白和nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。

图6D为带有Δ3849微基因的转基因mdx小鼠肌肉中，nNOS、人抗肌萎缩蛋白和nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。

图6E为用带有本发明的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因的AVV-6载体治疗过的mdx小鼠肌肉中，nNOS、人抗肌萎缩蛋白和nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。

图7A为用带有本发明的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因的AVV-9载体治疗过的mdx小鼠肌肉中，nNOS、人类抗肌萎缩蛋白(分别对N端结构域，R16、R17和H3)，以及nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。同时还显示了AAV载体的结构图。

图7B为用带有本发明的ΔR3-15/ΔR17-23/ΔC微基因的AVV-9载体治疗过的mdx小鼠肌肉中，nNOS、人类抗肌萎缩蛋白(分别对N端结构域，R16、R17和H3)，以及nNOS活性的免疫荧光染色与组织-酶染色。同时还显示了AAV载体的结构图。

图8A-8C描述了酵母双杂交试验，显示出nNOS PDZ结构域与R16-17之间，而并非与R16或R17之间的正向相互作用。图8A是在酵母双杂交实验中所用构建子(construct)的简图。nNOS PDZ结构域***到含有DNA结合结构域的构建子中。此构建子还可表达色氨酸(Trp)。它可在缺乏Trp的培养基(Trp-)中生长。R16、R17、R16-17或互生蛋白PDZ结构域***到在含有DNA激活结构域的构建子中。这些构建子可表达亮氨酸(Leu)，它们可在缺乏亮氨酸的培养基(Leu-)中生长。R16-17的结构不同于R16或R17的结构。DNA结合结构域与DNA激活结构域之间的相互作用引发了组氨酸(His)的生成。因此，这些细胞可以在Leu-/Trp-/His-三重缺乏培养基中生长。图8B是在Leu-/Trp-/His-三重缺乏培养基中的一次代表性酵母双杂交试验。图8C是在Leu-/Trp-/His-三重缺乏培养基中的一次代表性点稀释试验。互生蛋白PDZ结构域DNA激活构建子或R16-17DNA激活构建子的共转化使酵母得以生长。与R16或R17DNA激活构建子的共转化并不能促成生长。√表示酵母细胞在三重缺乏培养基中生长；X表示酵母细胞未在三重缺乏培养基中生长。

图9A-9B显示为ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因增强了mdx骨骼肌中的肌纤维膜完整性。AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC被包装在AAV-6载体内。将6×10e10vg的载体颗粒传递至两月龄的mdx小鼠的腓肠肌(N＝4)。AAV感染后40天时进行了伊文氏蓝染料(Evans blue dye，EBD)摄取实验。对感染AAV的肌肉的系列肌肉切片拍摄了具有代表性的低倍(图9A)与高倍(图9B)免疫荧光染色显微照片。在每张照片中标出了由各抗体识别的抗原表位。微-抗肌萎缩蛋白沿肌纤维膜表达。在受损的肌纤维中聚集了伊文氏蓝染料。

图10A-10B显示ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC与ΔR4-23/ΔC微基因在mdx小鼠内导致了相似程度的肌肉力量改善。将AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC和AV.CMV.ΔR4-23/ΔC包装到AAV血清型-9(AAV-9)中。将AAV-9载体通过面部静脉注射传递至新生的雄性mdx小鼠体内(1×10e12vg颗粒/载体/鼠)。在AAV注射后三个月时测定伸趾长肌(EDL)肌肉的比力(specificforce)。使用年龄与性别相符的BL10与mdx小鼠作为肌肉力量测试的对照。星号表示BL10EDL肌肉的比力显著高于其它组。十字表示感染AAV的小鼠的比力显著高于mdx组，但低于BL10组。在感染AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC与AV.CMV.ΔR4-23/ΔC的小鼠之间并无统计学差异。样本大小，BL10为N＝4，mdx为N＝5，AV.CMV.ΔR4-23/ΔC感染的mdx小鼠为N＝6，AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC感染的mdx小鼠为N＝5。

图11A-11B显示在新生mdx4cv小鼠中***传递AAV-9AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC，提高了骨骼肌的比力并降低了血清肌酸激酶(CK)水平。将1×10e12vg的AAV-9AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC颗粒通过面部静脉注射传递至新生的雄性mdx4cv小鼠体内。在AAV感染后三个月时测试伸趾长肌(EDL)肌肉的比力(图11A)以及血清肌酸激酶水平(图11B)。使用年龄与性别相符的BL6与mdx4cv小鼠作为对照。星号表示BL6小鼠的测试结果显著优于其它组。十字表示感染AAV的小鼠的测试结果显著优于mdx4cv组，但低于BL6组。样本大小，BL6为N＝7，mdx4cv为N＝6，AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC感染的mdx4cv小鼠为N＝6。

图12A-12D显示在成年myoD/抗肌萎缩蛋白双敲除小鼠(m-dko)中***传递AAV-9AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC，提高了骨骼肌功能并降低了血清肌酸激酶(CK)水平。将5.5×10e12vg的AAV-9AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC的颗粒通过尾部静脉注射传递到两月龄的雄性m-dko小鼠体内。在AAV注射后三个月测试伸趾长肌(EDL)功能(图12A-12C)以及血清肌酸激酶水平(图12D)。使用年龄与性别相符的未被注射的同窝出生的小鼠作为对照。图12A为比抽搐力(在单次刺激下)；图12B为在不同频率的强直刺激下的比强直力；图12C为10周期的离心收缩期间的力量衰退图。星号表示感染AAV的小鼠的测试结果显著优于未感染的对照组。肌肉功能测试的样本大小，未被感染的同窝出生小鼠对照组为N＝4，感染AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC的m-dko小鼠为N＝14。CK测试的样本大小，未被感染的同窝出生小鼠对照组为N＝3，感染AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC的m-dko小鼠为N＝6。

图13为反式剪接AAV(tsAAV)载体和重叠AAV载体的转基因重建的简图。在tsAAV载体中，ITR依赖性重组重建了全长表达框。通过改造过的剪接供体(SD)与剪接接受体(SA)序列去除了双-D ITR的连接。在重叠AAV载体中，共享区域通过同源重组方式进行重组。病毒性ITRs在此过程中被去除。

图14为杂交AAV载体的转基因重建的简图。AV.CMV.LacZ.杂交5′载体包含CMV启动子、5′端的半截的LacZ基因、剪接供体(SD)以及872bp碱性磷酸酶(AP)序列。AV.CMV.LacZ.杂交3′载体包含872bp AP序列、其后的剪接受体(SA)、3′端的半截LacZ基因以及SV40多聚腺苷酸化信号(polyA)。载体基因组的两侧是AAV-2ITR。共感染时，可通过AP序列-介导的同源重组来重建完整的LacZ表达框。或者也可通过病毒性ITR-介导的头对尾重组来获得。在用细胞剪接设备(cellular splicing machinery)(虚线)去除连接序列后可实现LacZ的表达。

发明具体说明

在此所提及的所有公开文本、专利申请和专利，以及其他参考文献都是以全文引用的方式并入。

本发明发现了一个全新系列的抗肌萎缩蛋白小基因和微基因，其小到足以包装到AAV或慢病毒载体中，并且仍然保留有全长野生型抗肌萎缩蛋白基因的基本功能，包括但不限于，机械连接功能和信号传导功能(例如肌纤维膜与nNOS相关的功能)，保护肌肉避免不因营养不良而受到损伤。本发明发现，在合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因中包括入抗肌萎缩蛋白的中部杆状结构域的R16和R17重复单位对于nNOS的修复来说至关重要。换句话说，保留有R16和R17的小/微-抗肌萎缩蛋白基因可以修复肌纤维膜中的nNOS，其修复方式与全长抗肌萎缩蛋白相似。本发明进一步发现，通过使用本发明的小/微-基因进行治疗而修复的nNOS蛋白保留了它的生物功能(酶活性)。

“抗肌萎缩蛋白基因”是指具有核苷酸序列的核酸分子，其编码全长抗肌萎缩蛋白。本发明包括使用来源于任何哺乳类物种的抗肌萎缩蛋白基因，包括但不限于人类、鼠和狗，特别是人类。某特定的全长抗肌萎缩蛋白基因具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，其编码具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的全长抗肌萎缩蛋白。

“结构域”是指蛋白结构的一部分。例如，在此所述的人类的抗肌萎缩蛋白基因的“N端结构域”包括从约1至约252的氨基酸残基，特别是SEQ ID NO：1中第1个氨基酸残基蛋氨酸至第252个氨基酸残基谷氨酸，更特别的是被如SEQ ID NO：17所示的核苷酸编码的氨基酸序列。类似地，在此所述的抗肌萎缩蛋白的“中部杆状结构域”或“杆状结构域”，包括SEQ ID NO：1中约第253位至约第3112位的氨基酸残基，特别是SEQ ID NO：1中第253个氨基酸残基蛋氨酸至第3112个氨基酸残基亮氨酸。在此所述的抗肌萎缩蛋白的“富含半胱氨酸的结构域”包括SEQ ID NO：1中约第3113位至约第3408位的氨基酸残基，特别是SEQ IDNO：1中第3113个氨基酸残基精氨酸至第3048个氨基酸残基苏氨酸，更特别的是由如SEQ IDNO：46所示的核苷酸编码的氨基酸序列。在此所述的抗肌萎缩蛋白的“C端结构域”包括SEQID NO：1中约第3409位至约第3685位的氨基酸残基，特别是SEQ ID NO：47中第3409个氨基酸残基脯氨酸至第3685个氨基酸残基蛋氨酸。

“抗肌萎缩蛋白微基因”或“微-抗肌萎缩蛋白基因”或“微基因”是指等于或小于5kb长的核酸分子，其编码一个修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽(在本申请中也被称为微-抗肌萎缩蛋白)，并保留有全长抗肌萎缩蛋白的N端结构域、富含半胱氨酸的结构域、两个或多个中部杆状结构域的重复单位以及中部杆状结构域的两个或多个铰链。

“微抗肌萎缩蛋白”是指一个修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白分子，其保留有一个全长抗肌萎缩蛋白的生物功能，编码序列的长度等于或小于5kb。图1中为微抗肌萎缩蛋白的实例。

“抗肌萎缩蛋白小基因”，“小抗肌萎缩蛋白基因”或“小基因”是指长度超过5kb但小于全长抗肌萎缩蛋白编码序列的核酸分子，优选地，长度在5kb至10kb左右，更优选地，长度在约5kb至8kb左右，甚至更优选地，长度在7kb左右，其编码一个修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽(在本申请中也被称为小-抗肌萎缩蛋白)，其保留有全长抗肌萎缩蛋白的N端结构域、富含半胱氨酸的结构域、两个或多个中部杆状结构域的重复单位(也用R与一个数字表示，例如，R16指的是第16个重复单位)以及中部杆状结构域的两个或多个铰链。“小抗肌萎缩蛋白”是指一个修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白分子，其保留有全长抗肌萎缩蛋白的生物功能，编码序列的长度大于5kb但小于全长抗肌萎缩蛋白的编码序列。

抗肌萎缩蛋白的“生物功能”指某些功能，其包括但不限于在细胞骨架与细胞外基质之间提供机械连接，以及信号传导等功能，例如修复肌纤维膜中的nNOS。

用“修饰的”连接抗肌萎缩蛋白基因或抗肌萎缩蛋白，是指野生型(或自然产产生型)全长抗肌萎缩蛋白基因或抗肌萎缩蛋白分子被改变，致使修饰的抗肌萎缩蛋白基因或抗肌萎缩蛋白分子不再包括抗肌萎缩蛋白基因的全长编码序列或抗肌萎缩蛋白的全长氨基酸序列，但仍然保留或实质上保留有全长基因或蛋白的生物功能。

“修饰的N端结构域”是指在结构和/或序列上不同于野生型或自然产生型的N端结构域，但其保留有野生型或自然产生型N端结构域的功能。用“修饰或变化”是指对核酸分子或多肽进行的任何改变，例如突变，其仍保留有核酸分子或多肽的基本功能，并且/或者与该核酸分子或多肽实质上同源，或相似/等同于该核酸分子或多肽。

在一种实施方式中，本发明涉及一种核酸分子(在本发明中也称为小基因或微基因)，其含有编码修饰的或非全长的抗肌萎缩蛋白多肽，保留了N端结构域、中部杆状结构域(mid-rod domain)的两个或三个类血影蛋白重复单位，中部杆状结构域的两个或多个铰链区，以及全长抗肌萎缩蛋白多肽的富含半胱氨酸的结构域。

在一特定实施方式中，本发明的小基因或微基因进一步包括编码抗肌萎缩蛋白C端结构域的核苷酸序列。已证明，C端结构域的突变与DMD病人的认知表型相关(Tuffery等，1995；Kerr等，2001)。而且，C端结构域突变也已被证明在一类病人中导致了DMD(McCabe等，1989；Prior等，1995；Suminaga等，2004)。我们无意于用任何特定理论作限定，有人认为小-或微-抗肌萎缩蛋白基因在进一步包括编码抗肌萎缩蛋白C端结构域的DNA序列时，可为DMD提供更好的治疗或保护。在一具体实施方式中，中部杆状结构域的重复单位可来自任何物种，包括，但不限于，人类，犬类、鼠类、猪类、猪、兔、鸡。

优选地，本发明的小基因或微基因的两个或多个类血影蛋白重复单位包括中部杆状结构域的R16和R17。但是，本发明还包括其他小基因和微基因，其除了含有编码R16和R17的序列以外，还含有其他类血影蛋白重复单位的序列，包括一种或多种选自R1-15和R18-R24。例如，如图1所示，微基因可包括R1，R16，R17和R24(如，图1的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC)，或R1-R2，R16，R17和R24(如，图1的ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC)，或R1，R16-R19，和R24(如，图1的ΔR2-15/ΔH3-23/ΔC)，以上都是本发明的具体实施方式。在本发明中用到的符号“Δ”是指在核苷酸或氨基酸序列的某特定序列或区域的删除或缺失。例如，ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC代表一种微基因，其中重复单位2-15，18-23和C端结构域被删除或缺失。在另一特定实施方式中，本发明包括小基因，其含有重复单位R1-R3，R16，R17和R20-R24(如，图1的ΔR2-15/ΔR18-19)，或R1-R3和R16-R24(如，图1的ΔH2-R15)。

本发明的小基因或微基因的铰链区优选地包括，但不限于，H1和H4铰链区。但是，本发明还包括其他小基因或微基因，其除了含有H1和H4以外，还含有其他铰链区。例如，图1所示H3也可包括在某小基因中，如ΔR2-15/ΔR18-19和ΔH2-R15，这些都是本发明的具体实施方式。

在一种实施方式中，本发明涉及一种小基因或微基因，其包括一核苷酸序列，或与编码修饰的或非全长抗肌萎缩蛋白多肽的核苷酸序列高度同源(substantial homology)、高度相似或高度等同的核苷酸序列，所述修饰或非全长抗肌萎缩蛋白多肽保留了如SEQ ID NO：17所示的N端结构域，两个或多个如SEQ ID NO：19-44所示的中部杆状结构域的类血影蛋白重复单位，两个或多个如SEQ ID NO：18-45及SEQ ID NO：1所示的中部杆状结构域的铰链区，以及全长抗肌萎缩蛋白的如SEQ ID NO：46所示的富含半胱氨酸的结构域。

“高度同源”、“高度相似”或“高度等同”是指核酸序列或氨基酸序列在序列上至少有70％，优选地，至少80％，更优选地，至少90％，再优选地，至少95％的同源、相似或等同。

在另一种实施方式中，小基因或微基因是那些可以在高、中、或低严格条件(stringentconditions)下与所选序列杂交的序列。这里提到的在37-42℃低严格条件包括和包含：在杂交条件中至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺以及至少约1M到至少约2M的盐，以及在洗脱条件中至少约1M到至少约2M的盐。其他的严格条件可在必要时使用，例如中度严格，其包括和包含在杂交条件中至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺以及从至少约0.5M到至少约0.9M的盐，以及在洗脱条件中至少约0.5M到至少约0.9M盐，或高度严格，其包括和包含在杂交条件中至少约31％v/v到至少约50％v/v甲酰胺以及从至少约0.01M到至少约0.15M盐，以及在洗脱条件中至少约0.01M到至少约0.15M盐。杂交可以在不同的温度下进行，当这发生时，其他条件可相应调整。具体杂交条件的实例包括在65℃杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS进行一次或多次洗脱，最后用0.2×SSC，更优选地，用0.1×SSC和0.1％SDS进行最后一次洗脱，在室温或最高65℃或68℃的温度下进行。

在另一种实施方式中，修饰的抗肌萎缩蛋白包括，但不限于，中部杆状结构域的如SEQID NO：所示的R16和如SEQ ID NO：所示的R17。但是，本发明也包括其他修饰的抗肌萎缩蛋白，其含有R16和R17以及其他类血影蛋白重复单位，选自如SEQ ID NO：19-34分别所示的R1-R15和如SEQ ID NO：37-44分别所示的R18-R24。例如，如图1所示，修饰的抗肌萎缩蛋白可包括R1、R16、R17和R24(如图1的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC)，或R1-R2，R16，R17和R24(如，图1的ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC)，或R1，R16-R19，和R24(如，图1的ΔR2-15/ΔH3-23/ΔC)，这些都是本发明的特定实施方式。在另一种特定实施方式中，本发明包括修饰的抗肌萎缩蛋白，其含有重复单位R1-R3、R16、R17、R20-R24(如，图1的ΔR2-15/ΔR18-19)，或R1-R3、R16-R24(如，图1的ΔH2-R15)。

类似地，本发明的小基因或微基因优选地包括，但不限于，如SEQ ID NO：18所示的铰链区H1和SEQ ID NO：45所示的铰链区H4。但是，本发明还包括其他小基因和微基因，其包括H1和H4以及其他铰链区。例如，图1所示H3也可包含在小基因中，例如，ΔR2-15/ΔR18-19和ΔH2-R15，这些都是本发明特定的实施方式。

更加优选的是，本发明涉及修饰的抗肌萎缩蛋白ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC(如SEQ ID NO：13所示)，ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC(如SEQ ID NO：12所示)，ΔR2-15/ΔH3-23/ΔC(如SEQ ID NO：11所示)，以及修饰的抗肌萎缩蛋白ΔR2-15/ΔR18-19(如SEQ ID NO：8所示)以及ΔH2-15(如SEQ ID NO：7所示)。本发明的微基因和小基因的任何修饰和变动也被本发明包括在内。本发明特别包括编码前述小基因或微基因表达产物的兼并(degenerate)核酸分子。根据本发明，微-/小-抗肌萎缩蛋白基因可以通过本领域技术人员所知的常规技术合成、生成、获得或组装，在本发明下面提供的实施例中也有说明。例如，本发明的小基因和微基因可通过分子生物学技术合成，在实施例2和图3中有说明。

由本发明中的小基因和/或微基因编码的多肽也包括在本发明中。

在另一种实施方式中，本发明提供了可传递(deliver)本发明中的核酸分子的载体(vector)。任何适用于该目的的载体都包括在本发明中。特别是，本发明提供了一系列重组腺相关病毒载体(AAV)和慢病毒载体，用于传递本发明中的可修复肌纤维膜nNOS的核酸分子(小/微-抗肌萎缩蛋白基因)。本发明的重组AAV载体(单载体或双载体)包括本发明中任一核酸分子(小/微-抗肌萎缩蛋白基因)，其可修复肌纤维膜nNOS，操作性连接于表达框(启动子和polyA)以及病毒反向末端重复单位(ITR)。

优选地，本发明包括的载体包括，但不限于，AAV载体例如AV.CMV.ΔR2-15/Δ18-23/ΔC，AV.小CMV.ΔR3-15/Δ18-23/ΔC，AV.小CMV.ΔR2-15/ΔH3-R23/ΔC，AV.ΔH2-R15供体/AV.ΔH2-R15接受体，AV.ΔH2-R15/ΔR18-19.头/AV.ΔH2-R15/ΔR18-19.尾。这些载体的修饰和改动也包括在本发明中。

可根据以上说明以及下面实施例2中的描述，通过常规技术生成编码小-或微-抗肌萎缩蛋白多肽分子的小基因或微基因。然后可使用适当的限制性内切酶将小基因或微基因切除并剪接入某选择的表达框，该表达框优选地适用于AAV载体。另外，可使用已知方法将纯化的小基因或微基因核酸分子全部测序，然后制备任意多种翻译等同的(translationally equivalent)合成DNA序列，其编码氨基酸序列，这种合成序列可被***适当的表达框，该表达框优选地适用于AAV载体。

本领域已知多种表达框和载体。“表达框”(expression cassette)是指一套完整的调控序列(control sequence)包括起始序列、启动子序列和终止序列，当它们位于适当阅读框中的结构基因两侧时，在细胞中可发挥功能。表达框经常以及优选地含有多种限制性酶切位点，其适用于剪切和***任何想要的结构基因，如本发明中的微基因或小基因。很重要的一点是，克隆的基因在结构序列中有一个在正确的阅读框中的起始密码子。另外，本发明的表达框优选地包括一个强组成性启动子序列，如，CMV启动子，位于基因的一端从而导致基因以高频率被转录，以及包括一个poly A识别序列在基因的另一端从而保证对信使RNA的处理和转运。可***本发明中的微基因的优选(空)表达框的例子有，由Yue等(Yue & Duan 2002Biotechniques 33(3)：672-678)描述的pcis.RSVmcs，pcis.CMVmcs，pcis.CMVmcs-内含子，pcis.SV40mcs，pcis.SV40mcs-内含子，pcis.CK6mcs，以及pcis.CAGmcs。可***本发明小基因的优选(空)表达框的例子有，由Duan等(Duan，Yue and Engelhardt 2003Methods inMolecular Bioloev 219：29-51)描述的pDD188，pDD293和pDD295，以及由Ghosh等(Ghosh，Yue，Lai and Duan 2008Molecular Therapy 16：124-130)描述的pAG15，pAG21。高度优选的表达框可被设计为包括一种或多种选择性标记基因，例如卡那霉素抗性基因。

“载体”是指可在宿主细胞中复制和表达外来基因的DNA序列。一般来说，载体有一种或多种内切酶识别位点，可用适当的酶以可预测的方式剪切。这样的载体在构建时可优选地包括其他的结构基因序列，使之具有可识别和分离转化细胞的标记。优选的标记/选择物包括卡那霉素、氯磺隆、膦丝菌素(phosphonothricin)、潮霉素和甲氨蝶呤。载体中的外来遗传物质在细胞中得到功能性表达，这样的细胞被载体“转化”并被称为“转化子”。

特别优选的载体是AAV载体，是单链DNA分子，衍生自腺相关病毒的基因组且无致病性。

可用在表达框中的启动子包括，但不限于，nos、ocs、菜豆蛋白(phaseolin)、CaMV、RSV、CMV、SV40、CAG、CK6、和MCK启动子。表达框含有小基因或微基因，其操作性连接于理想的调控序列，表达框可连接入适当的载体用于传递。总体来说，可使用AAV载体和慢病毒载体，其含有复制和调控序列，可与宿主细胞兼容。一种适当的载体，例如单个AAV载体一般在末端带有病毒反向末端重复单位(ITR)、启动子，和微基因和多聚腺苷酸。

“双载体***”是指由两个载体例如，AAV载体组成的载体***，在***中两个载体携带需要传递的基因或序列的一部分，通过两个载体之间的相互作用重组得到完整的基因。

在一种实施方式中，本发明中的双载体***中，如AAV双载体***中的两个载体，是反剪接载体(ts载体，例如，tsAAV载体)。

在另一种实施方式中，本发明中的双载体***中的两个载体，如AAV双载体***，是杂交载体(hybrid vectors)(例如，杂交AAV载体)。反剪接AAV载体一般带有(除在单AAV载体中已有的以外)剪接供体信号和剪接接受体信号。杂交AAV载体一般带有(除在单AAV载体和反剪接载体中已有的以外)同源重叠序列，优选地来自于人胎盘碱性磷酸酶基因的中部三分之一。慢病毒载体一般带有5′长末端重复单位(LTR)，3′LTR和包装信号Ψ，如图2所示。

“操作性连接”是指，一个核酸分子与另一个核酸分子处于功能性相关的位置。例如，如果表达框(启动子和polyA)可影响小/微-抗肌萎缩蛋白基因的转录，则该表达框是操作性连接于该序列。

AAV和慢病毒载体的结构、功能和使用方面的信息在本领域为公知且可获得。本发明中的双AAV载体的包装容量大，例如至少10kb。三种经典的双载体为，顺式激活、反式剪接(ts)和重叠载体(综述请见Duan，D.，Z.Yan，and J.F.Engelhardt.2006.Expanding the capacityof AAV vectors，p.pp525-32.In M.E.Bloom，S.F.Cotmore，R.M.Linden，C.R.Parrish，and J.R.Kerr(ed.)，Parvoviruses.Hodder Arnold；Distributed in the U.S.A.by Oxford University Press，London，New York.Ghosh，A.，and D.Duan.2007.Expending Adeno-associated Viral VectorCapacity：A Tale of Two Vectors.Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 24：165-177，2007.)。

只有ts和重叠载体可以传递6kb的小基因。在tsAAV中，大的治疗基因被分割成供体载体和接受体载体。供体载体带有基因的5′端部分以及剪接供体信号。接受体载体带有剪接接受体信号以及基因的3′端部分。通过AAV反向末端重复单位(ITR)介导的分子内重组和重组基因组随后的剪接(图13)实现表达，见Duan，D.，Y.Yue，and J.F.Engelhardt.2001.Expanding AAV Packaging Capacity With Transsplicing Or Overlapping Vectors：A QuantitativeComparison.MoI Ther 4：383-91，Sun，L.，J.Li，and X.Xiao.2000.Overcoming adeno-associatedvirus vector size limitation through viral DNA heterodimerization.Nat.Med.6：599-602，and Yan，Z.，Y.Zhang，D.Duan，and J.F.Engelhardt.2000.From the Cover：Trans-splicing vectors expandthe utility of adeno-associated virus for gene therapy.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 97：6716-6721。

在重叠载体中，大的治疗基因被分割成上游载体和下游载体。上游载体和下游载体共用一个同源区(Duan，D.，Y.Yue，and J.F.Engelhardt.2001.，Halbert，C.L.，J.M.Allen，and A.D.Miller.2002.Efficient mouse airway transduction following recombination between AAV vectorscarrying parts of a larger gene.Nat Biotechnol 20：697-701)。通过同源重组实现转基因重组(图13)。通过理性载体设计，例如优化基因的分割位点，可使tsAAV载体的转化效率达到单个AAV载体的转化效率(Lai et al 2005 Nature Biotechnique：Lai et al 2006 Human Gene Therapy)。而且，tsAAV载体的***传递已被证明可有效在啮齿动物的全身肌肉中进行转导(Ghosh，Yue，Long，Bostic and Duan 2007 Molecular Therapy 16：124-130)。TsAAV介导的小基因治疗已被证明在单mdx肌肉中可减少肌肉病征，改善肌肉力量以及阻止收缩导致的受伤(Lai，Y.，D.Li，Y.Yue，and D.Duan.2007.Design of trans-splicing adeno-associated viral vectors for Duchennemuscular dystrophy gene therapy.Method in Molecular Medicine：In-pτess.，Lai，Y.，Y.Yue，M.Liu，and D.Duan.2006.Synthetic intron improves transduction efficiency of transsplicingadeno-associated viral vectors.Hum Gene Ther 17：1036-42，and Lai，Y.，Y.Yue，M.Liu，A.Ghosh，J.F.Engelhardt，J.S.Chamberlain，and D.Duan.2005.Efficient in vivo gene expression bytrans-splicing adeno-associated viral vectors.Nat Biotechnol 23：1435-9.))。

除经典的双AAV载体以外，杂交的AAV双载体***近来已被开发(Ghosh，Yue，Lai andDuan 2008 Molecular Therapy 16：124-130)。TsAAV高度依赖于最佳基因分割位点。这个缺陷可通过杂交载体***克服。在杂交AAV载体中，可通过如tsAAV载体中描述过的传统的反剪接通路，或者通过高度重组性外来DNA序列进行同源重组，从而实现转基因重组。

图1显示了其他研究者发表/研究的全长抗肌萎缩蛋白基因、小/微-抗肌萎缩蛋白基因，以及本发明人合成的代表性的小/微-抗肌萎缩蛋白基因的结构及其各自在修复肌纤维膜上nNOS的功能。在图1中，N代表抗肌萎缩蛋白的N端结构域；H1-4代表抗肌萎缩蛋白的杆状结构域的铰链区1-4；数字代表在抗肌萎缩蛋白杆状结构域中的类血影蛋白重复单位(带正电荷的重复单位以白色数字显示)；CR代表抗肌萎缩蛋白的富含半胱氨酸的结构域；C代表抗肌萎缩蛋白的C端结构域；带点的格子表示在每个构建子中被删除的区域。

如图1所示，在本发明以前，小基因Δ17-48，小基因ΔH2-R19，微基因ΔR4-R23/ΔC，和微基因Δ3849(ΔR3-21/ΔC)已有发现和研究。虽然具有其他优点，但这些小/微基因都不具有修复肌纤维膜上nNOS的功能，其他已发表的小/微抗肌萎缩蛋白也不具有这样的功能(未列在图1中)。在导致本发明的工作中，合成了新的小/微基因。还发现这些小/微基因含有R16-17重复单位，例如ΔH2-R15，ΔH2-R15/ΔR18-19，ΔH2-R15/ΔC，ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC，以及ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC，都被证明可修复nNOS，而没有R16或R17重复单位的小/微基因，例如，ΔH2-R17，ΔH2-R16，ΔH2-R15/ΔR17-19，和ΔR3-15/ΔR17-23，则缺乏这种能力。见本发明中的图1和下面提供的实施例。

图1进一步说明了微结构域的nNOS招募功能与其天然环境/位置无关。在野生型的抗肌萎缩蛋白中，R16-17被R15和R18包围。在发明的小/微-抗肌萎缩蛋白基因中，当R16-17毗邻于其他重复单位或铰链区时，如R1(例如在ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC中)，R2(例如在ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC中)，R3(例如在ΔH2-R15及其衍生物中)，H3(例如在ΔH2-R15/ΔR18-19中)，和R24(例如在ΔR2-R15/ΔR18-23/ΔC及其衍生物中)，nNOS蛋白及其功能在肌纤维膜上也可得到恢复。

相应地，在另一种实施方式中，本发明涉及一种用于在某对象中治疗DMD，BMD，和/或XLDC的方法，通过对所述对象给药治疗有效剂量的本发明中的小基因和/或微基因，优选地，通过给药带有所述小基因和/或微基因的载体，更优选地，通过对所述对象给药治疗有效剂量的含有本发明所述小基因和/或微基因的AAV载体。

“对象”是指任何哺乳动物对象，优选地，人类。与本发明方法相一致的给药途径包括局部或区域性肌肉注射用于提高病人的局部肌肉功能，对某个区域的所有肌肉或对病人全身***给药(例如静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药)，在局部和/或***给药后用AAV或慢病毒载体对肌原性干细胞进行体外感染。

“治疗有效剂量”是指某剂量，在正确的医疗鉴定(sound medical judgment)范围内，其足够高以至于可显著正向改善需治疗的状态，但又足够低以至于可避免严重的副作用(在合理的受益/风险比情况下)。治疗有效剂量会随着治疗的特定状况，或被治疗的对象的状况以及他/她的身体状况，以及使用的制备方法、载体或组合物的种类而有所不同。

在特定的实施方式中，本发明包括静脉内给药。例如，在用含R16和R17的微-抗肌萎缩蛋白基因进行AAV-9基因治疗时，对新生小鼠(1周龄或更小)的剂量为约0.5到约1.5×10e11vg颗粒/克体重或约50到约75μl/克体重；对年轻小鼠(1周龄到1月龄)的剂量为约0.5到约1.5×10e11vg颗粒/克体重或约75到约200μl/克体重；对成年小鼠(1到20月大)的剂量为约0.5到约1.5×10e11vg颗粒/克体重或约200到约400μl/克体重；对新生狗(三天龄或更小)的剂量为约0.5到约2×10e11vg颗粒/克体重或约10到约25μl/克体重；对年轻狗(3天龄到3月龄)的剂量为约0.5到约2×10e11vg颗粒/克体重或约10到约25μl/克体重；对成年狗(3月大或更大)的剂量为约1到约3×10e11vg颗粒/克体重或约15到约30μl/克体重。

根据本发明，在发现抗肌萎缩蛋白中可招募nNOS的R16-17微结构域后，该微结构域可被整合入非病毒和/或病毒基因治疗载体，和/或细胞治疗中，用于治疗抗肌萎缩蛋白缺乏疾病如DMD、BMD、和XLDC。本发明提供了一系列AAV小/微抗肌萎缩蛋白载体，其可在抗肌萎缩蛋白缺乏的肌肉中修复nNOS。重组AAV载体包括可修复nNOS的抗肌萎缩蛋白的小基因/微基因，表达框(启动子和poly A)，和病毒反向末端重复单位(ITR)。图2列举了带有本发明中的小/微抗肌萎缩蛋白基因的AAV载体的构建子。

在另一种实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其含有一种或多种本发明的AAV载体和慢病毒载体和未修饰的质粒DNA分子以及一种药用可接受运载物(carrier)。

核酸的药物制剂，剂型以及给药方式已经基本上公开，例如，在Felgner等的美国专利5580859中。局部给药和***给药都应包括在本发明中。当本发明的分子用于预防用途时，本发明的物质可作为长期使用，优选通过***给药。

含有本发明的治疗物质的一种或多种合适的单位剂型可选择性地制成缓释制剂，可通过多种途径给药，包括口服，或非肠道给药(non-parental)，包括直肠给药、透皮给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、胸内给药、肺内给药以及鼻腔内给药等。在适当的时候，所述制剂可以以分散的单位制剂形式方便的提供，并可以通过药学领域公知的任何方法制备。这些方法可包括，将治疗物质与液体运载物、固体基质、半固体运载物、精细筛分的(finely divided)固体运载物或以上的组合，混合，然后，如有有必要的话，将产品加入理想的传递***或将产品定型为理想的传递***。

当为口服给药而制备本发明的治疗物质时，可优选地将其与药用可接受的运载物、稀释剂或辅料相结合形成药物制剂，或单位剂型。“药用可接受”是指，所述运载物、稀释剂、辅料、和/或盐必须与该制剂的其他成分相兼容，且对接受者无害。口服制剂的活性成分可以是粉末或颗粒形式；可以是溶液、混悬液或乳液形式；或者可以是在可实现的基质(achievablebase)中，如合成树脂可用于从咀嚼胶中摄入活性成分。所述活性成分也可以是大药丸、煎膏剂或糊剂形式。

含有本发明的药物组合物的药物制剂可通过本领域公知的方法使用公知的可获得的成分进行制备。例如，所述物质可以与常见辅料、稀释剂、或运载物进行制剂，可形成片剂、胶囊剂、混悬剂、粉末剂，以及类似剂型。适用于这样制剂的辅料、稀释剂和运载物的实例包括以下填充剂和补充剂例如，淀粉、糖类、甘露醇，和硅酸衍生物；粘合剂例如羧甲基纤维素，HPMC和其他纤维素衍生物，海藻酸盐、明胶，和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂例如甘油；崩解剂例如碳酸钙和碳酸氢钠；溶解阻滞剂例如石蜡；再吸收增速剂例如季铵类化合物；表面活性剂例如十六烷醇，单硬脂酸甘油；吸附运载物例如高岭土和膨润土；以及润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁，以及固体聚乙二醇。

本发明的治疗物质还可被制成便于口服的酏剂或溶液剂或适用于非肠道给药的溶液剂，例如通过肌肉内给药、皮下给药或静脉给药途径。本发明的治疗物质的药物制剂还可以是水相或非水相溶液或分散剂的形式，或者是乳剂或混悬剂的形式。

因此，所述治疗物质可以制成非肠道给药制剂(例如，注射制剂，例如，单次浓注射(bolusinjection)或连续滴注)，可以是在安瓿中、预填充的针管中、小体积滴注容器中的单位剂型或者是在添加有防腐剂的多剂量容器中的单位剂型。活性成分可以是混悬剂、溶液剂或油相载体或水相载体的乳剂，以及可以含有助制剂(formulatory)物质例如助悬剂、稳定剂、和/或分散剂。另外，活性物质可以是粉末形式，通过无菌分离无菌固体或从溶液中冻干获得，用于在使用前与适当的溶媒重组，即，与无菌、无热原水重组。

这些制剂含有药用可接受的溶媒和佐剂，其都为本领域公知的现有技术。

本发明的组合物还可含有增稠剂例如纤维素和/或纤维素衍生物。他们还可含有树胶(gum)例如黄原胶、瓜尔胶、卡波胶(carbo gum)、***胶，或其他聚乙二醇类，陶土类(bentones)以及高岭石类，以及其类似物。

如果必要的话，还可添加佐剂，佐剂可选自抗氧剂、表面活性剂、其他防腐剂、薄膜形成剂、角质溶解剂、或抗粉刺剂(comedolytic agents)、香味剂和着色剂。另外，还可加入其他活性成分，不管是针对所述状态的或是针对某些其他状态的。

本发明的药物组合物的局部传递也可通过多种技术，将所述物质给药至病灶(diseasesite)或接近病灶。定点的(site specific)或靶向局部给药技术的实例不意在限制但作为可用技术的举例描述。实例包括局部给药导管，例如滴注导管或留置导管，例如，滴注导管针、分流器和支架或其他可植入器械，定点运载物，直接注射，或直接应用方式。

特别地，为了将本发明的载体传递至某组织如肌肉，可使用任何物理或生物方法将所述载体导入某宿主动物的肌肉组织中。载体是指裸露的重组载体以及包装在病毒包膜蛋白中的载体DNA，这是AAV给药中所公知的。实验已经证明，仅需将AAV载体溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)或溶于N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸(HEPES)缓冲溶液中就足够提供可用于肌肉组织表达的载体，而且在与该载体共同给药的运载物或其他组分上没有已知的限制(虽然对载体的常规操作中应避免降解DNA的组分)。药物组合物可制成可注射的制剂或可通过透皮运输传递至肌肉的外用制剂。前人已经开发了无数的可用于肌肉注射和透皮运输的制剂，这些在本发明中都可应用。为方便给药和方便使用，载体可以与任何药用可接受的运载物一起使用。

为肌肉注射的目的，可在佐剂例如芝麻油或花生油或水相丙二醇中使用溶液，以及无菌水相溶液。这样的水相溶液可以是缓冲体系，如果希望的话，可以首先用盐或葡萄糖将液体稀释剂做到等渗。可以通过在水中适当混合表面活性剂例如羟丙基纤维素，来制备AAV载体作为游离酸(DNA含有酸性磷酸盐基团)的溶液或AAV载体作为药用可接受盐的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇以及其混合物中或在油中制备AAV病毒颗粒。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以阻止微生物的生长。在这一点上，本领域技术人员通过公知的标准技术即可得到无菌水相溶媒。

适用于注射用途的药物剂型包括无菌水相溶液剂或分散剂和无菌粉末用于临用时制备无菌可注射溶液剂或分散剂。在所有的情况下，这些剂型必须是无菌的且必须在某种程度上为流体以保证可注射性(syringability)。其必须在生产和储存条件下稳定，且必须防止被微生物例如细菌和真菌污染。所述运载物可以是溶剂或分散媒介，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇以及类似物)，以上的适当的混合物、以及植物油。应保持适当的流动性，例如，可通过使用包衣例如卵磷脂，在分散剂的情况下可通过保持所需的粒径，以及可通过使用表面活性剂的方法。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞以及其类似物等，防止微生物的作用。在许多情况下，可优选包括等渗剂，例如，糖类或氯化钠。可通过使用吸收延迟剂，例如，硬脂酸镁和明胶，从而延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液剂的制备可通过将需要量的所述AAV载体，与多种前述的所需的其他成分共同加入适当的溶剂，再进行过滤除菌。一般来说，分散剂的制备可通过将无菌的活性成分加入无菌溶媒，其含有基本分散溶媒以及上述所需的其他成分。在用无菌粉末制备无菌注射用溶液剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥，从先前过滤除菌的溶液中得到活性成分加上其他附加理想成分的粉末。

本发明的治疗化合物可单独给药或与药用可接受的运载物联合给药于哺乳动物。活性成分和运载物的相对比例可根据化合物的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准的药学惯例来决定。本发明中治疗成分的最适合预防或治疗的剂量根据给药形式、选择的特定化合物以及接受治疗的特定病人的生理情况会有所不同。一般来说，最初会使用小剂量，如果必要的话，可以小幅度递增直到在一定条件下达到最佳效果。剂量的实例在下面的实施例中有描述。

由于AAV已被证明适用于广泛的宿主范围(用于肺部表达)且在肌肉中可持续存在(persist)，因此本发明的载体可应用于在任何动物中表达某基因，特别是在哺乳动物、鸟类、鱼类、和爬行动物中，尤其是在家养哺乳动物和鸟类中例如牛、羊、猪、马、狗、猫、鸡、和火鸡。特别优选的用途是对人和兽医方面的应用。

被表达的基因既可以是编码某蛋白的DNA片段，和使用者想要的任何调控序列(如启动子、操纵子)，也可以是非编码的DNA片段，其转录可产生完整的或部分的某些含RNA的分子(如转录调控序列，+RNA，或反义分子)。

腺相关病毒载体与上述载体***相比有特定的优势。首先，像腺病毒一样，AAV可有效感染不***细胞。第二，在载体中所有AAV病毒基因都已被除去。由于病毒基因表达导致的免疫反应已不成问题，因此AAV载体比腺病毒载体更安全。第三，野生型AAV天然就是整合型病毒，因此其可整合到宿主染色体且会在细胞中稳定保持转基因。第四，重组AAV载体可在哺乳动物组织如肌肉中作为附加体(episomal)稳定存在多年，特别是在啮齿类动物、狗和人中。附加体的形式被认为是AAV在体内组织中介导的转化中占主导地位的形式。第五，AAV是极其稳定的病毒，其可抵抗多种去污剂，pH变化和热(在56℃可稳定超过1小时)。它可被冻干并重溶且不失活。因此它是基因治疗中非常具有前景的传递载体。

本发明进一步提供了实施例，包括发明的小/微基因的制备，nNOS修复的检测、nNOS蛋白活性的检测、发明的AAV载体的表达。以下提供的实施例仅旨在例举一些实施方式，而不应以任何方式理解为限制权利要求的范围，其范围仅被说明书所界定。

实施例1：实验方法：

动物模型和体内基因传递。本发明中描述的所有动物实验都已获得密苏里大学动物管理和使用委员会的批准，并遵守国立卫生院的指导原则。正常实验小鼠(BL10小鼠)和抗肌萎缩蛋白缺陷的实验小鼠(mdx和mdx4cv小鼠)最初购自杰克逊实验室(BarHarbor，Maine)。myoD/抗肌萎缩蛋白双敲除(m-dko)的小鼠最初从渥太华研究所的麦克·罗德尼克博士处获得。随后在密苏里大学通过内部繁育建立克隆种系(colonies)，小鼠(包括实验小鼠和繁育配对)在特定的无病原体动物房中饲养，温度20-23℃，光照-黑暗循环为12小时-12小时。将两块肌肉(胫骨前肌(TA)和腓肠肌)用于评价抗肌萎缩蛋白的表达，nNOS的表达以及nNOS活性，通过体内局部转染非病毒质粒或腺病毒介导的局部基因传递。在腺病毒介导的基因传递(局部和***传递)后，将伸趾长肌(EDL)肌肉用于评价抗肌萎缩蛋白的表达、nNOS的表达、nNOS活性和肌肉力量的改善。在静脉***基因传递后，对全身肌肉(包括骨骼肌和心肌)都进行分析，测定抗肌萎缩蛋白的表达，nNOS的表达以及nNOS活性和肌肉病理的改善。为将质粒或腺病毒传递至这些肌肉，肌肉的近端首先开一条2-3毫米的口。将33G汉密尔顿针***肌肉的中间腹部(belly)。将载体(质粒或腺病毒)注射入肌肉，同时缓慢退出注射针。缝合伤口，监测动物直到其苏醒。

人抗肌萎缩蛋白和nNOS的双免疫荧光染色。所有报道过的小/微-抗肌萎缩蛋白基因以及发明出的小/微-抗肌萎缩蛋白基因都是根据人抗肌萎缩蛋白的cDNA建立模型的。为评价合成小/微-基因的表达，使用了一种单克隆抗体，其可特异性地与人抗肌萎缩蛋白的铰链1区反应，而不与小鼠的抗肌萎缩蛋白反应(Dys-3，克隆Dy10/12B2，IgG2a；1∶20稀释；Novocastra公司，纽卡斯尔，英国)。为评价nNOS的表达，使用一种抗nNOS的C端的多克隆抗体(1∶2000稀释；圣克鲁兹，圣克鲁兹，加利福利亚州)。该多克隆抗体在小鼠肌肉中的背景信号非常低。

以下为双免疫染色法的操作步骤说明。简要地说，用KPBS(365μM KH₂PO₄，1.64mMK₂HPO₄，160mM NaCl)冲洗8μm空气干燥的冷冻切片。用1％山羊血清KPBS溶液室温封闭15分钟。用0.2％明胶(Sigma，圣路易，密苏里州)的KPBS溶液洗。加入抗nNOS抗体4℃过夜。用0.2％明胶的KPBS溶液洗。加入Alex488缀合的羊抗兔抗体(1∶100稀释；Molecular Probe，Eugene，俄勒冈州)显示nNOS的蛋白表达。第二步需要使用在小鼠肌肉中使用鼠单克隆抗体。首先，封闭以阻止二抗与内源小鼠免疫球蛋白(Ig)的结合。用木瓜蛋白酶消化的兔抗鼠IgG(包括Fab和Fc片段)进行封闭。简要的说，兔抗鼠IgG(Sigma，圣路易，密苏里州)用木瓜蛋白酶(Sigma，圣路易，密苏里州)在1mM EDTA和22mM L-半胱氨酸(Sigma，圣路易，密苏里州)存在的条件下，在37℃消化16小时。消化反应用碘乙酸(Sigma，圣路易，密苏里州)终止。双免疫染色中，用nNOS抗体染过色的冰冻切片用抗鼠IgG封闭溶液在室温封闭60分钟。冰冻切片用PBS洗后，再用20％兔血清(杰克逊免疫研究实验室，West Grove，宾夕法尼亚州)在室温封闭30分钟。用PBS洗后，加入Dys-3单克隆抗体(用1％兔血清稀释)4℃过夜。用PBS洗后，用Alex594缀合的羊抗鼠抗体(Molecular Probe，Eugene，俄勒冈州)显示人抗肌萎缩蛋白抗原表位。为细胞核成像以及减少光漂白(photobleaching)，用抗光衰退试剂盒(SlowFade Light Antifade Kit)将切片用DAPI(Molecular Probe，Eugene，俄勒冈州)染色(mounted)。用尼康E800荧光显微镜的Qimage Retiga 1300照相机拍下显微照片(photomicrographs)。

组织-酶染色检测nNOS活性。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)黄递酶(diaphorase)活性的减弱，对nNOS活性进行组织化学监测(Hope等，1991；Bredt等，1991；Dawson等，1991)。nNOS是一种NDAPH黄递酶(Hope等，1991)。本质上说，nNOS将NADPH作为一个电子供体，把无色可溶的四唑硝基蓝(NBT)盐转化成为蓝色不溶的甲臜(formazan)。为检测肌肉中的nNOS活性，将16μm空气干燥的冰冻切片首先用4％多聚甲醛在4℃固定2小时。这个步骤使其他细胞酶如脱氢酶和P450的非特异性NADPH黄递酶活性失活。而来自nNOS的NADPH黄递酶活性则可抵抗多聚甲醛的固定(Matsumoto等，1993；Spessert and Claassen，1998)。

用磷酸盐缓冲溶液(PBS)简单冲洗后，将组织切片用0.2％Triton X-100在37℃浸润20分钟。然后用含有0.2％Triton X-100，0.2mM NADPH，和0.16mg/ml NBT的溶液在37℃染色4小时，显示NADPH黄递酶的活性。功能性的nNOS酶在显微镜的亮区显示蓝色染色。用尼康E800荧光显微镜的Qimage Retiga 1300照相机拍下显微照片。

重组AAV-6的生成。用于AAV包装的顺式质粒带有本发明中的小/微基因如ΔR2-15/R18-23/ΔC微基因。我们无意于被任何机制限制，R16-17微结构域被认为是在这些小/微基因中起nNOS修复作用。为得到AAV载体，包装细胞系(293细胞)在质粒转染前48小时以1∶6的比例分到150mm的培养盘中。为获得AAV-6载体，共同转染一共四种质粒。这些包括顺式质粒，pMT-Rep2，pCMVCap6和pHelper。每次载体准备(15×150mm培养盘)使用187.5μg顺式质粒，187.5μg pMT-Rep2，562.5μg pCMVCap6和562.5μg pHelper(比例为1∶1∶3∶3)。所有质粒在15.2ml水中完全混合后，加入1.68ml CaCl₂使终浓度成250mM。将DNA/CaCl₂混合液缓慢滴加至16.8ml 2×HBS中，以形成DNA-磷酸盐沉淀。然后将DNA-磷酸盐沉淀逐滴加入293细胞中，同时摇晃培养盘。转染后72小时，用细胞收集器(cell lifer)(Corning Incorporated，Corning，纽约)收集细胞裂解液。在台式离心机中离心(3000rpm，4℃)20分钟后，将细胞沉淀(cell pellet)重悬于9ml 10mM的Tris-HCl(pH8.0)中。细胞沉淀用干冰/乙醇和40℃水浴冻融8到10次。细胞沉淀在功率输出为5.5的条件下超声10分钟(冰上)(Misonic Cell Disruptor S3000；Misonix，纽约)。细胞沉淀在37℃用DNA酶I消化45分钟。再次在功率输出为5.5的条件下超声7分钟(冰上)。裂解液用1/10体积的0.25％胰蛋白酶和10％脱氧胆酸钠在37℃消化30分钟。在4℃以4000rpm离心30分钟得到澄清的细胞裂解液。将上清液转移至一个新管中。用10mM的Tris(pH8)将体积调整至29ml，并加入18.2g的CsCl₂(终浓度，0.613g CsCl₂/ml)。溶液在37℃培养30分钟以溶解CsCl₂，然后在4℃以4000rpm离心30分钟。将上清液加入至6支5ml贝克曼超离心管中，放入SW55Ti转头中，在4℃以46,000rpm离心40hr。用20号(Gauge)针从管底收集层分(fraction)。用放射性标记的人抗肌萎缩蛋白基因特异性探针通过狭缝转印(slot blot)识别含有病毒的层分(fraction)。含有最高病毒滴度的层分(fraction)合并在一起并在4℃以46,000rpm离心40hr。收集层分(fraction)并通过狭缝转印(slot blot)识别含有最高病毒的层分(fraction)。病毒储存液在HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.8)中在4℃透析2×24小时。

重组AAV-9的生成。用于AAV-6包装的同样的顺式质粒也用于AAV-9的包装。除了包装质粒以外，转染和纯化操作基本上与AAV-6制备中的相同。未使用四质粒共转染方法，而是使用一种三质粒转染方法，使用顺式质粒，pRep2/Cap9和pHelper，比例为1∶1∶3(187.5μg顺式质粒，187.5μg pRep2/Cap9和562.5μg pHelper)(Bostick et al，2007；Ghosh et al，2007)。

实施例2：小/微-抗肌萎缩蛋白基因

抗肌萎缩蛋白小基因的一个例子，ΔH2-R15，可通过使用ΔH2-R19小基因作为模板得到。图3显示，原型构建子的鉴定酶切包括全长基因，ΔH2-R19小基因以及三个新合成的小基因。ΔH2-R19小基因不能在肌纤维膜中修复nNOS，但正在进行DMD基因治疗的研究(Harper et al，2002；Lai et al，2005)。ΔH2-R17，ΔH2-R16和ΔH2-R15三个小基因与ΔH2-R19小基因相比，分别另含有两个(R18和R19)、三个(R17、R18和R19)、和四个(R16、R17、R18和R19)额外的重复单位。额外的重复单位可通过鉴定条带的分子量逐渐增加而显现。特别是，每个构建子用Nsi I/Sal I双酶切后可从转基因中释放出鉴定片段。酶切后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳。鉴定条带的大小用分子量标记(1kb梯度)确定。星号表示ΔH2-R19构建子由于不完全酶切造成的残留质粒。

与合成的小-抗肌萎缩蛋白基因相似，合成的微-抗肌萎缩蛋白基因也可通过标准的分子生物学克隆过程得到。过程基本如下，将相关的DNA序列(如重复单位，铰链区等)通过高保真PCR反应扩增，然后用T4 DNA连接酶通过酶连接重新组装。然后将重组的合成DNA分子用标准DNA重组技术转化至感受态大肠杆菌中。通过限制性酶切鉴定正确的克隆。这些克隆进一步通过DNA测序确证。

实施例3：nNOS修复

图4为免疫荧光分析结果，显示在两月龄的mdx小鼠中，用全长或某些合成小-抗肌萎缩蛋白基因，ΔH2-R15，ΔH2-R16，ΔH2-R17，或ΔH2-R19治疗后，骨骼肌中nNOS的修复以及抗肌萎缩蛋白的表达。同时还显示了未治疗的mdx小鼠肌肉的回复突变纤维克隆。

实验中，在两月龄的mdx小鼠的胫骨前肌(TA)和腓肠肌中注射入带有全长人抗肌萎缩蛋白cDNA，ΔH2-R19，ΔH2-R17，ΔH2-R16，或发明的ΔH2-R15小基因的质粒。所有小基因都衍生自人抗肌萎缩蛋白基因，并可被一种单克隆抗体(Dys-3)识别，该单克隆抗体可特异性识别仅存在于人抗肌萎缩蛋白的某个抗原表位(这个抗体在本申请中被称为Hum Dys抗体)。在所有这些构建子中，转基因在CMV启动子和SV40 polyA的转录调控下表达。

在注射时，在mdx肌肉中除少数回复突变纤维外没有抗肌萎缩蛋白表达。mdx肌肉中抗肌萎缩蛋白表达的缺失是因为在这种模型中小鼠抗肌萎缩蛋白基因的外含子23位有一个点突变。这个突变导致了翻译的提早终止以及抗肌萎缩蛋白表达丢失。偶尔地，突变外显子被跳过从而会产生RNA转录子。这就使得抗肌萎缩蛋白使在含有跳过转录子(skippedtranscripts)的肌纤维中表达。这些肌纤维被称为回复突变。回复突变肌纤维的出现频率通常＜1％。由于回复突变肌纤维带有小鼠抗肌萎缩蛋白，因此它不能被人抗肌萎缩蛋白特异性的抗体识别。

为了得到抗肌萎缩蛋白表达与小抗肌萎缩蛋白基因(ΔH2-R15)中nNOS表达的关联，以及与人全长抗肌萎缩蛋白基因对照和其他对照小基因(ΔH2-R19，ΔH2-R17，ΔH2-R16)中nNOS表达之间的关联，在免疫染色中使用两种不同的抗体，Hum Dys抗体和nNOS抗体。如图4所示，Hum Dys抗体(图4，顶行)仅与人抗肌萎缩蛋白反应而不识别回复突变肌纤维中的鼠抗肌萎缩蛋白。nNOS抗体(图4，中间行)可识别肌纤维膜中存在的nNOS。在转染了全长抗肌萎缩蛋白质粒的细胞和转染了ΔH2-R15小基因的细胞中，以及在回复突变肌纤维中都有正染色，但在转染了ΔH2-R19，ΔH2-R17，ΔH2-R16小基因的肌纤维中没有正染色。在合并后的图像中(图4，底行)，可修复nNOS蛋白的构建子显示为黄色(全长和ΔH2-R15)，而不可修复nNOS蛋白的构建子显示为红色(ΔH2-R16，ΔH2-R17，ΔH2-R19)。在回复突变肌纤维中的鼠抗肌萎缩蛋白不能被Dys-3抗体识别，在合并后的图像中显示为绿色。标度尺为50μm。

表2为图4中显示的免疫染色结果的量化。表2提供了总结性的证据证明发明的ΔH2-R15小基因可修复肌纤维膜中的nNOS。

图5为另外的免疫荧光分析结果，显示在肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠中，用三种另外的合成小/微基因ΔH2-R15/ΔH18-19，ΔH2-R15/ΔC，或ΔR3-15/ΔR18-23/ΔC治疗后，骨骼肌中nNOS的修复以及抗肌萎缩蛋白的表达。同时还显示了未治疗的mdx小鼠肌肉的回复突变纤维。

同样地，所述的另外的小/微基因也是在CMV启动子和SV40 polyA的转录调控下表达。将带有这些发明的基因的质粒注射入两月龄mdx小鼠的TA或腓肠肌中。一到两周后测定抗肌萎缩蛋白的表达和nNOS的修复。这些发明的小/微基因的表达通过特异性识别人抗肌萎缩蛋白抗原表位的抗体(红色)检测。nNOS的表达通过nNOS特异性抗体(绿色)显示。合并的图像显示，发明的小/微-抗肌萎缩蛋白和nNOS蛋白有共定位(黄色)。在这些显微照片中，带有发明的小/微基因的纤维用星号标记。在未处理的肌肉(无质粒)中，仅检测到回复突变肌纤维(十字)。标度尺为50μm。

实施例4：nNOS活性测试

通过严格的(stringent)组织-酶实验确定招募的nNOS蛋白的生物化学功能。nNOS-活性结果包括在图5，6B-6E和7A-7B中，nNOS活性染色在亮区图像中显示为蓝色。一个重要的关注点是，在用发明的小/微基因进行治疗后，通过免疫荧光检测到的nNOS蛋白是否确实是一个功能性蛋白。nNOS具有NADPH黄递酶活性(Hope et al，1991；Bredt et al，1991；Dawson et al，1991)。本质上，这种酶活性使电子从NADPH转移至一种无色可溶的四唑硝基蓝盐，并最终生成一种无色不可溶的甲臜衍生物(Beesley，1995；Rothe et al，2005)。nNOS活性实验，即发明人使用的组织-酶实验，之前已被其他研究者用于证明nNOS和α-互生蛋白(Kameya et al，1999)之间的功能性相互作用。免疫荧光染色中显示n-NOS蛋白正染色的肌纤维在原位酶实验中也显示出了nNOS活性实验结果。表3显示了图5中免疫染色的量化和nNOS活性实验的结果。表3提供了清楚的证据证明有R16-17微-结构域的小/微基因可在肌纤维膜中修复功能性nNOS蛋白。R16-17微-结构域对nNOS的招募活性与其在全长蛋白中的天然位置无关。表3的结果进一步证明了这一结论，即发明的小/微基因对nNOS的修复与抗肌萎缩蛋白的C端结构域无关。

实施例5：含有小/微基因的AAV载体

图6A显示了AAV载体的一个例子，即，含有ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因的AAV载体，并与全长蛋白和现有的Δ3849微基因表达框(cassette)(Wang et al，2000)作比较。AAV载体的表达框含有CMV启动子，ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因，和SV40 polyA。整个表达框两端连接有AAV的ITR。AAV载体的获得是通过将整个构建子(AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC)包装至具有所选择的AAV血清型(serotype)的衣壳(capsid)中，血清型例如AAV-6，AAV-8，和AAV-9。图6A还显示了另一个微抗肌萎缩蛋白表达框(MCK.ΔR3-22/ΔC)的结构。这个微基因最初被其作者称为“Δ3849小基因”(Wang et al，2000)。为方便比较，将其重命名为ΔR3-22/ΔC微基因以便反映出其分子结构。

图6B到6E显示了免疫荧光染色和nNOS活性染色的结果。在图6B到6E中，微基因的表达(来自转基因mdx小鼠，如6D所示；或来自发明的AAV-6载体，如6E所示)通过特异性识别人抗肌萎缩蛋白抗原表位的单克隆抗体以红色显示。nNOS蛋白使用nNOS特异性的多克隆抗体以绿色显示。细胞核用DAPI染色以蓝色显示。nNOS的酶活性在亮区显微镜下在肌纤维膜上用蓝色显示。在这些栏中，顶行的显微照片为低倍图像(标度尺，500μm)。底行的显微照片分别为顶行显微照片中的带框区域的放大图像(标度尺，100μm)。

在这些实验中，AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC使用已知的实验方法包装成AAV-6，然后将包装好的AAV载体传递至两月龄mdx小鼠的TA肌肉中(Lai et al，2005；Ghosh et al，2006；Yue et al，2006；Lai et al，2006)。三周后收集AAV感染的肌肉。

图6B显示了在正常小鼠TA肌肉中肌纤维膜nNOS的位置。在正常小鼠肌肉中，用特异性识别人抗肌萎缩蛋白抗原表位的抗体(Dys-3)检测不到人抗肌萎缩蛋白。在正常小鼠肌肉中检测到大量nNOS蛋白和nNOS活性。已证明nNOS倾向于表达在II类纤维中。在小鼠的TA肌肉中，99％的纤维都是II类纤维。星号显示了少数的nNOS蛋白和nNOS活性显阴性的肌纤维(＜1％)。这些是I类纤维。

图6C显示了在mdx肌肉中肌纤维膜上缺少nNOS蛋白和nNOS活性。在mdx小鼠肌肉中，用特异性识别人抗肌萎缩蛋白抗原表位的抗体(Hum Dys)检测不到人抗肌萎缩蛋白。箭头指示少见的具有nNOS蛋白和nNOS活性的回复突变纤维。

图6D证明了已发表的ΔR3-21/ΔC微基因无法修复肌纤维膜的nNOS。#号表示一个具有代表型的肌纤维，其表达ΔR3-21/ΔC微基因但nNOS蛋白和nNOS活性呈阴性。

图6E显示了发明的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因AAV载体对nNOS蛋白和nNOS活性的成功修复。AAV-6(AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC)有效感染了mdx TA肌肉的大部分肌纤维。十字表示一个具有代表性的肌纤维，其表达了ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因且呈nNOS阳性。双十字表示一具有代表性的肌纤维，其未被AAV感染故没有ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因的表达或nNOS蛋白/活性。与表达ΔR3-21/ΔC微基因的肌肉不同的是，所有的ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因阳性的纤维还表现出对nNOS蛋白和nNOS活性的阳性染色。而ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因阴性的纤维对nNOS蛋白和nNOS活性基本上也呈阴性。

实施例6：R16和R17重复单位在发明的微-基因AAV载体对nNOS的修复中都为必需。

图7A和7B显示免疫荧光染色和nNOS活性染色结果。在这些实验中，通过已知的实验方法将AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC(图7A)和AV.CMV.ΔR3-15/ΔR17-23/ΔC(图7B)包装入AAV-9中，然后将包装后的AAV载体传递至50天龄的mdx小鼠的TA肌肉中(Bostick等，2007；Ghosh等，2007)。30天后收集被AAV感染的肌肉。

图7A显示，发明的ΔR2-15/R18-23/ΔC微基因AAV-9载体成功修复了nNOS蛋白和nNOS活性。为检测ΔR2-15/R18-23/ΔC微基因的表达，使用了四种不同的抗肌萎缩蛋白的抗体。铰链1抗体(也称作Dys 3)仅识别人抗肌萎缩蛋白的铰链1。R16抗体(也称作Mandys106)识别抗肌萎缩蛋白重复单位16。R17抗体(也称作Manex 44A)识别抗肌萎缩蛋白重复单位17。铰链3抗体(也称作Manex 50)识别抗肌萎缩蛋白铰链3。发明的ΔR2-15/R18-23/ΔC微基因不含H3。因此，铰链3抗体仅检测到少量的回复突变纤维。铰链1、R16和R17抗体显示，AV.CMV.ΔR2-15/R18-23/ΔC载体得到大量转化。这些转入AAV的肌纤维还表达了nNOS蛋白并显示了nNOS活性(标度尺，500μm)。

图7B显示在感染了AV.CMV.ΔR3-15/R17-23/ΔC AAV-9载体的mdx肌肉的肌纤维膜中缺乏nNOS蛋白和nNOS活性。这个微基因不含R17。因此，用R17抗体仅检测到少量的回复突变纤维。

虽然本发明的描述与具体实施方法相关，但是应理解，发明的方法可进行进一步的改进。本专利申请意在包括大体上根据本发明的原则而作出的对本发明的任何变动、使用、或改动，以及包括对本发明的改换，这种改换在本发明相关领域的已知或常用技术范围内，且可适用于前述的基本特征以及下面的权利要求的范围内。

实施例7：酵母双杂交研究结果显示R16-17和nNOS的PDZ结构域之间存在相互作用。

我们在mdx小鼠的体内研究表明，仅有R16(例如在ΔR3-15/R17-23/ΔC微基因中)或仅有R17(例如在ΔH2-R16微基因中)都不能修复肌纤维膜中nNOS的表达。但是，当R16和R17两者都存在时(例如在ΔR2-15/R18-23/ΔC微基因中)，nNOS可被招募到肌纤维膜。为确定R16-17和nNOS的PDZ结构域之间是否存在直接的相互作用，我们进行了酵母双杂交试验(图8)。

结合构建子表达DNA结合域，色氨酸(Trp)和nNOS的PDZ结构域(图8A)。激活构建子表达DNA激活域，亮氨酸(Leu)和抗肌萎缩蛋白类血影蛋白重复单位(仅R16，仅R17或R16和R17两者都有)(图8A)。带有互生蛋白PDZ结构域的激活构建子在实验中作为阳性对照。DNA结合结构域和DNA激活结构域之间的相互作用可开启组氨酸(His)的生成(图8A)。转入单个构建子的酵母细胞不能在Leu-/Trp-双缺乏的培养盘上生长。共同转入结合和激活构建子的酵母细胞可以在Leu-/Trp-培养盘上生长。在阳性对照中，互生蛋白的PDZ结构域和nNOS的PDZ结构域之间的相互作用导致组氨酸的生成。这使得酵母细胞可以在Leu-/Trp-/His-三缺乏的培养盘上生长(图8B和图8C)。我们观察到共同转染入R16-17激活构建子的酵母细胞的生长，但未观察到共转染入R16或R17激活构建子的酵母细胞的生长(图8B和8C)。综上，我们的酵母双杂交实验结果表明，在R16-17和nNOS的PDZ结构域之间存在直接的相互作用。但是，仅R16或仅R17都不能与nNOS的PDZ结构域产生相互作用。

含有R16-17的微-抗肌萎缩蛋白基因可增强肌纤维膜。抗肌萎缩蛋白为肌纤维膜提供了力学支持。在抗肌萎缩蛋白缺失的情况下，肌肉收缩导致肌纤维膜损伤。这可以通过受伤肌纤维中伊文氏蓝染料的聚集来测定。将AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC传递至两月龄的成年mdx小鼠的腓肠肌中，40天后进行EBD摄入实验。用特异性识别N端、R16和R17的抗体进行系列免疫荧光染色，结果显示微基因表达(图9)。R6-8和C端在ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因中被删除。特异性识别这些区域的抗体不能得到阳性染色。仅在未被AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC载体转染的肌纤维中观察到EBD。

含有R16-17的微-抗肌萎缩蛋白基因可在杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)的小鼠模型中改善肌肉力量。ΔR4-23微基因是已报道的最佳的微基因之一(Abmayr等，2005；Gregorevic等，2006；Gregorevic等，2004；Harper等，2002；Liu等，2005；Yue等，2003；Yue等，2006)。在mdx小鼠、肌营养相关蛋白/抗肌萎缩蛋白双敲除小鼠、和营养不良狗的实验中都表现出具有前景的结果。比较感染了AV.CMV.ΔR4-23/ΔC或AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC的mdx小鼠伸趾长肌(EDL)的肌肉力量。除了在杆状结构域的结构有区别之外(图10A)，两种微基因都导致了相同水平的力量改善(图10B)。实验测试了ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因是否可在mdx4cv小鼠中改善肌肉力量。这些小鼠的遗传背景为BL6，在抗肌萎缩蛋白基因中携带不同的突变。在新生的mdx4cv小鼠中进行***基因传递后，观察到EDL肌肉比力得到显著提高(图11A)。在DMD病人和DMD动物模型中血清肌酸激酶(CK)的水平升高。用ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因进行AAV治疗显著降低了mdx4cv小鼠中的血清CK水平(图11B)。

为进一步评价ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC微基因的治疗效果，在成年myoD/抗肌萎缩蛋白双敲除(m-dko)小鼠中进行了更加严格的实验。Mdx小鼠表现出轻微的表型。这个有部分是因为在小鼠骨骼肌中有强健的肌肉新生。在m-dko小鼠中，骨骼肌特异性的转录因子myoD失活导致肌肉新生的阻断。m-dko小鼠表现出与人类病人相似的严重的肌肉疾病(Duan，2006；Megeney等，1996；Megeney等，1999)。在两月龄的雄性m-dko小鼠中进行AAV-9的***传递。AAV治疗后三个月，在单次(抽搐)和强直刺激下测试EDL肌肉力量。与未治疗小鼠相比，AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC感染显著增强了肌肉力量(图12A和12B)。DMD肌肉对离心收缩引起的受伤尤其敏感。在未治疗的m-dko小鼠中，离心收缩导致肌肉力量的快速削弱。AV.CMV.ΔR2-15/ΔR18-23/ΔC治疗显著保护了离心受伤后的肌肉力量(图12C)。除了肌肉力量的改善以外，在成年m-dko小鼠中的AAV治疗还导致了血清CK水平的显著降低(图12D)。

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Claims (11)

1.一种分离的核酸分子，其含有一核苷酸序列，该序列编码一衍生自全长野生型抗肌萎缩蛋白的修饰蛋白，其中该修饰蛋白含有，从N端到C端：

(1)抗肌萎缩蛋白的N端结构域或抗肌萎缩蛋白的修饰的N端结构域；

(2)抗肌萎缩蛋白的中部杆状结构域的至少两个重复单位，其中所述至少两个重复单位包括R16和R17；

(3)抗肌萎缩蛋白的至少两个铰链区，其中所述至少两个铰链区包括H1和H4；以及

(4)抗肌萎缩蛋白的富含半胱氨酸的结构域。

2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述抗肌萎缩蛋白的中部杆状结构域的至少两个重复单位选自由以下成员组成的组：(1)R1、R16、R17和R24，(2)R1-R2、R16、R17和R24，(3)R1、R16-R19和R24，(4)R1-R3、R16、R17和R20-R24，以及(5)R1-R3和R16-R24。

3.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述抗肌萎缩蛋白的至少两个铰链区包括H1，H3和H4。

4.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述序列选自由以下成员组成的组：SEQ IDNOs：7-8和10-13。

5.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其进一步含有一编码抗肌萎缩蛋白的C端结构域的序列。

6.一种由权利要求1所述的任一核酸分子编码的多肽。

7.一种单重组的腺相关病毒(AAV)载体，其含有权利要求1所述的任一核酸分子，操作性连接于一表达框和病毒反向末端重复序列(ITR)。

8.一种双重组的AAV载体***，其含有两个AAV载体，其中两个AAV载体之一包括权利要求1所述的任一核酸分子的一部分，而另一个载体包括所述核酸分子的剩余部分，且其中所述两个载体进一步包括可允许双方重组从而形成所述全长的核酸分子序列。

9.一种在某对象中治疗抗肌萎缩蛋白缺陷性疾病的方法，通过对所述对象给药治疗有效剂量的如权利要求7或8所述的AAV载体以及药用可接受的运载物。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述抗肌萎缩蛋白缺陷性疾病选自由以下成员组成的组：杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克尔肌肉萎缩症(BMD)、X染色体关联的扩张型心肌病(XLDC)。

11.一种药物组合物，其含有一种或多种如权利要求7或8所述的AAV载体以及药用可接受的运载物。

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